JP6974181B2 - 個体の免疫レパートリーの変化を測定するための方法 - Google Patents
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関連出願の相互参照
本願は、参照によって本明細書に組み入れられる「個体の免疫レパートリーの変化を測定するための方法(Method for Measuring a Change in an Individual’s Immunorepertoire)」という名称を付けられ2015年3月6日に出願された米国特許仮出願第62/129,706号に対する優先権を主張する。
本願は、参照によって本明細書に組み入れられる「個体の免疫レパートリーの変化を測定するための方法(Method for Measuring a Change in an Individual’s Immunorepertoire)」という名称を付けられ2015年3月6日に出願された米国特許仮出願第62/129,706号に対する優先権を主張する。
発明の分野
本開示は、リンパ球の差次的に発現される受容体および特有CDR3配列に基づき、単一細胞レベルで個体のTリンパ球およびBリンパ球を分類するための方法、および疾患および/またはそのような疾患の処置の前、最中、および/または後の個体の免疫レパートリーの変化を決定する方法に関する。
本開示は、リンパ球の差次的に発現される受容体および特有CDR3配列に基づき、単一細胞レベルで個体のTリンパ球およびBリンパ球を分類するための方法、および疾患および/またはそのような疾患の処置の前、最中、および/または後の個体の免疫レパートリーの変化を決定する方法に関する。
発明の背景
ホメオスタシスのプロセスを通じて、免疫系は、総称して個体の「免疫レパートリー」と呼ばれる、ある特定の数およびレパートリーのTリンパ球およびBリンパ球を維持する。その一方で、個体の免疫レパートリーは、連続的細胞代謝回転の結果および抗原への曝露の結果として、常に変化する。そのような免疫レパートリーの変化には、例えば、新たな(ナイーブ)Tリンパ球およびBリンパ球の発生、活性Tリンパ球およびBリンパ球の拡大、ならびに新たなメモリーTリンパ球およびBリンパ球の形成が含まれうる。
ホメオスタシスのプロセスを通じて、免疫系は、総称して個体の「免疫レパートリー」と呼ばれる、ある特定の数およびレパートリーのTリンパ球およびBリンパ球を維持する。その一方で、個体の免疫レパートリーは、連続的細胞代謝回転の結果および抗原への曝露の結果として、常に変化する。そのような免疫レパートリーの変化には、例えば、新たな(ナイーブ)Tリンパ球およびBリンパ球の発生、活性Tリンパ球およびBリンパ球の拡大、ならびに新たなメモリーTリンパ球およびBリンパ球の形成が含まれうる。
免疫療法および細胞療法は、がんおよび自己免疫疾患の処置にとって徐々に一般的なツールになりつつある。免疫療法には、免疫経路を調節するためまたは疾患に対する患者の免疫応答をブーストするための抗体処置が含まれうる。細胞療法には、患者の血液または白血球細胞を疾患抗原にエクスビボで曝露し、続いて処理した血液または白血球細胞を患者に再導入することが含まれうる。通常の方法は合成低分子を利用し、特定の疾患経路を標的とするが、免疫療法および細胞療法は、疾患と戦うように患者の免疫系を教育することによって作用しうる。
疾患状態にある場合、またはそのような疾患状態の処置の最中である場合、患者の免疫系は、疾患と戦うために動員される。結果として、免疫レパートリーの代謝回転速度は変化しうる。そのような変化の測定は、処置の有効性の指標を与える可能性がある。しかしながら、現在、科学者または医師が免疫レパートリー代謝回転速度を測定するのを可能にするツールまたは方法は入手可能ではなく；白血球細胞計数およびフローサイトメトリーなどの現在の方法は理想的ではない。患者の白血球細胞数を測定することは、リンパ球の総数またはリンパ球のカテゴリーに属する細胞の数のみを提供し、フローサイトメトリーは表面マーカーに基づくTリンパ球およびBリンパ球の分類を可能にする。しかしながら、これらの方法のいずれも、免疫レパートリー代謝回転速度の正確な測定は提供しない。したがって、現在の方法は、免疫療法などの療法の治療結果の評価、患者をプレスクリーニングするためのマーカーの作製、および特定の療法に最適な患者の同定にとって理想的ではない。したがって、差次的に発現されるTリンパ球およびBリンパ球受容体に基づき単一細胞レベルでTリンパ球およびBリンパ球を分類するツールと、この情報を用いて個体の免疫レパートリーの変化を決定する方法とが必要とされる。
1つの態様において、本開示は、個体の免疫レパートリーの変化を算出する方法に関し、そのような変化は、最も劇的な免疫細胞の代謝回転速度の測定値である。該方法は、同じ患者から収集した2つまたはそれより多いサンプル由来の免疫細胞の集団におけるクロノタイプ(すなわち、クローン型)を定量化する工程を含みうる。1つの態様において、頻度データが、各クロノタイプの頻度を同定することによって2つまたはそれより多いサンプルについて算出され、頻度データはサンプル差異を補正するために正規化される。次いで、患者サンプルにおける各クロノタイプの頻度の質的および量的な絶対値差分が、各サンプルに共通しており最大頻度変化を有するクロノタイプを決定するために算出されうる。次いで、方法は、サンプル間で最も変化の程度が高いクロノタイプのパーセンテージを決定する工程を含みうる。サンプルは、個体のベースライン免疫レパートリーを決定するために同時点で収集されるか、または免疫レパートリー変化速度を算出するために異なる時点で収集されうる。ある特定の態様において、免疫レパートリー変化速度は、健康現象の前、最中、または後の時点で決定される。本開示の方法は、以前には免疫レパートリー変化の算出を不可能にしていたサンプリングおよび配列決定の不一致を無くしつつ、膨大な量の配列決定データの分析を可能にする。
[本発明1001]
同じ患者から収集した第1のサンプル中および第2のサンプル中の免疫細胞の集団または亜集団における免疫細胞のクロノタイプを定量化する工程；
