CN108277263A - 一种检测braf基因v600e的引物探针组合物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物及其检测方法，所述引物探针组合物包括针对BRAF基因V600E位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对BRAF基因V600E位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对BRAF基因V600E位点的特异性引物SEQ ID NO.3‑4，通过针对V600E位点特定区域进行设计引物并修饰探针，二者相互匹配，并将ddPCR与高特异性的引物探针组合物相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，各步骤协同增效，最终提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物及其检测方法

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物及其检测方法。

背景技术

BRAF基因位于染色体臂7q34上，编码BRAF蛋白，而丝氨酸-苏氨酸激酶是Ras-Raf-Mek-Erk-MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号级联的一部分，该途径的激活涉及促进细胞的生长，增殖和分化。人体中存在三种功能性RAF蛋白，即ARAF、BRAF和CRAF。其中，BRAF具有最高的基础激酶活性，是MAPK通路最有效的激活剂。BRAF基因由18个外显子组成，最常见的活化突变位于1799位核苷酸的外显子15中，将胸腺嘧啶转换为腺嘌呤，这导致在位置600的谷氨酸取代缬氨酸，其被命名为V600E。该突变发生在BRAF蛋白的激酶结构域内，据报道其激酶活性高于其正常对应物的10倍。因此，它作为癌基因能够促进细胞生长，分化和生存。现有已经鉴定了30多种不同的BRAF突变，然而V600E占所有BRAF突变的约90％，是临床实验室通常测试的突变。BRAF基因突变在许多不同的癌症中发现，发生率最高的恶性黑色素瘤(27-70％)，甲状腺乳头状癌(36-53％)，结直肠癌(5-22％)和浆液性卵巢癌(30％)。然而，它也可能发生在其他癌症中，包括肺癌、胶质瘤、室管膜瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、肝癌、胃癌和食管癌中。

靶向治疗作为一种新兴治疗手段，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。然而靶向药物的选择依赖于患者的基因分型，靶向药物往往有其对应的靶基因，当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活，或者是调控细胞凋亡的信号通路被抑制，当使用相应的靶向药物之后，该通路被阻断，肿瘤细胞被杀死。因此针对癌症的靶基因以及其驱动基因的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础。

现有的癌基因的检测方法主要包括QPCR、一代测序、FISH、IHC等。但是，这些方法检测步骤繁琐，且敏感度低，而且针对FISH以及IHC的检测结果还需要有经验的技术人员进行鉴定。近几年来，液体活检出现在公众的视野之中，《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一，可以实现稀有变异和拷贝数变异的检出，灵敏度高。循环肿瘤DNA(ctDNA)是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于基因分型和肿瘤发展状态及预后的无创检测。CtDNA是游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)的一种，最早应用于产前胎儿性别的判断和筛查唐氏综合征等发育性疾病。但是存在于外周血液中的游离DNA与癌症关系的理解十分缓慢，原因是ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。随着肿瘤的疾病进展，ctDNA在血液中的含量也随之升高，液体活检技术在超早期就能对血液中含有的极微量的ctDNA进行捕获测序，为肿瘤早期诊断及相关突变提供参考依据，这对癌症的早期发现是一次革命性的进步。

针对现有的癌基因检测方法存在如下缺陷与不足：第一，传统检测优化方法主要依靠技术人员的经验进行结果判读，不能直接、客观、准确反映检测结果，也不能对DNA进行绝对定量；第二，现有的基于BRAF基因V600E位点的检测优化方法，通常对样本的cfDNA总量和质量要求高，容易受大量血缘DNA以及反应抑制剂的影响；第三，现有的基于BRAF基因V600E位点的检测优化方法检测步骤繁琐，且检测灵敏度低，会存在一定量的假阳性检测结果，尤其是血浆样本中cfDNA假阳性检出率更高，因为cfDNA主要是来源于胚系起源的良性细胞，ctDNA占比相对低很多；第四，有文献资料显示在cfDNA提取过程中加入carrier RNA并不能促使cfDNA提取总量增加，很有可能会使gDNA大片段聚沉。第四，液体活检步骤繁琐，周期较长，成本高，不适合单个或2个位点的检测。

