JP2022533656A - 免疫レパートリー健康評価システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、個人の免疫レパートリーおよび健康を評価するためのシステムおよび方法に関する。本開示は、（a）デバイス、例えばスマートフォンを、ウェブアプリケーションに接続することによる、サーバ上のまたはサーバによりアクセス可能なデータベースへの、識別情報（例えば、家族の病歴、年齢、性別、および他の識別情報）の個人による提出と、（b）免疫レパートリーの処理のためおよび得られたデータのデータベースへの提出のための血液サンプルの、個人による提出とを意図している。データは、データベースにアクセスするサーバにより処理される。個人は、その後、スマートフォンまたは他のインターネット接続デバイスによりアクセス可能なウェブアプリケーションを用いて、カスタマイズされたレポートにアクセスし得る。カスタマイズされたレポートは、個人の免疫レパートリー指標を表示する。本明細書に開示される3つの免疫レパートリー指標は、（1）クローン型指標、（2）エッセンシャル指標、および（3）多様性指標を含む。特定の態様において、カスタマイズされたレポートは、固有クローン型のサイズがそのようなクローン型の頻度に対応する、個人の免疫レパートリーのグラフィカル表示を含む。
Description
発明の背景
個人における正常状態の存在または非存在を検出するための診断試験が現在利用可能となっており、定期的に実施されている。しかし、これらの試験は、個人における免疫レパートリーの明確な評価またはそのような個人の免疫レパートリーがどのようにして健康の存在または非存在を示すのかに関する見解を提供しない。したがって、個人に、そのような個人の健康の評価を補助し得る様式で彼らの免疫レパートリーを評価および表示する手段を提供するシステムおよび方法に対する要望が存在する。
個人における正常状態の存在または非存在を検出するための診断試験が現在利用可能となっており、定期的に実施されている。しかし、これらの試験は、個人における免疫レパートリーの明確な評価またはそのような個人の免疫レパートリーがどのようにして健康の存在または非存在を示すのかに関する見解を提供しない。したがって、個人に、そのような個人の健康の評価を補助し得る様式で彼らの免疫レパートリーを評価および表示する手段を提供するシステムおよび方法に対する要望が存在する。
発明の要旨
いくつかの態様において、本開示は、使用者の免疫レパートリープロフィールを使用者に提示する方法に関し、本方法は、使用者から血液サンプルを得る工程、クローン型指標、エッセンシャル指標、および多様性指標からなる群より選択される少なくとも1つの指標を決定し、使用者の血液サンプルについての免疫レパートリープロフィールを作成する工程、ならびに使用者の免疫レパートリープロフィールに関して使用者に情報を出力する工程を含む。いくつかの態様において、この方法は、使用者に関連する特徴データセットを得る工程をさらに含み、使用者に関連する特徴データは、使用者の年齢および性別を含む。いくつかの態様において、特徴データはさらに、任意の疾患の存在を含む。いくつかの態様において、血液サンプルは、全血を含む。いくつかの態様において、血液サンプルは、乾燥血液スポットを含む。いくつかの態様において、この方法は、血液採集カードを含むキットを使用者に提供する工程であって、血液採集カードが少なくとも1カ所の血液採集領域およびQRコード（登録商標）を含む、工程、および使用者がQRコードをスキャンし、ソフトウェアアプリケーション上で使用者のアカウントと血液サンプルを関連付ける工程、の追加工程を含む。いくつかの態様において、使用者に情報を出力する工程は、ソフトウェアアプリケーションを用いて実施される。
いくつかの態様において、本開示は、使用者の免疫レパートリープロフィールを使用者に提示する方法に関し、本方法は、使用者から血液サンプルを得る工程、クローン型指標、エッセンシャル指標、および多様性指標からなる群より選択される少なくとも1つの指標を決定し、使用者の血液サンプルについての免疫レパートリープロフィールを作成する工程、ならびに使用者の免疫レパートリープロフィールに関して使用者に情報を出力する工程を含む。いくつかの態様において、この方法は、使用者に関連する特徴データセットを得る工程をさらに含み、使用者に関連する特徴データは、使用者の年齢および性別を含む。いくつかの態様において、特徴データはさらに、任意の疾患の存在を含む。いくつかの態様において、血液サンプルは、全血を含む。いくつかの態様において、血液サンプルは、乾燥血液スポットを含む。いくつかの態様において、この方法は、血液採集カードを含むキットを使用者に提供する工程であって、血液採集カードが少なくとも1カ所の血液採集領域およびQRコード（登録商標）を含む、工程、および使用者がQRコードをスキャンし、ソフトウェアアプリケーション上で使用者のアカウントと血液サンプルを関連付ける工程、の追加工程を含む。いくつかの態様において、使用者に情報を出力する工程は、ソフトウェアアプリケーションを用いて実施される。
いくつかの態様において、本開示は、使用者の免疫レパートリープロフィールを使用者に提示する方法に関し、本方法は、血液採集カードを含むキットを使用者に提供する工程であって、血液採集カードが少なくとも1カ所の血液採集領域およびQRコードを含む、工程、使用者がQRコードをスキャンし、ソフトウェアアプリケーション上で使用者のアカウントと血液サンプルを関連付ける工程、使用者に関連する特徴データセットを得る工程であって、使用者に関連する特徴データが、使用者の年齢、性別および任意の疾患の存在または非存在を含む、工程、使用者から血液サンプルを得る工程、クローン型指標、エッセンシャル指標、および多様性指標からなる群より選択される少なくとも1つの指標を決定し、使用者の血液サンプルについての免疫レパートリープロフィールを作成する工程、ならびにソフトウェアアプリケーションを用いて使用者の免疫レパートリープロフィールに関して使用者に情報を出力する工程を含む。
詳細な説明