各クロノタイプの頻度を同定することによって該第1のサンプルおよび該第2のサンプルについて頻度データを算出する工程；
該第1のサンプルおよび該第2のサンプルについて該頻度データを正規化する工程；
該第1のサンプル中および該第2のサンプル中に存在する各クロノタイプの頻度の絶対値差分を決定する工程；ならびに
該第1のサンプルと該第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有するクロノタイプを決定する工程
を含む、対象の免疫レパートリーの変化を算出する方法。
[本発明1002]
免疫細胞のクロノタイプが、アームPCRおよび次世代シーケンシングを用いて定量化される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記クロノタイプがCDR3クロノタイプである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが同時点で収集される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが、異なる時点で収集される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
最大頻度変化を有する少なくとも100個のクロノタイプを同定する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
各サンプルが白血球細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記対象が健常である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記対象が、疾患と診断されているか、または疾患を有すると疑われる、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記対象が免疫療法で処置される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記対象が、前記第1のサンプルを収集した後に免疫療法を受ける、本発明1010の方法。
[本発明1012]
白血球細胞の少なくとも2つのサンプル集団を対象から収集する工程；
標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中で白血球細胞の各集団由来のポリヌクレオチドを別々に増幅して、第1のアンプリコンのセットを生成する工程であって、該標的特異的なネステッドプライマーの少なくとも一部が、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を該第1アンプリコンに組み込むための鋳型として増幅中に機能する追加のヌクレオチドを含む、工程；
該第1のアンプリコンを含有する各第1の反応混合物の一部を別々に、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2の反応混合物に移す工程；
各集団について、該少なくとも1つの共通プライマーを用いて該第1のアンプリコンを増幅して、第2のアンプリコンのセットを生成する工程；
各該第2のアンプリコンを配列決定して、サンプル中に存在する特定のCDR3領域の頻度を同定する工程；
CDR3頻度データを正規化する工程；
第1のサンプルのおよび第2のサンプルの正規化した該CDR3頻度データを比較して、各CDR3配列の頻度間の絶対値差分を決定する工程；ならびに
該第1のサンプルと該第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有するCDR3配列を決定する工程
を含む、対象の免疫レパートリーの変化を算出する方法。
[本発明1013]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが同時点で収集される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが、異なる時点で収集される、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記対象が健常である、本発明1012の方法。
[本発明1016]
前記対象が、疾患と診断されているか、または疾患を有すると疑われる、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記対象が免疫療法で処置される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記対象が、前記第1のサンプルを収集した後に免疫療法を受ける、本発明1010の方法。
[本発明1001]
同じ患者から収集した第1のサンプル中および第2のサンプル中の免疫細胞の集団または亜集団における免疫細胞のクロノタイプを定量化する工程；
各クロノタイプの頻度を同定することによって該第1のサンプルおよび該第2のサンプルについて頻度データを算出する工程；
該第1のサンプルおよび該第2のサンプルについて該頻度データを正規化する工程；
該第1のサンプル中および該第2のサンプル中に存在する各クロノタイプの頻度の絶対値差分を決定する工程；ならびに
該第1のサンプルと該第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有するクロノタイプを決定する工程
を含む、対象の免疫レパートリーの変化を算出する方法。
[本発明1002]
免疫細胞のクロノタイプが、アームPCRおよび次世代シーケンシングを用いて定量化される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記クロノタイプがCDR3クロノタイプである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが同時点で収集される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが、異なる時点で収集される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
