CN107488727A - 3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107488727A
CN107488727A CN201710888201.3A CN201710888201A CN107488727A CN 107488727 A CN107488727 A CN 107488727A CN 201710888201 A CN201710888201 A CN 201710888201A CN 107488727 A CN107488727 A CN 107488727A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
kras
mutation
fam
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710888201.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107488727B (zh
Inventor
蔡畅
闫慧婷
王海波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Zhenhe Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhen (beijing) Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhen (beijing) Technology Co Ltd filed Critical Zhen (beijing) Technology Co Ltd
Priority to CN201710888201.3A priority Critical patent/CN107488727B/zh
Publication of CN107488727A publication Critical patent/CN107488727A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107488727B publication Critical patent/CN107488727B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。该引物探针组合物包括：检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针。上述引物探针组合物由于包含了与肠癌相关的7个常见突变位点，根据不同突变位点的引物及携带的不同荧光信号的探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D‑PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。

Description

3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂 盒及方法
技术领域
本发明涉及3D-PCR检测领域，具体而言，涉及一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。
背景技术
根据国际癌症研究中心(IARC)预测，癌症发病人数在未来将会以每年3％～5％的速度递增，并有调查研究显示：中低收入国家癌症的发病率远高于发达国家，预计在2020年全球将有2000万新发病例的产生，死亡病例将达1200万。所以各国对癌症采取的预防措施刻不容缓。每年我国用于癌症病人的医疗支出高达800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近些年来，我国癌症的发病率呈逐年上升的趋势，尤其是肠癌发病率明显上升。
研究显示：肿瘤相关基因出现异常导致肿瘤细胞逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等现象的出现。而传统的肿瘤治疗主要针对细胞DNA，这种治疗手段往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，一些正常的细胞也被错杀。随着生物医药科技的快速发展，肿瘤的诊断方法和治疗手段不断提高，尤其是靶向治疗的出现，使肿瘤的死亡率得到了有效的控制。与传统的肿瘤治疗相比，靶向治疗具有高选择性和低毒性等优点，同时效果好、毒副作用小，可以长期指导临床用药，其作用机理是针对肿瘤细胞特有的靶点设计结合药物，从而达到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用，对患者而言不仅延长了患者的生存时间还改善了患者的生存质量。
研究表明，KRAS基因的突变导致细胞逃逸凋亡，无限增值。在正常情况下，当细胞受到外界刺激后，生长因子等信号通路被激活，KRAS被激活的生长因子磷酸化后短暂活化，进而激活该信号通路中的下游信号蛋白，调控细胞生长增值，而后KRAS基因失活；当KRAS基因发生异常时，则不受上游生长因子的调控，从而导致下游细胞持续增值，并阻止细胞凋亡。KRAS突变多发生在第12位和13位密码子上，其中以G13D、G12D、G12A、G12C、G12S、G12V这6种突变类型最为常见，约占KRAS基因总突变的90％以上。
研究表明，BRAF基因在结直肠癌等恶性肿瘤中均存在不同程度的突变，突变频率约为15％左右，该突变主要发生在15外显子的激活区，其中90％以上的突变为15外显子1977位核苷酸上的T突变为A，导致其编码的氨基酸由缬氨酸突变为谷氨酸。BRAF编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过RAS-RAF-MEK-MAPK激酶信号传导干预肿瘤细胞生长增值，最终导致肿瘤的发生。MAPK信号通路可正常调节细胞生长、分裂和分化，也可因BRAF家族成员致癌性突变体的形成而引发癌症，其中BRAF V600突变体的产生显著增强了BRAF的活性，从而导致癌细胞分裂失控。
目前检测基因变异的技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法，方法简介于下：
Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法。其基本原理为每个反应含有所有四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧核苷酸而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记，并将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，在激光的作用下跑到最末端的DNA就可以发出荧光。由于ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP(4种双脱氧核糖核苷酸)荧光标记不同，计算机即可根据颜色判断在这个位置上碱基究竟是哪一个(A，T，G，C)。
ARMS法，为突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。引物3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。
然而，上述两种方法都存在检测灵敏度低的缺陷。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法，以解决现有技术的方法在检测肠癌基因的突变时存在检测灵敏度低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物，该引物探针组合物包括：检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针。
进一步地，检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变的引物及探针以及检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针分别如下表1所示：