本開示は、個人の免疫レパートリーおよび健康を評価するためのシステムおよび方法に関する。図1に示されるように、本開示は、（a）デバイス、例えば、スマートフォンをウェブアプリケーションに接続することによる、サーバ上のまたはサーバによりアクセス可能なデータベースへの、識別情報（例えば、家族の病歴、年齢、性別および他の識別情報）の個人による提出と、（b）免疫レパートリーの処理のためおよび得られたデータのデータベースへの提出のための、血液サンプルの個人による提出とを意図している。図2に示されるように、データは、使用者のためのカスタムレポートを作成するよう、データベースにアクセスするサーバにより処理される。個人は、その後、図3に示されるように、スマートフォンまたは他のインターネット接続デバイスによりアクセス可能なウェブアプリケーションを用いてカスタマイズされたレポートにアクセスし得る。カスタマイズされたレポートは、個人の免疫レパートリー指標を示す。本明細書に開示される3つの免疫レパートリー指標は、（1）クローン型指標、（2）エッセンシャル指標、および（3）多様性指標を含む。特定の態様において、カスタマイズされたレポートは、固有クローン型のサイズがそのようなクローン型の頻度に対応する、個人の免疫レパートリーのグラフィカル表示を含む。
本開示は、個人の免疫レパートリーおよび健康を評価するためのシステムおよび方法に関する。図1に示されるように、本開示は、（a）デバイス、例えば、スマートフォンをウェブアプリケーションに接続することによる、サーバ上のまたはサーバによりアクセス可能なデータベースへの、識別情報（例えば、家族の病歴、年齢、性別および他の識別情報）の個人による提出と、（b）免疫レパートリーの処理のためおよび得られたデータのデータベースへの提出のための、血液サンプルの個人による提出とを意図している。図2に示されるように、データは、使用者のためのカスタムレポートを作成するよう、データベースにアクセスするサーバにより処理される。個人は、その後、図3に示されるように、スマートフォンまたは他のインターネット接続デバイスによりアクセス可能なウェブアプリケーションを用いてカスタマイズされたレポートにアクセスし得る。カスタマイズされたレポートは、個人の免疫レパートリー指標を示す。本明細書に開示される3つの免疫レパートリー指標は、（1）クローン型指標、（2）エッセンシャル指標、および（3）多様性指標を含む。特定の態様において、カスタマイズされたレポートは、固有クローン型のサイズがそのようなクローン型の頻度に対応する、個人の免疫レパートリーのグラフィカル表示を含む。
いくつかの態様において、血液サンプルは、ランセットおよび滅菌血液採集カードを含むキットを用いることにより使用者により採集され得る。血液採集カードは、紙およびカード用紙を含むがこれらに限定されない、血液を吸収するのに適した素材を含み得る。使用者は、ランセットを使用して、例えば使用者の指先の1つから、血液を抜き出してもよい。血液採集カードは、使用者が血液のサンプルを配置でき、そしてそのような血液を乾燥させられる1つまたは複数の血液採集領域を含む。血液採集カードはさらに、QRコードを含んでよく、使用者はこれをスマートフォンまたは他のデバイスを用いてスキャンし、このQRコードおよび血液サンプルを、ソフトウェアアプリケーション上で使用者のアカウントと関連づけることができる。使用者は、その後、データベース上に保存される使用者レポートを作成するために、再水和、処理、ならびに使用者のクローン型指標、エッセンシャル指標、および／または多様性指標の決定のために、血液採集カードを送ることができる。使用者は、その後、インターネット接続デバイスを通じてソフトウェアアプリケーションを用いてデータベース上に保存されている彼または彼女の使用者レポートにアクセスすることができる。
クローン型指標
本明細書に開示される第1の指標は、クローン型指標と称される。個人のクローン型指標は、リンパ球を含む個人のサンプル、例えば血液サンプルにおける固有クローン型の総数を測定し、固有クローン型の総数を、そのサンプルにおける単位リード（read）数で除算することによって得られる。本明細書で使用される場合、「血液サンプル」は、末梢血、乾燥血液スポット、臍帯血、または血液を含む他のサンプルを意味する。
本明細書に開示される第1の指標は、クローン型指標と称される。個人のクローン型指標は、リンパ球を含む個人のサンプル、例えば血液サンプルにおける固有クローン型の総数を測定し、固有クローン型の総数を、そのサンプルにおける単位リード（read）数で除算することによって得られる。本明細書で使用される場合、「血液サンプル」は、末梢血、乾燥血液スポット、臍帯血、または血液を含む他のサンプルを意味する。
エッセンシャル指標
本明細書に開示される第2の指標は、エッセンシャル指標と称される。1つの態様において、エッセンシャル指標は、個人のリード100,000中の上位1000のパブリックCDR3（pCDR3）の数である。pCDR3は、2人以上の個人に存在するCDR3である。上位1000のpCDR3を決定するために、個人の集合（指標プール）のpCDR3が決定され、ランク付けされる。他の態様において、上位1000より少ないpCDRが評価される。他の態様において、上位1000より多いpCDR3が評価される。他の態様において、100,000より少ないリードが個人から取られる。他の態様において、100,000より多いリードが個人から取られる。
本明細書に開示される第2の指標は、エッセンシャル指標と称される。1つの態様において、エッセンシャル指標は、個人のリード100,000中の上位1000のパブリックCDR3（pCDR3）の数である。pCDR3は、2人以上の個人に存在するCDR3である。上位1000のpCDR3を決定するために、個人の集合（指標プール）のpCDR3が決定され、ランク付けされる。他の態様において、上位1000より少ないpCDRが評価される。他の態様において、上位1000より多いpCDR3が評価される。他の態様において、100,000より少ないリードが個人から取られる。他の態様において、100,000より多いリードが個人から取られる。
