CN105296615A - 一种hla-b*1502检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种HLA-B*1502检测试剂盒，属于卡马西平用药检测技术领域。本发明采用Allele-Specific？LAMP技术，针对rs10484555的C等位基因设计了特异引物，利用rs10484555的C等位基因与HLA-B*1502的关联性判断患者是否携带HLA-B*1502等位基因，从而指导卡马西平个体化用药，避免直接测试HLA-B*1502带来的问题。本发明提供的试剂盒成本低廉、检测时间短、准确性高，易于推广。

Description

一种HLA-B*1502检测试剂盒
技术领域
本发明涉及卡马西平个体化用药检测技术领域，尤其涉及一种HLA-B*1502检测试剂盒。
背景技术
卡马西平是常见的抗精神性药物，临床上主要用于抗癫痫，也可用于三叉神经痛等。在某些个体当中，卡马西平会导致史蒂文斯-约翰逊综合征(StevensJohnsonsyndrome，SJS)和中毒性表皮坏死溶解症(toxicepidermalnecrolysis，TEN)，这是一种严重的皮肤和粘膜反应，可导致永久性残疾甚至致命。在白种人中，由卡马西平引起的SJS/TEN的几率很低，只有万分之一到万分之三，然而，在一些亚洲国家，包括南亚的印度人，患者服用卡马西平而导致的SJS/TEN较白种人高出10倍左右。
现已证实，SJS/TEN风险的增加与HLA-B*1502有关，并且这种关联性与个体中HLA-B*1502纯合还是杂合无关，HLA-B*1502等位基因几乎仅存在于有亚裔血统的人群中。美国食品药品监督管理局(FDA)建议，在开始使用卡马西平治疗之前，应对患者进行HLA-B*1502等位基因检测，如经检测结果呈阳性，则不宜使用卡马西平，除非药品的预期收益明显大于严重皮肤反应风险的增加。
中国食品药品监督管理局(CFDA)在2015年发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中明确指出，“携带HLA-B*1502等位基因者慎用卡马西平和苯妥英”。
目前对HLA-B*1502的检测主要有直接测序法(PCR-SBT)、PCR-SSP法以及荧光定量法。直接测序法优点是直观，可直接获取待检者的具体HLA类型，但是操作繁琐，所需试剂和设备均被国外企业垄断，价格不菲，并且由于需要经常性的开管，很容易造成样本之间的交叉污染，因此不适宜大规模推广；PCR-SSP法成本较低，操作简单，可准确得鉴定待测样本是否含有HLA-B*1502等位基因，然而它最终也需要开管检测，进而增加样本间污染的可能性，因此也不是检测大量样本的最理想方法；荧光定量法有很高的灵敏度，可快速准确得进行分型，但需要比较昂贵的设备和探针。因此，探讨检测HLA-B*1502的新方向、新方法、新技术很有必要。
研究发现，在HLA-B基因座附近存在与某些亚型高度连锁的SNP，即“标签SNP”，HLA-B*1502的标签SNP是rs10484555的C等位基因，二者的特异性可达99.27％。因此，通过检测标签SNP来检测样本的HLA-B的基因型是一种新的研究方向。
环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技术是日本科学家于2000年开发出来的一种恒温扩增技术，针对靶基因的六个区域设计四条特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下恒温扩增，可在十几分钟到一小时之内产生109-1010数量级的产物，反应结束后通过肉眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无需开管，因此大大简化了操作步骤，同时又可以有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水浴锅即可开展检测，又节约了大量的检测成本。因此，采用LAMP方法检测HLA-B*1502的基因型是一种新型且适于大规模使用的方法。
发明内容
本发明要解决的问题是现有的HLA-B*1502检测方法不理想，不适于大规模推广使用。
为解决上述问题，本发明在LAMP的基础上采用等位基因特异性环介导等温扩增(Allele-SpecificLAMP)技术，针对HLA-B*1502的标签SNP进行检测，提供了一种适于推广使用的试剂盒及检测方法。
本发明的第一个目的在于提供一种HLA-B*1502检测引物，用于检测rs10484555的C等位基因，包括以下引物：
5′-AAATTGTTAAAGGTACTTGGAAAG-3′(SEQIDNo.1，以下简称F3)
5′-CATCTAAAGTATACAATTCAATGGTT-3′(SEQIDNo.2，以下简称B3)
5′-GCCATGAAGTAAATCCATAAATTTTGAGTTTGTGCCTGTCAAGCTAGGA-3′(SEQIDNo.3，以下简称FIP)
5′-AGAGAGACATATTATAAAGCCGTGGATCATATTCAGAGTTTTAAATCTGCA-3′(SEQIDNo.4，以下简称BIP)。
本发明提供的引物中，FIP是针对rs10484555的C等位基因的特异引物，在其中额外引进了一个突变，增加了引物的特异性，降低了非特异扩增的可能性，提高了检测的准确性。
优选地，所述F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
本发明的第二个目的在于提供一种HLA-B*1502检测试剂盒。所述试剂盒包括检测rs10484555位点基因型进而检测HLA-B*1502的组合物，所述组合物包括上述的引物，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
进一步地，所述组合物还包括用于显示组合物颜色的指示剂。
优选地，所述指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物或者为羟基萘酚蓝。
进一步地，所述检测组合物还包括甜菜碱或二甲基亚砜中的一种。其中，甜菜碱的浓度大于0，小于等于1M。二甲基亚砜的浓度大于0，小于等于10％(体积分数)。
