CN105255863B

CN105255863B - 一种slco1b1 521t>c的检测引物及其组合物

Info

Publication number: CN105255863B
Application number: CN201510652715.XA
Authority: CN
Inventors: 汪大为
Original assignee: Beijing Jinqi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jinqi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-10-10
Filing date: 2015-10-10
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2035-10-10
Also published as: CN105255863A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种SLCO1B1 521T>C的检测引物，所述检测引物如下：正向外侧引物F3T：SEQ ID NO:1；反向外侧引物B3T：SEQ ID NO:2；正向内侧引物FIPT：SEQ ID NO:3；反向内侧引物BIPT：SEQ ID NO:4；正向外侧引物F3C：SEQ ID NO:5；反向外侧引物B3C：SEQ ID NO:6；正向内侧引物FIPC：SEQ ID NO:7；反向内侧引物BIPC：SEQ ID NO:8。本发明步骤简单、扩增反应快速、高效、特异性高、鉴定简便，使该技术有着更广阔的应用前景。

Description

一种SLCO1B1 521T>C的检测引物及其组合物

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种SLCO1B1 521T>C的检测引物及其组合物。

背景技术

由SLCO1B1基因编码的有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1，又称 OATP-C、OATP2或LST1)，在肝细胞摄取和清除内源性和外源性物质如胆汁酸、非结合型胆红素、甲状腺素、他汀类药物、瑞格列奈、依那普利拉、替莫普利、缬沙坦、奥美沙坦、甲氨蝶呤和伊立替康活性代谢产物SN-38等中发挥重要作用。该基因第5外显子521T>C(rs4149056，Val174Ala)多态性是亚洲人群中的主要遗传变异，等位基因频率为10～15％，携带521C等位基因的SLCO1B1所编码的OATP1B1会显著降低其对底物的摄取能力，使他汀类药物如普伐他汀、阿托伐他汀和罗苏伐他汀等的血药浓度升高。他汀类药物的严重不良反应包括肝功能下降和横纹肌溶解症等。因此，携带521C等位基因的患者应用辛伐他汀、西立伐他汀时肌病的发生风险显著增加。为降低他汀类药物严重不良反应的发生风险，《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中也建议“临床上根据SLCO1B1基因型选择他汀类药物进行治疗。”

现阶段用来检测rs4149056位点的方法有很多，主要集中于PCR-直接测序法、Taqman荧光PCR法、HRM法、核酸杂交法等等，这些方法虽然都能以相对较短的时间准确得检测rs4149056，但是都需要依赖比较昂贵的仪器和/或试剂，其中测序法操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法(HRM法)对设备要求较高，临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能准确检测。CN 102021239A公开了一种SLCO1B1基因SNP检测特异性引物和液相芯片，然而这种方法不仅操作繁琐，检测耗时较长，还需要昂贵的检测设备。因此这些方法都比较难以广泛推广开来，尤其是在偏远的经济欠发达地区。然而，从目前来看，这种检测需求又非常巨大，因此，有必要寻求一种检测方法，既能做到费用低廉，又能实现快速准确得检测。

环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换 DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。

发明内容

本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种SLCO1B1 521T>C的检测引物及其组合物，具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种SLCO1B1基因的检测引物组，所述检测引物组如下：

正向外侧引物F3T：SEQ ID NO:1： TAAGTAGAATAATTAAGAGTTTACAAGT；

反向外侧引物B3T：SEQ ID NO:2：CCTTCTTTAGCGAAATCATCAA；

正向内侧引物FIPT：SEQ ID NO:3： GACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTGCTAAAATTAATGTTTAAAATGA AACACTC；

反向内侧引物BIPT：SEQ ID NO:4： TGGTCATGGGTAATATGCTTCGTGGTAAGAAAGCCCCAATGGTACT；

正向外侧引物F3C：SEQ ID NO:5： AGTAGTTAAATTTGTAATAGAAATGCTA；

反向外侧引物B3C：SEQ ID NO:6： CAATTTAATATTTTGTGTACATTACCTAA；

正向内侧引物FIPC：SEQ ID NO:7： GCCTATATCCACATGTATGACCCAGATTAAAATGAAACACTCTCTTATCTAC ATAGG；

反向内侧引物BIPC：SEQ ID NO:8： CTTCGTGGAATAGGGGAGACTCAAGAAGAATGTCCTTCTTTAGCG。

优选地，所述SEQ ID NO:1-4所示的序列是用于检测rs4149056位点的T 等位基因。

优选地，所述SEQ ID NO:5-8所示的序列是用于检测rs4149056位点的C 等位基因。

本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了F1c和 F2，BIP包含了B1c和B2，上述引物均由在线软件PrimerExplorer V4设计。本发明在普通LAMP的基础上，以特异性要求最严格的F1c或B1c的5’端针对 rs4149056位点设计等位基因特异引物，分别检测rs4149056的C等位基因和 rs4149056的T等位基因。通过分别在BIPT和FIPC的5’端第三位引进额外突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。

