JP2009511026A

JP2009511026A - 血栓塞栓性及び冠状動脈性心疾患の診断方法

Info

Publication number: JP2009511026A
Application number: JP2008534895A
Authority: JP
Inventors: デトレフ・コツィアン; マティーアス・ヘルマン
Original assignee: Sanofi Synthelabo SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-09-30
Publication date: 2009-03-19
Also published as: AU2006301578A1; AU2006301578B2; EP1937839B1; IL190585A0; DE102005048899A1; EP1937839A1; ATE525481T1; BRPI0617341A2; CA2625698A1; AU2006301578B9; AR056125A1; KR20080052662A; CN101287846A; US20090197774A1; TW200734638A; WO2007042165A1; IL190585A

Abstract

本発明は、血栓塞栓症及び／又は冠状動脈性心疾患のin vitro診断の方法に関する。人からの試料の、ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸の４７０位のヌクレオチド、又はヒトＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸が決定される。

Description

本発明は、人の試料の、ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸の４７０位のヌクレオチド、又はヒトＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸が決定される、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患のin vitro診断の方法に関する。

ＥＧＬＮ２は、そのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性によりプロリルヒドロキシラーゼドメイン含有蛋白質１（ＰＨＤ１）としても知られている、５つのコーディングエキソンからなる保存ゲノム構造を有するＥｇｌ−Ｎｉｎｅ遺伝子ファミリーの近縁の蛋白質の１グループに属する。ＨＩＦ（低酸素誘導因子）は、酸素のホメオスタシスの様々な局面において重要な役割を果たす転写制御因子であるが、ＥＧＬＮアイソフォーム類である、ＥＧＬＮ１（ＰＨＤ１）、ＥＧＬＮ２（ＰＨＤ２）及びＥＧＬＮ３（ＰＨＤ３）のＨＩＦの生理的調節への寄与はまだ不明である（Appelhoff, R. J. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 38458-38465, No. 37）。全てのＥＧＬＮアイソフォーム類は異なる細胞特異的及び誘導性挙動を呈し、これが低酸素へのＨＩＦ応答の調節においてフレキシビリティを可能にすると考えられる。このことは、特定のＥＧＬＮアイソザイムの特異的薬理学的阻害が、治療への応用に有用と思われるＨＩＦ応答の選択的調節能を有することが可能なことを意味するものである(Appelhoff, R. J. et al. (2004), 同上)。ＥＧＬＮ２の阻害は、例えば、安静時のさまざまな細胞タイプにわたって広くＨＩＦ応答を活性化するはずである。対照的に、ＥＧＬＮ３の特異的阻害は高レベルの酵素を発現する特定の組織での低酸素への応答を選択的に増加させるはずである(Appelhoff, R. J. et al. (2004), 同上)。このことは、虚血性／低酸素性疾患の治療の可能性を開く可能性がある。ＥＧＬＮ２とＥＧＬＮ３に反して、ＥＧＬＮ１の生理的役割について多くは知られていない。

冠状動脈心疾患の発病と進行においてＥＧＬＮ２の潜在的関与をより理解するために、遺伝子型−表現型関連解析が、本発明に従って参照番号ＮＭ＿０５３０４６．２で公開されたＥＧＬＮ２参照配列の４７０位におけるＥＧＬＮ２遺伝子の変異に関して、特性が良く分かっている患者群で実施された。ＥＧＬＮ２遺伝子の異なる遺伝的変異体類は既にＳＮＰ（一塩基多型）として知られ、そしてhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=112398)で公開されている。

驚くべきことに、ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸の４７０位のヌクレオチドの変異、特にシトシンからチミジンへの変異、又はヒトＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸の変異、特にセリンからロイシンへの変異が、血栓塞栓性及び冠状動脈性心疾患の発生と相関することが見出された。

従って、本発明の主題は、ある人又は患者の試料の、ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸の４７０位のヌクレオチド、又はヒトＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸が決定される、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患のin vitro又はin vivo診断の方法に関する。

本発明の好ましい実施態様において、血栓塞栓性疾患は、脳卒中、遷延性可逆性虚血性神経症候（ＰＲＩＮＤ）及び又は一過性虚血性発作（ＴＩＡ）であり、そして冠状動脈性心疾患は心筋梗塞である。

