CN102209791A

CN102209791A - Hla基因型的检测

Info

Publication number: CN102209791A
Application number: CN2009801446905A
Authority: CN
Inventors: 郑淑恒; 关国良; 吴香玲
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK; Hospital Authority
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK; Hospital Authority
Priority date: 2008-11-12
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: CN102209791B; WO2010054589A1; HK1159696A1

Abstract

本发明公开了基于环介导等温扩增(LAMP)原理检测HLA基因型的快速遗传学方法，具体而言，公开了基于LAMP原理检测HLA-B*1502等位基因的方法和试剂盒。

Description

HLA基因型的检测

发明领域

本发明涉及基于环介导等温扩增(LAMP)原理检测HLA基因型的快速遗传学方法。具体而言，本发明涉及基于LAMP原理检测HLA-B*1502等位基因的方法或试剂盒。

发明背景

人白细胞抗原(HLA)是细胞表面分子，其精密地参与用于T细胞活化的加工过的抗原肽的呈递并在其中起重要作用。HLA由6号染色体短臂上的基因复合体所编码，其构成机体最重要的免疫遗传系统之一。HLA基因复合体不仅是多基因的而且是多等位基因的，所以在不同的个体中可以产生高度多样性的不同HLA蛋白。已经证实，该机制中的多态性与对免疫介导的/控制的疾病的易感性的个体变异有关并在药物诱发的副反应中起重要作用(1，2)。

根据以往，通过血清学检测进行HLA分型，这是非常不精确的。最新的技术是利用聚合酶链式反应(PCR)(3)和核苷酸测序(4)来破解DNA样品中HLA的基因型。尽管基于序列的分型(SBT)得到非常精确且高分辨能力的数据，但是这会花费大量人力成本和试剂成本，是临床应用甚至研究应用上无法解决的问题。通过序列特异性引物(SSP)-PCR进行的具体HLA基因型的检测可以需要较少的人力并且费用更低。然而，由于存在交叉反应，某些基因型不能被区分开。

数个近期研究报道了HLA等位基因和药物过敏的易感性之间的强遗传学关联。该遗传学关联可以是药物特异性的，例如与卡马西平特异性重度皮肤反应(Stevens Johnson综合症和中毒性表皮坏死松解)和其他形式的过敏相关的HLA-B*1502、与阿巴卡韦过敏相关的HLA-B*5701、与别嘌呤醇诱发的重度皮肤副反应相关的HLA-B*5801。

在大多数HLA遗传关联研究中，由于财政资源所限，不能获得统计学上足够的样品量。因此，很多研究缺乏统计学功效来检测和证实涉及低频率等位基因的关联。重要的是，尽管越来越多的证据已经揭示在开立某些药物之前进行HLA检测从而避免携带易感性HLA基因型(2，11)的患者中的副反应和潜在致命药物反应的重要性，但是获得HLA检测结果所需的高额费用和相对长的测试周转时间(TAT)(＞1天)是有效实施指导意见的主要障碍，即使是由美国食品药品管理局(FDA)所建议的指导意见(即，在对亚洲人开立卡马西平(CBZ)之前进行B*1502检测，以防止药物诱发的Stevens Johnson综合症/中毒性表皮坏死松解(SJS/TEN)(7))。因此，对于能以低费用进行的简单、精确且快速的HLA检测存在巨大需求。

HLA基因型分型是昂贵的测试，仅在专业中心中使用。其也具有长的测试周转时间(TAT)，通常需要多于1天的时间。用于指导药物处方开立的HLA状态的快速诊断还未被开发出并加以验证。

称为环介导等温扩增(LAMP)(5，6)的新的核酸扩增方法能在等温条件下高度特异型地、高效地且快速地扩增DNA。LAMP最显著的优势是在63-65℃之间的等温条件下扩增具体DNA序列的能力。该能力允许仅使用易于在医院实验室中使用的简单且合算的反应设备来实施所述方法。

LAMP已被开发用于检测重度急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)复制酶基因(24)、甲型肝炎病毒(HAV)基因组的非翻译区(25)、人甲型流感病毒DNA(26)等。然而，LAMP还未被开发用于人HLA基因型分型。

发明概述

鉴于上述，我们开发并验证了基于LAMP原理的HLA基因型分型的新的检测方法。

本文一方面公开了检测个体中HLA基因型的方法，包括

提供靶向于所述HLA基因型的不同的特定区的引物组A和B，例如靶向于所述基因型的两个外显子，其中组A和B都包括上游内部引物(FIP)、下游内部引物(BIP)、两种外部引物(上游引物和下游引物)以及一种或两种环状引物(环状上游引物和环状下游引物)；

制备反应混合物A和反应混合物B，所述反应混合物A包含引物组A、反应缓冲液、DNA聚合酶和从所述个体获得的全血或纯化的DNA模板，所述反应混合物B包含引物组B、反应缓冲液、DNA聚合酶和从所述个体获得的全血或纯化的DNA模板；