微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术作为第三代PCR技术，是在传统PCR方法基础上采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与实时荧光定量PCR相比，无需构建标准曲线，不受扩增效率的影响，其结果具有更高的精确度、准确性和灵敏度。微滴数字PCR的核心是能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，其中每个微滴中含有或不含一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度和拷贝数，以绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数。

CN102876784A公开了一种焦磷酸测序法检测BRAF基因多态性的试剂盒及方法，具体是指BRAF基因rs113488022(V600E)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2-4所示的引物，该发明的试剂盒，可以实现对BRAF基因突变进行检测，从而达到对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体(如西妥昔单抗等)、黑色素瘤抑制剂Zelboraf等用药实现安全合理有效的个体化给药。CN104099425A涉及一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，质控引物探针内标混合液包括质控引物对、BRAF基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针和内标模板；检测引物探针内标混合液包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断核酸序列、内标引物对、内标特异性探针和内标模板。但上述技术灵敏度低，操作步骤复杂繁琐，费时费力，检测效率较差。

据美国国家综合癌症网(缩写NCCN)NSCLC临床指南推荐，癌症患者在使用靶向治疗药物之前应进行BRAF基因的突变检测，以选择获益人群。目前市场上针对癌症的基因检测技术主要是FISH、ARMS、一代测序技术或者是二代高通量测序技术。这些检测手段都存在很多弊端，例如：全基因组或者全外显子组的检测，虽然检测内容丰富，但是成本高，而且检测出来的绝大多数信息与患者对应的癌症无关；FISH检测结果的准确性高度依赖于检测人员的经验和技能；二代高通量测序检测步骤繁琐，工作量较大，检测周期较长，仅用于检测1-2个基因位点的突变信息费用较高。因此迫切需要针对肿瘤一个或两个位点进行分析，检测开发一种快速、便捷、准确、经济的检测技术，以便实现靶向治疗动态实时监测。

综上，现有技术对于检测BRAF基因V600E位点突变存在诸多问题，而基于循环肿瘤DNA检测技术现已成为焦点，ddPCR技术可以实现低投入、高灵敏度、高准确性的突变DNA检测，研发一种特异性针对BRAF基因V600E位点突变的ddPCR检测方法，能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险，具有广阔的应用前景和市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物及其检测方法，所述引物探针组合物针对BRAF基因V600E位点特定区域进行设计并修饰，引物和探针相互匹配，并优化检测方法，各步骤协同增效，提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括针对BRAF基因V600E位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对BRAF基因V600E位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对BRAF基因V600E位点的特异性引物SEQ ID NO.3-4。

SEQ ID NO.1为5’-TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT-3’；

SEQ ID NO.2为5’-TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT-3’；

SEQ ID NO:3为5’-CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG-3’；

SEQ ID NO:4为5’-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3’。

优选地，所述探针的3’端带有小沟结合物-非荧光性淬灭基团修饰。

优选地，所述探针的5’端带有荧光基团修饰；

优选地，所述野生型探针的荧光基团与突变型探针的荧光基团不同。

本发明中，小沟结合物为Minor Groove Binders，简称为MGB。

本发明中，所述非荧光性淬灭基团为Non-Fluorescent Quencher(NFQ)，所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ)，它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。

本发明中，所述荧光基团包括FAM基团、TEX基团、TET基团或JOE基团，优选为FAM基团和HEX基团，FAM基团即羟基荧光素，绿色荧光，是荧光素衍生物的一种，和其他荧光素衍生物相比，FAM与氨基反应更快，产物更稳定，使用更加普遍；HEX基团即六氯6甲基荧光素，是在FAM基团上加以改进的，减弱了pH敏感性，FAM和HEX荧光基团配合使用常被用于DNA测序，PCR产物定量和核酸探针等。

本发明中，针对BRAF基因15号外显子V600E突变位点上下游的特定区域，设计了PCR上下游引物和高特异性的突变型检测探针和野生型检测探针，通过选择BRAF基因的特定区域作为设计模板，优化对探针的修饰，在探针3’端采用非荧光性的淬灭基团，并在3’端连接小沟结合物，筛选与探针匹配性更高的引物，引物和探针相片匹配，协同增效，最终提高了检测的灵敏度和准确性，可以对BRAF基因V600E位点突变进行准确检测，并能检测出低频突变。

第二方面，本发明提供一种检测BRAF基因V600E的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品的cfDNA；

