CN105177152B

CN105177152B - 检测hla-b*51等位基因的方法和引物

Info

Publication number: CN105177152B
Application number: CN201510632634.3A
Authority: CN
Inventors: 李文静; 刘赵玲; 王淑; 王淑一
Original assignee: FUZHOU AIDIKANG MEDICAL INSPECTION CO LTD
Current assignee: Fuzhou Aidikang Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN105177152A

Abstract

本发明公开了检测HLA‑B*51等位基因的方法和引物，所述引物包括扩增覆盖HLA‑B*51等位基因序列的正、反向引物、内参引物和测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述测序引物可用于快速准确地检测HLA‑B*51等位基因，可应用于HLA‑B*51与白塞病相关性的研究中。

Description

检测HLA-B*51等位基因的方法和引物

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测HLA-B*51等位基因的引物和方法。

背景技术

白塞病(adamantiades-behcet’s disease ABD)又称贝赫切特病、口-眼-生殖器三联征等。是一种慢性全身性血管炎症性疾病，主要表现为复发性口腔溃疡、生殖器溃疡、眼炎及皮肤损害，也可累及血管、神经系统、消化道、关节、肺、肾、附睾等器官。其发病范围位于北纬30°～45°的欧亚地区，东起东亚如日本、朝鲜、中国，向西延伸至中亚如土耳其、伊朗直到地中海沿岸，与古代丝绸之路基本吻合，又称丝绸之路病。白塞病的好发年龄在16～40岁，大部分患者预后良好，眼、中枢神经系统及大血管受累者预后欠佳。尽管确切的病因仍不清楚，但认为遗传及免疫是其主要的内在因素，有研究表明超过60％的白塞病病人与HLA-B51有关。

早于1973年Ohnos就发现HLA-B5在ABD患者中比正常对照组出现的频率明显增高，1978年进一步证实为HLA-B51。通过大量样本统计研究证实，45％～60％的白塞病发病与HLA-B51呈高度正相关，但不确定是HLA-B51本身还是某个与其紧密连锁的基因造成白塞病的易感性。为了对ABD进行候选基因的研究，评估HLA-51在ABD中的分配，一个国际研究小组针对此进行了全基因组关联分析研究(GWAS)，研究包括了1215例ABD病人和1278例对照者，结果表明：HLA-B51基因型在病例组的发生率为59.1％，对照组仅为29.3％。在HLA-B区段中最显著的SNP(单核苷酸基因多态性)位于从HLA-B端粒到编码MHC I类链相关基因A(MICA)的着丝点区域，HLA-B51和位于从HLA-B到超过着丝粒62kb的MICA基因区域的多态基因位点之间存在强烈的连锁不平衡。HLA-B51比其他基因的SNP与疾病更为相关。大量研究证实，不同人种和该病明显相关的只有HLA-B51，但是HLA-B51不是唯一的致病因素，因为仍有约1/3的患者无此基因。随着对ABD发病机制研究的深入，3了解局部及系统免疫细胞的激活机制，了解不同临床亚型的发病机制，将有助于我们研制开发更为特异和更少毒性的免疫抑制剂。

目前常用的HLA等位基因分型的方法有PCR-SSO，PCR-SSP，PCR-SBT等，可分为低分辨和高分辨方法。但这些方法不能对HLA-B*51等位基因是否为阳性做出精准的判断。

发明内容

本发明的目的是检测患者是否HLA-B*51等位基因阳性，以辅助诊断白塞病，判断预后，并采用更直观有效的Sanger测序法。

本发明的目的在于提供用于检测HLA-B*51等位基因的引物，包括：扩增覆盖检测HLA-B*51等位基因的正、反向引物HLA-B*51-F和HLA-B*51-R，以及测序引物M13-F和M13-R；所述引物碱基序列为：

HLA-B*51-F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG

HLA-B*51-R：AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，还包括检测内参基因的引物actin-F和actin-R，所述检测内参基因的碱基序列为：

actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT

actin-R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG

进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：HLA-B*51-F:HLA-B*51-R＝1:1。

进一步地，所述内参基因的引物的使用浓度比为：actin-F:actin-R＝1:1。

本发明的另一个目的在于提供一种检测检测HLA-B*51等位基因的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)利用扩增引物HLA-B*51-F与HLA-B*51-R，actin-F与actin-R对(1)中的DNA进行扩增，当两对引物的扩增都有结果，需对样本进行测序检测；

(3)利用测序引物M13-F与M13-R对(2)中HLA-B*51-F与HLA-B*51-R所得的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与野生型HLA-B*51等位基因序列进行比较，确定基因序列是否完全相符；当比较结果与HLA-B*51等位基因序列完全相符，则可确定样本HLA-B*51等位基因阳性；当只有actin-F与actin-R这对引物扩增有结果，HLA-B*51-F与HLA-B*51-R的扩增无结果，则可确定样本HLA-B*51等位基因阴性；

其中所述引物碱基序列为：

HLA-B*51-F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG

HLA-B*51-R：AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA

actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT

actin–R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

本发明的目的还在于提供一种检测HLA-B*51等位基因的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括1对扩增引物HLA-B*51-F与HLA-B*51-R，1对内参引物actin-F与actin-R，测序体系包括1对测序引物M13-F与M13-R，包括：