本開示の1つの局面において、個人の免疫レパートリーは、その個人のエッセンシャル指標が最小比率を満たすまたは超える場合に正常とみなされ、個人の正常性指標がそのような最小比率を下回る場合に個人の免疫レパートリーが異常であるとみなされる。1つの態様において、最小比率は35％である。
個人により発現されるCDR3は、非常に大きな多様性を示し、最大1015個もの固有のCDR3が生じ得る。したがって、CDR3は、免疫系の多様性の根拠として使用され得る。7500万のCDR3のサンプリングに基づき、本発明者は、無作為に選択されたCDR3のおよそ81％が、特定の個人に固有であり、複数の個人間で共有されていないことを決定した。
本開示の方法は、個人において正常な免疫状態または異常な免疫状態を特定するために以下の工程を用いて実施され得、該方法は以下の工程を含む：（a）標的特異的ネスト型プライマーを含む反応ミックス中で個人由来の白血球細胞集団からポリヌクレオチドを増幅し、第1アンプリコンセットを生成する工程であって、標的特異的ネスト型プライマーの少なくとも一部が、増幅時に、少なくとも1つの共通ポリマーに対する結合部位を第1アンプリコンに組み込むためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含む、工程、（b）第1アンプリコンを含む第1反応ミックスの一部を、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2反応ミックスに移す工程、（c）少なくとも1つの共通プライマーを用いて、第1アンプリコンを増幅し、第2アンプリコンセットを生成する工程、（d）第2アンプリコンを配列決定して、白血球細胞の部分集団におけるCDR3配列を特定する工程、および（e）pCDR3を構成するCDR3配列を特定する工程、（f）個人のpCDR3に基づきエッセンシャル指標を計算する工程、ならびに（g）エッセンシャル指標が正常であるかまたは異常であるかを特定する工程であって、正常な状態が最小比率のpCDR3の存在により特徴づけられ、異常な状態が最小比率のpCDR3の非存在により特徴づけられる工程。
特定の態様において、配列決定は、サンプルあたり約100,000のリードが取られることを含む。特定の態様において、リードは、無作為選択を用いて複数回、例えば約10～100回行われる。参照プールの上位1000のpCDR3における個人のpCDR3の数は、「エッセンシャル指標」と称される比率を提供し、これは0％～100％の数字である。例えば、個人のサンプルが上位1000のpCDR3配列のうちの200を含む場合、個人のエッセンシャル指標は0.20または20％である。他の態様において、少なくとも10,000のリードが取られる。他の態様において、100,000を超えるリードが取られる。他の態様において、リードは10回未満行われる。他の態様において、リードは100回超行われる。
特定の態様において、指標プールは、約1000名の個人から構成される。他の態様において、指標プールは、100～1000名の個人を含む。他の態様において、指標プールは、100名未満の個人を含む。他の態様において、指標プールは、1000名超の個人を含む。個人に対して、個人群は、変動要因を制御する場合、年齢一致、性別一致、健康、疾患一致、および／または当技術分野で一般に知られている他の基準であり得る。特定の態様において、指標プールは、健常対照群から構成される。他の態様において、指標プールは、健常対照群と1つまたは複数の疾患状態を有する個人の混合から構成される。他の態様において、指標プールは、1つまたは複数の特定の疾患を有する個人から構成される。
他の態様において、指標プールにより共有されるCDR3配列（すなわち、pCDR3）は、指標プールの各サンプルを比較し、そのような参照プールにおいて試験された個人の少なくとも50％により共有されているCDR3を特定することにより決定される。特定の態様において、pCDR3は、おおよそ上位1000の共有されているCDR3配列を含む。他の態様において、pCDR3は、少なくとも100のCDR3配列を含む。他の態様において、pCDR3は、1000超のCDR3配列を含む。
以前は、免疫系を広範な様式で評価することは、ヒトまたは動物の免疫系における細胞の数および種類が非常に多く、細胞の小サブセット以上の配列決定がほぼ不可能であったため、困難であった。本発明者は、以前から利用可能であった方法よりも高い感度および特異性を提供しつつ半定量的な結果をもたらす、半定量PCR法（米国特許出願公開番号20090253183により詳細に記載される、アームPCR）を開発した。特異性および感度を増大させること、それによって単一のサンプル内で検出可能な標的数を増加させることが、これの能力であり、これが、この方法を、免疫レパートリーのクローン型の相対数を検出する上で理想的なものにしている。本発明者は、より最近、この配列決定法を用いることで、個人のCDR3配列を、指標グループにより一般に共有されているものと比較することができることを発見し、本方法の完成に至った。この方法は、個人の指標プールに対して対象の免疫レパートリーの多様性を評価するために使用され得る。例えば、本発明者は、疾患の存在が、減少した免疫レパートリーの多様性、例えば、本開示の方法を用いて容易に検出され得るCDR3配列の多様性の減少に相関することを示した。したがってこの方法は、臨床実務において現在使用されている細胞数計測および生化学試験と同様に、正常対異常の免疫レパートリーの多様性の初期診断標識として有用であり得る。
免疫レパートリーのクローン型（すなわち、クローンのタイプ）は、免疫系の免疫グロブリン（Ig）およびT細胞受容体（TCR）生成の初期段階における体細胞組み換えを通じた可変（V）、多様性（D)、連結（J）遺伝子セグメントの再構成により決定される。V(D)J再構成体は、T細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ鎖から、ならびに免疫グロブリン重鎖（IgH）および軽鎖（IgK、IgL）から、増幅および検出され得る。細胞は、例えば、末梢血、リンパ組織、癌組織、または他の器官および／もしくは器官系の組織もしくは体液を入手することによって、個人から入手され得る。これらのサンプル、例えば血液サンプルを入手する技術は、当業者に公知である。細胞数は、PCR増幅および配列決定により検出される配列の数から推定され得る。