第二方面，本发明提供一种检测SLCO1B1基因的反应体系，所述反应体系包括第一方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱， Bst DNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。

优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄和 Tween-20。

优选地，所述Tris-HCl的浓度为10-30mM，例如可以是10mM、11mM、 12mM、13mM、15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM或30mM，优选为15-25mM，进一步优选为20mM。

优选地，所述KCl的浓度为10-60mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、 15mM、18mM、20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、 50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或60mM，优选为50-55mM，进一步优选为50mM。

优选地，所述(NH₄)₂SO₄的浓度为5-13mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM或13mM，优选为8-12mM，进一步优选为10mM。

优选地，所述MgSO₄的浓度为2-8mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、 5mM、6mM、7mM或8mM，优选为2-6mM，进一步优选为4mM。

优选地，所述Tween-20的体积分数为0.1-1％，例如可以是0.1％、0.2％、 0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，优选为0.1％。

优选地，所述dNTPs的浓度为1-2mM，例如可以是1mM、1.1mM、1.2mM、 1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，优选为1.2-1.8mM，进一步优选为1.4mM。

优选地，所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130μM，例如可以是108μM、 109μM、110μM、111μM、112μM、115μM、116μM、118μM、120μM、122μM、 125μM、126μM、128μM或130μM，优选为115-123μM，进一步优选为120μM。

优选地，所述甜菜碱的浓度为0.1-1M，例如可以是0.1M、0.2M、0.4M、 0.6M、0.8M或1M，优选为0.5-0.8M，进一步优选为0.8M。

作为优选技术方案，所述反应体系包括反应体系T和反应体系C，其中每个25μL反应体系含有以下组分：

去离子水加至25μL。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包括如下步骤：

将反应体系T和反应体系C所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反应后升温进行灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。

优选地，所述恒温水浴锅的温度为55-68℃，例如可以是55℃、56℃、57 ℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或68℃，优选为58-61 ℃，进一步优选为60℃。

优选地，所述反应时间为15-90min，例如可以是15min、20min、25min、 30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、 75min、80min、85min或90min，优选为45-90min，进一步优选为60min。

优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：

反应体系T为天蓝色，反应体系C为紫罗兰，则待测位点基因型为TT；

反应体系T为紫罗兰，反应体系C为天蓝色，则待测位点基因型为CC；

反应体系T为天蓝色，反应体系C为天蓝色，则待测位点基因型为CT。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)步骤简单：扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；

(2)高特异性：应用四条引物识别目的片段的六个区域，并且这六个区域的顺序、长短、退火温度都有相应要求。扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，可应用于遗传背景相似的细菌或病毒的分型定性检测；

(3)扩增反应快速、高效：整个扩增1h即可完成，且产率高；

(4)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化来完成，在水浴锅中就能进行，使该技术有着更广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明引物组的示意图；

图2为本发明引物组中的FIP和BIP的示意图；

图3为本发明实施例1中的M1-4的反应产物的电泳图；

其中，M-DNAmarker，从上致下依次为2400bp、2200bp、2000bp、1800b、 1600bp、1400bp、1200bp、1000bp、800bp、600bp、400bp和200bp；1^T-M1组的T反应体系；1^C-M1组的C反应体系；2^T-M2组的T反应体系；2^C-M2组的C反应体系；3^T-M3组的T反应体系；3^C-M3组的C反应体系；4^T-M4组的T反应体系；4^C-M4组的C反应体系；

图4是本发明实施例1中M1组的测序图谱；

图5是本发明实施例1中M2组的测序图谱；

图6是本发明实施例1中M3组的测序图谱。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例

抽取3人1ml静脉血以EDTA抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为检测的模板，分别标记为M1、M2、M3，另有一已知的C等位基因阳性的质粒作为阳性对照，记为M4。用本发明中的相对应的引物组进行反应，验证本发明的实施效果。