表1：
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的试剂盒，该试剂盒包括上述任一种引物探针组合物。
进一步地，试剂盒中扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在。
进一步地，试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选阳性质控品为含有KRAS或BRAF基因突变的DNA与野生型DNA的混合液；更优选，KRAS-G12A的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H1573的DNA，KRAS-G12S的阳性质控品DNA的来源为细胞系A549的DNA，KRAS-G12V的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H441的DNA，KRAS-G12D的阳性质控品DNA的来源为细胞系A427的DNA，KRAS-G12C的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H2122的DNA，KRAS-G13D的阳性质控品DNA的来源为细胞系HCT116的DNA，BRAF-V600E的阳性质控品DNA的来源为细胞系SK-HEP-1的DNA。
进一步地，试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。
根据本发明的另一方面，提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的方法，该方法包括：利用上述任一种试剂盒配制KRAS和BRAF基因每个突变位点的PCR反应体系；将各突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；将数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；将得到扩增结果的数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据荧光信号判读每个突变位点的突变结果。
进一步地，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图按顺时针方向依次分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(+)以及FAM(-)VIC(-)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，则根据荧光信号判读每个突变位点的突变结果的步骤包括：若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定该待测样本为阳性样本；若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目<3，则判定待测样本为阴性样本或低于检测限。
应用本发明的技术方案，本申请提出的上述适用于3D-PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物，由于包含了与肠癌相关的7个常见突变位点，根据不同突变位点的引物及携带的不同荧光信号的探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D-PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1A至图7B示出了根据本发明的实施例的1中采用本申请的7个肠癌基因突变检测引物和探针与对比引物和探针的检测结果图；其中，
图1A示出了采用KRAS基因的G12A突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图1B示出了采用KRAS基因的G12A突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图2A示出了采用KRAS基因的G12C突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图2B示出了采用KRAS基因的G12C突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图3A示出了采用KRAS基因的G12D突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图3B示出了采用KRAS基因的G12D突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图4A示出了采用KRAS基因的G12S突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图4B示出了采用KRAS基因的G12S突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图5A示出了采用KRAS基因的G12V突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图5B示出了采用KRAS基因的G12V突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图6A示出了采用KRAS基因的G13D突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图6B示出了采用KRAS基因的G13D突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图7A示出了采用BRAF基因的V600E突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图7B示出了采用BRAF基因的V600E突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中检测基因突变的方法存在检测灵敏度低的缺陷，为了改善现有技术中的这一状况，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种3D-PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物，该引物组合物包括检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，所述6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针。
本申请提出的上述适用于3D-PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物，由于同时包含了与肠癌相关的7个常见突变位点，根据不同突变位点的引物及携带的不同荧光信号的探针分别对各突变位点进行检测，不仅能同时检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D-PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。
优选地，本申请针对上述7个突变位点设计了如表1所示的引物及探针。
表1：
其中，引物对含目的突变的片段的扩增效率较高，而野生探针能够特异与扩增片段中的野生型模板结合，突变探针能够特异与扩增片段中的突变型模板结合，从而使得检测特异性更高。以KRAS基因的G12A突变检测探针为例，野生探针为TTGGAGCTGGTGGC，突变探针为TTGGAGCTGGTCGC，两者存在一处G与C的区别，因而能够将野生型模板和突变型模板区分开来。