分别孵育反应混合物A和B，优选在63-65℃下孵育15-50分钟，以及

检测反应混合物中的产物，

其中反应混合物A和B中产物的存在表明个体具有所述HLA基因型。

本文另一方面公开了检测个体中与药物过敏的易感性相关的HLA基因型的方法，包括：

提供获自所述个体的血液样品或所述样品的纯化的DNA模板；

检测反应混合物中的产物，

其中反应混合物A和B中产物的存在表明所述个体具有药物过敏反应的增加的风险或经历药物过敏反应。

在本文公开的本发明的一些实施方案中，可以通过下述检测反应混合物中的产物：(i)肉眼检查由于作为反应副产物的焦磷酸镁的形成而在反应管中形成的浑浊，(ii)通过将诸如SYBR Green I的染色剂添加至反应混合物来检查颜色变化，所述SYBR Green I与反应中形成的双链DNA结合而发出荧光；(iii)通过将钙黄绿素和氯化锰添加至反应混合物来检查颜色变化，其中焦磷酸离子从钙黄绿素中去除锰离子，使得钙黄绿素可以与镁离子结合而发出绿色荧光，并肉眼检查颜色变化。

在本文公开的本发明的一个实施方案中，首先通过加热处理制备反应混合物中的血液样品。在另一个实施方案中，将全血用水以1∶10进行稀释并加热至＞95℃持续3-5分钟。

在本发明的一个实施方案中，将包含两种环状引物的反应混合物A在63℃孵育15-25分钟，所述环状引物例如引物组A中的上游环状引物和下游环状引物。在另一实施方案中，将包含一种或两种环状引物的反应混合物B在63℃孵育40-50分钟，所述环状引物例如引物组B中的上游环状引物和/或下游环状引物。

在本文公开的本发明的一些实施方案中，所述HLA基因型选自：与卡马西平特异性重度皮肤反应和其他形式的过敏相关的HLA-B*1502，与阿巴卡韦过敏相关的HLA-B*5701，与别嘌呤醇诱发的重度皮肤副反应相关的HLA-B*5801，与磺酰胺-SJS相关的HLA-A29、HLA-B12和HLA-DR7，与昔康(oxicam)-SJS相关的HLA-A2和HLA-B12，与甲醋唑胺-SJS相关的HLA-B59，与别嘌呤醇药疹相关的HLA-Aw33和HLA-B17/Bw58，与左旋咪唑粒细胞缺乏症相关的HLA-B27，与肼苯哒嗪SLE相关的HLA-DR4，与青霉胺毒性相关的HLA-DR3，与氯氮平粒细胞缺乏症相关的HLA-B38、HLA-DR4和HLA-DQw3，与安乃近粒细胞缺乏症相关的HLA-A24、HLA-B7和HLA-DQw1。优选地，所述HLA基因型选自：与卡马西平特异性重度皮肤反应和其他形式的过敏相关的HLA-B*1502、与阿巴卡韦过敏相关的HLA-B*5701和与别嘌呤醇诱发的重度皮肤副反应相关的HLA-B*5801，并且优选HLA-B*1502。

在本发明的一个实施方案中，所述HLA基因型是HLA-B*1502基因(GenBank登录号：L42145)，引物组A包括对应于HLA-B*1502外显子2序列的6个不同区(SEQ ID NO.9-14)的4种寡核苷酸(SEQ ID NO.1-4)和对应于SEQ ID NO.9和10之间或SEQ ID NO.13和14之间的序列的2种寡核苷酸(SEQ ID NO.21-22)；而引物组B包括对应于HLA-B*1502外显子3序列的6个不同区(SEQ ID NO.15-20)的4种寡核苷酸(SEQ ID NO.5-8)和对应于SEQ ID NO.15和16之间的序列的1种寡核苷酸(SEQ.ID NO.23)。

附图简要说明

图1显示用于检测HLA-B*1502的LAMP-HB引物。在LAMP-HB检测中使用的引物组A和B的序列显示在图1的表中。在引物组A中，SEQ ID NO：1-4和SEQ ID NO：21-22是引物，SEQ ID NO：9-14是引物结合位点。在引物组B中，SEQ ID NO：5-8和SEQ ID NO：23是引物，SEQ ID NO：15-20是引物结合位点。标出了B*1502序列外显子2和3中引物结合位点的位置。其他HLA-B等位基因序列的实例与B*1502进行比对，其中仅示出了不同于B*1502的错配核苷酸(用“-”表示匹配的核苷酸)。由于引物与其他HLA-B等位基因的交叉反应，因此需要2组引物来确认样品中存在B*1502等位基因。

图2显示通过LAMP-HB检测HLA-B*1502等位基因。图2中显示LAMP-HB的颜色。将Sybr Green I添加至反应混合物后对反应进行肉眼检查。绿色指示阳性反应，而橙色指示阴性反应。管A和B中的样品#1都显示为绿色，这表示HLA-B*1502等位基因的阳性状态，而管A和B中的样品#2仍为橙色，这表示B*1502等位基因为阴性状态。A：管A；B：管B；+：阳性反应；-：阴性反应。

发明的详细描述

定义

术语“等位基因”意图表示基因的备选形式，其编码相同的功能性蛋白但是相对于相同基因的另一形式具有核苷酸序列的差异。

本文所用的术语“基因型分型”意图表示确定人类个体等位基因模式或基因型的过程。

本文所用的术语“引物”是指通过在核酸分子的扩增或聚合期间与核苷酸单体的共价结合而被延伸的单链寡核苷酸。

本文所用的术语“模板”是指将被扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。就双链DNA分子而言，在对这些分子进行扩增、合成或测序之前，使双链DNA分子的链变性以形成第一链和第二链。与模板的一部分互补的引物在合适的条件下进行杂交，然后由聚合酶合成与模板或其一部分互补的分子。

本文所用的术语“扩增”是指使用DNA聚合酶、增加核苷酸序列拷贝数的任何体外方法。核酸扩增导致核苷酸被合并入DNA分子或引物，从而形成与DNA模板互补的新的DNA分子。形成的DNA分子和它的模板可被用作模板来合成其他的DNA分子。本文所用的一个扩增反应可以由多轮DNA复制组成。

