CN103540648A - 高脂血症易感性无创检测试剂盒（apob等基因） - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测高脂血症易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C(rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与高脂血症发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估高脂血症发病的风险级别，指导人群提早预防疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。

Description

高脂血症易感性无创检测试剂盒(APOB等基因)
技术领域
本项目属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种高脂血症易感基因无创检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估高脂血症遗传易感性的风险级别，并作为高脂血症的建议指导。 
背景技术
随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病患者有逐年增加趋势，心脑血管疾病已成为继癌症之后导致人类死亡的又一大杀手! 大量研究表明：高脂血症（hyperlipidemia，HLP）等脂质代谢紊乱病症是引起心脑血管疾病不可忽视的重要原因。高脂血症是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑梗死、心脏猝死等疾病重要的危险因素，同时也是引起高血压、糖耐量异常、糖尿病等其他重要脏器病变的一个重要危险因素。高脂血症发病受遗传、环境和生活方式等多因素影响。在遗传因素的影响方面，现有研究发现多个基因与血脂水平相关，Apo B基因EcoR I位点多态性和MTHFR基因上C677T位点多态性均与HLP密切相关，可以作为受检者是否属于易患高脂血症人群的预测依据。而数据显示SLCO1B1基因多态性影响部分药物的治疗效果，因此该位点的基因型检测结果可以帮助医生给出用药建议。
人载脂蛋白B(apoprotein B，Apo B)作为低密度脂蛋白（LDL）受体的配体介导细胞内胆固醇的清除，在脂类转运和代谢过程中起着极其重要的作用。Apo B基因位于2号染色体短臂上，全长43kb，mRNA长度为14kb，可编码4536个氨基酸。研究表明该基因存在明显的多态性，其中EcoR I 位点与血脂异常相关，EcoR I多态性是由于外显子29中第4154位密码子突变(GAA-AAA)，氨基酸序列上由赖氨酸取代谷氨酸。胡鹏等通过分析EcoR I位点多态性与血清总蛋白( TP)、白蛋白( AIB)、球蛋白a( GLO)、血脂、脂蛋白( Lpa)等的关系，表明点突变所造成的EcoR I酶切位点的部分或完全缺失，可以明显升高儿童血脂水平，同时降低血清蛋白水平，因而该位点可作为检测高脂血症指标之一。
亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是血浆同型半胱氨酸（Hcy）再甲基化代谢的关键酶之一，由于基因突变导致酶活性降低往往会影响血浆Hcy水平。其中C677T突变常常引起轻至中度高同型半胱氨酸血症。MTHFR在C677T位点目的基因长度为198bp，677位基因座原有的碱基C突变为碱基T后可产生一个Hinf I限制性酶切位点，而野生型基因序列中无这一位点。研究表明MTHFR基因C677T位点多态性可能与高胆固醇血症相关，T等位基因突变可能是高胆固醇血症的危险因素。
有机阴离子转运多肽OATP1Bl(又称OATP-C，OATP2，LST1，编码基因SLCO1B1)是一种特异性分布于肝细胞基底膜上的一种转运蛋白，和体内诸多内源性或外源性物质的肝脏摄取作用关系密切。例如胆汁酸、硫化和葡萄糖醛酸化结合物、甲状腺激素、多肽、甲氨喋呤和他汀类药物等都是OATP1B1转运的底物。目前为止，OATP1B1基因上已陆续发现超过20种单核苷酸多态性(SNP)的突变，而这将会导致细胞对OATP1B1底物的摄取能力大大降低，并与转运功能异常有关。医学工作者通过对来自全国的24名健康男性基因分型及其对高脂血症常用药物匹伐他汀的吸收结果发现，52l T > C 突变组对匹伐他汀的吸收显著低于野生型521TT纯合子，这表明该基因的突变将降低对药物的正常吸收，进而影响高脂血症的治疗效果。
综上所述，鉴于ApoB基因、MTHFR基因和SLCO1B1基因在高脂血症发生过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在高脂血症发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患高脂血症高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施并提出治疗建议，这对于降低高脂血症发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估高脂血症发病风险级别，本发明提供一种高脂血症基因无创检测试剂盒。
该试剂盒包括：
检测 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O等）；
PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O等）；
DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等）。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul。
PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶 0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。
测序反应体系：25%BigDye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100%乙醇溶液 15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O 2ul。
本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20℃。 
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
 
实施例1. 检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对： 
（1）APOB（EcoRⅠ）正向引物：5'TGGCTTGCTAACCTCTCTG3'
APOB（EcoRⅠ）反向引物：5'CTTGAGAGACTGAATGGC3'
（2）MTHFR（C677T）正向引物：5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'
MTHFR（C677T）反向引物：5'GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'
（3）SLCO1B1 (T521C)正向引物：5'TCTATCCTTACACTTCACC3'
     SLCO1B1 (T521C)反向引物：5'ACGCACAACTTGGATTAGC3'
PCR扩增的反应体系为：10×PCR 反应缓冲液 2.5ul；25mM的dNTP 混合液0.2ul、5U/ul Taq酶0.125ul、DNA模板1ul(12-15ng左右)、20uM正向引物反向引物各0.25ul、ddH2O 19.175ul；
反应条件为：94℃ 4分钟变性和酶激活，94℃ 30秒变性，55℃ 30秒退火，72℃ 1分钟延长，循环28次，最后72℃延长5分钟以上。
3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，1U/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，去离子水3.875ul；
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15min，72℃、20min。
4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物：
（1）APOB（EcoRⅠ）测序引物：5'TGGCTTGCTAACCTCTCTG3'
（2）MTHFR（C677T）测序引物：5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'
（3）SLCO1B1 (T521C)测序引物：5' TCTATCCTTACACTTCACC3'
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物1ul，25%Bigdye mix1ul,3.2uM DNA测序引物 1ul，去离子水2ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2min，进行25个循环的96℃ 30s，55℃30s,60℃ 4min。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1ul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min；在4℃,3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul，3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪中。
5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2. 为人群进行预防高脂血症基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
3.高脂血症高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具高脂血症风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读高脂血症基因无创检测报告单。

Claims (7)

1.一种筛查高脂血症高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于：检测 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是针对 APOB基因上EcoRⅠ、MTHFR基因上C677T (rs1801133)、SLCO1B1基因上T521C (rs4149032)的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下：
（1）APOB（EcoRⅠ）正向引物：5'TGGCTTGCTAACCTCTCTG3'
APOB（EcoRⅠ）反向引物：5' CTTGAGAGACTGAATGGC3'
（2）MTHFR（C677T）正向引物：5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'
MTHFR（C677T）反向引物：5'GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'
（3）SLCO1B1 (T521C) 正向引物：5'TCTATCCTTACACTTCACC3'
     SLCO1B1 (T521C) 反向引物：5'ACGCACAACTTGGATTAGC3'。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下：
（1）APOB（EcoRⅠ）测序引物：5'TGGCTTGCTAACCTCTCTG3'
（2）MTHFR（C677T）测序引物：5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'
（3）SLCO1B1 (T521C) 测序引物：5' TCTATCCTTACACTTCACC3'。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
（1）PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul，25mM dNTP混合液0.2ul，5U／ul Taq DNA聚合酶 0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH2O 19.175ul；
（2）PCR产物纯化体系：1 U／ul SAP酶0.75ul，10 U／ul ExoI酶0.375ul，ddH2O 3.875ul；
（3）测序反应体系：25% BigDye mix1ul，3.2uM DNA测序引物1ul，125mM EDTA溶液1ul，100%乙醇溶液15ul，70%乙醇溶液30ul，HIDI溶液8ul，ddH2O 2ul。
7.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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