优选地，所述组合物中甜菜碱的浓度为0.8M。
优选地，所述组合物中，F3和B3均为0.4μM，FIP和BIP均为1.6μM。
进一步地，所述缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，Tween-200.1％(体积分数)。
优选地，若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μM，氯化锰为0.5mM。若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μM。
优选地，所述组合物中dNTP为1.4mM，Bst聚合酶为8U。
本发明的第三个目的在于提供一种HLA-B*1502的检测方法。所述检测方法，使用上述的HLA-B*1502检测试剂盒，具体为：将待检测的核酸加入到所述组合物中，得到的反应体系于55～70℃下反应，反应结束后观察体系的变化。
进一步地，所述待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8～4ng/μL。
优选地，反应结束后，将反应体系进行灭活处理。灭活处理使得体系中的酶失活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增，影响反应结果的判断。
优选地，反应温度为58～65℃。
优选地，所述反应时间为40～120min。
在本发明的反应体系中，反应前体系为澄清状态，发生阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，体系产生肉眼可见的沉淀，变为浑浊状态。观察体系状态的变化可以直接判定是否发生扩增反应。
当体系中存在指示剂时：(1)若指示剂为羟基萘酚蓝，反应前体系中的镁离子与dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色；(2)若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物时，反应前钙黄绿素与氯化锰中的锰离子结合，体系呈现黄色；当有阳性反应时，副产物焦磷酸与锰离子结合生成沉淀，钙黄绿素与体系中的镁离子结合，颜色逐渐由黄色变为荧光绿色。观察反应体系颜色和/或状态的变化可以直接判定是否发生扩增反应。
本发明具有的优点和积极效果是：(1)本发明采用Allele-SpecificLAMP技术，针对rs10484555的C等位基因设计了特异引物，利用rs10484555的C等位基因与HLA-B*15021的关联性判断患者是否携带HLA-B*1502等位基因，从而指导卡马西平个体化用药，避免直接测试HLA-B*1502。(2)本发明运用Allele-SpecificLAMP技术，设计了特异引物，测试后，观察反应体系的状态变化(是否有沉淀或者颜色的变化)即可判断是否发生阳性反应，肉眼即可进行判断，无需额外的装置设备，简便易行，(3)使用本发明提供的检测引物、试剂盒和方法进行检测，所需要的设备仅是水浴锅或金属浴或者热循环仪，检测成本低；检测耗时较短；且本检测方法不需要额外的开管检测，因此有效避免了交叉污染的产生，提高了检测的准确性。
本发明提供的试剂盒成本低廉、检测时间短、准确性高，易于推广。
附图说明
图1是检测样本1-9经LAMP反应得到的产物的电泳图。
图2-图9分别是检测样本1-8用PCR-测序法得到的rs10484555位点的测序图谱。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的描述。
一种HLA-B*1502检测引物，用于检测rs10484555的C等位基因，包括以下引物：
5′-AAATTGTTAAAGGTACTTGGAAAG-3′(SEQIDNo.1，以下简称F3)
5′-CATCTAAAGTATACAATTCAATGGTT-3′(SEQIDNo.2，以下简称B3)
5′-GCCATGAAGTAAATCCATAAATTTTGAGTTTGTGCCTGTCAAGCTAGGA-3′(SEQIDNo.3，以下简称FIP)
5′-AGAGAGACATATTATAAAGCCGTGGATCATATTCAGAGTTTTAAATCTGCA-3′(SEQIDNo.4，以下简称BIP)。
上述的F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
一种HLA-B*1502检测试剂盒，包括检测rs10484555位点基因型进而检测HLA-B*1502的组合物。所述组合物包括上述的引物，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、指示剂、甜菜碱或二甲基亚砜中的一种。
组合物中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置。作为一种实施方案，F3和B3均为0.4μM，FIP和BIP均为1.6μM，dNTP为1.4mM，Bst聚合酶为8U。若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μM，氯化锰为0.5mM。若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μM。
若组分中有甜菜碱，其浓度浓度大于0，小于等于1M；若为二甲基亚砜，其浓度大于0，小于等于10％(体积分数)。作为优选，甜菜碱的浓度为0.8M。
作为一种实施方案，缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，Tween-200.1％(体积分数)。
一种HLA-B*1502的检测方法，使用上述的HLA-B*1502检测试剂盒。具体为：将待检测的核酸加入到上述组合物中，得到的反应体系。反应体系于55～70℃下反应40～120min。反应结束后，将反应体系进行灭活处理。灭活处理使得体系中的酶失活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增。反应结束后观察体系的变化。作为优选，待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8～4ng/μL。反应温度为58～65℃，恒温反应。
