CN102643906A - 焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性试剂盒及方法。所述试剂盒对伊立替康用药基因进行分型，具体的是指：UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.3-8所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)的检测，从而达到对伊立替康用药实现安全合理有效的个体化给药。

Description

焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

伊立替康系喜树碱类前药，在体内可经羧酸酯酶代谢成活性形式7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)。SN-38作用靶点是DNA拓扑异构酶I，可干扰DNA复制和转录，可抑制DNA合成，具有较强杀伤肿瘤活性。广泛应用于胃癌、结直肠癌、肺癌等实体瘤治疗，可显著提高患者总生存期。但伊立替康治疗时，严重的毒副反应发生率较高，特别是可导致严重的延迟性腹泻和粒细胞缺乏，使其临床应用受到影响。临床研究表明，40％以上接受伊立替康治疗的患者可出现3～4级迟发性腹泻，约10％患者可出现嗜中性白血球减少症，从而导致化疗方案提前中止。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)葡萄糖醛酸化灭活，生成葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)，从而保护健康细胞免受伊立替康毒性的影响。UGT1A1基因呈多态性，最常见的是启动子区域的UGT1A1*28，野生型有6个AT重复，突变体为7个AT重复。含有较高数目的TA重复序列即TA7患者，与野生型TA6比较，UGTIAI基因的表达量降低且活性也降低。此外在UGT1A1基因1号、4号和5号外显子上核苷酸的改变也产生了一系列活性降低的突变体(UGT1A1*6、UGT1A1*7、UGT1A1*27、UGT1A1*29)。突变型UGT1A1*28的杂合子比野生型对SN-38的葡萄糖醛苷化活性稍低，而UGT1A1*28的突变纯合子对SN-38的葡萄糖醛苷化活性则仅是野生型的35％，从而更容易产生毒副作用。野生型UGT1A1(6/6)在接受伊立替康治疗时产生毒副作用风险较低，而UGT1A1*28突变型杂合子(6/7)产生毒副作用的几率为12.5％，突变型纯合子(7/7)则有50％产生毒副作用的可能性。该突变的影响是与剂量相关的，在使用低剂量伊立替康治疗时，UGT1A1突变与否对毒副作用的风险影响不大。学者针对118名服用依利替康的日本癌症患者进行了病例对照研究，在这118人中有26人发生了严重不良反应(发生频率为22％)，包括4级粒细胞减少，4级血样便腹泻或脱水，3级水样便腹泻。在出现严重不良反应的26人中，发生UGT1A1*28突变的有12人(46％，其中纯合子4人，杂合子8人)，另外没有发生不良反应中的92人中有13人是UGT1A1*28的突变的个体(14％)。研究者发现UGT1A1*28突变纯合子严重腹泻的发生率为70％，而*28突变杂合子和野生型纯合子中的发生率分别为33％和17％；另有研究证实4级粒细胞减少症的发生率在MM，WM和WW个体中的发生率分别为50％，12.5％和0。美国FDA明文规定UGT1A1*28突变的纯合子和杂合子的个体发生严重不良反应的风险极大的增加了(约7倍)，应当严加监控。在中国人中，野生型纯合子(6/6)、杂合子(6/7)和突变型纯合子(7/7)的发生频率分别为70.2％、27.7％和2.1％。UGT1A1*6(G71R，211G＞A)13％东方人特有。有研究显示UGT1A1*6突变使UGT1A1的葡萄糖醛酸化的能力下降70％，使伊立替康的毒副作用风险显著增加。

综上UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多态性是影响伊立替康需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多态性的试剂盒将为伊立替康的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多态性是影响伊立替康剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床伊立替康个体化用药治疗的用药基因UGT1A1*6(SEQ IDNO.1)和UGT1A1*28(SEQ IDNO.2)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测伊立替康个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：

(1)扩增引物：

UGT1A1*6(rs4148323)上游引物：5′-GAA ATA GTT GTC CTA GCACC-3′(SEQ IDNO.3)；

UGT1A1*28(rs3064744)上游引物5′-ACA GCT TTT TAT AGT CACGTGA-3′(SEQ ID NO.4)；

UGT1A1*6(rs4148323)下游引物：5′-CTT CAA GGT GTA AAA TGCTC-3′(SEQ IDNO.5)；

UGT1A1*28(rs3064744)下游引物5′-TGC TCA GCC AGT GGC TGCCAT CCA-3′(SEQ ID NO.6)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：

UGT1A1*6(rs4148323)测序引物：5′-TCA AGG TGT AAA ATG CTC-3′(SEQIDNO.7)；

UGT1A1*28(rs3064744)测序引物：5′-CGC CCT CTC CTA CTT AT-3′(SEQIDNO.8)；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用权利要求1所述的试剂盒检测伊立替康个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应：

配制50μlPCR扩增体系，包含：10×PCR buffr10.0μl，dNTP 3.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，rTaq1.0μl，水30.0μl，模板4.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃5min预变性；然后依次在95℃30S，55℃30S，72℃30S，进行36个循环；再在72℃保持3min，最终保持在4℃，得扩增产物；