本文所用的术语“寡核苷酸”是指包含共价连接的核苷酸序列的合成的或天然的分子，所述核苷酸是通过一个核苷酸的戊糖的3′位置与邻近核苷酸的戊糖的5′位置之间的磷酸二酯键连接的。

本文所用的药物“过敏反应”是指发生对药物分子或药物代谢物的免疫相似应答。

该应答通常的特征为多种症状并且与这类综合症的临床描述一致(Knowles et al.，Lancet.356：1587(2000)；Carr et al.，Lancet.356：1423，(2000))。该免疫反应享有Gell和Coombs系统中存在的类型的特征，但是未必是相同的(参见Sullivan TJ：Drug allergy(药物变态反应)，Middleton et al.(eds)：Allergy：Principle and Practice(变态反应：原理与实践)，第四版，St.Louis，Mosby，1993，p.1730)。

基于公开的HLA等位基因的基因组序列，我们开发了特异性靶向于HLA等位基因的两个不同区的环介导等温扩增(LAMP)检测。这些检测能在等温条件下、在1小时内检测纯化的DNA样品和加热处理的血液样品中的HLA基因型靶标。如下提供了引物、样品、反应条件、方法和结果说明。

引物设计

将用于LAMP检测的引物设计为靶向于HLA等位基因中的特定区，所述HLA等位基因选自：与卡马西平特异性相关的HLA-B*1502、与阿巴卡韦过敏相关的HLA-B*5701、与别嘌呤醇诱发的重度皮肤副反应相关的HLA-B*5801、与磺酰胺-SJS相关的HLA-A29、HLA-B12和HLA-DR7，与昔康(oxicam)-SJS相关的HLA-A2和HLA-B12，与甲醋唑胺-SJS相关的HLA-B59，与别嘌呤醇药疹相关的HLA-Aw33和HLA-B17/Bw58，与左旋咪唑粒细胞缺乏症相关的HLA-B27，与肼苯哒嗪SLE相关的HLA-DR4，与青霉胺毒性相关的HLA-DR3，与氯氮平粒细胞缺乏症相关的HLA-B38、HLA-DR4和HLA-DQw3，以及与安乃近粒细胞缺乏症相关的HLA-A24、HLA-B7和HLA-DQw1。例如，将引物设计为靶向于HLA-B*1502基因(GenBank登录号：L42145)的外显子2至外显子3。

首先，使用IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html)中的“序列比对工具(Sequence Alignment Tool)”将序列与其他HLA-B、HLA-DR和HLA-DQ等位基因序列进行比对，从而获得可用于检测的、不同于其他等位基因的HLA的特定区。然后使用Primer Explorer V4软件设计与这些区特异性结合的候选引物(Eiken Genome，Japan，http://primerexplorer.jp/e/)。对于LAMP反应中200个碱基对的区内的最佳扩增，与其他HLA-B、HLA-DR和HLA-DQ等位基因的交叉反应是不可避免的。因此，为了增加说明的特异性，设计2组引物，使得两组都能扩增待检测的HLA基因型序列而不扩增其他等位基因。两组引物(组A和组B)被用于LAMP检测，每一组包括上游内部引物(FIP)、下游内部引物(BIP)、两种外部引物(F3和B3)以及一种或两种环状引物(LF和LB)。

作为示例性实例，为了检测HLA-B*1502等位基因，将用于LAMP检测的引物设计为靶向于HLA-B*1502基因(GenBank登录号：L42145)的外显子2至外显子3区。首先，使用IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html)中的“序列比对工具(Sequence Alignment Tool)”将HLA-B*1502序列与其他HLA-B等位基因序列进行比对，从而获得不同于其他等位基因的B*1502的特定区。然后使用Primer Explorer V4软件设计与这些区特异性结合的候选引物(Eiken Genome，Japan，http://primerexplorer.jp/e/)。对于LAMP反应中200个碱基对的区内的最佳扩增，与其他HLA-B等位基因的交叉反应是不可避免的。因此，为了增加说明的特异性，设计2组引物，使得两组都能扩增B*1502序列而不扩增其他等位基因。

图1的内容中示意性地描述了用于LAMP反应的定向于HLA-B*1502等位基因的引物。上游内部引物(FIP)包含F2和F1c的互补序列，下游内部引物(BIP)包含B2和B1c的互补序列，其中如图1所示界定模板序列上的每个序列(F1、F2、B1c和B2c)。两种外部引物(上游引物和下游引物)是F3和B3。环状引物包含环状上游引物LF和环状下游引物LB。在诸如Notomi et al.(5)的一些参考文献中，在内部引物(FIP或BIP)中的F1c或B1c和F2或B2之间插入数个胸苷的间隔物，使得在FIP和BIP中分别插入一个和两个胸苷间隔物。然而，本研究中没有使用间隔物，因为LAMP反应可以在使用没有间隔物的内部引物的情况下进行。

可以化学合成这些寡核苷酸或引物(例如，固相亚磷酰胺三酯法)，然后进行纯化(例如，脱盐或HPLC)。

样品

可以从人类个体的任何来源获取适于利用本技术进行分析的样品。优选的样品是外周血(对加热处理而言)或含有所述个体基因组DNA的样品(对DNA提取而言)。通过用水稀释血液(例如，1/10稀释)并在＞95℃的温度下处理3-5分钟来进行血液的加热处理；而可以通过本领域内公知的方法进行DNA提取，例如，酚/氯仿提取和乙醇沉淀。