在本申请另一种典型的实施方式中，提出一种采用3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的试剂盒，该试剂盒包括上述的任一种引物探针组合物。该试剂盒所适用的3D数字PCR系统包括硅芯片、加载系统和荧光分析仪及其相关的耗材。该系统采用高密度的纳升流控芯片技术，将样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中，并使用热循环仪进行PCR扩増DNA，扩增后采用3D数字PCR系统进行荧光读取，逐个分析样品中的荧光信号。最终根据泊松分布原理以及空白孔的比例，利用系统自带的分析软件可计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。
本发明试剂盒检测的基因突变位点信息见以下表2。
本发明试剂盒的引物、探针序列信息见上述表2。
为了进一步提高本申请的试剂盒的使用便利性和检测准确性，在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒中，扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在，这样对于同一检测样本，在配制PCR反应体系时，不需要对引物和探针进行分别添加，提高检测效率。
在本申请另一种优选的实施例中，本申请的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选阳性质控品为含有KRAS或BRAF基因突变的DNA与野生型DNA的混合液。其中，含有KRAS或BRAF基因突变的DNA采用含有KRAS或BRAF基因突变的细胞系DNA与不含有相应突变的野生型细胞系DNA按照特定比例进行混合，形成DNA混合液。这样的阳性质控品相比化学合成的DNA质控品，更接近待测样本中DNA的真实状态，因而，检测结果也较合成的DNA更准确。
优选地，本申请上述试剂盒中的阳性质控品来源如下：KRAS-G12A的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H1573的DNA；KRAS-G12S的阳性质控品DNA的来源为细胞系A549的DNA；KRAS-G12V的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H441的DNA；KRAS-G12D的阳性质控品DNA的来源为细胞系A427的DNA；KRAS-G12C的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H2122的DNA；KRAS-G13D的阳性质控品DNA的来源为细胞系HCT116的DNA；BRAF-V600E的阳性质控品DNA的来源为细胞系SK-HEP-1的DNA。
为了使3D数字PCR反应检测更快速，更高效，在另一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，该预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。该预混液可以采用现有的适用于3D数字PCR的PCR Mix预混液。
具体地，本申请试剂盒的组成见以下表3。
表3：
在本申请第三种典型的实施方式中，还提供了一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的方法，该方法包括：利用上述任一种试剂盒配制KRAS和BRAF基因每个突变位点的PCR反应体系；将各突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；将数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；将得到扩增结果的数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据荧光信号判读每个突变位点的突变结果。利用本申请的试剂盒进行KRAS和BRAF突变基因的检测，不仅检测灵敏度高，而且检测效率和准确性均很高。
在另一种优选的实施例中，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图按顺时针方向依次分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(+)以及FAM(-)VIC(-)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，则根据荧光信号判读每个突变位点的突变结果的步骤包括：若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定待测样本为阳性样本；若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目<3，则判定待测样本为阴性样本或低于检测限。
上述优选的实施例中，根据荧光信号判读每个突变位点的突变结果的步骤根据不同对照样本的荧光值强弱进行合理设定即可，并不仅限于等于P对照荧光值，还可以根据根据人工判断选择小于或大于P对照荧光值，但明显能够确定属于阳性的荧光信号或属于阴性的荧光信号的，也可以手动调节相应的荧光值范围。
下面详细介绍本申请的引物、探针、试剂盒的检测过程。
一、主要原材料
a)靶位点
将KRAS G12A、KRAS G12C、KRAS G12D、KRAS G12S、KRAS G12V、KRAS G13D和BRAFV600E基因作为靶序列。
b)引物、探针
从GenBank上下载KRAS G12A、KRAS G12C、KRAS G12D、KRAS G12S、KRAS G12V、KRASG13D和BRAF V600E基因序列，根据引物探针设计原则，通过Primer Express3.0软件设计特异性引物及TaqMan MGB探针。引物和探针分别购自金唯智生物科技有限公司和赛默飞世尔科技公司。
c)阴阳性质控品
阴性质控品为野生型细胞系基因组DNA，本公司培养和提取DNA。
阳性质控品为突变细胞系(KRAS G12A、KRAS G12C、KRAS G12D、KRAS G12S、KRASG12V、KRAS G13D和BRAF V600E)基因组DNA与野生型细胞系基因组DNA按比例混合的混合液，本公司培养、提取DNA及后期混合。
d)芯片及其缓冲液的混合液(Buffer mix)
采用QuantStudioTM3D数字PCR Master Mix v2及QuantStudioTM3D数字PCR 20KChip Kit v2，购自赛默飞世尔科技公司。
二、本申请试剂盒的操作方法为：
1.待测样本：
待测样本来源为肿瘤石蜡包埋(FFPE)样本中提取的DNA。
2.检测方法：
一种检测人类KRAS和BRAF基因突变的芯片式数字PCR方法，包括以下步骤：从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按下表4配制每个测试的PCR预混液，配制体系如下表4：
表4：
(1)配制上述检测人类KRAS基因和BRAF基因突变的反应体系；
(2)把反应体系14.5ul上样到数字PCR芯片中；
(3)把数字芯片放入到专用数字PCR仪中，进行PCR扩增；PCR扩增程序如下表5：
表5：
(4)从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后，将芯片放入到芯片扫描仪中扫描荧光信号；
(5)根据荧光信号判读结果。
3.分析数据及显示结果：
对PCR扩增后的产物进行荧光信号的收集(其中，FAM信号呈蓝色，VIC信号呈红色，ROX呈黄色，FAM信号与VIC信号叠加呈绿色)，检测FAM和VIC的荧光信号。根据设计的探针类型、两种荧光信号的点数及比例判断样本是否含有突变基因、计算突变率等。
ddPCR结果图分为4个象限：FAM+VIC-区、FAM+VIC+区、FAM-VIC-区和FAM-VIC+区。
①根据阳性对照结果图中成簇蓝色点的荧光值，划出阴性对照和样本的蓝色点。比如阳性对照蓝色点荧光值在5000附近，则阴性对照或样本的蓝色点必须同时满足下列2个条件：①落在“FAM+VIC-”区②荧光值在5000左右且成簇分布；
②阴性对照有效性判定：蓝色点<3个；
③样本阴阳性判定：样本蓝色点≥3个，则判定有相关位点突变；样本蓝色点<3个，则判定无相关突变或低于最低检测限。
注释：
黄色：既没有FAM荧光信号也没有VIC荧光信号的点代表该微孔没有进入DNA模板，因此没有任何扩增信号，即无模板(ROX，左下)；