特に、４７０位のヌクレオチドが染色体ＤＮＡ中のチミジン若しくはｍＲＮＡ中のウラシルと決定され、又は５８位のアミノ酸がロイシンと決定された場合、脳卒中、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの高いリスクが存在する。しかし、もし４７０位のヌクレオチドがシチジンと決定されるか５８位のアミノ酸がセリンと決定された場合、心筋梗塞、特に早期心筋梗塞の高いリスクが存在する。

本発明によれば、「ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｃ」の用語は、参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の４７０位にＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子にシチジンを有し、その結果対応する蛋白質の５８位がアミノ酸セリンになる人のグループを意味する。これらの人々は、このＥＧＬＮ２変異体に関してホモ接合性である。従って、「ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｔ」の用語は、ＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の１つの対立遺伝子にシチジンを有し、その結果対応する蛋白質の５８位がセリンになり、そしてＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の他の対立遺伝子にチミジンを有し、その結果対応する蛋白質の５８位がロイシンになる人のグループを意味する。これらの人々は、このＥＧＬＮ２変異体に関してヘテロ接合性である。

ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする参照配列の核酸配列は、好ましくは配列番号１の核酸配列を有し、そしてヒトＥＧＬＮ２蛋白質のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有する。しかしながら、本発明は、またヒトＥＧＬＮ２及びヒト以外のそのホモログ、例えば他の哺乳類のＥＧＬＮ２ホモログ又はCaenorhabdidis elegans、マウス若しくはラット由来のＥＧＬＮ２ホモログなどを含むが、ただし、前述の参照配列の４７０位に対応する位置においてシチジンからチミジンへのヌクレオチド交換及び／又は前述の参照配列の５８位に対応する位置においてセリンからロイシンのアミノ酸交換が存在し、そして更に対応の蛋白質がプロリルヒドロキシラーゼ活性、特にＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を有するという条件の場合である。前述の酵素活性は、例えば、Ｐｒｏ、例えばＨＩＦ−１αのＰｒｏ⁵⁶⁴の酸化が検出できる質量分光分析、又は当業者に周知の酵素的分析によって測定し得る。

一般的に、４７０位の特異的ヌクレオチドは、核酸配列決定法、核酸の質量分光分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法によって測定し得る。核酸配列決定法の例は、放射性及び／又は蛍光標識ヌクレオチドを用いるピロ配列決定及び／又は配列決定である。ハイブリダイゼーション法の例は、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析及び／又はＤＮＡマイクロアレイによるハイブリダイゼーション法である。増幅法の例は、TaqMan解析、差次的ＲＮＡ発現分析及び／又は表現差異分析である (Shi M. M. (2002) Am J Pharmacogenomics., 2(3), 197-205; Kozian & Kirschbaum (1999) Trends Biotechnol., 17(2), 73-8.)。

更に、５８位のアミノ酸配列は、特異的蛋白質の量を測定する方法及び／又は特異蛋白質の活性を測定する方法によって決定することができる。特定の蛋白質の量を測定する方法の例は、ウェスタンブロット法及び／又はＥＬＩＳＡである。特異蛋白質の活性を測定する方法は、当業者に周知のin vitro試験分析及び／又はヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞によるin vitro全細胞試験分析である。

個々の変異体の検出用試料の例は、細胞、組織又は体液、特に血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞である。好ましくは、試料は、更なる解析用の試料の核酸若しくは染色体ＤＮＡ、又は蛋白質を単離及び／又は精製するために、当業者に周知の従来法によって前処理される。

更なる任意の工程において、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患に罹患する人のリスク及び／又は年齢は、実施例に示すようにして決定することができる。

別の任意の工程において、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患に対する薬剤の投与量を決定することができる。

一般的に、ＥＧＬＮ２遺伝子で見出された遺伝的変異は、本発明に従って、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患（「心血管疾患」としても知られる）、特に早期心筋梗塞、発作、ＰＲＩＮＤ、ＴＩＡ及び／又は冠状動脈性心疾患のリスク評価及び／又は予防的治療のための遺伝子マーカーとして使用することができる。