反应

使用本文公开的反应混合物或按照Notomi et al(2000，2008)进行LAMP反应。例如，反应混合物可含有12.5μl 2×反应缓冲液、40pmol每种FIP和BIP、20pmol用于加速反应的环状引物(LF或LF和LB中的每一种)、5pmol每种F3和B3、2μl加热处理过的血液或DNA模板以及1μl 8U Bst DNA聚合酶。然后将反应混合物于60-65℃孵育30-60分钟。

结果说明

通过以下检测LAMP产物：(i)肉眼检查由于作为反应副产物的焦磷酸镁的形成而在反应管中形成的浑浊，(ii)通过将SYBR Green I添加至反应混合物来在日光下检查从橙至绿的颜色变化(或在UV光下检查绿色荧光的存在)，SYBR Green I与反应中形成的双链DNA结合而发出绿色荧光；(iii)通过将钙黄绿素和氯化锰添加至反应混合物来在日光下检查从橙至绿的颜色变化(或在UV光下检查绿色荧光的存在)，其中焦磷酸离子从钙黄绿素中去除锰离子，使得钙黄绿素可以与镁离子结合而发出绿色荧光。对于结果评分，只有当管A和管B中都存在白色沉淀物或绿色时认为是HLA-B*1502等位基因阳性，因为由于与其他HLA等位基因的交叉反应，在任何一个管中可能产生阳性信号。

在应用角度上与已有的或以前的产品的比较

通过常规HLA-分型技术可以进行诸如HLA-B*1502的HLA基因型的检测，例如，通过序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)、序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)和基于序列的分型(SBT)。这些方法需要昂贵的设备(例如，热循环仪、测序仪)和专业技能，并且实验过程耗时而繁琐，需要不止一天。此外，高度纯化的并且完整的DNA是这些方法所必需的，因为他们都是基于PCR的技术。

而LAMP技术不需要先进设备，因为全部扩增过程发生在等温条件下。纯化的DNA模板不是必需的，使得可以省去DNA提取所需的费用和时间。此外，全部扩增过程可以在1小时内完成，并且几乎可以立即看到结果，而不需要通过其他技术(例如，对于SSP-PCR需要凝胶电泳、对于SSOP需要酶反应、对于SBT需要序列分析)检测反应产物。

市场潜力(预期客户、用途等)

由于卡马西平在大多数国家是处方药，因此目标使用者群体将是治疗这些疾病的患者的医师。由于这些疾病是常见的，所以专业医师和初级护理医生都将是使用者。在大多数医疗护理情况中，负责癫痫患者的专业医师包括神经科医师(成人和儿科)、普通医师、普通儿科医师、神经外科医师、老年病学医师以及精神病医师。

治疗神经性疼痛的专业医师包括疼痛专业医师、神经科医师、糖尿病医师、神经外科医师以及矫形外科医师。通常由精神病医师负责双相情感障碍患者。

以下实施例意图说明本发明的实施方案，并且不应被解释为对本发明范围的限制。

实施例

材料和方法：

研究设计和样品

为了研究通过新的检测方法、使用B*1502作为实例来检测具体HLA基因型的可行性和准确性，在研究的第一阶段，匿名招募了健康血液供体，获取50份DNA样品(B*1502阳性25份和B*1502阴性25份)和200份冷冻血液样品(B*1502阳性30份和B*1502阴性170份)。在之前的HLA遗传关联研究中通过作为对照的高分辨力SBT对所有这250份样品进行分型并因此已知这些样品的HLA-B基因型。按照IHWG技术手册(8)进行SBT，并使用SBT工具(Genome Diagnostics，the Netherlands)分析得到的序列。通过新的LAMP方法直接检测DNA样品的B*1502的携带者状态，在进行加热处理而不进行DNA提取之后，检测冷冻血液样品。为了进一步验证该新检测方法在临床环境中的应用，在本研究的第二阶段中，从常规血液科实验室随机匿名获取200份患者的新鲜血液样品。通过对于加热过的血液的新的基于LAMP的方法(LAMP-HB)和之前描述的SSP-PCR(9)，对所有这200份样品的B*1502携带者状态前瞻性地并同时进行分型。将新检测方法获得的结果与标准SBT或SSP-PCR的数据进行比较，用于评估灵敏性和特异性的准确性。在研究的第二阶段中，还计算了平均检测TAT和TAT₉₀(90％的样品中)。

LAMP-HB(对加热过的血液的环介导等温扩增)

引物设计

将用于LAMP检测的引物设计为靶向于HLA-B*1502基因(GenBank登录号：L42145)的外显子2至外显子3。首先，使用IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html)中的“序列比对工具(Sequence Alignment Tool)”将该序列与其他HLA-B等位基因序列进行比对，从而获得不同于其他等位基因的B*1502的特定区。然后使用Primer Explorer V4软件设计与这些区特异性结合的候选引物(Eiken Genome，Japan，http://primerexplorer.jp/e/)。对于LAMP反应中200个碱基对的区内的最佳扩增，与其他HLA-B等位基因的交叉反应是不可避免的。因此，为了增加说明的特异性，设计2组引物，使得两组都能扩增B*1502序列而不扩增其他等位基因。将包括一种或两种环状引物(LF和LB)的两组引物(管A和管B)用于LAMP检测。两组引物(组A和组B)的每一组都由SEQ ID NO.1-8所示的识别HLA-B*1502序列6个不同区(SEQ ID NO.9-20)的4种寡核苷酸(上游内部引物(FIP)、下游内部引物(BIP)、两种外部引物(F3和B3))和与检测期间所形成的单链环状区互补的、用于加速LAMP反应的1-2种寡核苷酸(环状引物，SEQ ID NO.21-23)组成。