(2)配制包含第一方面所述的引物探针组合物的反应体系后加入步骤(1)得到的cfDNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果。

本发明采用针对肿瘤BRAF基因V600E位点设计的1对引物和2条荧光探针对微量cfDNA进行PCR扩增和检测，然后对探针荧光信号值进行数据分析，获得准确的BRAF基因V600E位点信息，其检测结果用于分析和判断靶标基因的突变信息，并为患者治疗和用药指导提供可靠的分析依据。

优选地，步骤(1)所述样品包括石蜡包埋病理切片组织或外周血浆，优选为外周血浆。

优选地，步骤(3)所述ddPCR的反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

外周血中的ctDNA含量很低，比例约为1/1000，因此保证血浆cfDNA提取质量至关重要。

优选地，步骤(1)所述提取样品cfDNA的具体步骤如下：

(1’)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离；

(2’)采用两步纯化法对步骤(1)分离得到的血浆抽提cfDNA。

优选地，在cfDNA提取过程中不加入carrier RNA。

优选地，步骤(1’)所述分离的步骤为：将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃。

优选地，步骤(1’)所述分离的离心转速为1200-1800g，例如可以是1200g、1400g、1600g或1800g。

优选地，步骤(1’)所述分离的离心温度为0-4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃。

优选地，步骤(1’)所述分离的离心时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min或12min。

优选地，步骤(2’)所述两步纯化法的步骤为：首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA。

优选地，步骤(3)所述分析的步骤包括使用微滴分析仪专用分析软件QuantaSoft，根据实验样本和对照样本所生成微滴荧光信号进行分析。在微滴分析仪运行完毕后进行结果分析，根据双通道和单通道检测微滴散点图所显示的微滴所在区域和微滴个数来确定荧光阈值、检测阈值以及阴、阳性结果判读和分析。

作为优选技术方案，一种检测BRAF基因V600E的方法，具体包括如下步骤:

(1)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离，将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃，其中，离心的条件为1200-1800g，0-4℃离心8-12min；

采用两步纯化法对二次离心后得到的血浆抽提cfDNA，首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cf DNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析所述检测结果，ddPCR的反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

本发明通过对大量方法和试剂的筛选，改进血浆中cfDNA的提取方法，不需加入carrier RNA，采用两步醇沉的方法进行提取DNA，并将微滴数字PCR与高特异性的引物序列和探针序列相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，创造性的提出了一种实时、无创、精准、快速的肿瘤BRAF基因V600E位点的检测方法。本发明的检测方法以外周血中极其微量的ctDNA为检测对象，通过微滴乳化技术，降低抑制剂的影响，从而降低背景噪声，使得检测方法的灵敏度和准确性大幅度提升，可为靶向用药提供关键的靶标突变位点信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间。

本发明中，优化后的BRAF基因V600E位点检测PCR反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存；

第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如第一方面所述的引物探针组合物。

优选地，所述试剂盒还包括野生型标准品、阳性标准品和不含dUTP的ddPCR预混液。

本发明提供的试剂盒能应用于肿瘤检测试剂盒或癌症基因检测设备中，获得实时、准确的BRAF基因V600E位点的突变信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，提高患者生活质量，延长患者的生存时间。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的引物探针组合物通过选择BRAF基因的特定区域作为设计模板，优化对探针的修饰，筛选与探针匹配性更高的引物，引物和探针相片匹配，协同增效，最终提高了检测的灵敏度和准确性，可以对BRAF基因V600E位点突变进行准确检测，可以定量分析低至0.001％的突变频率；

(2)本发明提供的检测方法，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，只需少量的外周血，并将微滴数字PCR与高特异性的引物序列和探针序列相结合，该方法具有无可比拟的精确性，并且可以做到绝对定量，不再需要标准曲线，检测周期短，检测方法的灵敏度和准确性大幅度提升，具有10,000×以上的测序深度，测序的灵敏度能达到0.1％，可为靶向用药提供关键的靶标突变位点信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案。

附图说明

图1是本发明实施例2中20170712001-b样本提取的cfDNA的质控检测结果图；

图2是本发明实施例4中cfDNA样本V600E突变型位点检测一维结果图；

图3是本发明实施例4中cfDNA样本V600E野生型位点检测一维结果图；

图4是本发明实施例4中cfDNA样本V600E突变型、野生型位点检测二维结果图；

图5为本发明实施例4中cfDNA BRAF基因V600E位点突变阴性检测结果图，其中图5(A)为突变型检测结果图；图5(B)为野生型检测结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

