CN111235240A - 人braf基因v600e位点突变检测的pcr反应液与试剂盒 - Google Patents

人braf基因v600e位点突变检测的pcr反应液与试剂盒 Download PDF

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CN111235240A CN202010224158.2A CN202010224158A CN111235240A CN 111235240 A CN111235240 A CN 111235240A CN 202010224158 A CN202010224158 A CN 202010224158A CN 111235240 A CN111235240 A CN 111235240A
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罗景燕
何继谦
张钰莹
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Abstract

本发明涉及一种生物技术领域，尤指一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液，PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri‑F1、下游引物Pri‑R1、野生型探针和突变型探针；本发明采用的引物以及探针的终浓度及特异性都尤其适用于微滴式数字PCR检测中，采用的微滴式数字PCR技术进行检测，具有更高的灵敏度和特异性、准确性，通过本发明配制的反应液或试剂盒，可提高了检测灵敏度、提高检测的准确率，为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导，对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。

Description

人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤指一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒。
背景技术
BRAF基因定位在7号染色体上，编码B-raf蛋白，其参与丝蛋白激酶(MAPK)通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，BRAF基因发生突变后其所编码B-raf蛋白的氨基酸发生改变，造成BRAF激酶持续性激活，该持续性激活信号传导至下游信号通路导致细胞无限制增殖和分化，促使肿瘤细胞增长和进一步恶化。BRAF基因在多数癌症都存在不同比例的突变，其中在恶性黑色素瘤中突变发生率可高达70％，甲状腺乳头状癌、结直肠癌和浆液性卵巢癌等都有着不低的突变发生率，在其他如肺癌、胶质瘤、胃癌和肝癌等癌症中虽然突变发生率不高，但仍不能忽视对BRAF基因突变的筛选治疗。
目前，已鉴定在BRAF基因中存在多达30多种形式的突变，但绝大多数突变频率很低，其中最为显著的是以15号外显子上的V600E突变，所以对BRAF基因V600E位点进行检测可以得到更精确突变检出率，为结直肠癌治疗提供更有效的治疗建议。
目前常用的检测BRAF基因V600E位点的技术主要有FISH、ARMS-PCR检测、一代测序、NGS和IHC等，这些检测方法都存在操作复杂、对实验人员要求较高、检测灵敏度不足和检测周期长等缺点。例如一代测序以及NGS检测成本高，需要配备相应的人员进行分析；FISH、IHC需要经验丰富的实验人员，还存在人为操作误差。而微滴式数字PCR作为第三代PCR，能够不依赖标准曲线对样本进行准确的绝对定量，能够把整个反应分割成数万个微滴反应，避免抑制物的影响，更能挖掘出低频率突变DNA片段。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在公开一种生物技术领域，尤指一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种人BRAF基因V600E位点突变检测的引物，根据人类15号外显子上的BRAF基因V600E位点的突变区域进行针对性设计的特异引物，其特征在于，所述引物为：
以SEQ ID NO.1所示序列为上游引物Pri-F1的核苷酸序列；
SEQ ID NO.1：TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA
以SEQ ID NO.2所示序列为下游引物Pri-R1的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2：GACAACTGTTCAAACTGATGGGAC。
本发明提供一种人BRAF基因V600E位点突变检测的探针，其特征在于，所述探针包括针对人BRAF基因V600E位点的野生型探针和突变型探针；
以SEQ ID NO.3所示序列为野生型探针Pro-WT-VIC的核苷酸序列；
SEQ ID NO.3：5’-VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-MGB-NFQ-3’
以SEQ ID NO.4所示序列为突变型探针Pro-MUT-FAM的核苷酸序列；
SEQ ID NO.4：5’-FAM-CTAGCTACAGAGAAATC-MGB-NFQ-3’。
本发明提供使用上述引物或探针用于配制一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1、野生型探针和突变型探针；PCR反应预混液为用于微滴式数字PCR的微滴式数字PCR用反应预混液，含dUTP/UDG。
优选地，所述突变型探针和所述野生型探针的5’端标记不同的荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团，所述突变型探针Pro-MUT-FAM和野生型探针Pro-WT-VIC荧光报告基团为FAM、VIC或HEX；所述非荧光淬灭基团为NFQ。
优选地，所述上游引物Pri-F1和下游引物Pri-R1的浓度为500～1000nM，更优选浓度为900nM。
优选地，所述突变型探针Pro-MUT-FAM和野生型探针Pro-WT-VIC的浓度为100～500nM，更优选浓度为250nM。
本发明提供一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述PCR反应液，还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂为Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit。
本发明提供一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒应用方法，其特征在于，所述的应用方法包括以下步骤：
1)从待测样品中提取DNA模板，浓度为10～50ng/μl；
