CN102242207A - 癌基因brafv600e突变检测的引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,旨在提供一种检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。本发明的引物和探针分别包括突变特异性上游引物、突变非特异性上游引物和通用下游引物以及通用探针,如SEQ NO.1~11所示。本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml,灵敏度良好;不含BRAFV600E的样本时,其扩增曲线ct值≥36,特异性强;由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量,避免假阴性结果,方便质控。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,特别涉及用于检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。
背景技术
BRAF基因是一种癌基因,与ARAF、RAF1(CRAF)基因同属RAF家族,位于7q34,长约190kb。由其翻译的BRAF蛋白由783个氨基酸组成,有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF蛋白为丝苏氨酸蛋白激酶raf/mil家族成员,为Ras-Raf-MEK一ERK信号通路中上游重要调节因子。BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处,它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接,从而调节细胞的分化、分裂。该通路被异常激活时,可促进细胞增殖、生长,最终导致肿瘤发生。Braf基因突变与肿瘤发生具有重要关联,对其展开深入研究具有重要价值。
研究表明,在人类的多种肿瘤中存在不同频率的BRAF癌基因突变,最常见于恶性黑色素瘤(30-60%)、乳头状甲状腺癌(29-83%)、结直肠癌(6-15%)。序列分析BRAF突变形式共有40余种,主要集中在两个区域:①位于exonl1上的的突变,约占10%,常为G463、G465、G468等的点突变;②位于exonl5上的激活区突变约占90%,多为位于1799核苷酸上T突变(即V600E突变),导致谷氨酸取代缬氨酸。BRAFV600E突变使BRAF蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。因此,及时检测BRAF突变发生情况,对早期筛选肿瘤病人以及对肿瘤个性化治疗、预后将具有重要的指导意义。常用的BRAF突变检测方法主要有直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)等,但均存在一定的局限性。等位基因特异扩增实时定量PCR法具有克服序列多态性、高灵敏度的优点,目前在BRAF突变检测上的应用日益广泛。在等位基因特异扩增实时定量PCR检测方法中,引物和探针的设计尤为重要,决定了突变检测结果的有效性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术的不足,提供用于检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。
基于上述目的,本发明采用以下技术方案:
提供一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物,包括通用下游引物BRAFR和只扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE;所述的突变特异性上游引物BRAFFE是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.1:5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′;
SEQ NO.2:5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′;
SEQ NO.3:5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′;
SEQ NO.4:5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′;
SEQ NO.5:5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′;
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.6:5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′;
SEQ NO.7:5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物,包括通用下游引物BRAFR和能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV;所述的突变非特异性上游引物BRAFFV是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.8:5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′;
SEQ NO.9:5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′;
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.6:5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′;
SEQ NO.7:5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针,所使用的探针为通用LNA探针,探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸,所述通用LNA探针的序列为:
SEQ NO.10:5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。
本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针,所使用的探针为通用TaqMan探针,探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸,所述的通用TaqMan探针的序列为:
SEQ NO.11:5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ 1-3′。
本发明的具体原理是:采用等位基因特异性扩增实时定量PCR方法(AS-PCR)判断肿瘤标本中是否存在癌基因BRAFV600E突变以及突变所占比例。
所使用的引物包括一对突变特异性上游引物(只扩增突变型模板)和通用下游引物;一对突变非特异性上游引物(可同时等效地扩增野生型和突变型模板)和通用下游引物。所使用的探针为通用LNA探针或者TaqMan探针,探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时,报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收,在PCR扩增过程中,DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解,使报告基团的荧光信号可以被检测,荧光信号量的变化与扩增产物量成正比,从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。探针部分碱基锁核酸化以增加探针对靶序列的识别能力和亲和力。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml,说明其灵敏度良好。
(2)本发明提供的突变特异性引物和探针检测不含BRAFV600E的样本时,其扩增曲线ct值≥36,说明其特异性强。
(3)由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量,避免假阴性结果,方便质控。
附图说明
图1为BRAFV600E突变检测用引物和探针实施案例1检测未突变样本扩增图;
图2为BRAFV600E突变检测用引物和探针实施案例1检测突变样本扩增图。
具体实施方式
1.引物和探针的设计:根据BRAF基因T1799A序列改变,分别在突变特异性上游引物的3’端引入一个或者多个碱基的突变使其特异性扩增突变型等位基因。在突变位点之外数碱基设计突变非特异性上游引物,用以同时扩增野生型和突变型等位基因。设计并筛选多对引物和探针,引物长度一般为20碱基左右。优化引物探针序列组合,使其达到最佳的特异性和灵敏度。选择如待检样本中没有BRAFV600E,用特异性引物扩增显示ct值≥36的引物探针序列组合,具体实施案例如下:
实施案例1:
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为:
5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为:
5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为:
5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。
(4)锁核酸探针序列:
5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。