本发明中涉及的名词解释如下：

荧光检测探针，是指针对肿瘤BRAF基因V600E的野生型位点和突变型位点设计的2条带有荧光基团、MGB基团和NFQ猝灭基团的探针，这2条捕获探针确保了V600E位点的野生型和突变型位点能够被准确的检测，不遗漏，也没有其它基因的干扰，保障了检测的精准。

“Carrier RNA”为一种是协助分离RNA的试剂，carrier RNA能特异吸附低浓度RNA，并且有助于降低提取过程中RNase对RNA的降解作用。然而，carrier RNA对于常规双链DNA的提取并无促进作用。

本文所用“血液”和“外周血”为相同概念。

PCR特异性扩增，是指利用PCR扩增的方法，对外周血中提取的极其微量的cfDNA进行肿瘤BRAF基因特定区域V600E位点的扩增。

实施例1试剂盒的组装

(1)探针和引物的设计：针对BRAF基因V600E目标区域的上下游设计特异性引物；采用Taqman探针法进行设计，针对BRAF基因V600E突变型和野生型序列设计相对应的突变型和野生型探针，上下游引物以及野生型、突变型检测探针由苏州泓迅生物科技有限公司合成。

针对BRAF基因V600E位点的PCR扩增上、下游引物特异性引物具体如下：

SEQ ID NO.3为CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG；

SEQ ID NO.4为ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG；

突变型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与BRAF基因V600E突变型位点结合；

突变型探针具体序列如下：

V600E-TT：

SEQ ID NO.1为5’-FAM-TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT-MGB-NFQ；

野生型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与BRAF基因V600E野生型位点结合。

野生型探针具体序列如下：

V600E-WT：

SEQ ID NO.2为5’-FAM-TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT-MGB-NFQ；

(2)将上述引物探针组合物与阳性标准品(包含突变率为5％的强阳性标准品和突变率为0.1％的弱阳性标准品)、阴性对照(野生型标准品)、不含dUTP的ddPCR预混液、超纯水等组装成试剂盒。

实施例2提取cfDNA

1.取外周血2mL，并在获得血液的4h内进行处理，包括以下步骤：

(1)将外周血于1600g的转速下4℃离心10min，分离为血细胞和血浆(上清液)，血细胞于-80℃保存；

(2)将血浆样本进行第二次离心，16000g离心4℃10min，移取上清液转并移至保存管中，置于-80℃保存。

2.采用核酸提取或纯化(重鼎，ZD-YL-Midi-40)进行cfDNA提取，提取步骤如下：

(1)取洁净的10mL离心管，加入10μL Proteinase K，再加入2mL步骤1收集的血浆和2mL溶液GH，漩涡混合15s，然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min；

(2)上述混合液中加入2mL异丙醇(血浆：GH：异丙醇＝1:1:1)，充分漩涡混合(此步骤需在生物安全柜中进行)，置于4℃冰箱中孵育10min，将混合液移入套有收集管的中量离心柱后10000rpm离心1min，弃去收集管中废液(此步骤需在生物安全柜中进行)；

(3)向离心柱中加入2.5mL溶液W1A(按照要求加入无水乙醇)，然后10000rpm离心3min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回；

(4)向离心柱中加入4mL溶液W2(按照要求加入无水乙醇)，10000rpm离心3min，去除废液；

(5)向离心柱中加入2mL无水乙醇，10000rpm离心3min，将离心柱小心取出，转移至新的15mL离心管中，开盖室温放置10min，挥发残余乙醇；

(6)向离心柱中加入提前预热的450μL TE溶液，室温静置5min后，10000rpm离心3min；

(7)弃去15mL离心管内的中量离心柱，向管内洗脱液中加入450μL溶液BK与450μL无水乙醇，涡旋混匀，混匀后室温静置5-10min；

(8)取微量离心柱(套有收集管)，将700μL混匀液移入微量离心柱中，封盖离心，转速13000rpm离心30s，弃废液，重复操作，直至混匀液全部过柱；

(9)12000rpm，空转2min，然后室温静置5min，挥发残留乙醇；

(10)将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中，然后向柱中加入溶液纳滤水(50～60℃预热，提高洗脱效率)43μL，室温静置5min后离心，转速13000rpm离心2min；