約30～90ヌクレオチドを含むCDR3領域は、その遺伝子の組み換えられた可変（V)、多様性（D)、および連結（J）セグメントの接続体を含む。それは、その受容体の結合特異性をコードし、固有のV(D)J再構成体を特定するための配列タグとして有用である。
Wangらは、検体中の標的分子の数の定量的または半定量的評価を得るためにPCRが使用され得ることを開示した（Wang, M. et al, 「Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction」, (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 86: 9717-9721）。定量的増幅を達成するのに特に効果的な方法は、以前に本発明者によって報告されている。1つのそのような方法は、アームPCRとして知られており、これは米国特許出願公開番号20090253183A1に記載されている。
本開示の局面は、T細胞、B細胞、および／またはTもしくはB細胞のサブセットからのCDR3のアームPCR増幅を含む。そのような細胞型は、FACS選別および磁気ビーズ選別を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の技術を用いて選別および単離され得る。したがって、細胞の「集団（population）」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に細胞の「集団（populations）」または「部分集団」のいずれかと称されているものを含む。多数の増幅産物は、その後、例えば、454またはIllumina等のプラットフォームを用いる次世代配列決定を用いて効率的に配列決定され得る。
アームPCR法は、1回の反応で複数のポリヌクレオチドの非常に感度の高い、半定量的な増幅を提供する。アームPCR法はまた、密閉されたカセットシステム（iCubate（登録商標）, Huntsville, Alabama）内で自動化された方法により実施され得、このことは、例えば、様々なTおよびB細胞のレパートリーが非常に膨大であることから、本発明の方法において有益である。アームPCR法において、標的の数は、DNAポリメラーゼにより誘導される反応の中で増加し、これは、この反応に導入される標的特異的プライマーの結果である。この増幅反応のさらなる結果は、共通プライマーに対する結合部位の導入であり、これは、第1アンプリコンセットを含む第1反応ミックスの一部を、共通プライマーを含む第2反応ミックスに移動させることにより、その後の増幅において使用される。「少なくとも1つの共通プライマー」は、本明細書で使用される場合、そのような結合部位に結合する少なくとも1つのプライマーを表し、プライマー対、例えば順方向および逆方向プライマーを含む。この移動は、第1増幅反応物から反応ミックスの一部を回収し、そのサンプルを第2反応チューブもしくはチャンバーに投入することによって、または完了した第1増幅物から液体の一部を除去しつつ、一部を残し、第1増幅が行われたチューブに新しい試薬を添加することによってのいずれかにより行われ得る。いずれの場合も、その後、検出のための増幅産物を生成するために、追加の緩衝液、ポリメラーゼ等が共通プライマーと共に添加され得る。共通プライマーを用いた標的分子の増幅は、第1増幅において増幅された標的の量的な数が、標的特異的ではなく共通のプライマーを用いて増幅され、それによって検出のために非常に多数の標的が生成され、個々の血液サンプル内で様々な再構成体を含む細胞の相対量を決定することが可能になるという、半定量的な結果を提供する。また、第2反応ミックスを第1反応ミックスの一部と組み合わせることで、より高濃度の標的特異的プライマーを第1反応ミックスに添加することが可能になり、それによって第1増幅反応におけるより高い感度が達成される。診断利用される正常性指標を生成するための細胞集団内で発現されたCDR3の十分に高感度かつ定量的な評価を可能にするのは、特異性および感度の組み合わせ、それと共にアームPCR法のような方法の使用により定量的な結果を達成する能力である。
抗原の認識によるクローン拡大は、抗体産生B細胞または受容体含有T細胞を含むであろう、その抗原を認識するより大きな細胞集団を生成する。これは、本明細書に開示される方法にしたがい取られるリードを、抗原特異的拡大を反映するよう偏らせ、それによって検出されるpCDR3配列の比率を減少させ得る。したがって、相対的に低い正常性指標、例えば、最小比率を下回るものは、特定の疾患を有すると診断された個人においてまたは特定の抗原に対して最近ワクチン接種した個人において多く見られる特定の細胞集団の拡大を示し得る。
免疫系細胞の可変領域を増幅および配列決定するためのプライマーは、商業的に入手可能であり、刊行物、例えば、本発明者の公開された特許出願W02009137255およびS201000021896A1に記載されている。