红色：有VIC荧光信号但没有FAM荧光信号的点代表该微孔进入了野生型模板，因此有VIC荧光信号，即野生型模板(VIC，右下)；
蓝色：有FAM荧光信号但没有VIC荧光信号的点代表该微孔进入了突变的DNA模板，因此有FAM荧光信号产生，即突变型模板(FAM，左上)；
绿色：既有FAM荧光信号也有VIC荧光信号的点代表该微孔同时进入了野生型和突变型两种模板，因此同时出现了FAM+VIC信号，即混合模板(野生型+突变型，右上)。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1：本申请试剂盒的引物和探针的效果检测
1.制备本申请试剂盒的引物探针
选用本申请表1中所示的KRAS和BRAF的引物和探针；
选用其他合成的KRAS和BRAF的引物和探针进行比较(简称对比引物和探针)，其他合成的引物探针序列信息如表6：
表6：
2.扩增试剂准备
从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下表7配制每个测试的PCR预混液。配制体系如下表7：
表7：
3.加样
把反应体系14.5ul上样到数字PCR芯片中。
4.PCR扩增
PCR扩增程序为：
96℃，10min；
(60℃，2min；98℃，30sec)39个循环；
60℃，2min；10℃，结束，反应体系设为14.5μl。
5.读取数据
从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后，将芯片放入到芯片扫描仪中扫描荧光信号。
6.结果
结果见附图1A至图7B(附图为黑白图，彩图未显示)。从图1A至图7B，同一图号下的A与B的对比可以看出，A为现有技术的引物及探针检测结果，可以看出四个象限分布不明确；而B为本申请试剂盒产品，四个象限均成簇出现，与背景有明确分界线。可见，本申请的试剂盒检测准确性更高。
实施例2：本申请试剂盒的最低检出限检测
1.制备最低检测限质控品
选用KRAS基因G12A、G12C、G12D、G12S、G12V、G13D突变体的DNA与KRAS阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制各突变体的最低限质控品。
选用BRAF基因V600E突变体的DNA和BRAF阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制BRAF基因突变的最低限质控品。
DNA模板量为30ng，突变比例为0.2％的样本作为本实施例的检出限质控品。最低检测限质控品具体如表8所示：
表8：
2.反应体系和操作步骤同实施例1。
3.重复检测20次，检测得到的实验结果如表9所示：
表9：
名称 定性结果
KRAS G12A 阳性
KRAS G12C 阳性
KRAS G12D 阳性
KRAS G12V 阳性
KRAS G12S 阳性
KRAS G13D 阳性
BRAF V600E 阳性
由表9的实验结果可知，DNA模板量为30ng，本申请的试剂盒能检出突变比例为0.2％的KRAS或BRAF基因突变。
实施例3：本申请试剂盒的重复性检测
1.制备重复性质控品
选用KRAS基因G12A、G12C、G12D、G12S、G12V、G13D突变体的DNA与KRAS阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制各突变体的突变比例为1％的样本，并且，选用BRAF基因V600E突变体DNA与BRAF阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制突变比例为1％的样本，作为本实施例的重复性质控品。具体如表10所示：
表10：
2.反应体系和操作步骤同实施例1
3.重复检测10次，检测得到的实验结果分别如表11-表17所示：
表11：
由表11的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表12：
由表12的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表13：
由表13的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表14：
由表14的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表15：
由表15的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表16：
由表16的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表17：
由表17的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
实施例4：本申请试剂盒的抗干扰检测
选用含有与KRAS基因G12A、G12C、G12D、G12S、G12V、G13D突变相邻的突变(KRASQ61H、KRAS Q61K、KRAS A146T)的细胞系DNA，具体细胞系信息如表18所示，作为本实施例的抗干扰质控品。具体如表19所示：
表18：
细胞系名称 突变位点 突变位置及类型
AMO-1 KRAS A146T c.436G>A
NCI-H460 KRAS Q61H c.183A>C
SW948 KRAS Q61L c.182A>T
表19：
细胞系名称 标本种类
NCI-H460 KRAS基因Q61H突变的细胞系DNA
SW948 KRAS基因Q61L突变的细胞系DNA
AMO-1 KRAS基因A146T突变的细胞系DNA
2.实验反应体系和操作步骤同实施例1
3.重复检测2次，检测得到的实验结果如表20至表22所示：
表20：
由表20的实验结果可知，含KRAS Q61H突变的细胞系DNA，检测试剂盒的7个位点结果阴性符合率100％。
表21：
由表21的实验结果可知，含KRAS Q61L突变的细胞系DNA，检测试剂盒的7个位点结果阴性符合率100％。
表22：
由表22的实验结果可知，含KRAS A146T突变的细胞系DNA，检测试剂盒的7个位点结果阴性符合率100％。
从以上的描述中，可以看出，本申请上述的实施例实现了如下技术效果：
(1)目前市面上没有用于检测肠癌用药相关基因KRAS的G12、KRAS的G13及BRAF的V600E多种突变位点的数字PCR试剂盒，而本申请的试剂盒可检测肠癌相关的7个常见突变位点，根据不同突变位点携带的不同荧光信号进行区分不同位点的突变，结果直观清晰。
(2)灵敏度高：本试剂盒在复杂的检测背景下，检测灵敏仍可达0.1～0.2％，相比于ARMS方法的1％灵敏度更有优势。
(3)特异性强：本试剂盒针对KRAS基因的多种突变以及BRAF基因设计了特定的引物和探针，所述引物和探针在PCR扩增反应时特异性强，扩增效率高，极大的减少了非特异性扩增造成的干扰。
(4)本申请的试剂盒提供了阴阳性质控品，可以进行对照反应，保证了实验的质控。
(5)操作简单快捷，与NGS相比，操作步骤少，周期短，成本低，反应通量灵活(1～24个样本均可)。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 臻和（北京）科技有限公司
<120> 3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物组合物、试剂盒及方法
<130> PN73760ZHKEJ
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgt 29
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ttggagctgg tggc 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
ttggagctgg tcgc 14
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
ggcctgctga aaatgactga a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
tggagctggt ggcgt 15