(11)将离心下来的溶液重新移入离心柱内，将离心柱放在离心管中，开盖室温静置2min，13000rpm离心3min；

3.采用Life Qubit 2.0测定提取的cfDNA的浓度，Agilent 4200TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小，质控结果见图1，图中可以清晰看见，样本cfDNA片段大小主要集中在150-200bp之间，符合cfDNA质控标准。

实施例3BRAF基因V600E位点检测

1.配制反应体系：

(1)探针和引物的设计：针对BRAF基因V600E目标区域的上下游设计特异性引物；采用Taqman探针法进行设计，针对BRAF基因V600E突变型和野生型序列设计相对应的突变型和野生型探针，上下游引物以及野生型、突变型检测探针由苏州泓迅生物科技有限公司合成；

针对BRAF基因V600E位点的PCR扩增上、下游引物特异性引物具体如下：

SEQ ID NO.3为CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG；

SEQ ID NO.4为ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG；

突变型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与BRAF基因V600E突变型位点结合；

突变型探针具体序列如下：

V600E-TT：

SEQ ID NO.1为5’-FAM-TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT-MGB-NFQ；

野生型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团，这种探针在退火时与BRAF基因V600E野生型位点结合；

野生型探针具体序列如下：

V600E-WT：

SEQ ID NO.2为5’-FAM-TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT-MGB-NFQ；

(2)按照表1配置PCR反应体系(先不加DNA模板)，12μL/管进行分装，该阶段在试剂准备区完成，将配制好的反应体系转移至样本制备区；

表1 PCR反应体系的配制

(3)向分装好的PCR反应体系中加入DNA模板，反应体系共20μL，该阶段在样本制备区完成，模板添加顺序依次为：空白对照、阴性对照、受检验样本、弱阳性对照、强阳性对照；

空白对照组：8μL无菌水，封闭PCR管；

阴性对照组：4μL浓度为1.25ng/μL的野生型标准品和4μL无菌水；

弱阳性对照组：4μL浓度为5ng/μL突变率为0.1％的弱阳性标准品和4μL无菌水；

样本检测组：无菌水稀释的受检样本，8μL；

强阳性对照组：4μL浓度为0.25ng/μL突变率为5％的强阳性标准品和4μL无菌水；

(4)各体系涡旋仪混合，于掌式离心机离上离心，去除气泡，然后将反应体系转移至ddPCR检测区；

3.ddPCR检测阶段(该阶段在ddPCR检测区完成)

(1)制备微滴

A.取出微滴生成卡，按操作要求组装，在Oil加样孔中加入油，70μL/孔；

B.在Sample加样孔中加入20μL上述反应体系，盖上封条，于微滴生成器中反应，由于微滴生成时，Oil孔与Sample孔不能为空，故空白的Oil孔加入70μL油，Sample孔用25μL水代替；

(2)PCR扩增

A.用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内(吸取和转移微滴时需缓慢操作，防止产生气泡，单次操作用时约5s)；

B.用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s；

C.完成封膜后，将96孔板置于梯度扩增仪(T100Thermal Cycler)进行PCR反应，PCR条件如下：

BRAF基因V600E位点检测PCR反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存；

(3)微滴检测

将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪，设置反应参数，编辑样品信息，对所有样本进行荧光检测；微滴读取结束后，保存数据，进行下一步分析；

实施例4BRAF基因V600E位点检测荧光信号的读取和数值分析

1.BRAF基因V600E位点荧光信号的读取

(1)打开QuantaSoft软件，导入样本检测数据，选择Analyze模块开始对数据进行分析；

(2)首先需要确认所有样本类型的微滴生成数要在10000以上，只有在这个范围内检出的数据的CV值能控制在1.6％以内，然后选择1D Amplitude，确定突变型探针和野生型探针的荧光阈值，以空白对照组和野生型对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值，结果见图2和图3所示；