様々な高スループット配列決定技術、例えばHoffman-LaRoche, Inc.の454（登録商標）配列決定システムが、商業的に利用可能である。この454（登録商標）配列決定法において、例えば、AおよびBアダプターは、PCR中にPCR産物に連結されるかまたはPCR反応後にライゲートされるかのいずれかである。アダプターは、増幅および配列決定工程で使用される。アームPCR技術と組み合わせて行う場合、AおよびBアダプターは、増幅反応において（ときに「共同プライマー」または「スーパープライマー」と称される）共通プライマーとして使用され得る。AおよびBアダプターがサンプルライブラリ（例えば、PCRアンプリコン）に物理的に付加された後、一本鎖DNAライブラリが、当業者に公知の技術を用いて調製される。一本鎖DNAライブラリは、専用設計されたDNA捕捉ビーズ上に固定化される。各ビーズは、固有の一本鎖DNAライブラリフラグメントを保持する。ビーズに結合されたライブラリは、油中水混合物中で増幅試薬と共に乳化され、各々が1つの固有のサンプルライブラリフラグメントを有する1つのみのビーズを含むマイクロリアクタが生成される。各々の固有のサンプルライブラリフラグメントは、競合または混入配列を排除したその独自のマイクロリアクタ内で増幅される。フラグメントコレクション全体の増幅は、並行して行われる。各フラグメントにつき、これは、ビーズあたり数百万のコピー数をもたらす。その後、このエマルジョンPCRは破壊されるが、増幅されたフラグメントはそれらの各々のビーズに結合した状態のままである。クローン増幅されたフラグメントは、濃縮され、配列決定のためにPicoTiterPlate（登録商標）デバイスに投入される。PicoTiterPlate（登録商標）ウェルの直径は、ウェルあたり1つのみのビーズを許容する。配列決定酵素の添加後、配列決定機器の流体工学サブシステムは、各々が単一のビーズを含む数十万のウェルを通じて定められた順に個々のヌクレオチドを流動させる。テンプレート鎖に相補的な1つ（または複数）のヌクレオチドの添加は、機器内のCCDカメラにより記録される化学発光シグナルを発生させる。PicoTiterPlate（登録商標）デバイスを通じて生成されるシグナル強度と位置情報の組み合わせは、ソフトウェアが、GS FLXシステムにより各々最大約450塩基対である1,000,000超の個々のリードの配列を決定することを可能にする。
定量的および／または半定量的方法を用いて配列が得られたら、その後、例えば個々のサンプルの既定数のリードにより表されるpCDR3の比率を決定することにより、正常性指標を計算することが可能になる。各々の個人の正常性指標は、その個人の正常性指標が正常範囲内に入るのか、したがって正常なのか、またはしきい値を下回るのか、したがって異常なのかを決定するために、既定のしきい値と比較され得る。
本開示の方法は、個人の免疫レパートリーが異常であるかどうかを決定する診断目的で、医師に追加の臨床試験を提供する。さらに、本開示の方法は、特に自動化されたシステム、例えば米国特許出願公開番号201000291668A1において本発明者により記載されたシステムにおいて使用される場合、複数の個人からのサンプルを分析するために使用され得、増幅された標的配列の検出が1つまたは複数のマイクロアレイの使用により達成される。
個々のサンプル
ヘパリンナトリウム中に収集された全血サンプル（40 ml）または末梢血単核細胞（PBMC）を、健常な個人および疾患を有する個人の両方の混合集団である1100名の個人から得た。1100名の個人を、グループあたり100サンプルとなるよう、11の異なるグループに無作為に配置した。
ヘパリンナトリウム中に収集された全血サンプル（40 ml）または末梢血単核細胞（PBMC）を、健常な個人および疾患を有する個人の両方の混合集団である1100名の個人から得た。1100名の個人を、グループあたり100サンプルとなるよう、11の異なるグループに無作為に配置した。
RNAの抽出およびレパートリーの増幅
RNAの抽出は、製造元のプロトコルにしたがいRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いてネスト型配列特異的プライマーセット（順方向外側、Fo；順方向内側、Fi；逆方向外側、Ro；および逆方向内側、Ri）を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー（FiおよびRi）に連結した。最初の数回の増幅サイクルでこれらのタグ配列をPCR産物に組み込んだ後、共同プライマー対を用いて指数関数増幅相を実行した。増幅の第1ラウンドでは、配列特異的ネスト型プライマーのみを使用した。ついで、ネスト型プライマーをエキソヌクレアーゼ消化により除去し、第1ラウンドPCR産物を、共同プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによる増幅の第2ラウンドにおけるテンプレートとして使用した。各々個々のバーコードタグを、PCRプライマーを通じて同じサンプル由来のアンプリコンに導入した。
RNAの抽出は、製造元のプロトコルにしたがいRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いてネスト型配列特異的プライマーセット（順方向外側、Fo；順方向内側、Fi；逆方向外側、Ro；および逆方向内側、Ri）を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー（FiおよびRi）に連結した。最初の数回の増幅サイクルでこれらのタグ配列をPCR産物に組み込んだ後、共同プライマー対を用いて指数関数増幅相を実行した。増幅の第1ラウンドでは、配列特異的ネスト型プライマーのみを使用した。ついで、ネスト型プライマーをエキソヌクレアーゼ消化により除去し、第1ラウンドPCR産物を、共同プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによる増幅の第2ラウンドにおけるテンプレートとして使用した。各々個々のバーコードタグを、PCRプライマーを通じて同じサンプル由来のアンプリコンに導入した。
配列決定
異なるサンプル由来のバーコードタグ付加されたアンプリコン産物をプールしてひとまとめにし、2％アガロースゲルに投入した。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250～500bpフラグメントに対応するDNAバンドからDNAフラグメントを精製した。454 GS FLXシステムをチタンキット（SeqWright, Inc.）と共に用いてDNAを配列決定した。
異なるサンプル由来のバーコードタグ付加されたアンプリコン産物をプールしてひとまとめにし、2％アガロースゲルに投入した。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250～500bpフラグメントに対応するDNAバンドからDNAフラグメントを精製した。454 GS FLXシステムをチタンキット（SeqWright, Inc.）と共に用いてDNAを配列決定した。