具体实施时，抽取8人1ml静脉血以EDTA抗凝管保存，每管取200uL血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为检测的样本，样本记为模板T。上述8个样本分别顺序编号1-8，除上述8组外，还加入了已知rs10484555的C等位基因阳性的质粒作为阳性对照，编号9。
对模板T采用Allele-SpecificLAMP技术，使待检测的核酸进行LAMP反应，检测rs10484555位点的基因型。将模板Tn(n为组别编号，1-9)分别加入到组合物中，得到反应体系。反应体系在60℃下恒温反应60min，之后升温至80℃进行灭活处理20min，之后降温，观察体系颜色变化即可。
作为一种实施方案，试剂盒中反应体系总容积为25μL，各组分和其规格如下表所示：
反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别反应体系的颜色及基因型判断如下表所示：
由上表可知，编号为1-8的样本反应体系均保持紫罗兰色，证明其未发生阳性反应，提示这8个样本在rs10484555位点的基因型为T。根据HLA-B*1502与rs10484555的C等位基因的关联性，检测样本1-8不携带HLA-B*1502等位基因，适用卡马西平用药。
为进一步验证反应的准确性，对上述组别的LAMP产物进行电泳，用2％的琼脂糖凝胶，6v/cm电压下电泳30min。得到的电泳图如附图1所示。第9组的阳性反应呈现典型的梯状条带，而阴性反应则没有条带。与本发明的检测方法的结果相同。
将上述8个实验组别的模板(阳性对照组除外)分别用PCR-测序法对rs10484555进行分型，得到的rs10484555位点的测序图谱如图2-图9所示，对比基因测序图谱和本发明提供的试剂盒的检测结果可知，二者的检测吻合率100％。可验证本发明的结果精准。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (16)

1.一种HLA-B*1502检测引物，其特征在于：包括以下引物：
5′-AAATTGTTAAAGGTACTTGGAAAG-3′(SEQIDNo.1，以下简称F3)
5′-CATCTAAAGTATACAATTCAATGGTT-3′(SEQIDNo.2，以下简称B3)
5′-GCCATGAAGTAAATCCATAAATTTTGAGTTTGTGCCTGTCAAGCTAGGA-3′(SEQIDNo.3，以下简称FIP)
5′-AGAGAGACATATTATAAAGCCGTGGATCATATTCAGAGTTTTAAATCTGCA-3′(SEQIDNo.4，以下简称BIP)。
2.根据权利要求1所述的HLA-B*1502检测引物，其特征在于：所述F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
3.一种HLA-B*1502检测试剂盒，包括用于检测HLA-B*1502的组合物，所述组合物包括权利要求1或2所述的引物，其特征在于：所述组合物还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
4.根据权利要求3所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括用于显示组合物颜色的指示剂。
5.根据权利要求4所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物或者为羟基萘酚蓝。
6.根据权利要求3所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括甜菜碱或二甲基亚砜中的一种；
其中，甜菜碱的浓度大于0，小于等于1M；
二甲基亚砜的浓度大于0，小于等于10％(体积分数)。
7.根据权利要求6所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述甜菜碱的浓度为0.8M。
8.根据权利要求3-6任一所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述组合物中，F3和B3均为0.4μM，FIP和BIP均为1.6μM。
9.根据权利要求3-6任一所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，Tween-200.1％(体积分数)。
10.根据权利要求5所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μM，氯化锰为0.5mM；
若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μM。
11.根据权利要求3-6任一所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：所述组合物中dNTP为1.4mM，Bst聚合酶为8U。
12.一种HLA-B*1502的检测方法，使用权利要求3-11任一所述的HLA-B*1502检测试剂盒，其特征在于：将待检测的核酸加入到所述组合物中，得到的反应体系于55～70℃下反应，反应结束后观察体系的变化。
13.根据权利要求12所述的HLA-B*1502的检测方法，其特征在于：所述待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8～4ng/μL。
14.根据权利要求12或13所述的HLA-B*1502的检测方法，其特征在于：反应结束后，将反应体系进行灭活处理。
15.根据权利要求12或13所述的HLA-B*1502的检测方法，其特征在于：反应温度为58～65℃。
16.根据权利要求12或13所述的HLA-B*1502的检测方法，其特征在于：反应时间为40～120min。
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