最大頻度変化を有する少なくとも100個のクロノタイプを同定する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
各サンプルが白血球細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記対象が健常である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記対象が、疾患と診断されているか、または疾患を有すると疑われる、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記対象が免疫療法で処置される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記対象が、前記第1のサンプルを収集した後に免疫療法を受ける、本発明1010の方法。
[本発明1012]
白血球細胞の少なくとも2つのサンプル集団を対象から収集する工程；
標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中で白血球細胞の各集団由来のポリヌクレオチドを別々に増幅して、第1のアンプリコンのセットを生成する工程であって、該標的特異的なネステッドプライマーの少なくとも一部が、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を該第1アンプリコンに組み込むための鋳型として増幅中に機能する追加のヌクレオチドを含む、工程；
該第1のアンプリコンを含有する各第1の反応混合物の一部を別々に、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2の反応混合物に移す工程；
各集団について、該少なくとも1つの共通プライマーを用いて該第1のアンプリコンを増幅して、第2のアンプリコンのセットを生成する工程；
各該第2のアンプリコンを配列決定して、サンプル中に存在する特定のCDR3領域の頻度を同定する工程；
CDR3頻度データを正規化する工程；
第1のサンプルのおよび第2のサンプルの正規化した該CDR3頻度データを比較して、各CDR3配列の頻度間の絶対値差分を決定する工程；ならびに
該第1のサンプルと該第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有するCDR3配列を決定する工程
を含む、対象の免疫レパートリーの変化を算出する方法。
[本発明1013]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが同時点で収集される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが、異なる時点で収集される、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記対象が健常である、本発明1012の方法。
[本発明1016]
前記対象が、疾患と診断されているか、または疾患を有すると疑われる、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記対象が免疫療法で処置される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記対象が、前記第1のサンプルを収集した後に免疫療法を受ける、本発明1010の方法。
本開示は、以下の図を参照してより良く理解することができる。
異なる時点で患者から得られたCDR3配列決定の生データの図である。
正規化配列データを決定する際に利用した算出を図示する。カラムAは配列生データを表し、カラムBおよびCは正規化データを表す。
同じ患者から収集した2つのサンプルのデルタインデックスを決定する際に利用した算出を表す。カラムDは各サンプルにおける各CDR3リード数の頻度間の絶対値差分を表し、カラムEは2つのサンプルのインパクト範囲の算出を表し、かつカラムFは2つのサンプルのデルタインデックスの算出を表す。
サンプルのシグナル最適化を表す。カラムHは100のインパクト範囲についてシグナル対ノイズ比の算出を表し、カラムIは1,000のインパクト範囲についてシグナル対ノイズ比の算出を表し、かつカラムJは10,000のインパクト範囲についてシグナル対ノイズ比の算出を表す。
複数のサンプルグループの算出されたデルタインデックスを図示する。グループAは、2つのサブサンプルに分割される、一人の患者から採取した単一のサンプルを表し、グループBは、同時点で同じ個体から採取された複数のサンプルを表し、グループCは、1日または2日の間隔を有する2つの異なる時点で同じ個体から採取されたサンプルを表し、グループDは、3ヶ月の間隔を有する2つの異なる時点で同じ個体から採取されたサンプルを表し、かつグループEは、異なる時点で異なる個体から採取されたサンプルを表す。この状況では、デルタインデックスは、ほぼ100％であると予想される。
詳細な説明
本発明者らは、疾患に罹患している個体または疾患の処置のために治療を受けている個体の免疫レパートリーの変化を決定するための方法を開発している。該方法は、健康現象の前、最中、または後に一個体で見られる免疫細胞多様性のレベルの変化における差異を用いて、個体に対する疾患の影響または処置計画の効果を判定する。そのような健康現象には、1つの態様において、自然発生(すなわち、疾患の発症)または人工発生(すなわち、疾患処置の開始)が含まれうる。本発明の1つの局面において、免疫細胞多様性のレベルの差異はデルタインデックスと称される。デルタインデックスは、個体の最も劇的な免疫細胞の経時的な量的変化(CDR3の上方または下方制御)および質的変化(クローンの獲得または欠失)として本明細書において定義される。1つの態様において、本発明は、3番目の相補性決定領域(CDR3)、そのヌクレオチド配列がそれぞれT細胞クローンまたはB細胞クローンに特有である領域の変化を決定する。1つの態様において、個体の免疫系内の最も劇的な免疫細胞は、免疫レパートリーインパクト範囲としてとして称される。1つの態様において、インパクト範囲は、そのヌクレオチド配列の最大の変化を示すサンプル集団内の100個のCDR3クローンとして定義される。他の態様において、インパクト範囲は、他の数のクローン、例えば、最大の変化を示す1,000クローンまたは10,000クローンを含みうる。本明細書で用いられる「免疫細胞」は、Tリンパ球および/またはBリンパ球を指す。