图1列出了本研究中使用的引物，并将其他HLA-B等位基因的实例与B*1502序列进行比对，以说明引物的特异性。大多数发生交叉反应的等位基因是极其罕见的等位基因，仅对特异性产生极少影响(10)。在引物组的交叉反应性中，亚洲人群中所报道的罕见等位基因如下：

组A：1515、1531，

组B：1503、1506、1513、1518、1521、1525；

亚洲人群中未被报道的罕见等位基因如下：

组A：1555，

组B：1516、1523、1529、1536、1539、1540、1567；以及

世界人群中没有报道过等位基因频率的几乎不存在的等位基因如下：

组A：1588、9512、9521、9544

组B：1544、1561、1562、1564、1569、1574、1580、1589、1593、1595、1598、4608、9503、9506、9508、9512、9515、9519、9521、9527、9532、9538、9539。

因此，引物组的交叉反应性如下：

组A-B*1502、1515、1531、1555、1588、9512、9521和9544；

组B-B*1502、B*1503、B*1506、B*1513、B*1516、B*1518、B*1521、B*1523、B*1525、B*1529、B*1536、B*1539、B*1540、B*1544、B*1561、B*1562、B*1564、B*1567、B*1569、B*1574、B*1580、B*1589、B*1593、B*1595、B*1598、B*4608、B*9503、B*9506、B*9508、B*9512、B*9515、B*9519、B*9521、B*9527、B*9532、B*9538和B*9539。

尽管B*1502、9512和9521会与两个引物组都发生反应，但是B*9512和9521是仅在于少数个体的非常罕见的等位基因。

LAMP反应

首先通过加热处理制备用于LAMP反应的血液样品。用水将收集在EDTA瓶中的10μl全血以1∶10进行稀释并在98℃加热3分钟。按照Notomi et al(5，6)，使用反应混合物进行LAMP反应。简单而言，管A中的反应混合物A含有12.5μl 2×反应缓冲液、FIP和BIP(SEQ ID NO.3-4)每种40pmol、20pmol用于加速反应的环状引物(LF和LB中的每种，SEQ ID NO.21-22)、HLA-B*1502外显子2序列的F3和B3(SEQ ID NO.1-2)每种5pmol、2μl加热处理过的血液或纯化的DNA模板以及1μl 8U Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)；管B中的反应混合物B含有12.5μl 2×反应缓冲液、FIP和BIP(SEQ ID NO.7-8)每种40pmol、20pmol用于加速反应的环状引物(LF，SEQ ID NO.23)、HLA-B*1502外显子3序列的F3和B3(SEQ ID NO.5-6)每种5pmol、2μl加热处理过的血液或纯化的DNA模板以及1μl 8U Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)。

对于管A，将反应混合物于63℃孵育15-25分钟；对于管B，将反应混合物于63℃孵育40-50分钟。

LAMP结果说明

通过向反应混合物添加1μl 1∶10稀释的Sybr Green I(Invitrogen，Calsbad，CA)来检测反应混合物中的LAMP产物，并肉眼检查颜色变化。绿色指示阳性反应，橙色指示阴性反应。对于质量控制，与每批样品一同检测B*1502阳性对照血液样品(杂合子)和阴性对照样品(B*1502阴性DNA)。当2个反应管(A和B)都变为绿色时，认为该测试样品是B*1502阳性的，而当1管或2管是橙色时，认为它是非B*1502。

结果

I期研究：

来自利用LAMP的所有50份DNA样品(B*1502阳性25份和B*1502阴性25份)的结果与通过之前SBT所获得的结果完全一致。在200份冷冻血液样品(B*1502阳性30份和B*1502阴性170份)中，LAMP-HB和之前SBT的结果之间也观察到了完全一致性。在所有165个B*1502检测阴性的样品中，166个样品在管A和管B中都为阴性反应。然而，在管A的1个样品(1/170)和管B的3个其它样品(3/170)中发现了由绿色指示的阳性反应，这提示了存在预期的交叉反应并突出了使用2组特异性引物以增强特异性的必要。因此，在本研究中没有观察到由于两管中的交叉阳性反应而产生的假阳性检测。SBT数据检查发现：表现为管A中交叉阳性反应的样品实际上是B*1515携带者，且表现为管B中交叉阳性反应的样品实际上是B*1525携带者。

II期研究：

在前瞻性随机招募的200份新鲜血液样品中，LAMP-HB指示的B*1502状态与通过同时进行的SSP-PCR所获得的结果相同。通过两种方法都发现35个样品中B*1502为阳性并且165个样品中B*1502为阴性。200份新鲜血液样品的平均TAT是33.1+10.8分钟，TAT₉₀是45分钟。

综上，我们的发现表明：通过新的基于LAMP的HLA检测在DNA、冷冻血液样品或新鲜血液样品中获得的结果与通过SBT或SSP-PCR获得的结果100％一致，这证实了具体HLA基因型的LAMP-HB检测是准确的方法，至少对B*1502是准确的。通过基于LAMP的方法所获得的实验结果的质量在血液或DNA样品之间以及新鲜血液样品或冷冻血液样品之间没有重要差异。未遇到假阳性或假阴性结果。通过清晰的颜色改变可以容易地观察到所有的阳性或阴性反应。未发现具有无法确定的状态的样品。由于在LAMP之前通过对血液样品进行加热处理而无需进行DNA提取，因此TAT和费用都降低了。可以在1小时内快速获得所有结果。