更に、遺伝的変異は、人、個人若しくは患者の治療用の有効な治療薬の投与量の適応及び／又は血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患、特に早期心筋梗塞、脳卒中、ＰＲＩＮＤ、ＴＩＡ及び／又は冠状動脈性心疾患のリスク増加の臨床治験研究のための、又はそのために選ばれた人、個人又は患者の特定のための遺伝子マーカーとして、本発明に従って使用することができる。遺伝的変異は、また特定の人、個人若しくは患者に対し薬剤活性物質の許容性、安全性及び有効性を評価するために、又は前述の疾患の特別の治療に適切な人、個人又は患者を特定するために、本発明に従って使用することができる。

また、この遺伝的変異は、該疾患の治療に対して薬学的に活性な化合物の検出及び評価のためのハイスループット・スクリーニング試験の一部としても、本発明に従って使用することができる。

本研究は、また人、個人又は患者の各々に治療又は助言を行なうための該疾患のリスクファクターを特定するために、使用することができる。

本発明に従った血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の診断の好ましい方法は、以下の工程：
（ａ）試料、特に、細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を、検査すべき人又は患者から取得し；
（ｂ）核酸プローブ、特にＤＮＡプローブを、該試料から単離し；
（ｃ）プライマー、特に実施例に特定されたプライマーを用いて、ＥＧＬＮ２遺伝子の４７０位を包含する特定の領域を増幅し；
（ｄ）増幅された領域の配列を決定し；
（ｅ）配列決定された領域を解析し；そして
（ｆ）血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患、特に早期心筋梗塞、脳卒中、ＰＲＩＮＤ、ＴＩＡ及び／又は冠状動脈性心疾患のリスクを評価する；
を含む。

本発明による血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の診断の代わりの方法は、以下の工程：
（ａ）試料、特に、細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を、検査すべき人又は患者から取得し；
（ｂ）ＥＧＬＮ２蛋白質を、該試料から単離し；
（ｃ）ＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸を決定し；そして
（ｄ）血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患，特に早期心筋梗塞、発作、ＰＲＩＮＤ、ＴＩＡ及び／又は冠状動脈性心疾患のリスクを評価する；
を含む。
より好ましい工程は、実施例において個々に又は集合的に規定されており、各工程を参照することによって本明細書に組み入れられている。

以下の図、表、配列及び実施例は、発明の範囲を制限することなく本発明を説明するものである。

配列決定と解析によるＳＮＰ検出
増幅のためのオリゴヌクレオチド(プライマー)：
以下のプライマーが、参照番号ＮＭ＿０５３０４６．２に示されるＥＧＬＮ２配列中の４７０位におけるＣからＴへのヌクレオチド交換の検出に使用された：
プライマー１：5'- CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG -3' (参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２; 配列番号３のヌクレオチド４４４−４６３)；
プライマー２：5'- GGGCTGGCAGTGGTAGAG -3' (参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２; 配列番号４の塩基５０４−５２１の相補配列)。

増幅のためのＰＣＲプロトコール：
使用した試薬はApplied Biosystems (Foster City、USA)製：２０ｎｇのゲノムＤＮＡ；１単位TaqGold ＤＮＡポリメラーゼ；１×Taq ポリメラーゼ緩衝液；５００μＭのｄＮＴＰｓ；２.５ｍＭのＭｇＣｌ₂；前掲の２００ｎＭの各増幅プライマー対；Ｈ₂Ｏを加えて（ａｄ）５μｌにする。

遺伝子型特定のためのＰＣＲの増幅プログラム：
９５℃１０分間 ×１サイクル；

９５℃３０秒間
７０℃３０秒間 ×２サイクル；

９５℃３０秒間
６５℃３０秒間 ×２サイクル；

９５℃３０秒間
６０℃３０秒間 ×２サイクル；

９５℃３０秒間
５６℃３０秒間
７２℃３０秒間 ×４０サイクル；

７２℃１０分間
４℃３０秒間 ×１サイクル；

ＳＮＰのミニ配列決定と検出のためのプロトコール
使用した試薬はApplied Biosystems 社 (Foster City、USA)製。２μｌ精製ＰＣＲ産物、１.５μｌのBigDye−Terminatorキット、前掲の２００ｎＭの配列決定プラマー；Ｈ₂Ｏで１０μｌにする。

