CN106222246A - 检测ugt1a1基因多态性的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种检测UGT1A1基因多态性的试剂盒，属于生物技术领域。本发明的目的是应用焦磷酸测序平台，开发了一种可以快速准确分析基因多态行的检测UGT1A1基因多态性的试剂盒。本发明试剂盒包括：引物、Taq酶、缓冲液、d‑NTP,并加盖密封的多个试剂瓶或管；分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物混合物包括正向引物、反向引物和测序引物。本发明试剂盒的扩增范围可涵盖所有正常人及伊立替康用药患者。试剂盒具有分析时间短、高通量、所需要的遗传物质少的特点。

Description

检测UGT1A1基因多态性的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
自1998年美国食品药物管理局(Food and DrugAdmistraton，FDA)批准伊立替康(CPT-11)-线治疗转移性结直肠癌以来，CPT-11相关的毒性，即迟发性腹泻和中性粒细胞减少，引起临床医生的广泛关注。
伊立替康（irinotecan,CPT-11）是喜树碱半合成衍生物，其主要代谢部位在肝脏，经静脉注射后，在体内经羧酸酯酶（carboxylesterases,CES）水解转化为其活性代谢产物7－乙基－10－羟基喜树碱（7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin,SN-38），抑制ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅰ，发挥细胞毒效应。其对结直肠癌、胃癌、小细胞肺癌等具有较好的疗效。
研究表明伊立替康可提高患者的化疗有效率、无疾病进展生存时间（progression-free survival,PFS）和总生存时间（overall suivival,OS）。然而其迟发性腹泻和粒细胞减少发生率可达约46％和30％，甚至导致患者死亡。因 此，CPT-11的 临 床应 用 受 到 限 制。SN-38主要经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶家族（uridinediphosphate glucronosyltransferases,UGTs）灭活，近年来不少研究证实尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1（uridine-diphosphoglucuronosyl-transferase 1A1,UGT1A1）的功能及其基因多态性与伊立替康毒性有密切关系。
UGT1A1 是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 1 的简称 ,UGT1A1 多分布在肝脏 ,以尿苷二磷酸葡萄糖醛酸为糖基供体与底物结合进行反应 , 增加底物的水溶性 , 从而使底物溶解后随胆汁或尿液排出体外。它能修饰代谢物的药理活性 , 使代谢物失活 ,是机体重要的解毒剂。
人类的 UGT1A1 基因位于 2 号染色体的 2q37, 它能催化胆红素与葡萄糖酸的结合 , 是胆红素的主要代谢酶。
UGT1A1 基因多肽性主要来自于启动子区 TATA 盒的变异 , 变异范围包括5~8个 TA 重复片断 , UGT1A1*1 和 UGT1A1*28 是最常见的变异体 , 个体是任意两个等位基因的组合 , 含有两个野生型基因的个体即是 6/6 纯合基因型 ；两个 UGT1A1*28 等位基因的个体即是 7/7 纯合基因型 ；1 个野生型等位基因加 1 个UGT1A1*28 等位基因即组成 6/7 杂合基因型。
UGTlAl*28/*28是UGTlA启动子区TATA盒中7个TA重复的多态性等位基因(即TA7/7型)与6个TA重复的野生型(即TA6/6型)相比，TA7/7型通过影响转录活性或导致氨基酸改变，影响酶的活性，导致CPT-11的毒性增加。
有研究表明，UGTlAl*28 TA7/7型的转录活性下降18％～30％，使患者中性粒细胞减少的风险明显升高。为此，2005年美国FDA建议辉瑞制药公司修改了CPT-11的说明书，增补了相对于TA6/6型，TA7/7型患者中性粒细胞减少的风险增加的警示，并建议TA7/7型患者的CPT-11起始剂量应该降低。
目前国内通过SFDA认证的,检测UGT1A1基因的试剂盒为上海源奇生物医药科技有限公司的产品。其原理是PCR扩增而后进行毛细管电泳。该产品对于结果判读存在一定主观性，且存在判断错误的可能并且费用昂贵。
发明内容
本发明的目的是应用焦磷酸测序平台，开发了一种可以快速准确分析基因多态行的检测UGT1A1基因多态性的试剂盒。
本发明试剂盒包括：
(1) 引物、Taq 酶、缓冲液、d-NTP,并加盖密封的多个试剂瓶或 管；
(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物混合物包括正向引物、反向引物和测序引物，所使用的引物序列分别为：5’-CAACTCCCTGCTACCTTTGTGG-3’、5’biotion-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’和5’-TCGATTGGTTTTTGC-3’。
本发明试剂盒内采用自主设计的特异性引物，并且Reverse采用生物素修饰 ，便于焦磷酸测序仪吸附有效基因片段。
本发明PCR 反应液包括 dNTP、缓冲液， PCR反应液中加入1.25-2.5单位 Taq 酶。
本发明试剂盒的扩增范围可涵盖所有正常人及伊立替康用药患者。试剂盒具有分析时间短、高通量、所需要的 遗传物质少的特点。本发明上下游引物具有特异性，与目的片段有特异性结合位点，能够特异的结合目的基因，测序引物具有特异性，可以准确的将目的片段进行测序。