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
tggagctggt gtcgta 16
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
tgctgaaaat gactgaatat aaacttgtg 29
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
agctgtatcg tcaaggcact ctt 23
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
tggagctggt ggcgta 16
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
tggagctggt agcgt 15
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
ggcctgctga aaatgactga a 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
ttggagctgg tggcg 15
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
tggagctggt gacgt 15
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
tgctgaaaat gactgaatat aaacttgtg 29
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
tagctgtatc gtcaaggcac tctt 24
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
ttggagctgg ttgcgta 17
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
tggagctggt ggcgt 15
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
ggcctgctga aaatgactga a 21
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
ttggagctgg tggcg 15
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
tggagctggt gacgt 15
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
gcccaggagt gccaagaga 19
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
ttaggatgag gtgagatgct ttcc 24
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
atctaatggg aaagttttag gtt 23
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
ctaatgggaa agattt 16
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgt 29
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 31
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
ttggagctgg tggc 14
<210> 32
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
ttggagctgg tcgc 14
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
ggcctgctga aaatgactga a 21
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
tggagctggt ggcgt 15
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
tggagctggt gtcgta 16
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
tgctgaaaat gactgaatat aaacttgtg 29
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
agctgtatcg tcaaggcact ctt 23
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
tggagctggt ggcgta 16
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
tggagctggt agcgt 15
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
ggcctgctga aaatgactga a 21
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
ttggagctgg tggcg 15
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
tggagctggt gacgt 15
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
tgctgaaaat gactgaatat aaacttgtg 29
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
tagctgtatc gtcaaggcac tctt 24
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
ttggagctgg ttgcgta 17
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
tggagctggt ggcgt 15
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
ggcctgctga aaatgactga a 21
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
gctgtatcgt caaggcactc ttg 23
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
ttggagctgg tggcg 15
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
tggagctggt gacgt 15
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
gcccaggagt gccaagaga 19
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
ttaggatgag gtgagatgct ttcc 24
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
atctaatggg aaagttttag gtt 23
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
ctaatgggaa agattt 16

Claims (8)

1.一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括：