本発明者らは、疾患に罹患している個体または疾患の処置のために治療を受けている個体の免疫レパートリーの変化を決定するための方法を開発している。該方法は、健康現象の前、最中、または後に一個体で見られる免疫細胞多様性のレベルの変化における差異を用いて、個体に対する疾患の影響または処置計画の効果を判定する。そのような健康現象には、1つの態様において、自然発生(すなわち、疾患の発症)または人工発生(すなわち、疾患処置の開始)が含まれうる。本発明の1つの局面において、免疫細胞多様性のレベルの差異はデルタインデックスと称される。デルタインデックスは、個体の最も劇的な免疫細胞の経時的な量的変化(CDR3の上方または下方制御)および質的変化(クローンの獲得または欠失)として本明細書において定義される。1つの態様において、本発明は、3番目の相補性決定領域(CDR3)、そのヌクレオチド配列がそれぞれT細胞クローンまたはB細胞クローンに特有である領域の変化を決定する。1つの態様において、個体の免疫系内の最も劇的な免疫細胞は、免疫レパートリーインパクト範囲としてとして称される。1つの態様において、インパクト範囲は、そのヌクレオチド配列の最大の変化を示すサンプル集団内の100個のCDR3クローンとして定義される。他の態様において、インパクト範囲は、他の数のクローン、例えば、最大の変化を示す1,000クローンまたは10,000クローンを含みうる。本明細書で用いられる「免疫細胞」は、Tリンパ球および/またはBリンパ球を指す。
本発明の方法は、個体の最も劇的な免疫細胞の経時的な変化の割合を評価するための以下の工程を用いて実施されうる：(a)白血球細胞の少なくとも2つのサンプル集団を対象から収集する工程；(b)標的特異的ネステッドプライマーを含む反応混合物中で白血球細胞の各集団由来のポリヌクレオチドを別々に増幅して、第1のアンプリコンのセットを生成する工程であって、標的特異的ネステッドプライマーの少なくとも一部が、少なくとも1つの共通プライマーの結合部位を第1のアンプリコンに組み込むための鋳型として増幅中に機能する追加的ヌクレオチドを含む、工程；(c)第1のアンプリコンを含有する各第1の反応混合物の一部を別々に、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2の反応混合物に移す工程；(d)各集団に対して、少なくとも1つの共通プライマーを用いて、第1のアンプリコンを増幅して、第2のアンプリコンのセットを生成する工程；(e)各第2のアンプリコンを配列決定して、サンプル中に存在する特異的CDR3領域の頻度を同定する工程；(f)CDR3頻度データを正規化する工程；(g)第1のサンプルのおよび第2のサンプルの正規化したCDR3頻度データを比較し、各CDR3配列の頻度間の絶対値差分を決定する工程；(h)第1のサンプルと第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有するCDR3配列を決定する工程；ならびに(i)最大の変化の程度を有する工程(h)由来の配列を決定する工程。本明細書において用いられる「対象」は、ヒトまたは動物のいずれかを意味する。
ヒトまたは動物の免疫系における細胞の数および多様度はあまりに大きく、細胞の小さなサブセットを上回る配列決定は非現実的であることから、広範に免疫系を評価することは以前には難しかった。本発明者らは、半定量的な結果をもたらしつつ、以前に入手可能な方法と比べて感度および特異性の向上をもたらす、半定量的PCR法(アームPCR、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,999,092号において詳細に説明される)を開発した。特異性および感度を向上させ、それによって単一サンプル内で検出可能な標的の数を増大させるこの能力は、方法を免疫レパートリーのクロノタイプの相対数を検出するのに理想的なものとする。本発明者らは、より最近になって、この配列決定法を用いると、個々の対象の免疫レパートリーの変化または代謝回転速度を比較することが可能になることを発見し、これが、本発明の開発につながっている。方法は、例えばがんなどの特定の疾患について処置を受けている対象を評価するために用いられている。本発明者らは、免疫レパートリーの多様性の変化が本発明の方法を用いて容易に検出できることを実証している。したがって、これらの方法は、細胞計数および生化学的検査が現在の臨床実務で用いられているのと同様に、処置有効性の指標として有用である可能性がある。
免疫レパートリーのクロノタイプは、免疫系の免疫グロブリン(Ig)およびT細胞受容体(TCR)産生の初期段階における体細胞組換えによる可変(V)遺伝子セグメント、多様性(D)遺伝子セグメント、および連結(J)遺伝子セグメントの再構成によって決定される。V(D)J再構成は、T細胞受容体α鎖、β鎖、γ鎖、およびδ鎖、ならびに免疫グロブリン重鎖(IgH)および軽鎖(IgK、IgL)から増幅および検出することができる。細胞は、例えば、末梢血、リンパ組織、がん組織、または他の器官および/もしくは器官系由来の組織もしくは液体を入手することによって患者から得られうる。血液サンプルなどのこれらのサンプルを得るための技法は、当業者に公知である。本明細書において用いられる「クロノタイプを定量化する」は、特定のクロノタイプに属する細胞の数を計数すること、またはその信頼できる近似値を入手することを意味する。細胞数は、PCR増幅および配列決定によって検出された配列の数から推定されうる。