讨论

在后基因组研究时代，已经证实大多数人类疾病都有病原学或发病机制的遗传关联。遗传检测在日常临床实践中变得越来越重要，其正逐步变为个性化治疗。然而，为了准确性，需要确保质量的先进系统和专业技能，受以上两点的限制，遗传检测在普遍应用中仍是相当受限的，在大多数临床机构中仅局限于少数专业中心。因此，由于转交和长时间的分析过程的延误，可能不能及时提供检测结果来便于进行最好的临床管理。对于HLA检测尤其如此。尽管特定HLA基因型的检测在指导疾病风险和药物处方开立中提供有价值的信息(2，11)，但是所需的高额花费和专业技能以及长时间的检测TAT是其有效应用的主要屏障。

药物诱发的过敏是常见的临床问题。诸如用于治疗高尿酸血症的别嘌呤醇、用于治疗HIV感染的阿巴卡韦和用于治疗癫痫的卡马西平(CBZ)的有用的药物都与严重药物反应有关(2，11)。最近的研究已经揭示分别在HLA-B*5801和B*5701携带者中产生别嘌呤醇诱发的重度皮肤反应和阿巴卡韦过敏的显著较高的风险(12，13)。因此，可以将这些HLA等位基因作为特异性遗传风险标志物来鉴定易感个体。我们和其它研究人员明确证实了非常重要的实例：包括香港中国人在内的亚洲人中的常见的等位基因(14)HLA-B*1502的携带者在发生潜在致命性的CBZ诱发的Stevens Johnso综合症/中毒性表皮坏死松解(C-SJS/TEN)中具有显著增高的风险(9，15，16)。SJS/TEN是严重的副反应，其特征为快速发展的疱状斑疹和靶样病变并伴随具有潜在致命后果的广泛且严重的粘膜脱离(17，18)。发病率显著，并且据报道死亡率是病例数的10-30％(19)。由台湾研究所报道的对于C-SJS/TEN的B*1502携带者状态的高阳性(93.6％)和阴性(100％)预测值确认了B*1502的值可以作为C-SJS/TEN的良好预测遗传表标志物(15)。由于CBZ是用于癫痫的一线药物，因此，US FDA在2007年12月发出警告，建议在祖先来自存在HLA-B*1502等位基因的地区的患者中检测HLA-B*1502，并且如果发现患者具有该等位基因，则避免用该药(7)。

然而，该建议在临床执行上具有难度，主要有以下三方面原因。第一，检测HLA-B*1502的现有技术(SSP-PCR)依赖于对从患者血液提取的DNA进行多重PCR。需要昂贵的设备和实验室中超过一天的实验过程。该方法昂贵并且仅能在专业中心进行。获得检测结果所造成的延误导致启用CBZ的延误，并因此导致控制疾病的延误。对于住院患者而言，这可能意味着延迟出院，并因此意味着更高的医疗护理费用。第二，可以用CBZ治疗的癫痫、神经性疼痛或双相型障碍患者通常在门诊就诊。通常的临床实践是医疗咨询之后为患者提供处方。要求患者等待检测结果并于数天以后再返回获得处方是不切实际的。第三，检测HLA-B*1502与亚洲患者关系最密切，但是很多亚洲国家医疗资源贫乏，并且这些国家无法负担常规SSP-PCR检测(表1)。

为了克服这些实际的障碍，有必要开发更快速且更合算的、理想情况下可以在诊所使用的检测。所开发的检测在HLA-B*1502常见的亚洲人群中具有巨大的市场。它将应用于癫痫、神经性疼痛或双相型障碍患者。同时，这些疾病估计占一般人群的约10％(20，22)。

在该前景下，我们开发HLA检测的备选方法并发现了最具吸引力的候选者LAMP检测。LAMP检测是开发用于基于核酸等温扩增原理来检测特定基因的非常新但简单的技术。专门设计靶基因区上识别6个不同区的4个高度特异性的引物，一组引物在同一链上相继与靶DNA退火，并且稍后退火的引物通过Bst DNA聚合酶的链置换活性而置换之前引物所形成的链。在两条链中都发生该反应，并将引物设计为使得在等温条件下形成环，从而产生一系列具有不同长度的茎-环DNA。在扩增的同时，形成来自焦磷酸镁的白色沉淀物，该沉淀物允许简单通过肉眼检查来评价浑浊(5，6)。为了确保高度特异性，设计两组特异性引物，使每组都识别靶基因上的6个特定区。因此，与SSP-PCR方法相比，大大降低了交叉反应的机会，在SSP-PCR方法的每个PCR反应中仅靶向于单一区。对于该新的检测方法，预计可将其应用于所有具体HLA基因型的检测。

从仅在近些年中LAMP主要在微生物学和食品卫生产业领域中的应用来看，其在遗传检测中提供了良好前景(6)。LAMP不需要诸如热循环仪的任何先进设备。由于在等温条件下发生反应，因此仅需要水浴或加热块。此外，由于反应提供高扩增效率，因此可在1小时内看到结果，其中阳性管中DNA在15-60分钟内扩增10⁹-10¹⁰倍。通过在单一反应中结合核酸扩增与阳性终点检测，LAMP提供高灵敏性和特异性的快速诊断。这使其成为最适于在临床或诊所内进行遗传检测。