(3)焦磷酸测序单链样本纯化；

(4)焦磷酸测序及结果分析。

本发明的试剂盒对UGT1A1*6(rs4148323)目标序列和UGT1A1*28(rs3064744)目标序列进行分析和检测；其中，UGT1A1*6(rs4148323)目标序列包括：野生型TGCTCCGTCTC(SEQ ID NO.9)和突变型TGCTCTGTCTC(SEQ IDNO.10)，扩增片段长度为66bp；UGT1A1*28(rs3064744)目标序列包括：野生型(AT)6GGC(SEQ ID NO.11)和突变型(AT)7GGC(SEQ ID NO.12)，扩增片段长度为244bp。

由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对伊立替康个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上伊立替康个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。

附图说明

图1为本发明UGT1A1*6CC焦磷酸测序结果；

图2为本发明UGT1A1*6CT焦磷酸测序结果；

图3为本发明UGT1A1*6TT焦磷酸测序结果；

图4为本发明UGT1A1*28TA6/TA6焦磷酸测序结果；

图5为本发明UGT1A1*28TA6/TA7焦磷酸测序结果；

图6为本发明UGT1A1*28TA7/TA7焦磷酸测序结果。

具体实施方式

下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。

实施例1：

UGT1A1*6(rs4148323)上游引物：5′-GAA ATA GTT GTC CTA GCA CC-3′(SEQ ID NO.3)；

UGT1A1*28(rs3064744)上游引物5′-ACA GCT TTT TAT AGT CAC GTGA-3′(SEQ ID NO.4)；

UGT1A1*6(rs4148323)下游引物：5′-CTT CAA GGT GTA AAA TGC TC-3′(SEQ ID NO.5)；

UGT1A1*28(rs3064744)下游引物5′-TGC TCA GCC AGT GGC TGC CATCCA-3′(SEQ IDNO.6)；

UGT1A1*6(rs4148323)测序引物：5′-TCA AGG TGT AAA ATG CTC-3′(SEQ ID NO.7)；

UGT1A1*28(rs3064744)测序引物：5′-CGC CCT CTC CTA CTT AT-3′(SEQIDNO.8)；

1.DNA提取

1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：

(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。

1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；

1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；

1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；

1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；

1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；

1.7 13,000rpm室温离心20秒；

1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；

1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；

1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；

1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；

1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；

1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；

1.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；

1.15 13,000rpm室温离心1min；

1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；

1.17移取300uL 75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；

1.18 13,000rpm室温离心1min；

1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；

1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；

1.21目测沉淀大小，加入50～100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；

1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解DNA。

1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；

1.24保存核酸标本至4℃冰箱；

2.聚合酶链反应

2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表：

注：上游引物和下游引物各有两种，这里的1.0μl是指每种上游引物各加0.5μl，以及每种下游引物各加0.5μl。

2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加4μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；

2.3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：

2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；

2.5点击“start”开始仪器运行。

3.焦磷酸测序单链样本纯化

3.1纯化前试剂和仪器准备：

进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。

3.2单链样本纯化操作：

3.2.1在PSQ 96板中先加40μlAnnealing Buffer和2～3μl测序引物(10uM)；

3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；

3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；

3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；

3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；

3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；

3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml 70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；

3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；

3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；

3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的Sepharose Beads；

3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；

3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；

3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；

3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；

3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；

3.2.16Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads；

3.2.17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。

3.3纯化完毕后清洗：

3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；

3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；

3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；

3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；

3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。

4.焦磷酸测序

4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；

4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；

4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。

5.焦磷酸测序结果分析

在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测UGT1A1*6和UGT1A1*28基因多态性，焦磷酸检测结果如图1～6。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对UGT1A1*6和UGT1A1*28基因多态性进行检测和判读。图1～3提示UGT1A1*6分别为野生型纯合子、突变型杂合子、突变型纯合子，图4～6提示UGT1A1*28为野生型纯合子、突变型杂合子、突变型纯合子。临床医生可根据UGT1A1*6和UGT1A1*28基因多态性，判断出不同基因型患者使用伊立替康治疗时的疗效和毒副反应。

综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测UGT1A1*6和UGT1A1*28基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于伊立替康的个体化使用。

Claims (2)

1.一种焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：

(1)扩增引物：

上游引物：5′-GAA ATA GTT GTC CTA GCA CC-3′；

5′-ACA GCT TTT TAT AGT CAC GTG A-3′；

下游引物：5′-CTT CAA GGT GTA AAA TGC TC-3′；

5′-TGC TCA GCC AGT GGC TGC CAT CCA-3′；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：5′-TCA AGG TGT AAA ATG CTC-3′；

5′-CGC CCT CTC CTA CTT AT-3′。

2.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测伊立替康个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应：

配制50μlPCR扩增体系，包含：10×PCR buffr10.0μl，dNTP 3.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，rTaq1.0μl，水30.0μl，模板4.0μl；循环程序为：95℃5min预变性；依次在95℃30S，55℃30S，72℃30S，进行36个循环；72℃保持3min，最终保持在4℃，得扩增产物；

(3)焦磷酸测序单链样本纯化；

(4)焦磷酸测序及结果分析。

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