CDR3領域は、約30〜90ヌクレオチドを含み、遺伝子の組換えられた可変(V)セグメント、多様性(D)セグメントおよび連結(J)セグメントの接合部を包含する。それは、受容体の結合特異性をコードし、特有のV(D)J再構成を同定する配列タグとして有用である。
本発明の局面には、T細胞、B細胞、および/またはT細胞もしくはB細胞のサブセット由来のCDR3領域のアームPCR増幅が含まれる。したがって、本明細書で用いられる細胞の「集団」という用語は、一般に細胞の「集団」または「亜集団」と称されるものを包含する。次いで、多数の増幅産物は、次世代配列決定プラットフォームを用いて効率的に配列決定されうる。
アームPCR法は、1回の反応で複数のポリヌクレオチドの高感度の半定量的増幅を提供する。アームPCR法はまた、閉鎖カセットシステム(iCubate(登録商標), Huntsville, Ala.)での自動化法によって実施することができ、例えば、様々なT細胞およびB細胞のレパートリーは非常に広範であることから、これは本方法において有益である。アームPCR法において、標的数は、DNAポリメラーゼによって推進される反応において増大し、これは反応内に導入される標的特異的プライマーの結果である。この増幅反応のさらなる結果は、共通プライマー向けの結合部位の導入であり、これは、アンプリコンの第1のセットを含有する第1の反応混合物の一部を、共通プライマーを含む第2の反応混合物に移すことによってその後の増幅において用いられる。本明細書で用いられる「少なくとも1つの共通プライマー」は、そのような結合部位に結合する少なくとも1つのプライマーを指し、フォワードプライマーおよびリバースプライマーなどのプライマーの対を含む。この移行は、第1の増幅反応から反応混合物の一部を回収し、そのサンプルを第2の反応用チューブまたはチャンバー内に導入することによって、または完了した第1の増幅から液体の一部を除去し、一部を残し、第1の増幅を実施したチューブ内に新鮮な試薬を添加することによって実施されうる。いずれの場合でも、次いで、追加のバッファー、ポリメラーゼなどが、検出用の増幅産物を産生させるための共通プライマーと一緒に添加されうる。共通プライマーを用いる標的分子の増幅は、半定量的な結果を与え、ここで、第1の増幅で増幅された定量的な数の標的は、標的特異的プライマーではなく共通プライマーを用いて増幅され、それによって、有意に高い数の標的を検出用に生成させ、患者の血液サンプル内の様々な再構成を含む細胞の相対数を決定することが可能になる。また、第2の反応混合物を第1の反応混合物の一部と組み合わせることによって、高い濃度の標的特異的プライマーを第1の反応混合物に添加することが可能になり、第1の増幅反応においてより優れた感度がもたらされる。この特異性および感度の組み合わせが、細胞の集団中のクロノタイプの種類および数の十分な感度かつ定量性の評価を可能にするアームPCR法などの方法の使用によって定量的結果を達成する能力と併せて、診断用途のデルタインデックスを生じさせる。
抗原の認識を原因とするクローン発現は、その特定の抗原を認識する細胞の大きな集団をもたらし、その相対数により細胞を評価することによって、抗原曝露が抗原産生B細胞または受容体を持つT細胞の拡大に影響を与えたかどうかを判定するための方法が提供される。これは、特定の疾患と診断されている個体に多い特定の細胞の集団が存在する可能性があるかどうか評価するのに助けとなる。例えば、方法は、処置またはワクチンが処置またはワクチンを与えられている個体において望ましい免疫応答を達成しているか否かを評価する際に特に助けとなる可能性がある。
免疫系細胞の可変領域を増幅および配列決定するためのプライマーは市販されていて、発明者らの公開された特許出願のWO2009137255およびUS201000021896A1などの刊行物に記載されていて、これらの両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
Hoffman-LaRoche, Inc.の454シークエンシングシステムなど、複数の市販のハイスループットシークエンシング技術が存在する。454°シークエンシング法では、例えば、AおよびBアダプターが、PCRの間にPCR産物に連結されるか、またはPCR反応後にその上にライゲートされるかのいずれかである。アダプターは、増幅工程および配列決定工程に用いられる。アームPCR技術と併せて行われる場合、AおよびBアダプターは、増幅反応において共通プライマー(「共用プライマー(communal primer)」または「スーパープライマー」と称されることもある)として用いられうる。AおよびBアダプターをサンプルライブラリ(PCRアンプリコンなど)に物理的に結合した後、当業者に公知の技術を用いて一本鎖DNAライブラリが調製される。一本鎖DNAライブラリは、特別に設計されたDNA捕捉ビーズ上に固定される。各ビーズは、特有の一本鎖DNAライブラリ断片を保有する。ビーズに結合されたライブラリは、油中水混合物中で増幅試薬により乳化され、各々が1つの特有のサンプルライブラリ断片を有する1つのビーズのみを含有するマイクロリアクタが生成される。各特有のサンプルライブラリ断片は、競合配列または混入配列が排除されたそれぞれのマイクロリアクタ内で増幅される。断片コレクション全体の増幅は並行して行われる。各断片について、これによりビーズあたり数百万のコピー数がもたらされる。その後、エマルジョンPCRは中断されるが、増幅された断片はそれらの個別のビーズに結合した状態で維持される。クローン増幅された断片は、配列決定のために濃縮されてPicoTiterPlate(登録商標)デバイスにロードされる。PicoTiterPlate(登録商標)のウェルの直径は、ウェルあたり1つのみのビーズを受け入れ可能である。シークエンシング酵素の添加後、シークエンシング機器の流体工学サブシステムは、個々のヌクレオチドを、決まった順で、1つのビーズを各々含有する数十万個のウェルに流し込む。鋳型鎖に相補的な1つ(または複数)のヌクレオチドの添加は化学発光シグナルが生じ、これが機器内部のCCDカメラによって記録される。PicoTiterPlate(登録商標)デバイスを通じて生成されたシグナル強度および位置情報の組み合わせにより、ソフトウェアは、GS FLXシステムにより、各々最大で約450塩基対の1,000,000個を超える個別のリードの配列を決定することができる。