配列決定データの分析
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがい選別した。配列の分離の後、Wangら（Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523）により報告されたアプローチと同様の様式で配列分析を行った。簡単に説明すると、IMGTサーバ（http://www.imgt.org）からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、プログラムIRmapを用いて配列リード上にマップした。マッピング情報を通じて、参照配列においてCDR3領域を定義する境界を配列リードに反映させた。配列決定リード内に含まれるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがい選別した。配列の分離の後、Wangら（Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523）により報告されたアプローチと同様の様式で配列分析を行った。簡単に説明すると、IMGTサーバ（http://www.imgt.org）からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、プログラムIRmapを用いて配列リード上にマップした。マッピング情報を通じて、参照配列においてCDR3領域を定義する境界を配列リードに反映させた。配列決定リード内に含まれるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
以下の表1は、臍帯血からの例示的なpCDR3を列挙している。以下の表2は、成人血液からの例示的なpCDR3を列挙している。
（表１）
（表２）
多様性指標
本明細書に開示される第3の指標は、多様性指標と称される。この方法は、一般に正常で健常な個人において見られる免疫細胞の多様性のレベルと、1つまたは複数の疾患状態を有する個人において見られる一般により低い多様性レベルとの間の差を、正常または異常な免疫状態の存在の診断標識として使用する。本発明の1つの局面において、多様性レベルはD50と称され、D50は、免疫系細胞の集団または部分集団における総CDR3の少なくとも半分を占める明確なCDR3の最小比率と定義される。そのヌクレオチド配列が各TまたはB細胞クローンに固有の領域である第3相補性決定領域（CDR3）は、その数が多いほど、多様性レベルが高い。D50は、以下のように説明される場合がある。総細胞数の「有意な比率」が50パーセント（50％）である場合、多様性指標（D50）はまた、riがi番目に豊富なCDR3の量であり、r1が最も豊富なCDR3の量であり、r2が2番目に豊富なCDR3の量である等のように順位づけされる優勢構成のS個の明確なCDR3から構成されるJ個の個別の細胞の免疫レパートリーの多様性（CDR3の総数）の尺度と定義され得る。Cは、総配列決定リードの50％を占める、明確なCDR3の最小数である。したがってD50は、C/S x 100により与えられる。
本明細書に開示される第3の指標は、多様性指標と称される。この方法は、一般に正常で健常な個人において見られる免疫細胞の多様性のレベルと、1つまたは複数の疾患状態を有する個人において見られる一般により低い多様性レベルとの間の差を、正常または異常な免疫状態の存在の診断標識として使用する。本発明の1つの局面において、多様性レベルはD50と称され、D50は、免疫系細胞の集団または部分集団における総CDR3の少なくとも半分を占める明確なCDR3の最小比率と定義される。そのヌクレオチド配列が各TまたはB細胞クローンに固有の領域である第3相補性決定領域（CDR3）は、その数が多いほど、多様性レベルが高い。D50は、以下のように説明される場合がある。総細胞数の「有意な比率」が50パーセント（50％）である場合、多様性指標（D50）はまた、riがi番目に豊富なCDR3の量であり、r1が最も豊富なCDR3の量であり、r2が2番目に豊富なCDR3の量である等のように順位づけされる優勢構成のS個の明確なCDR3から構成されるJ個の個別の細胞の免疫レパートリーの多様性（CDR3の総数）の尺度と定義され得る。Cは、総配列決定リードの50％を占める、明確なCDR3の最小数である。したがってD50は、C/S x 100により与えられる。
本発明の方法は、免疫レパートリーの多様性レベルを評価するために以下の工程を用いて実施され得る：（a）標的特異的ネスト型プライマーを含む反応ミックス中でヒトまたは動物対象由来の白血球細胞集団からポリヌクレオチドを増幅し、第1アンプリコンセットを生成する工程であって、標的特異的ネスト型プライマーの少なくとも一部が、増幅時に、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を第1アンプリコンに組み込むためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含む、工程、（b）第1アンプリコンを含む第1反応ミックスの一部を、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2反応ミックスに移す工程、（c）少なくとも1つの共通プライマーを用いて、第1アンプリコンを増幅し、第2アンプリコンセットを生成する工程、（d）第2アンプリコンを配列決定して、白血球細胞の部分集団においてV(D)J再構成配列を特定する工程、（e）特定されたV(D)J再構成配列を用いて、免疫系細胞の集団内の総細胞数およびその集団内で特定された各クローン型の総細胞数の両方を定量する工程、ならびに（f）その集団内で計測された総細胞数の有意な比率を占めるクローン型の数を特定する工程であって、正常な状態が総細胞数における有意な比率の中で見られるより多種のクローン型の存在により特徴づけられ、異常な状態が総細胞数における有意な比率の中で見られるより少ないクローン型数の存在により特徴づけられる、工程。