实施案例2:
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为:
5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为:
5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为:
5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。
(4)锁核酸探针序列:
5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ1-3′。
实施案例3:
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为:
5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为:
5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为:
5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
(4)TaqMan探针序列:
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
实施案例4:
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为:
5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为:
5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为:
5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。
(4)TaqMan探针序列:
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
实施案例5:
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为:
5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为:
5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为:
5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
(4)TaqMan探针序列:
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
实施案例6:
(1)突变特异性上游引物BRAFFE-1序列为:
5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-1序列为:
5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′。
(3)通用下游引物BRAFR-1序列为:
5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
(4)TaqMan探针序列:
5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
2.反应体系的优化:利用实体瘤术后冰冻组织或者石蜡组织作为检测标本,用DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit,Catalog no.51306)进行提取,DNA溶液分装后贮存于-20℃。
2.1引物浓度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下,将引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释,通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是0.3μmol/L。
2.2探针浓度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下,将探针浓度分别从,确0.05μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释,通过对试验结果的分析比较,确定最佳探针浓度是0.1μmol/L。
2.3退火温度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下,进行梯度PCR(56°至64°退火温度),通过对试验结果的分析比较,确定最佳退火温度是62°。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立,最后确定采用的BRAFV600E AS-PCR反应体系为25μl。按照两步法荧光定量PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
3.仪器检测通道的选择
选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致,具体按照仪器使用说明书进行设置。
4.PCR反应条件如下
95℃1min;95℃15s,62℃1min,40个循环,在62℃1min阶段收集荧光。
5.检测结果分析
如果待检样本中含有BRAFV600E,用特异性引物扩增时则显示阳性扩增曲线,其检测灵敏度可以达到500拷贝/ml;如果待检样本中没有BRAFV600E,用特异性引物扩增时则显示阴性扩增曲线,即ct值≥36,提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。用非特异性引物扩增曲线检测样本的总模板量,总模板量≤104拷贝/ml的样本视为不合格样本(丢弃或浓缩后再分析),总模板量≥106拷贝/ml的样本适当稀释后重新分析。
Claims (4)
1.用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物,包括通用下游引物BRAFR和只扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE;其特征在于,所述的突变特异性上游引物BRAFFE是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.1:5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3′;
SEQ NO.2:5′-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′;
SEQ NO.3:5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3′;
SEQ NO.4:5′-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3′;
SEQ NO.5:5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3′;
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.6:5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′;
SEQ NO.7:5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
2.用于检测癌基因BRAFV600E突变的引物,包括通用下游引物BRAFR和能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV;其特征在于,所述的突变非特异性上游引物BRAFFV是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.8:5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3′;
SEQ NO.9:5′-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′;
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条:
SEQ NO.6:5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′;
SEQ NO.7:5′-TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3′。
3.用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针,所使用的探针为通用LNA探针,其特征在于,探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸,所述通用LNA探针的序列为:
SEQ NO.10:5′-FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3′。
4.用于检测癌基因BRAFV600E突变的探针,所使用的探针为通用TaqMan探针,其特征在于,探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸,所述的通用TaqMan探针的序列为:
SEQ NO.11:5′-FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3′。
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