检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变各自的引物及探针，其中，所述6种氨基酸突变分别为G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及
检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述检测KRAS基因2号外显子上6种氨基酸突变的引物及探针以及所述检测BRAF基因15号外显子上V600E氨基酸突变的引物及探针分别如下表1所示：
表1：
3.一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选所述阳性质控品为含有所述KRAS或BRAF基因突变的DNA与野生型DNA的混合液；更优选，KRAS-G12A的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H1573的DNA，KRAS-G12S的阳性质控品DNA的来源为细胞系A549的DNA，KRAS-G12V的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H441的DNA，KRAS-G12D的阳性质控品DNA的来源为细胞系A427的DNA，KRAS-G12C的阳性质控品DNA的来源为细胞系NCI-H2122的DNA，KRAS-G13D的阳性质控品DNA的来源为细胞系HCT116的DNA，BRAF-V600E的阳性质控品DNA的来源为细胞系SK-HEP-1的DNA。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，所述预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。
7.一种3D数字PCR检测KRAS和BRAF基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求3至6中任一项所述的试剂盒配制KRAS和BRAF基因的每个突变位点的PCR反应体系；
将各所述突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；
将所述数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；
将得到所述扩增结果的所述数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判读每个所述突变位点的突变结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，所述荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图按顺时针方向依次分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(+)以及FAM(-)VIC(-)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，则根据所述荧光信号判读每个所述突变位点的突变结果的步骤包括：
若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且所述待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定所述待测样本为阳性样本；
若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且所述待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目<3，则判定所述待测样本为阴性样本或低于检测限。
CN201710888201.3A 2017-09-26 2017-09-26 3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法 Active CN107488727B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710888201.3A CN107488727B (zh) 2017-09-26 2017-09-26 3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710888201.3A CN107488727B (zh) 2017-09-26 2017-09-26 3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107488727A true CN107488727A (zh) 2017-12-19
CN107488727B CN107488727B (zh) 2020-06-02

Family

ID=60653513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710888201.3A Active CN107488727B (zh) 2017-09-26 2017-09-26 3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107488727B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161594A (zh) * 2018-08-17 2019-01-08 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测braf基因突变的方法及其试剂盒
CN116463423A (zh) * 2023-06-06 2023-07-21 基因科技（上海）股份有限公司 基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164495A (zh) * 2017-06-12 2017-09-15 安徽安龙基因医学检验所有限公司 用于人类kras基因突变检测的试剂盒及其检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164495A (zh) * 2017-06-12 2017-09-15 安徽安龙基因医学检验所有限公司 用于人类kras基因突变检测的试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID SEFRIOUI，ET AL: "Clinical value of chip-based digital-PCR platform for the detection of circulating DNA in metastatic colorectal cancer", 《DIGESTIVE AND LIVER DISEASE》 *
DAVID SEFRIOUI，ET AL: "Comparison of the quantification of KRAS mutations by digital PCR and E-ice-COLD-PCR in circulating-cell-free DNA from metastatic colorectal cancer patients", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
VALERIE TALY,ET AL: "Multiplex Picodroplet Digital PCR to Detect KRAS Mutations in Circulating DNA from the Plasma of Colorectal Cancer Patients", 《CLINICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161594A (zh) * 2018-08-17 2019-01-08 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测braf基因突变的方法及其试剂盒