附图说明
图1是第18个碱基T和第19个碱基A为待检测的多态性位点图；
图2是第18个碱基T和第19个碱基A为半峰高状态图；
图3是第18个碱基T和第19个碱基A为全峰高状态图；
图4是PCR产物电泳检测图。
具体实施方式
本发明试剂盒包括：
(1) 引物、Taq 酶、缓冲液、d-NTP,并加盖密封的多个试剂瓶或 管；
(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物混合物包括正向引物、反向引物和测序引物，所使用的引物序列分别为：5’-CAACTCCCTGCTACCTTTGTGG-3’、5’biotion-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’和5’-TCGATTGGTTTTTGC-3’。
本发明试剂盒内采用自主设计的特异性引物，并且Reverse采用生物素修饰 ，便于焦磷酸测序仪吸附有效基因片段。
本发明PCR 反应液包括 dNTP、缓冲液， PCR反应液中加入1.25-2.5单位 Taq 酶。
本发明试剂盒使用待测基因组DNA为模板，通过PCR扩增结合焦磷酸测序进行分析，确定UGT1A1*28/*28位点基因型。
本发明（1）设计一个100bp内片段PCR扩增体系，包括（a）可热启动的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和（b）2-脱氧核苷三磷酸（dNTPs），以及（c）与模板DNA匹配的上游引物、（d）能够与模板DNA匹配的下游引物、和（e）特异性的焦磷酸测序引物。（2）上游引物长度为22bp、下游引物长度为20bp，PCR反应的最适宜延伸温度在Taq酶的最佳作用温度内，从而提高产物的特异性。
上下游引物的碱基分别具有随机性，并且未连续出现4个以上的单一碱基，未在3’端出现超过3个的连续G或C，不会使引物在G十C富集序列区错误引发。引物自身不含有自身互补序列，不会形成发夹样二级结构。上下游引物之间没有多于4个的互补或同源碱基，不会形成引物二聚体。在下游引物的5’ 端进行生物素修饰，便于在焦磷酸测序时与磁珠上的亲核素结合，从而将目的片段提取出来进行测序。经过上述设计，使得上下游引物在PCR反应过程中易与目的片段结合，扩增效率增强，可获得更多的目的基因。
选择来源于真核细胞的DNA作为模板，上游引物互补结合到真核细胞DNA 目的序列的5’ 端，下游引物互补结合到真核细胞DNA 目的序列的3’端，使用上述PCR 扩增体系通过聚合酶链反应扩增UGT1A1基因片段。经过多次PCR扩增反应，发现我公司自主设计的上下游引物特异性强、扩增效果好。经过电泳检测，在140bp处有清晰明亮的单一条带。说明使用我公司自主设计的扩增引物，进行PCR扩增，所得的PCR扩增产物符合测序样本要求，该引物特异性强、扩增效果好。将PCR产物进行焦磷酸测序，可以准确得出测序序列，从而准确的判断出UGT1A1的基因型。这也说明我公司自主设计的测序引物具有特异性。（部分试验结果见附表1）
扩增产物作为下一步的引物测序反应的模板。针对扩增后产物进行焦磷酸检测和分析，通过检测得出的TA区域峰图，确定UGT1A1*28/*28位点基因型。
其技术关键点在于设计特异性的引物，并保证其扩增的区域只包含特定UGT1A1基因片段。
基于以上技术方案发明的试剂盒包括：(1) 分别装有缓冲液、正反向引物混合物、测序引物Taq酶、dNTP，并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR 反应液包括dNTPs、缓冲液和纯化水，特征在于PCR 反应中，有1.25-2.5单位Taq酶。
根据本发明的优选实施方案，其中引物混合物包括能够与待检位点双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，和能够与待检片段双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，特征在于所使用的引物序列分别为：5’-CAACTCCCTGCTACCTTTGTGG-3’和5’-biotion-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’ ；测序引物Sequencing：5’-TCGATTGGTTTTTGC-3’。
根据本发明的优选实施方案，正向、反向引物混合物中引物的工作浓度为0.2μM-0.4μM。
根据本发明的优选实施方案，测序引物混合物中引物的工作浓度为0.4μM-0.8μM。
根据本发明的优选实施方案，可以使用DNA 合成装置合成所需的寡核苷酸引物，并可用HPLC 法纯化。HPLC法是使用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的 DNA 片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。
根据本发明的优选实施方案，每个的PCR 反应体系中加入1.25-2.5单位Taq 酶。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的生物样品是真核细胞中的DNA，用来检测UGT1A1基因片段，可以是来自人体血细胞或体细胞的DNA。例如，DNA 样本可以来自外周血，脐血。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的特异性扩增引物通过聚合酶链反应技术可以对UGT1A1的DNA 片段进行扩增，扩增反应的循环数是50 循环。
根据本发明的一个优选实施方案，焦磷酸测序峰图中，根据TA序列中，最后一组TA的峰型来确定UGT1A1基因的类型。
简单地说，本发明的试剂盒包括一个PCR 反应体系及一个测序引物；选择来源于真核细胞的DNA 作为模板；在相互配对的引物中，其中一条互补到真核细胞DNA 目的序列的5’- 端，另一条互补于真核细胞DNA 目的序列的3’- 端；而且PCR 缓冲液和扩增反应需要的Taq 酶参与扩增反应。特异性的测序引物在焦磷酸测序仪上能够正确的找出目的基因，并判读出结果，给出直观的峰图。从而可以准确的判读出基因型。