由图2和图3可知，本发明设计的BRAF基因V600E探针具备良好的特异性，能明显区分出野生型微滴和突变型微滴；

(3)QuantaSoft软件会根据泊松分布计算每个样本20μL反应体系所含的模板拷贝数，利用FAM拷贝数/(FAM拷贝数+HEX拷贝数)计算出V600E突变率，结果见表2；

2.数值结果分析

表2肺癌样本20170712001-b BRAF V600E检测结果

本发明对肺癌患者的样本的ctDNA进行检测，模板投入量均约为10ng，由表2可知，20170712001-b样本中BRAF基因15号外显子V600E位点发生了突变，突变率为1.7％，突变检测结果见图4，阴性检测结果如图5所示，检测重复次数大于三次，结果完全一致，表明本发明提供的检测方法真实有效，根据所划定探针阈值，将2D强度图分为四个区域，左上区显示的是V600E位点突变的阳性微滴，左下区域显示的是阴性微滴，右上区显示的是野生型和突变型的微滴，右下区显示的是野生型DNA阳性微滴；存在BRAF基因V600E位点突变的癌症患者，可依据FDA批准和NCCN推荐，服用达拉非尼(BRAF抑制剂)联合曲美替尼(MEK抑制剂)用于治疗。

综上所述，本发明提供的引物探针组合物和肿瘤BRAF基因V600E位点检测方法，通过针对V600E位点特定区域进行设计引物并修饰探针，二者相互匹配，并将ddPCR与高特异性的引物探针组合物相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，各步骤协同增效，最终提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度，可以从微量的cfDNA中检测出ctDNA。采用本发明提供的技术方案，抽取5-10mL外周血液，通过对ctDNA的检测分析，动态评估癌症发展变化，制定精准医疗方案，整个检测过程无创伤，对病患没有任何负面影响；并且，本发明的检测优化方法可以准确的检测出靶向药物相关的BRAF基因V600E位点，这为个体化精准用药指导提供了重要的参考依据，具有广阔的应用前景和市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司

<120> 一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物及其检测方法

<130> 2018年

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttggtctagc tacagagaaa t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttggtctagc tacagtgaaa t 21

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctactgtttt cctttactta ctacacctca g 31

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atccagacaa ctgttcaaac tgatg 25

Claims (10)

1.一种检测BRAF基因V600E的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括针对BRAF基因V600E位点的突变型探针SEQ ID NO.1、针对BRAF基因V600E位点的野生型探针SEQ ID NO.2和针对BRAF基因V600E位点的特异性引物SEQ ID NO.3-4。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的3’端带有小沟结合物-非荧光性淬灭基团修饰；

优选地，所述探针的5’端带有荧光基团修饰；

优选地，所述野生型探针的荧光基团与突变型探针的荧光基团不同。

3.一种检测BRAF基因V600E的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样品的cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cfDNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样品包括石蜡包埋病理切片组织或外周血浆，优选为外周血浆；

优选地，步骤(3)所述ddPCR的反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取样品cfDNA的具体步骤如下：

(1’)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离；

(2’)采用两步纯化法对步骤(1)分离得到的血浆抽提cfDNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述分离的步骤为：将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述分离的离心转速为1200-1800g；

优选地，步骤(1’)所述分离的离心温度为0-4℃；

优选地，步骤(1’)所述分离的离心时间为8-12min。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2’)所述两步纯化法的步骤为：首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)抽取外周血，在4h内进行血浆和血细胞的分离，将外周血进行初次离心后，取下层血细胞冻存于-80℃，取上清液血浆进行二次离心，再取上清并保存于-80℃，其中，离心的条件为1200-1800g，0-4℃离心8-12min；

采用两步纯化法对二次离心后得到的血浆抽提cfDNA，首先采用1-2倍体积的异丙醇沉淀cfDNA，弃掉上清后将沉淀再用1-2倍体积的无水乙醇进行沉淀，弃掉上清后进行洗脱，得到cfDNA；

(2)配制包含权利要求1或2所述的引物探针组合物的反应体系后，加入步骤(1)得到的cf DNA；

(3)将步骤(2)得到的反应体系进行ddPCR检测并分析结果，ddPCR的反应条件：95℃变性10min；94℃变性30sec，60℃退火1min，35个循环；98℃延伸10min；4℃保存。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的引物探针组合物；

优选地，所述试剂盒还包括野生型标准品、阳性标准品和不含dUTP的ddPCR预混液。