CN116463423A (zh) * 2023-06-06 2023-07-21 基因科技（上海）股份有限公司 基因甲基化与突变联合检测试剂及其在结直肠癌诊断中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107488727B (zh) 2020-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107488728B (zh) 3d数字pcr检测egfr特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN105624309B (zh) 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒
CN103451311B (zh) 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用
Oh et al. Detection of low-level KRAS mutations using PNA-mediated asymmetric PCR clamping and melting curve analysis with unlabeled probes
CN103923975B (zh) 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
CN103923974B (zh) 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
Petrova et al. IDH1 and IDH2 mutations in patients with acute myeloid leukemia: Suitable targets for minimal residual disease monitoring?
CN110964814A (zh) 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法
Jiang et al. Evaluation of EGFR mutations in NSCLC with highly sensitive droplet digital PCR assays
CN107488727B (zh) 3d数字pcr检测kras和braf基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法
Laig et al. Digital PCR and the QuantStudio™ 3D Digital PCR system
CN110452983B (zh) 一种检测kras基因12密码子6种热点突变的引物、探针、检测体系和试剂盒及方法
CN108998558B (zh) 一种水稻粒宽调控基因gw8的荧光分子标记及其引物
CN104774963A (zh) 检测pik3ca基因突变的试剂盒及其检测方法
CN108728537A (zh) 一种检测人egfr基因21号外显子l858r位点突变的引物、试剂盒和方法
CN112852967A (zh) 一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒
KR101775953B1 (ko) 돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트
Hayashi et al. Usefulness of immunohistochemistry for the detection of the BRAF V600E mutation in ovarian serous borderline tumors
CN111304329A (zh) 一种检测braf基因v600e位点突变的试剂盒
CN111235240A (zh) 人braf基因v600e位点突变检测的pcr反应液与试剂盒
Zhao A comparative study of ddPCR and sanger sequencing for quantitative detection of low-frequency mutation rate
US10053737B2 (en) Methods and compositions for treating cancer by identifying one or more ERK mutations
Atsumi et al. Eprobe-mediated screening system for somatic mutations in the KRAS locus
CN109825590B (zh) 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物
CN112143815B (zh) 一种用于检测人fgfr2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 401, building D, Xidong chuangfong building, No. 88, Danshan Road, anzhen street, Xishan District, Wuxi City, Jiangsu Province

Applicant after: Wuxi Zhenhe Biotechnology Co., Ltd

Address before: 100091 No. 9, building 35, 908 Garden North Road, Beijing, Haidian District, 9

Applicant before: GENECAST (BEIJING) TECHNOLOGY Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: 1310-1318, block C, Xidong chuangfong building, 88 Danshan Road, anzhen street, Xishan District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214500

Patentee after: Wuxi Zhenhe Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Room 401, block D, Xidong Chuang Rong building, 88 Danshan Road, anzhen street, Xishan District, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee before: Wuxi Zhenhe Biotechnology Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 1310-1318, block C, Xidong chuangfong building, 88 Danshan Road, anzhen street, Xishan District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214500

Patentee after: Wuxi Zhenhe Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 1310-1318, block C, Xidong chuangfong building, 88 Danshan Road, anzhen street, Xishan District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214500

Patentee before: Wuxi Zhenhe Biotechnology Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder