CN102242207B - 癌基因brafv600e突变检测的引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。本发明的引物和探针分别包括突变特异性上游引物、突变非特异性上游引物和通用下游引物以及通用探针，如SEQ NO.1～11所示。本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml，灵敏度良好；不含BRAFV600E的样本时，其扩增曲线ct值≥36，特异性强；由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量，避免假阴性结果，方便质控。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，特别涉及用于检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。
背景技术
BRAF基因是一种癌基因，与ARAF、RAF1(CRAF)基因同属RAF家族，位于7q34，长约190kb。由其翻译的BRAF蛋白由783个氨基酸组成，有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF蛋白为丝苏氨酸蛋白激酶raf/mil家族成员，为Ras-Raf-MEK一ERK信号通路中上游重要调节因子。BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，从而调节细胞的分化、分裂。该通路被异常激活时，可促进细胞增殖、生长，最终导致肿瘤发生。Braf基因突变与肿瘤发生具有重要关联，对其展开深入研究具有重要价值。
研究表明，在人类的多种肿瘤中存在不同频率的BRAF癌基因突变，最常见于恶性黑色素瘤(30-60％)、乳头状甲状腺癌(29-83％)、结直肠癌(6-15％)。序列分析BRAF突变形式共有40余种，主要集中在两个区域：①位于exonl1上的的突变，约占10％，常为G463、G465、G468等的点突变；②位于exonl5上的激活区突变约占90％，多为位于1799核苷酸上T突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。BRAFV600E突变使BRAF蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。因此，及时检测BRAF突变发生情况，对早期筛选肿瘤病人以及对肿瘤个性化治疗、预后将具有重要的指导意义。常用的BRAF突变检测方法主要有直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)等，但均存在一定的局限性。等位基因特异扩增实时定量PCR法具有克服序列多态性、高灵敏度的优点，目前在BRAF突变检测上的应用日益广泛。在等位基因特异扩增实时定量PCR检测方法中，引物和探针的设计尤为重要，决定了突变检测结果的有效性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供用于检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
提供一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物，包括通用下游引物BRAFR和只扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE；所述的突变特异性上游引物BRAFFE是下述序列中的任意一条：
SEQ NO.1：5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′；
SEQ NO.2：5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′；
SEQ NO.3：5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′；
SEQ NO.4：5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′；
SEQ NO.5：5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′；
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条：
SEQ NO.6：5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′；
SEQ NO.7：5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物，包括通用下游引物BRAFR和能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV；所述的突变非特异性上游引物BRAFFV是下述序列中的任意一条：
SEQ NO.8：5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′；
SEQ NO.9：5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′；
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条：
SEQ NO.6：5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′；
SEQ NO.7：5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针，所使用的探针为通用LNA探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述通用LNA探针的序列为：
SEQ NO.10：5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。
本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针，所使用的探针为通用TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述的通用TaqMan探针的序列为：
SEQ NO.11：5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ 1-3′。
本发明的具体原理是：采用等位基因特异性扩增实时定量PCR方法(AS-PCR)判断肿瘤标本中是否存在癌基因BRAFV600E突变以及突变所占比例。
所使用的引物包括一对突变特异性上游引物(只扩增突变型模板)和通用下游引物；一对突变非特异性上游引物(可同时等效地扩增野生型和突变型模板)和通用下游引物。所使用的探针为通用LNA探针或者TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。探针部分碱基锁核酸化以增加探针对靶序列的识别能力和亲和力。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml，说明其灵敏度良好。
(2)本发明提供的突变特异性引物和探针检测不含BRAFV600E的样本时，其扩增曲线ct值≥36，说明其特异性强。
(3)由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量，避免假阴性结果，方便质控。
附图说明
图1为BRAFV600E突变检测用引物和探针实施案例1检测未突变样本扩增图；
图2为BRAFV600E突变检测用引物和探针实施案例1检测突变样本扩增图。
具体实施方式
1.引物和探针的设计：根据BRAF基因T1799A序列改变，分别在突变特异性上游引物的3’端引入一个或者多个碱基的突变使其特异性扩增突变型等位基因。在突变位点之外数碱基设计突变非特异性上游引物，用以同时扩增野生型和突变型等位基因。设计并筛选多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。优化引物探针序列组合，使其达到最佳的特异性和灵敏度。选择如待检样本中没有BRAFV600E，用特异性引物扩增显示ct值≥36的引物探针序列组合，具体实施案例如下：
实施案例1：
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：
5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：
5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：
5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。
(4)锁核酸探针序列：
5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。
实施案例2：
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：
5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：
5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：
5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。
(4)锁核酸探针序列：
5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ1-3′。
实施案例3：
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：
5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：
5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：
5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
(4)TaqMan探针序列：
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
实施案例4：
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：
5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：
5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：
5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。
(4)TaqMan探针序列：
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
实施案例5：
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：
5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：
5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：
5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
(4)TaqMan探针序列：
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
实施案例6：
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为：
5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为：
5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为：
5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
(4)TaqMan探针序列：
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
2.反应体系的优化：利用实体瘤术后冰冻组织或者石蜡组织作为检测标本，用DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，Catalog no.51306)进行提取，DNA溶液分装后贮存于-20℃。
2.1引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是0.3μmol/L。
2.2探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从，确0.05μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.1μmol/L。
2.3退火温度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(56°至64°退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是62°。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的BRAFV600E AS-PCR反应体系为25μl。按照两步法荧光定量PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
3.仪器检测通道的选择
选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。
4.PCR反应条件如下
95℃1min；95℃15s，62℃1min，40个循环，在62℃1min阶段收集荧光。
5.检测结果分析
如果待检样本中含有BRAFV600E，用特异性引物扩增时则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到500拷贝/ml；如果待检样本中没有BRAFV600E，用特异性引物扩增时则显示阴性扩增曲线，即ct值≥36，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。用非特异性引物扩增曲线检测样本的总模板量，总模板量≤104拷贝/ml的样本视为不合格样本(丢弃或浓缩后再分析)，总模板量≥106拷贝/ml的样本适当稀释后重新分析。
Claims (2)
1.用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物，包括通用下游引物BRAFR、只扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE、能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV；其特征在于，
所述的突变特异性上游引物BRAFFE的序列为：
SEQ NO. 1：5′- GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA -3′ ；
所述通用下游引物BRAFR的序列为：
SEQ NO. 6：5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′ ；
所述的突变非特异性上游引物BRAFFV的序列为：
SEQ NO. 8：5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG -3′。
2.与权利要求1中所述引物进行组合使用的用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针，所使用的探针为通用LNA 探针，其特征在于，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述通用LNA 探针的序列为：
SEQ NO. 10：5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ1-3′ 。
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