以前は、免疫系を広範な様式で評価することは、ヒトまたは動物の免疫系における細胞の数および種類が非常に多く、細胞の小サブセット以上の配列決定がほぼ不可能であったため、困難であった。本発明者は、以前から利用可能であった方法よりも高い感度および特異性を提供しつつ半定量的な結果をもたらす、半定量PCR法（米国特許出願公開番号20090253183により詳細に記載される、アームPCR）を開発した。特異性および感度を増大させること、それによって単一のサンプル内で検出可能な標的数を増加させることが、これの能力であり、これが、この方法を、免疫レパートリーのクローン型の相対数を検出する上で理想的なものにしている。本発明者は、より最近、この配列決定法を用いることで、個々の対象の免疫レパートリーを比較することができることを発見し、本方法の完成に至った。この方法を用いて、正常で健常かつ見かけ上は無症候性の対象、および様々な形態の癌を有すると診断された対象を評価し、例えば、本発明者は、疾患の存在が、減少した免疫レパートリーの多様性に相関すること、それが本方法を用いて容易に検出され得ることを示した。したがってこの方法は、臨床実務において現在使用されている細胞数計測および生化学試験と同様に、診断標識として有用であり得る。
免疫レパートリーのクローン型（すなわち、クローンのタイプ）は、免疫系の免疫グロブリン（Ig）およびT細胞受容体（TCR）生成の初期段階における体細胞組み換えを通じた可変（V）、多様性（D)、連結（J）遺伝子セグメントの再構成により決定される。V(D)J再構成体は、T細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ鎖から、ならびに免疫グロブリン重鎖（IgH）および軽鎖（IgK、IgL）から増幅および検出され得る。細胞は、例えば、末梢血、リンパ組織、癌組織、または他の器官および／もしくは器官系の組織もしくは体液を入手することによって、個人から入手され得る。これらのサンプル、例えば血液サンプルを入手する技術は、当業者に公知である。「クローン型を定量する」とは、本明細書で使用される場合、特定のクローン型に属する細胞の数の信頼性のある近似を計測または得ることを意味する。細胞数は、PCR増幅および配列決定により検出される配列の数から推定され得る。
約30～90ヌクレオチドを含むCDR3領域は、その遺伝子の組み換えられた可変（V)、多様性（D)、および連結（J）セグメントの接続体を含む。それは、その受容体の結合特異性をコードし、固有のV(D)J再構成体を特定するための配列タグとして有用である。
Wangらは、検体中の標的分子の数の定量的または半定量的評価を得るためにPCRが使用され得ることを開示した（Wang, M. et al., 「Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction」, (1989) Proc. Nat’l. Acad. Sci. 86: 9717-9721）。定量的増幅を達成するのに特に効果的な方法は、以前に本発明者によって報告されている。1つのそのような方法は、アームPCRとして知られており、これは米国特許出願公開番号20090253183A1に記載されている。
本発明の局面は、T細胞、B細胞、および／またはTもしくはB細胞のサブセットからのCDR3のアームPCR増幅を含む。したがって、細胞の「集団（population）」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に細胞の「集団（populations）」または「部分集団」のいずれかと称されているものを含む。多数の増幅産物は、その後、例えば、454またはIllumina等のプラットフォームを用いる次世代配列決定を用いて効率的に配列決定され得る。選択される有意な比率が50％である場合、その数値は、「D50」と称され得る。D50は、そのサンプル中で計測される総TまたはB細胞の50パーセント（50％）を占める優勢でありかつ固有のTまたはB細胞クローンの比率であり得る。例えば、高スループット配列決定において、D50は、総有効リードの50％を占める、すべての固有のCDR3の中で最も優勢なCDR3の数であり得、総有効リードは、一連のエラーフィルターを通して首尾よくスクリーニングされた特定可能なVおよびJ遺伝子セグメントを有する配列の数と定義される。
アームPCR法は、1回の反応で複数のポリヌクレオチドの非常に感度の高い、半定量的な増幅を提供する。アームPCR法はまた、密閉されたカセットシステム（iCubate（登録商標）, Huntsville, Alabama）内で自動化された方法により実施され得、このことは、例えば、様々なTおよびB細胞のレパートリーが非常に膨大であることから、本発明の方法において有益である。アームPCR法において、標的の数は、DNAポリメラーゼにより誘導される反応の中で増加し、これは、この反応に導入される標的特異的プライマーの結果である。この増幅反応のさらなる結果は、共通プライマーに対する結合部位の導入であり、これは、第1アンプリコンセットを含む第1反応ミックスの一部を、共通プライマーを含む第2反応ミックスに移動させることにより、その後の増幅において使用される。「少なくとも1つの共通プライマー」は、本明細書で使用される場合、そのような結合部位に結合する少なくとも1つのプライマーを表し、プライマー対、例えば順方向および逆方向プライマーを含む。この移動は、第1増幅反応物から反応ミックスの一部を回収し、そのサンプルを第2反応チューブもしくはチャンバーに投入することによって、または完了した第1増幅物から液体の一部を除去しつつ、一部を残し、第1増幅が行われたチューブに新しい試薬を添加することによってのいずれかにより行われ得る。いずれの場合も、その後、検出のための増幅産物を生成するために、追加の緩衝液、ポリメラーゼ等が共通プライマーと共に添加され得る。共通プライマーを用いた標的分子の増幅は、第1増幅において増幅された標的の量的な数が、標的特異的ではなく共通のプライマーを用いて増幅され、それによって検出のために非常に多数の標的が生成され、個々の血液サンプル内で様々な再構成体を含む細胞の相対量を決定することが可能になるという、半定量的な結果を提供する。また、第2反応ミックスを第1反応ミックスの一部と組み合わせることで、より高濃度の標的特異的プライマーを第1反応ミックスに添加することが可能になり、それによって第1増幅反応におけるより高い感度が達成される。診断利用される多様性指標を生成するための細胞集団内のクローン型の種類および数の十分に高感度かつ定量的な評価を可能にするのは、特異性および感度の組み合わせ、それと共にアームPCR法のような方法の使用により定量的な結果を達成する能力である。