对模板M采用Allele-Specific LAMP技术，使待检测的核酸进行LAMP反应，分为两组反应体系，一组针对T等位基因的体系T，一组针对C等位基因的体系C。将模板Mn(n为组别编号，1-4)分别加入到体系T和体系C中，得到反应体系T和C。

首先，选用如本申请第一方面所述的引物组对样本的序列进行反应，所述引物组如下：

正向外侧引物F3T：SEQ ID NO:1： TAAGTAGAATAATTAAGAGTTTACAAGT；

反向外侧引物B3T：SEQ ID NO:2：CCTTCTTTAGCGAAATCATCAA；

正向外侧引物F3C：SEQ ID NO:5： AGTAGTTAAATTTGTAATAGAAATGCTA；

反向外侧引物B3C：SEQ ID NO:6： CAATTTAATATTTTGTGTACATTACCTAA；

所有反应均设置同一种反应体系，组成如下：

反应体系T：

反应体系C：

两个反应体系反应时，于60℃下反应60min，之后升温至80℃保持20min 进行灭活处理，之后降温，观察体系颜色变化即可。

反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别反应体系的颜色及基因型判断如表1所示：

表1

由表1可以看出，编号为1-3的样本反应体系T均变为天蓝色，而反应体系C均保持紫罗兰色，证明反应体系T中均发生阳性反应，反应体系C中均未发生阳性反应，表明这3个样本在rs4149056位点处基因型为TT。

为进一步验证反应的准确性，对上述组别的LAMP产物进行电泳，用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，6v/cm电压下电泳30min。得到的电泳图如图3所示。1-3 组的反应体系T呈现典型的梯状条带，反应体系C则没有条带；第4组(已知的阳性质粒)反应体系C呈现典型的梯状条带，而反应体系T则没有条带。与本发明的检测方法的结果相同。

再将上述3个实验组别的模板(阳性对照组除外)分别用PCR-测序法进行分型，得到的测序图谱如图4-6所示，对比基因测序图谱和本发明提供的检测引物组的检测结果可知，二者的检测吻合率100％，可验证本发明的结果精准。

综上所述，本发明反应体系能够准确的判断反应样本的基因型，且本发明步骤简单：扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；扩增反应快速、高效、特异性高：整个扩增1h 即可完成，且产率高；鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的可视观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化来完成，在水浴锅中就能进行，使该技术有着更广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一组SLCO1B1521T>C的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组如下：

正向外侧引物F3T：SEQ ID NO:1；

反向外侧引物B3T：SEQ ID NO:2；

正向内侧引物FIPT：SEQ ID NO:3；

反向内侧引物BIPT：SEQ ID NO:4；

正向外侧引物F3C：SEQ ID NO:5；

反向外侧引物B3C：SEQ ID NO:6；

正向内侧引物FIPC：SEQ ID NO:7；

反向内侧引物BIPC：SEQ ID NO:8；

所述SEQ ID NO:1-4所示的序列是用于检测rs4149056位点的T等位基因；

所述SEQ ID NO:5-8所示的序列是用于检测rs4149056位点的C等位基因。

2.一种检测SLCO1B1基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，BstDNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。

3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄和Tween-20；所述Tris-HCl的浓度为10-30mM；所述KCl的浓度为10-60mM；所述(NH₄)₂SO₄的浓度为5-13mM；所述MgSO₄的浓度为2-8mM；所述Tween-20的体积分数为0.1-1％。

4.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述Tris-HCl的浓度为20mM；所述KCl的浓度为50mM；所述(NH₄)₂SO₄的浓度为10mM；所述MgSO₄的浓度为4mM；所述Tween-20的体积分数为0.1％。

5.根据权利要求2或3所述的反应体系，其特征在于，所述dNTPs的浓度为1-2mM；所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130μM。

6.根据权利要求2或3所述的反应体系，其特征在于，所述dNTPs的浓度为1.4mM；所述羟基萘酚蓝的浓度为120μM。

7.根据权利要求2-3中任一项所述的反应体系，其特征在于，所述甜菜碱的浓度为0.1-1M。

8.根据权利要求2-3中任一项所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括反应体系T和反应体系C，其中每个25μL反应体系含有以下组分：

缓冲液：