本発明の1つの態様において、T細胞、B細胞、および/またはT細胞もしくはB細胞のサブセットのCDR3領域からの配列決定情報は、単一の患者から入手される。図1に図示するように、これらの細胞は様々な時点で収集されうる。例えば、複数のサンプルが、同時点で同じ患者から収集されうる(PAT1S1、PAT1S2)。この態様において、サンプルは、処置計画の開始前に収集される。以下により詳細に説明するように、同時点で採取されたサンプルからの配列情報の分析は、患者の最も劇的な免疫細胞の初回またはベースライン免疫レパートリー代謝回転速度の確立を可能にする。さらなる態様において、本発明の方法は、異なる時点で同じ患者から収集したサンプルに対して実施される(PAT1S1、PAT2S1)(図1)。1つの態様において、サンプルは、処置計画の前、最中、および後に収集される可能性が有り、そのタイミングは患者の施術者によって決定されうる。この配列情報の分析によって、処置計画の結果として生じる患者の最も劇的な免疫細胞の免疫レパートリー代謝回転速度の変化を決定することが可能となる。
サンプルを収集する方法、収集した細胞の数、得られた配列決定リードの数(すなわち、サンプルから得られた配列の数)、およびサンプリングしたCDR3配列の数の差異は、共通のリード数に対してサンプルを最初に正規化することなしには、2つのサンプルの比較を不可能にする。したがって、参照は、後の測定のための比較の基礎として確立されなければならない。そのため、定量的および/または半定量的な方法を用いて配列を得て、次いで、そのような差異の原因となるデータを正規化することが好ましい。
図2および3は、免疫レパートリーのベースライン変化の算出のプロセスを例示する。図2のカラムAは、第1の患者サンプルからの免疫細胞の集団のいくつかのCDR3領域についての配列生データを表す。カラムAから分かるように、各検出遺伝子配列は、1000万(リード)の付随頻度を有する。本発明の1つの態様において、各サンプルは、これらの矛盾を説明するために1000万リードに正規化される。この態様において、正規化されたリード数は、各CDR3配列のリード数(すなわち、各特有CDR3配列がサンプル中に検出された回数)に正規化係数(1000万/サンプルのリードの総数)を乗じ(カラムB)、次いで、1000万で割る(カラムC)ことによって得られる。今回の例は1000万にリード数を正規化するが、他の態様では、リード数は他の細胞濃度に正規化されうる。
個体についてベースラインレパートリー代謝回転速度を確立するために、次に、単一の期間で収集した2つのサンプルからの正規化した配列データ(PAT1S1およびPAT1S2)を比較する。次に図3を参照すると、各サンプルにおける各CDR3リード数の頻度間の絶対値差分が決定される(カラムD)。本方法は個体の免疫レパートリーの変化を決定するために用いられることから、全ての定量的変化(すなわち、特有CDR3配列の頻度の増加または減少)がこれらの算出に含まれる。追加の態様において、各CDR3配列の頻度間の絶対値差分は定性的変化も含む。例えば、特定のCDR3配列が第1のサンプルでは存在するが、第2のサンプルでは存在しない(あるいはその逆)可能性があるという事実が、2つのサンプル間のクロノタイプ多様性の絶対値差分を決定するための算出においてある。
図3を再び参照すると、患者のベースライン免疫レパートリー代謝回転速度を決定する次の工程は、2つのサンプルのインパクト範囲の算出を含む(カラムE)。本明細書で用いられるインパクト範囲は、最も劇的なクローンが寄与する患者の免疫レパートリーのパーセンテージを決定することによって算出される。2つの集団間のサンプリングの差異を除去しうるようにインパクト範囲を決定する必要がある。前に記載したように、このようなサンプリングの不一致には、例えば、患者サンプルに含まれる細胞の数の差異、アームPCRの間の増幅効率の差異、配列決定の偏りの導入、および配列決定深度の差異が含まれうる。これらのサンプル変数の存在は、2つの集団間の頻度可変性を比較することを不可能にする。上述のように1000万リードに配列決定データを正規化することは、これらの不一致の一部を除去する助けになる。しかしながら、膨大な量の配列決定データの分析を可能にし、2つのサンプルの直接比較を可能にするためには、インパクト範囲を算出するなどのさらなる工程が取られなければならない。上述の変数はいかなる頻度変化も隠し、そのような比較を不可能にする。1つの態様において、インパクト範囲は、サンプル間で最大の頻度の差異を有する100クローンが寄与する患者の免疫レパートリーのパーセントを算出することによって決定される。図4に図示するように、他の数のクローン、例えば、サンプル間で最大の頻度の差異の有する1,000または10,000クローンが、他の態様におけるインパクト範囲の算出に含まれうる。
図3に図示した次の工程において、カラムF、デルタインデックスが2つのサンプルについて算出される。本明細書で用いられるデルタインデックスは、第1および第2のサンプル間で頻度差異を示すインパクト範囲内の配列決定したCDR3クローンの総パーセンテージを表す。図4に図示する例において、カラムH、サンプル1および2のインパクト範囲(平均)は7.27％であり、100個の最も劇的なCDR3クローンは患者の配列決定した免疫レパートリーの7.27％を構成することを示す。最終段階において、デルタインデックスは2つのサンプルについて算出される。この態様において、デルタインデックスは、サンプル1とサンプル2との間で変化しているインパクト範囲に含まれるCDR3クローンのパーセンテージである。図4に図示するように、カラムH、6.53％のデルタインデックスは、同時点で、例えば、健康現象の開始の前に収集した2つのサンプルから算出した、患者のベースライン免疫レパートリー代謝回転の算出値である。