为了改进对结果的视觉评分，我们在实验结束时将Sybr Green I添加至反应管。Sybr Green I是不对称的青色素染料，其与双链DNA结合而发出绿光。其在可见光下为橙色，并在双链DNA的量显著增加的情况下变成绿色。因此，绿色明确地指示为阳性反应，橙色明确地指示为阴性反应(图2)。为了增加实验室外应用的操作简易性并进一步降低费用和TAT，我们还研究并证实了将加热处理过的血液样品直接应用于LAMP反应混合物而未用现行常规的DNA提取的可行性。

在本研究中，我们首先利用之前通过SBT分型而已知B*1502携带者状态的DNA和冷冻血液样品，对将LAMP-HB用于快速并准确的B*1502检测进行了开发、优化和确认。为了证实该检测可应用于快速诊断，我们继续前瞻性地匿名招募患者的新鲜血液样品，用于LAMP-HB和SSP-PCR的平行HLA检测。同样，通过LAMP-HB确定的B*1502状态与通过SSP-PCR所确定的完全一致，表明LAMP-HB可以替代SSP-PCR用于临床应用。此外，与SSP-PCR(TAT＝1-2天)相比，LAMP-HB的TAT(从收到样品至报告结果)大大缩短(平均TAT＝33.1±10.8分钟，TAT₉₀＝45分钟)。为了进一步证明该检测是简单且容易遵照进行的，我们还准备了非专业人员使用的简单操作手册。邀请不具备遗传检测经验的事先不知情的年轻研究助理阅读并遵照说明对20份新鲜血液样品进行LAMB-HB检测。报告的所有20个结果都准确地鉴定了B*1502携带者状态。这些发现已经证实了LAMP-HB可以合算地应用于临床环境中，大多数目标患者都处于临床环境中接受治疗。重要的是，不同于PCR，LAMP不需要多步骤温度控制。因此，我们的方法具有被开发为用于诊所的“试剂盒”的潜力。这将大大增强在各种实践环境中工作的医生的可接受性，包括亚洲某些地区的不发达机构。

该新的检测方法有效地帮助克服有效执行FDA指导中的障碍。通过避免诸如SJS/TEN的药物诱发的严重皮肤反应，将显著增强患者的安全性和治疗质量。而这些方面的意义是巨大并且难以量化的，细致的费用效益分析强调在不同临床环境中对医疗保健和社会资源配置的显著影响(表)。更便宜的检测、更快的结果、更短的住院期、更早的疾病控制以及没有更多的C-SJS/TEN的治疗需要将节约巨大的费用(表1)(15，23)。

尽管在本研究中没有发现B*1502的假阳性检测，但据估计，在携带B*1515和B*1525组合的极其罕见的个体中(2×1/340×3/340＝0.005％)，可以检测到B*1502的假阳性。临床意义是：如果所述极其罕见的个体患有可用CBZ进行治疗的癫痫或其他疾病，当通过该新的LAMP方法进行检测时，将被禁止给予该药物。从而可以使用具有最小临床后果的备选药物。实际上，估计的假阳性率为0.005％(香港)至0.058％(中国北方)，数值是基于在包括台湾、香港、新加坡和中国的地区中与管A和B管中的B*1502发生交叉反应的罕见等位基因的所报道的等位基因频率计算出来的(10)。尽管列出了很多发生交叉反应的等位基因，尤其是对于管B，但是这些等位基因都是罕见等位基因，它们在大多数人群中几乎是不存在的并且在我们的目标地区内没有频率数字的报道。总之，在我们的研究中该新的LAMP-HB HLA检测达到了100％的灵敏性和特异性。然而，预测的特异性可能是＜100％但＞99.9％。

更重要的是，我们对B*1502的研究可以作为对HLA基因型分型方法中的模型。提供简单且廉价的HLA检测还意味着在HLA关联研究中，尤其在罕见目标HLA等位基因的验证研究中，可实现统计学上有力的大样品量。在本研究中所证实的本方法的成功无疑使HLA检测在临床和研究领域发生革命性变化。

将本说明书中提及的所有专利和出版物通过引用整体并入本文。

可以在不脱离本发明的范围的情况下，对本文描述的实施方案进行多种修改和变化，这对本领域技术人员是显而易见的。本领域技术人员想到的变化和其他应用都包括在本发明的实质内并由附加权利要求书的范围所界定。

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Claims

1.检测个体中HLA基因型的方法，包括：

提供靶向于所述HLA基因型的不同的特定区的引物组A和B，例如靶向于所述基因型的两个外显子，其中组A和B都包含上游内部引物(FIP)、下游内部引物(BIP)、两种外部引物(上游引物和下游引物)以及一种或两种环状引物(环状上游引物和环状下游引物)；