如图1所示，第18个碱基T和第19个碱基A为待检测的多态性位点，本图中显示这两个碱基为本底小峰状态，说明不存在第7个TA。因此判断为6TA/6TA基因型。
如图2所示，第18个碱基T和第19个碱基A为半峰高状态（可以从第16个碱基T与第18个碱基T间峰高的比值；可以从第17个碱基A9与第19个碱基T间峰高的比值看出），说明存在一个拷贝的第7个TA。因此判断为6TA/7TA基因型。
如图3所示，第18个碱基T和第19个碱基A为全峰高状态，说明存在两个拷贝的第7个TA。因此判断为7TA/7TA基因型。
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1 ：检测试剂盒及其使用
(1) 制备包括下列组成成分的试剂盒：引物混合物1 管(50μl/ 管)、Taq 酶1 管(7μl/管)、测序引物1 管(45ul/ 管)、缓冲液1 管(125ul/ 管)、dNTP1 管(100ul/ 管)。
(2) 标本采集、运送和保存：
1. 标本采集：标本为血液。血液为常规取静脉血2ml ，EDTA 抗凝处理。
2. 保存：可立即检测，4℃保存一周，-20℃保存期可达一年。
3. 运输：标本运送应采用0℃冰壶。
(3) 检测步骤和结果分析：
1.DNA 提取
建议使用Qiagen DNA 提取试剂盒。
外周全血的DNA 提取：4℃ 1000g 离心1.5ml 外周全血10 分钟，去掉上清。加入200μl 冰预冷的1×PBS 溶液重悬沉淀。接下来按照Qiagen Blood Protocol 说明书进行，直到最后一步。加入100μl AE 溶液或者蒸馏水到QIAamp spin column，室温温育至少5 分钟。室温6000g 离心1 分钟收集DNA 溶液。
脐血、静脉血或者绒毛组织DNA 提取：按照Qiagen Blood Protocol 说明书进行，最后收集到200μl DNA 溶液。
3.PCR 反应体系配制
对于每一个PCR 反应体系，混合以下成分到总体积为50ul。
组分 反应体积
缓冲液 5μl
引物混合物 2μl
Taq 酶 0.25μl
DNA 样品 2μl
dNTP 4μl
ddH2O 36.75μl
反应体系总量 50μl
4.PCR 反应条件
95℃预变性1 分钟，然后98℃ 10秒钟，61℃ 30秒钟，72℃ 20秒钟，共50 个循环；最后72℃ 5 分钟。
5. 扩增产物电泳
对于每一个分析，5μl PCR 产物与1μl 6×loading Buffer 混合，进行琼脂糖凝胶电泳。
6.焦磷酸测序上机
配制尖底96孔板反应体系：
PCR产物 25μl
磁珠 3μl
Binding buffer 40μl
H2O 12μl
合计： 80μl
将配好的尖底96孔板反应体系放常温下，以1500rpm振摇10分钟。
平底反应板的每个反应孔中加入1.6ul B，并加入38.4ul Annealing Buffer进行稀释，混匀。
按照焦磷酸测序仪SOP进行操作。
由图4电泳检测图可见在140bp处有清晰明亮单一条带，即为检测的目的条带，扩增引物特异性强。
由焦磷酸测序可知，测序引物能够与目的基因结合，准确检测出UGT1A1基因的多态性，此试剂盒特异性好、灵敏度强。

Claims (3)

1.一种检测UGT1A1基因多态性的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括：
(1) 引物、Taq 酶、缓冲液、d-NTP,并加盖密封的多个试剂瓶或 管；
(2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物混合物包括正向引物、反向引物和测序引物，所使用的引物序列分别为：5’-CAACTCCCTGCTACCTTTGTGG-3’、5’biotion-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’和5’-TCGATTGGTTTTTGC-3’。
2.根据权利要求 1 的试剂盒，其特征还在于：试剂盒内采用自主设计的特异性引物，并且Reverse采用生物素修饰 ，便于焦磷酸测序仪吸附有效基因片段。
3.根据权利要求 1 的试剂盒，其特征还在于：PCR 反应液包括 dNTP、缓冲液， PCR反应液中加入1.25-2.5单位 Taq 酶。
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Address after: 130122 Jinsha high tech Industrial Development Zone, Nanguan District, Changchun, Jilin, No. 39, Jinzhu villa, interchange between welfare road and Jinsong street.

Applicant after: CHANGCHUN HENGXIAO BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 130102 5 km long road, Xing Long Town, Changchun Economic Development Zone, Jilin

Applicant before: Changchun Hengchen Biological Technology Co., Ltd.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
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Application publication date: 20161214