2)配制用于ddPCR检测BRAF基因V600E位点突变的PCR反应液：PCR预混液、20μM上游引物、20μM下游引物、10μM突变型探针、10μM野生型探针、ddH2O；
3)以步骤1)的DNA模板，配制用于检测BRAF基因V600E位点突变的微滴式数字PCR检测的PCR特异扩增反应体系；
4)通过MicroDrop-100A样本制备仪将PCR特异扩增反应体系生成微滴；
5)进行数字PCR扩增，扩增的反应程序为：50℃，2min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；95℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；95℃30s，60℃60s，45个循环，升降温速率0.6℃/秒；98℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；16℃保持；
使用MicroDrop-100B生物芯片分析仪检测荧光信号，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop计算给出突变率/待检靶分子的拷贝数。
优选地，所述步骤2)中，配制PCR反应液的份量包括：PCR预混液10μl，20μM上游引物1.8μl，20μM下游引物1.8μl，10μM突变型探针0.5μl，10μM野生型探针0.5μl，ddH2O 3.4μl。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明采用的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及采用的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其终浓度及特异性都更适用于微滴式数字PCR检测，两者结合可发挥优良显著的特异性。
(2)本发明中采用的微滴式数字PCR技术进行检测，该技术能将单个样本的20μl检测BRAF基因V600E位点突变的特异扩增反应体系分割成10万个小微滴反应体系，通过检测小微滴反应体系有无带检靶分子的荧光值，计算出靶分子的具体拷贝数，不依赖于标准曲线和参照样本，这种检测方式具有更高的灵敏度和特异性、准确性，为肺癌个体化精准用药指导、药效评估以及疗效检测提供了重要的参考依据。
(3)本发明适用于肿瘤新鲜冰冻组织、石蜡包埋组织及低浓度的血液循环游离核酸中人BRAF基因V600E位点的检测。与目前临床上使用的ARMS-PCR方法相比，本发明提高了检测灵敏度，为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导；尤其对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。
附图说明
图1为本发明采用MicroDropTM微滴式数字PCR系统检测BRAF基因V600E位点突变频率线性FAM荧光信号一维图.
图2为本发明采用MicroDropTM微滴式数字PCR系统检测BRAF基因V600E位点突变频率线性VIC荧光信号一维图.
图3为本发明采用MicroDropTM微滴式数字PCR系统检测BRAF基因V600E位点突变频率线性微滴荧光分布二维图。
图4为本发明BRAF基因V600E位点突变频率线性拟合图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：
微滴式数字PCR(ddPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其原理为：标准PCR反应体系经过微滴发生后，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，经过PCR循环后之后，含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，没有模板的微滴就没有荧光信号产生。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
下述实施例中，MicroDropTM微滴式数字PCR系统来自广东永诺医疗科技有限公司，由MicroDrop-100A样本制备仪和MicroDrop-100B生物芯片分析仪组成；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：用于ddPCR检测BRAF基因V600E位点突变的PCR反应液的配制方法
(1)PCR预混液：为广东永诺医疗科技有限公司的MicroDropTM数字PCR仪配套的微滴式数字PCR用反应预混液(含dUTP/UDG)；
(2)引物探针：上游引物和下游引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中每条引物的浓度已配制为20μM，终浓度均为900nM；野生型探针和突变型探针如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，其中每条引物的浓度已配制为10μM，终浓度均为250nM；
(3)PCR反应液如表1所示：PCR预混液10μl、20μM上游引物1.8μl、20μM下游引物1.8μl、10μM突变型探针0.5μl、10μM野生型探针0.5μl、ddH2O 3.4μl，一个反应的总体积为18μl；
表1
PCR预混液 10ul
上游引物(20μM) 1.8μl
下游引物(20μM) 1.8μl
突变型探针(10μM) 0.5μl
野生型探针(10μM) 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 3.4μl
总体积 18μl
(4)基因组DNA提取：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit，按照试剂盒说明书抽提样本DNA，使用NanoDrop 100检测DNA纯度，凝胶电泳检测DNA的完整性，用qubit3.0荧光计定量DNA，DNA浓度范围在10ng/μl～50ng/μl；
(5)PCR特异扩增反应体系：在表1的PCR反应液加入2μl待测样本DNA，充分混合均匀，瞬时离心，得到20μl PCR特异扩增反应体系。
实施例二：检测方法
本实施例采用的PCR反应液按照实施例一中PCR反应液进行配制，具体的检测方法为：
(1)单个PCR反应体系的配制：取18μl PCR反应液加入2μl DNA模板，充分混合均匀，瞬时离心；
(2)微滴生成：完成配制的20μl数字PCR扩增体系加入到8个通道的微滴生成芯片的水相孔中，然后加入40μl微滴生成油到8个通道的微滴生成芯片的油相孔中，将芯片置于MicroDrop-100A样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中制备PCR微反应液滴；
(5)将微滴生成孔中的PCR微反应液滴小心转移至PCR板上，用封膜仪进行热封；