分别孵育反应混合物A和B，以及

检测反应混合物中的产物，

其中反应混合物A和B中产物的存在表明所述个体具有所述HLA基因型。

2.检测个体中与药物过敏易感性相关的HLA基因型的方法，包括：

提供获自所述个体的血液样品或所述样品的纯化的DNA模板；

分别孵育反应混合物A和B，以及

检测反应混合物中的产物，

3.如权利要求1或2所述的方法，其中首先通过加热处理制备反应混合物中的全血样品。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中用水以1∶10稀释全血并将其在98℃加热3分钟。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含两种环状引物的反应混合物A在约63-65℃孵育15-25分钟，所述两种环状引物例如上游环状引物和下游环状引物。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含一种或两种环状引物的反应混合物B在约63-65℃孵育40-50分钟，所述一种或两种环状引物例如上游环状引物和/或下游环状引物。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中反应混合物中产物的检测包括：(i)肉眼检查由于作为反应副产物的焦磷酸镁的形成而在反应管中形成的浑浊，(ii)通过将诸如SYBR Green I的染色剂添加至反应混合物来检查颜色变化，所述SYBR Green I与反应中形成的双链DNA结合而发出荧光；或(iii)通过将钙黄绿素和氯化锰添加至反应混合物来检查颜色变化，其中焦磷酸离子从钙黄绿素中去除锰离子，使得钙黄绿素可以与镁离子结合而发出绿色荧光，并肉眼检查颜色变化。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述HLA基因型选自：与卡马西平特异性重度皮肤反应和其他形式的过敏相关的HLA-B*1502，与阿巴卡韦过敏相关的HLA-B*5701，与别嘌呤醇诱发的重度皮肤副反应相关的HLA-B*5801，与磺酰胺-SJS相关的HLA-A29、HLA-B12和HLA-DR7，与昔康-SJS相关的HLA-A2和HLA-B12，与甲醋唑胺-SJS相关的HLA-B59，与别嘌呤醇药疹相关的HLA-Aw33和HLA-B17/Bw58，与左旋咪唑粒细胞缺乏症相关的HLA-B27，与肼苯哒嗪SLE相关的HLA-DR4，与青霉胺毒性相关的HLA-DR3，与氯氮平粒细胞缺乏症相关的HLA-B38、HLA-DR4和HLA-DQw3，与安乃近粒细胞缺乏症相关的HLA-A24、HLA-B7和HLA-DQw1。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述HLA基因型是HLA-B*1502基因(GenBank登录号：L42145)。

10.如权利要求9所述的方法，其中引物组A包括对应于HLA-B*1502外显子2序列的6个不同区(SEQ ID NO.9-14)的4种寡核苷酸(SEQ ID NO.1-4)和对应于HLA-B*1502外显子2序列的SEQ ID NO.9和10之间或SEQ ID NO.13和14之间的序列的2种寡核苷酸(SEQ ID NO.21-22)。

11.如权利要求9所述的方法，其中引物组B包括对应于HLA-B*1502外显子3序列的6个不同区(SEQ ID NO.15-20)的4种寡核苷酸(SEQ ID NO.5-8)和对应于HLA-B*1502外显子3序列的SEQ ID NO.15和16之间的序列的1种寡核苷酸(SEQ.ID NO.23)。

12.用于检测个体中HLA基因型的试剂盒，包括：

靶向于所述HLA基因型的不同的特定区的引物组A和B，例如靶向于所述基因型的两个外显子，其中组A和B都包括上游内部引物(FIP)、下游内部引物(BIP)、两种外部引物(上游引物和下游引物)以及一种或两种环状引物(环状上游引物和环状下游引物)；

反应缓冲液，

DNA聚合酶，以及

任选地包括作为阳性对照的全血或纯化的DNA模板。

13.用于检测个体中与药物过敏易感性相关的HLA基因型的试剂盒，包括：

反应缓冲液，

DNA聚合酶，以及

任选地包括作为阳性对照的全血或纯化的DNA模板。

14.如权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述引物组A包括两种环状引物，例如上游环状引物和下游环状引物。

15.如权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述引物组B包括一种或两种环状引物，例如上游环状引物和/或下游环状引物。

16.如权利要求12或13所述的试剂盒，还包括诸如SYBR Green I的染色剂或钙黄绿素和氯化锰，所述SYBR Green I与反应中形成的双链DNA结合而发出荧光。

17.如权利要求12-16中的任一项所述的试剂盒，其中所述HLA基因型选自：与卡马西平特异性重度皮肤反应和其他形式的过敏相关的HLA-B*1502，与阿巴卡韦过敏相关的HLA-B*5701，与别嘌呤醇诱发的重度皮肤副反应相关的HLA-B*5801，与磺酰胺-SJS相关的HLA-A29、HLA-B12和HLA-DR7，与昔康-SJS相关的HLA-A2和HLA-B12，与甲醋唑胺-SJS相关的HLA-B59，与别嘌呤醇药疹相关的HLA-Aw33和HLA-B17/Bw58，与左旋咪唑粒细胞缺乏症相关的HLA-B27，与肼苯哒嗪SLE相关的HLA-DR4，与青霉胺毒性相关的HLA-DR3，与氯氮平粒细胞缺乏症相关的HLA-B38、HLA-DR4和HLA-DQw3，与安乃近粒细胞缺乏症相关的HLA-A24、HLA-B7和HLA-DQw1。

18.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述HLA基因型是HLA-B*1502基因(GenBank登录号：L42145)。

19.如权利要求9所述的试剂盒，其中引物组A包括对应于HLA-B*1502外显子2序列的6个不同区(SEQ ID NO.9-14)的4种寡核苷酸(SEQ ID NO.1-4)和对应于SEQ ID NO.9和10之间或SEQ ID NO.13和14之间的序列的2种寡核苷酸(SEQ ID NO.21-22)。

20.如权利要求9所述的试剂盒，其中引物组B包括对应于HLA-B*1502外显子3序列的6个不同区(SEQ ID NO.15-20)的4种寡核苷酸(SEQ ID NO.5-8)和对应于SEQ ID NO.15和16之间的序列的1种寡核苷酸(SEQ.ID NO.23)。