ベースライン免疫レパートリー代謝回転速度を確立した後、次に、異なる時間で収集した2つのサンプルについてデルタインデックスを算出する。1つの態様において、第1のサンプルは処置の開始前に収集され、第2のサンプルは処置を完了する間またはその後に収集されうる。図4に例示するように、異なる時点で収集した2つのサンプルからのCDR3配列生データ(PAT1S1およびPAT2S1)は、(1)正規化され；(2)頻度間の絶対値差分が算出され；(3)2つのサンプルのインパクト範囲が算出され；かつ(4)2つのサンプルについてデルタインデックスが決定される。これらの工程は、図2〜4に関して前に記載したものと同じやり方で(すなわち、ベースラインデルタインデックスを算出するのと同じ形で)行われる。図4にさらに図示するように、次に、デルタインデックス算出のシグナル対ノイズ比が、以下の算出により例示されるように、ベースラインデルタインデックスを実験上のデルタインデックスと比較することによって決定されうる：
シグナル/ノイズ＝デルタインデックス(PAT1S1-PAT2S1)/デルタインデックス(PAT1S1-PAT1S2)。
図4に図示する態様において、100のインパクト範囲の選択は、最も低いシグナル対ノイズ比を生じさせ、よりノイズが少ない結果をもたらす。
シグナル/ノイズ＝デルタインデックス(PAT1S1-PAT2S1)/デルタインデックス(PAT1S1-PAT1S2)。
図4に図示する態様において、100のインパクト範囲の選択は、最も低いシグナル対ノイズ比を生じさせ、よりノイズが少ない結果をもたらす。
本発明は、最も劇的な免疫細胞のレパートリー比率の算出を可能にする。方法の工程は、例えば、サンプルサイズを正規化する場合、各CDR3の頻度値を得る場合、絶対頻度変化を得る場合、およびインパクト範囲を算出する場合に、膨大な量の配列データの操作を含む。これらの算出は、一部のクローンが健康現象の最中に上方制御されうること、それ以外が下方制御されうること、一部のクローンが第2の時点で消失しうること、および一部の新たなクローンが異なる時点で出現しうることを考慮する必要がある。本発明は、全体的なレパートリー変化を決定して、各CDR3に関連する該変化を定量化することによって、これらの課題を克服する。本発明は、以前には免疫レパートリー変化の比較を不可能にしていたサンプリングおよび配列決定の不一致を無くしつつ、膨大な量の配列決定データの分析を可能にする。
実施例1：患者サンプルのデルタインデックスの算出
2つの全血サンプルを、3ヶ月間隔で2人の健常な個体のそれぞれから収集した。各個体からのサンプルに対して2種類の次世代シーケンシング(NGS)プロトコールを実施した。平均で100万個の細胞からRNAを抽出し、アームPCRを用いてNGSライブラリを作製した。Illumina HiSeq(登録商標)機器を用いて、配列決定を行った。
2つの全血サンプルを、3ヶ月間隔で2人の健常な個体のそれぞれから収集した。各個体からのサンプルに対して2種類の次世代シーケンシング(NGS)プロトコールを実施した。平均で100万個の細胞からRNAを抽出し、アームPCRを用いてNGSライブラリを作製した。Illumina HiSeq(登録商標)機器を用いて、配列決定を行った。
図5は、複数のサンプルグループについて算出したデルタインデックスを例示する。
グループAは1人の患者から採取した単一のサンプルを表し、該サンプルは2つのサブサンプルに分割される。2つのサンプルはサンプル多様度のない同時点で収集されたため、この集団のデルタインデックスは0.00％である。
グループBは、同時点で同じ個体から採取された複数のサンプルを表す。レパートリー変化(デルタインデックス)は3.88％から6.53％の間で測定される。これらのサンプルの種類は、個体のベースラインレパートリー変化を算出するのに有用である。
グループCは、1または2日の間隔を有する2つの異なる時点で同じ個体から採取されたサンプルを表す。これらの算出レパートリー変化は、0％から100％の間で変化する可能性があり、健康現象によって引き起こされるレパートリー変化を決定するのに有用である。
グループDは、3ヶ月の間隔を有する2つの異なる時点で同じ個体から採取されたサンプルを表す。これらの算出レパートリー変化は、0％から100％の間で変化する可能性があり、健康現象によって引き起こされるレパートリー変化を決定するのに有用である。
グループEは、異なる時点で異なる個体から採取されたサンプルを表す。この状況では、デルタインデックスは、ほぼ100％であると予測される。
実施例2：健常な患者のサンプル
2つの全血サンプルを、3ヶ月の間隔で19名の健常な個体のそれぞれから収集した。各個体からのサンプルに対して2種類のNGSプロトコールを行った。平均で100万個の細胞からRNAを抽出し、アームPCRを用いてNGSライブラリを作製した。Illumina HiSeq(登録商標)機器を用いて、配列決定を行った。各サンプルについて、平均で500万のT細胞受容体分子を配列決定した(1個体当たり1000万個の総リード数)。およそ100,000〜300,000個の特有CDR3配列が各サンプルから得られた。
2つの全血サンプルを、3ヶ月の間隔で19名の健常な個体のそれぞれから収集した。各個体からのサンプルに対して2種類のNGSプロトコールを行った。平均で100万個の細胞からRNAを抽出し、アームPCRを用いてNGSライブラリを作製した。Illumina HiSeq(登録商標)機器を用いて、配列決定を行った。各サンプルについて、平均で500万のT細胞受容体分子を配列決定した(1個体当たり1000万個の総リード数)。およそ100,000〜300,000個の特有CDR3配列が各サンプルから得られた。