(6)将完成热封的PCR板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：50℃，2min，1个循环，升降温速率0.6℃/s；95℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/s；95℃30s，60℃60s，45个循环，升降温速率0.6℃/s；98℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/s；16℃保持；
(7)PCR扩增反应后将PCR板置于MicroDrop-100B生物芯片分析仪(广东永诺医疗科技有限公司)中进行检测荧光信号，有核酸分子模板的微滴信号检测仪就会给出荧光信号，没有模板的微滴信号检测仪就没有荧光信号。最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出带检靶分子的拷贝数。
实施例三：BRAF基因V600E位点突变频率线性
本实施例采用实施例二的检测方法对BRAF基因V600E位点突变频率进行检测，具体的检测方法为：
(1)样本制备：使用BRAF基因V600E位点野生型线性质粒按比例稀释BRAF基因V600E位点突变型线性质粒，得到突变频率为0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、5.0％、10％和50％突变频率样本，浓度为1*104拷贝/μl；
(2)单个PCR反应体系的配制：取18μl PCR反应液加入2μl突变频率质粒模板，充分混合均匀，瞬时离心；
(4)微滴生成：完成配制的20μl数字PCR扩增体系加入到8个通道的微滴生成芯片的水相孔中，然后加入40μl微滴生成油到8个通道的微滴生成芯片的油相孔中，将芯片置于MicroDrop-100A样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中制备PCR微反应液滴；
(5)将微滴生成孔中的PCR微反应液滴小心转移至PCR板上，用封板膜进行热封；
(6)将完成热封的PCR板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：50℃，2min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；95℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；95℃30s，60℃60s，45个循环，升降温速率0.6℃/秒；98℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；16℃保持；
(7)PCR扩增反应后将PCR板置于MicroDrop-100B生物芯片分析仪(广东永诺医疗科技有限公司)中进行检测荧光信号，有核酸分子模板的微滴信号检测仪就会给出荧光信号，没有模板的微滴信号检测仪就没有荧光信号。最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出待检靶分子的拷贝数；
(8)根据从QuantDrop数据分析软件得到的数据，计算出突变频率样本实际突变频率(以log10进行转化)，同时比较突变频率样本理论突变频率(以log10进行转化)，计算出BRAF基因V600E位点突变频率线性关系R2值。
实施例四：部分临床样本检测
本实施例采用实施例一所述PCR反应液和参照实施例二检测方法，对部分临床患者样本的BRAF基因V600E位点突变进行检测，同时与市场上现有最佳BRAF基因V600E位点突变检测试剂盒(荧光定量PCR检测方法，ARMS-PCR法)进行比较，具体的检测方法为：
(1)样本制备：277例临床患者样本；
(2)单个PCR反应体系的配制：取18μl PCR反应液加入2μl突变频率质粒模板，充分混合均匀，瞬时离心；
(3)微滴生成：完成配制的20μl数字PCR扩增体系加入到8个通道的微滴生成芯片的水相孔中，然后加入40μl微滴生成油到8个通道的微滴生成芯片的油相孔中，将芯片置于MicroDrop-100样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中制备PCR微反应液滴；
(4)将微滴生成孔中的PCR微反应液滴小心转移至PCR板上，用封板膜进行热封；
(5)将完成热封的PCR板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：50℃，2min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；95℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；95℃30s，60℃60s，45个循环，升降温速率0.6℃/秒；98℃，10min，1个循环，升降温速率0.6℃/秒；16℃保持；
(6)PCR扩增反应后将PCR板置于MicroDrop-100B生物芯片分析仪(广东永诺医疗科技有限公司)中进行检测荧光信号，有核酸分子模板的微滴信号检测仪就会给出荧光信号，没有模板的微滴信号检测仪就没有荧光信号。最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出带检靶分子的拷贝数；
(7)检测结果如表2临床样本检测结果分析表所示：
表2临床样本检测结果分析表
Figure BDA0002427084420000101
Figure BDA0002427084420000102
(8)在277例临床样本对比实验中显示，微滴式数字PCR与ARMS-PCR的结果一致性达95％；结果中不相符的临床样本是ARMS-PCR检测为阴性，而微滴式数字PCR检测为阳性的样本为5例；进一步的手术结果证实4例均为癌组织(其中1例未进行手术)。表明微滴式数字PCR灵敏度高于ARMS-PCR，有助于降低临床漏诊率。本发明是结合微滴式数字PCR对引物探针有较高的要求，对引物探针进行优选，提高对目标基因特异性扩增，提高了在微滴式数字PCR上的检测灵敏度。为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导；尤其对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 广州永诺生物科技有限公司；广东永诺医疗科技有限公司
<120> 人BRAF基因 V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctttactt actacacctc agata 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacaactgtt caaactgatg ggac 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagctacag tgaaatctcg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagctacag agaaatctc 19