配列決定のための増幅プログラム：
９６℃２分間 ×１サイクル；

９６℃１０秒間
５５℃１０秒間
６５℃４分間 ×３０サイクル；

７２℃７分間
４℃３０秒間 ×１サイクル；

配列決定産物の解析
配列は、まず予備データを得るためにSequenz Analyse ソフトウエア（Applied Biosystems社、Foster City、USA）で解析され、次いでPhred、Phrap、Polyphred及びConsedソフトウェアで処理された。Phred、Phrap、Polyphred及びConsedは、Washington大学のPhil Greenによって作成されたものである(http://www.genome.washington.edu)。

結果
被験者群の特性
表１は研究対象者群の特性を示す。

ＥＧＬＮ２遺伝子の変異体の頻度と分布
表２は、検討した患者群の参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２遺伝子の遺伝的変異体の頻度と分布を示す。

以下では、ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｃ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｓｅｒ）及びＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｔ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｌｅｕ）を有する個人だけが考慮に入れられる。

早期心筋梗塞の発症に対するＥＧＬＮ２の変異体の影響
表３は、検討した患者群において早期心筋梗塞（男性では５５歳未満、女性では６０歳未満）及び発作／ＰＲＩＮＤ(遷延性可逆性虚血性神経欠損)／ＴＩＡ（一過性虚血性発作）の発症に対する参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２の遺伝子型の影響を示す。０.０５未満のＰ値は統計的に関係ありを示す。

結果：
１．ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｃを有する患者は、ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｔを有する患者に比べて早期心筋梗塞に対し統計的に高い発生率を示した。
２．ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｔを有する患者は、ＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｃを有する患者に比べて発作、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの罹患リスクの有意な増加を示した。

冠状動脈性心疾患の患者年齢に対するＥＧＬＮ２の変異体の影響
図３は、患者群における冠状動脈性心疾患の発症年齢に対する、参照配列ＮＭ＿０５３０４２．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２の遺伝子型の影響を示す。

結果：
冠状動脈性心疾患の早期発症に対するＥＧＬＮ２―Ｃ４７０Ｃ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｓｅｒ) を有する患者の年齢の有意な依存性が、ＥＧＬＮ２−Ｃ４７０Ｔ（ＥＧＬＮ２Ｓｅｒ５８Ｌｅｕ）を有する患者の年齢に比べて認められた。

結論
前掲のＥＧＬＮ２をコードする遺伝子の遺伝的変異体及び／又は蛋白質ＥＧＬＮ２との間の統計的に有意な相関は、血栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の発症における前述の遺伝的変異体の関与を示唆するものである。その結果として、前述の遺伝的変異体は、血栓性及び／又は冠状動脈性心疾患の予後、特に早期心筋梗塞及び又は発作、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡの予後の生物学的マーカーとなる。

ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有するヒトＥＧＬＮ２遺伝子の核酸配列を示す。４７０位における遺伝的変異Ｃ→Ｔ(太字)を有する遺伝子断片の増幅に使用されるプライマーは下線で示される。ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有する核酸配列から導かれるヒトＥＧＬＮ２のアミノ酸配列を示す。ＥＧＬＮ蛋白質中の５８位のアミノ酸を太字で示す。患者群における冠状動脈性心疾患の発症年齢に対する、ＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸変換をもたらす参照配列ＮＭ＿０５３０４２．２の４７０位におけるＥＧＬＮ２の遺伝子型の影響を示す。Ｐ値は０.０５未満であり統計的に有意である。

配列の説明
配列番号１は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有するヒトＥＧＬＮ２蛋白質の核酸配列を示す。
配列番号２は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿０５３０４６を有する核酸配列から導かれるヒトＥＧＬＮ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２のヌクレオチド４４４−４６３の第１プライマー配列を示す。
配列番号４は、参照配列ＮＭ＿０５３０４６．２の塩基５０４−５２１の相補配列の第２プライマー配列を示す。