表1は、2億個の配列リード(1リード＝1分子)についてクローンを分析した結果を図示し、5.52％から23.33％の範囲、平均13％の算出デルタインデックスを含む。
（表１）算出デルタインデックス
実施例3：乳がんサンプル
ネオアジュバント処置、すなわち、手術前に腫瘍量を減少させるための手術前化学療法を受けた12人の乳がん患者から、サンプルを得た。
ネオアジュバント処置、すなわち、手術前に腫瘍量を減少させるための手術前化学療法を受けた12人の乳がん患者から、サンプルを得た。
末梢血サンプルを処置前および処置後に収集した。2種類のNGSプロトコールを各個体由来のサンプルに対して行った。平均で100万個の細胞からRNAを抽出し、アームPCRを用いてNGSライブラリを作製した。Illumina HiSeq(登録商標)機器を用いて配列決定を行った。表2に示すように、算出デルタインデックス範囲は20.49％から97％、平均58.85％であった。
（表２）算出デルタインデックス
これらの算出デルタインデックス範囲は、健常な個体(表1)で観察されたものと比較して、有意に高いレパートリー代謝回転速度を示す。本明細書に記載の方法論を用いて、免疫レパートリー代謝回転速度を算出することによって、現行の方法と比較して複数の利点がもたらされる。本明細書に開示の方法論は、例えば、治療成績を評価するのをまたは疾患状態の出現を示すのを助ける。
本明細書に記載の方法論およびその様々な態様は例示的なものである。本明細書に記載の方法論の他の様々な態様が可能である。
Claims (13)
- アームPCRおよび次世代シーケンシングを用いて、同じ患者から収集した第1のサンプル中および第2のサンプル中の免疫細胞の集団または亜集団における免疫細胞のクロノタイプを定量化する工程；
各クロノタイプの頻度を同定することによって該第1のサンプルおよび該第2のサンプルについて頻度データを算出する工程；
該第1のサンプルおよび該第2のサンプルについて該頻度データを正規化する工程；
該第1のサンプル中および該第2のサンプル中に存在する各クロノタイプの頻度の絶対値差分を決定する工程；
該第1のサンプルと該第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有する少なくとも100個のCDR3クロノタイプを決定する工程；
該少なくとも100個のCDR3クロノタイプが寄与する対象の免疫レパートリーの割合を算出することによってインパクト範囲を決定する工程；ならびに
前記第1のサンプルと前記第2のサンプルとの間の頻度差異を示すインパクト範囲内のCDR3クロノタイプの総割合を算出することによってデルタインデックスを決定する工程
を含む、対象の免疫レパートリーの変化を算出する方法。 - 前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが、異なる時点で収集される、請求項1に記載の方法。
- 各サンプルが白血球細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が健常である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、疾患と診断されているか、または疾患を有すると疑われる、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が免疫療法で処置される、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、前記第1のサンプルを収集した後に免疫療法を受ける、請求項6に記載の方法。
- 標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中で白血球細胞の各集団由来のポリヌクレオチドを別々に増幅して、第1のアンプリコンのセットを生成する工程であって、該標的特異的なネステッドプライマーの少なくとも一部が、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を該第1アンプリコンに組み込むための鋳型として増幅中に機能する追加のヌクレオチドを含む、工程；
該第1のアンプリコンを含有する各第1の反応混合物の一部を別々に、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2の反応混合物に移す工程；
各集団について、該少なくとも1つの共通プライマーを用いて該第1のアンプリコンを増幅して、第2のアンプリコンのセットを生成する工程；
各該第2のアンプリコンを配列決定して、サンプル中に存在する特定のCDR3領域の頻度を同定する工程；
CDR3頻度データを正規化する工程；
第1のサンプルのおよび第2のサンプルの正規化した該CDR3頻度データを比較して、各CDR3配列の頻度間の絶対値差分を決定する工程；
該第1のサンプルと該第2のサンプルとに共通しており最大頻度変化を有する少なくとも100個のCDR3配列を決定する工程
該少なくとも100個のCDR3クロノタイプが寄与する対象の免疫レパートリーの割合を算出することによってインパクト範囲を決定する工程；ならびに
前記第1のサンプルと前記第2のサンプルとの間の頻度差異を示すインパクト範囲内のCDR3クロノタイプの総割合を算出することによってデルタインデックスを決定する工程
を含む、対象由来の白血球細胞の少なくとも2つのサンプル集団に基づいて対象の免疫レパートリーの変化を算出する方法。 - 前記第1のサンプルおよび前記第2のサンプルが、異なる時点で収集される、請求項8に記載の方法。
- 前記対象が健常である、請求項8に記載の方法。
- 前記対象が、疾患と診断されているか、または疾患を有すると疑われる、請求項8に記載の方法。
- 前記対象が免疫療法で処置される、請求項8に記載の方法。
- 前記対象が、前記第1のサンプルを収集した後に免疫療法を受ける、請求項12に記載の方法。
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