Claims (9)

1.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的引物，其特征在于，所述引物为：
以SEQ ID NO.1所示序列为上游引物Pri-F1的核苷酸序列；
以SEQ ID NO.2所示序列为下游引物Pri-R1的核苷酸序列。
2.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的探针，其特征在于，所述探针包括针对人BRAF基因V600E位点的野生型探针和突变型探针；
以SEQ ID NO.3所示序列为野生型探针的核苷酸序列；
以SEQ ID NO.4所示序列为突变型探针的核苷酸序列。
3.使用权利要求1所述引物或权利要求2所述探针用于配制一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1、野生型探针和突变型探针。
4.根据权利要求3所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述突变型探针和所述野生型探针的5’端标记不同的荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团。
5.根据权利要求3所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述上游引物Pri-F1和下游引物Pri-R1的浓度为500～1000nM。
6.根据权利要求3所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述突变型探针和野生型探针的浓度为100～500nM。
7.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3～6任一项所述的PCR反应液。
8.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒应用方法，其特征在于，所述的应用方法包括以下步骤：
1)提取DNA模板，浓度为10～50ng/μl；
2)配制PCR反应液：PCR预混液、20μM上游引物、20μM下游引物、10μM突变型探针、10μM野生型探针、ddH2O；
3)配制PCR特异扩增反应体系；
4)将PCR特异扩增反应体系生成微滴；
5)进行数字PCR扩增，并通过软件计算突变率。
9.根据权利要求8所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒应用方法，其特征在于，所述步骤2)中，配制PCR反应液的份量包括：PCR预混液10μl，20μM上游引物1.8μl，20μM下游引物1.8μl，10μM突变型探针0.5μl，10μM野生型探针0.5μl，ddH2O 3.4μl。
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