Claims

血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患のin vitro診断の方法であって、人の試料の、ヒトＥＧＬＮ蛋白質をコードする核酸の４７０位のヌクレオチド又はヒトＥＧＬＮ２蛋白質の５８位アミノ酸が決定される方法。
血栓塞栓性疾患が、脳卒中、遷延性可逆性虚血性神経症候（ＰＲＩＮＤ）及び／又は一過性虚血性発作（ＴＩＡ）からなるグループから選ばれる、請求項１に記載の方法。
冠状動脈性心疾患が心筋梗塞である、請求項１に記載の方法。
脳卒中、ＰＲＩＮＤ及び／又はＴＩＡのリスクに対して、４７０位のヌクレオチドが染色体ＤＮＡ中のチミジン若しくはｍＲＮＡ中のウラシルと決定され、又は５８位のアミノ酸がロイシンと決定される、請求項２に記載の方法。
心筋梗塞、特に早期心筋梗塞のリスクに対して、４７０位のヌクレオチドがシチジンと決定され、又は５８位のアミノ酸がセリンと決定される、請求項３に記載の方法。
ヒトＥＧＬＮ２蛋白質をコードする核酸が配列番号１の塩基配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
ヒトＥＧＬＮ２蛋白質が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
４７０位のヌクレオチドが、核酸配列決定法、核酸の質量分光分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法からなるグループから選ばれる方法によって決定される、請求項１〜４及び６のいずれか１項に記載の方法。
核酸配列決定法が、ピロ配列決定及び／又は放射性及び／若しくは蛍光標識ヌクレオチドを用いる配列決定から選ばれるグループから選択される、請求項８に記載の方法。
ハイブリダイゼーション法が、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析及び／又はＤＮＡマイクロアレイによるハイブリダイゼーション法からなるグループから選択される、請求項８に記載の方法。
増幅法が、TaqMan解析、差次的ＲＮＡ発現分析及び／又は発現差異分析からなるグループから選択される、請求項８に記載の方法。
５８位のアミノ酸配列が、特定の蛋白質の量を測定する方法及び/又は特定の蛋白質の活性を測定する方法からなるグループから選択される方法によって決定される、請求項１〜３、５及び７のいずれか１項に記載の方法。
特定の異蛋白質の量が、ウェスタンブロット解析及び／又はＥＬＩＳＡからなるグループから選ばれる方法によって測定される、請求項１２に記載の方法。
特定の蛋白質の活性が、ヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞を用いてin vitro試験法及びin vivo全細胞試験法によって測定される、請求項１２に記載の方法。
試料が、細胞、組織及び／又は体液からなるグループから選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
更なる工程において、血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患に罹患する人のリスクが決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
更なる工程において薬剤の投与量が決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
以下の工程：
（ａ）検査すべき人から試料を取得し；
（ｂ）該試料から核酸プローブ、特にＤＮＡプローブを単離し；
（ｃ）プライマーを用いてＥＧＬＮ２遺伝子の４７０位を包含する特定の領域を増幅し；
（ｄ）増幅した領域の配列を決定し；
（ｅ）配列決定した領域を解析し；そして
（ｆ）血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患、特に心筋梗塞、発作、ＰＲＩＮＤ、ＴＩＡ及び／又は冠状動脈疾患のリスクを評価する；
を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
心筋梗塞が早期心筋梗塞である、請求項１８に記載の方法。
プライマーが配列番号３及び／又は配列番号４から選択される、請求項１８又は１９に記載の方法。
以下の工程：
（ａ）試料、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を、検査すべき人又は患者から取得し；
（ｂ）ＥＧＬＮ２蛋白質を該試料から単離し；
（ｃ）ＥＧＬＮ２蛋白質の５８位のアミノ酸を決定し；そして
（ｄ）血栓塞栓性及び／又は冠状動脈性心疾患、特に早期心筋梗塞、発作、ＰＲＩＮＤ、ＴＩＡ及び／又は冠状動脈疾患のリスクを評価する；
を含む、請求項１〜３、５、７又は１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
心筋梗塞が早期心筋梗塞である、請求項２０に記載の方法。