HLA-B*51-F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG

HLA-B*51-R:AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA

actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT

actin–R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FX DNAPolymerase。

进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。

进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。

有益效果：利用本发明所述扩增引物和内参引物，当两对引物的扩增都有结果，该患者可能是HLA-B*51，HLA-B*5801、*5701等基因型，需测序检测，测序结果与HLA-B*51等位基因序列完全相符，则可确定样本HLA-B*51等位基因阳性。当只有actin-F与actin-R这对引物扩增有结果，HLA-B*51-F与HLA-B*51-R的扩增无结果，则可直接判定样本HLA-B*51等位基因阴性。

由于HLA-B基因属于经典HLA I类基因,目前发现的HLA-B等位基因已超过500个。HLA-B等位基因的多态性主要表现在第2、3和4外显子,其序列可分为高度多态性位点和相对保守位点。检测HLA-B*51基因型的扩增引物就设计在HLA-B*51等位基因高度多态性位点的第2和第3号外显子区域，以降低测序时套峰出现的可能性，降低了结果判读的难度。由于HLA-B*51只是HLA-B*5众多亚型中的一种，比对各个亚型的基因序列可以发现(比如文献报道中比较常见的HLA-B*5201、HLA-B*5401、HLA-B*5601、HLA-B*5701、HLA-B*5801等亚型)，各亚型间的基因序列差异并不明显，扩增引物虽然设计在有高度多态性位点区域，扩增引物还是会非特异性扩增出HLA-B*5801，HLA-B*5701等亚型，例如比对各亚型的第2号和第3号外显子基因序列发现，扩增引物还是会非特异性扩增出其他亚型，当患者体内同时具备其中两种或多种亚型时，测序时还会有套峰出现的可能性。因此采用Sanger测序进行最终的分型。但是如果直接用HLA-B*51的扩增引物进行测序(HLA-B*51-F与HLA-B*51-R)，由于测序本身的技术限制前几十bp会读不准，套峰的出现将更加大了读取的难度，前面的序列如果读取不准确将会影响后面几十bp序列的读取结果。本发明创新性的在PCR扩增的上游引物5’端和下游引物5’端分别加了一段长18bp的M13-F引物序列和长16bp的M13-R引物序列。这样扩增产物两端都会带上所引入的M13-F及M13-R引物序列，随后用M13-F和M13-R直接用M13-F和M13-R引物进行正反向测序。由于扩增产物两端带上了M13-F及M13-R引物序列，测序结果的前期读取不会受到套峰的影响，也使HLA-B*51基因序列的测序结果读取会更早的进入读取准确的阶段。

本发明采用Sanger测序法检测HLA-B*51等位基因序列，通过测序结果的分析，以确定患者是否是HLA-B*51等位基因阳性，节省了检测时间，结果容易判读，很大程度的节省了检测成本。具有很高的特异性、准确性、灵敏度、操作简单，并且当HLA-B*51-F与HLA-B*51-R没有扩增结果时，还可以有效排除样本本身的原因。

附图说明

图1样品1的检测结果图。

图2样品2的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测HLA-B*51等位基因的引物，包括：扩增覆盖检测HLA-B*51等位基因的正、反向引物(HLA-B*51-F和HLA-B*51-R)和扩增内参基因的正、反向引物(actin-F和actin-R)；所述扩增引物的碱基序列分别为：

HLA-B*51-F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG

HLA-B*51-R:AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA

actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT

actin-R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。

所述引物还包括测序引物(M13-F和M13-R)，所述测序引物碱基序列为：

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

在检测中，先利用所述扩增引物HLA-B*51-F与HLA-B*51-R，actin-F与actin-R对样本DNA进行扩增获得扩增产物，然后利用所述测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。

检测检测HLA-B*51等位基因的试剂盒，包括：样本组织DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中，

所述检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；检测目的基因用的正、反向引物HLA-B*51-F(10μm)与HLA-B*51-R(10μm)，检测内参基因用的正、反向引物actin-F(10μm)与actin-R(10μm)。

所述测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13-F(3.2μm)与M13-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

检测体系PCR反应液配制如下：

其中，HLA-B*51-F与HLA-B*51-R，actin-F与actin-R的碱基序列为：

HLA-B*51-F：TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG

HLA-B*51-R:AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA

actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT

actin–R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。

阳性对照品：含有HLA-B*51序列的溶液。

阴性对照品：无HLA-B*51序列的溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2

血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：

X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入3个检测体系PCR反应液中各2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

(5)sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与测序引物：M13-F(3.2μm)与M13-R(3.2μm)，按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:AJ002151)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取临床白塞病样本2份，检测该2份样本是否存在HLA-B*51等位基因。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。

样品1的部分正向测序结果如图1所示，与HLA-B*51的基因序列不完全相符，HLA-B*51等位基因阴性。

样品2的部分正向测序结果如图1所示，与HLA-B*51的基因序列不完全相符，HLA-B*51等位基因阴性。

从检测结果可以看出，本发明所述引物能够扩增出HLA-B*51等位基因，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩增出HLA-B*51等位基因，可以用于检测HLA-B*51等位基因。

Claims

1.检测HLA-B*51等位基因的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测HLA-B*51等位基因的正、反向引物HLA-B*51-F和HLA-B*51-R，以及测序引物M13-F和M13-R；所述引物碱基序列为：

HLA-B*51-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGCCCCGCTTCATTG；

HLA-B*51-R：AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA；

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13-R：AACAGCTATGACCATG。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括检测内参基因的引物actin-F和actin-R，所述检测内参基因的碱基序列为：

actin-F：CTAACTGCGCGTGCGTTCT；

actin-R：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG。

3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为：HLA-B*51-F:HLA-B*51-R＝1:1。

4.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述内参基因的引物的使用浓度比为：actin-F:actin-R＝1:1。