抗原の認識によるクローン拡大は、その抗原を認識するより大きな細胞集団を生成し、それらの相対数により細胞を評価することは、抗原曝露が抗体産生B細胞または受容体含有T細胞の拡大に影響したかどうかを決定する方法を提供する。これは、例えば、特定の疾患を有すると診断された個人において優勢な特定の細胞集団が存在し得るかどうかを評価する助けとなり、特に、ワクチンが、そのワクチンが与えられた個人において所望の免疫応答を達成したかまたはしなかったかを評価する助けとなり得る。
免疫系細胞の可変領域を増幅および配列決定するためのプライマーは、商業的に入手可能であり、刊行物、例えば、本発明者の公開された特許出願W02009137255およびUS201000021896A1に記載されている。
様々な高スループット配列決定技術、例えばHoffman-LaRoche, Inc.の454（登録商標）配列決定システムが、商業的に利用可能である。この454（登録商標）配列決定法において、例えば、AおよびBアダプターは、PCR中にPCR産物に連結されるかまたはPCR反応後にライゲートされるかのいずれかである。アダプターは、増幅および配列決定工程で使用される。アームPCR技術と組み合わせて行う場合、AおよびBアダプターは、増幅反応において（ときに「共同プライマー」または「スーパープライマー」と称される）共通プライマーとして使用され得る。AおよびBアダプターがサンプルライブラリ（例えば、PCRアンプリコン）に物理的に付加された後、一本鎖DNAライブラリが、当業者に公知の技術を用いて調製される。一本鎖DNAライブラリは、専用設計されたDNA捕捉ビーズ上に固定化される。各ビーズは、固有の一本鎖DNAライブラリフラグメントを保持する。ビーズに結合されたライブラリは、油中水混合物中で増幅試薬と共に乳化され、各々が1つの固有のサンプルライブラリフラグメントを有する1つのみのビーズを含むマイクロリアクタが生成される。各々の固有のサンプルライブラリフラグメントは、競合または混入配列を排除したその独自のマイクロリアクタ内で増幅される。フラグメントコレクション全体の増幅は、並行して行われる。各フラグメントにつき、これは、ビーズあたり数百万のコピー数をもたらす。その後、このエマルジョンPCRは破壊されるが、増幅されたフラグメントがそれらの各々のビーズに結合した状態のままである。クローン増幅されたフラグメントは、濃縮され、配列決定のためにPicoTiterPlate（登録商標）デバイスに投入される。PicoTiterPlate（登録商標）ウェルの直径は、ウェルあたり1つのみのビーズを許容する。配列決定酵素の添加後、配列決定機器の流体工学サブシステムは、各々が単一のビーズを含む数十万のウェルを通じて定められた順に個々のヌクレオチドを流動させる。テンプレート鎖に相補的な1つ（または複数）のヌクレオチドの添加は、機器内のCCDカメラにより記録される化学発光シグナルを発生させる。PicoTiterPlate（登録商標）デバイスを通じて生成されるシグナル強度と位置情報の組み合わせは、ソフトウェアが、GS FLXシステムにより各々最大約450塩基対である1,000,000超の個々のリードの配列を決定することを可能にする。
定量的および／または半定量的方法を用いて配列が得られたら、その後、例えば個々のサンプルで検出された総クローンの少なくとも約50％を占めるクローンの比率を決定することにより、D50を計算することが可能になる。正常範囲が、個々人について得られた数値と比較され得、その結果は、数値としておよび正常または異常な結果としての両方として報告され得る。これは、医師に、診断目的でさらなる臨床試験を提供する。健常な個人、結腸癌を有する個人、および肺癌を有する個人由来の個々のサンプルの結果が、以下の表1に示されている。これらの結果は、T細胞集団からのものであり、8（年齢一致させた正常）～10（結腸癌、肺癌）個のサンプルからの結果の平均として表されている。
（表１）
各々の数値は、評価対象の集団において検出された配列の総数の約50パーセントを構成するクローンの比率を表すので、上記数値から、正常からの偏差として表される、免疫レパートリーの多様性の欠如が、診断試験パネルにおいて使用する上での有用な基準となり得ることが明らかである。本発明の方法は、特に自動化されたシステム、例えば米国特許出願公開番号201000291668A1において本発明者により記載されたシステムにおいて使用される場合、増幅された標的配列の検出を1つまたは複数のマイクロアレイの使用により達成することで、複数の個人由来のサンプルを分析するために使用され得る。
少なくとも1つのマイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションもまた、個人の免疫レパートリーのD50を決定するために使用され得る。そのような方法において、D50は、すべてのVおよびまたはJ遺伝子からの総シグナルの少なくとも50％を占める最も優勢な可変遺伝子（Vおよび／またはJ遺伝子）の比率として計算され得る。
表2は、（8名の）正常で健常な個人および（20名の）慢性リンパ性白血病を有する個人ならびに（12名の）ループスを有する個人の間の、D50により示される、B細胞の多様性の違いを示している。
（表２）
最近、ヒトまたは動物内の微生物の多様性（「微生物叢」）もまた、その健康状態がより不健康な状態に変化する際に変移することを、様々な研究所の研究者らが報告した。例えば、微生物集団の変移は、例えば、様々な胃腸障害、肥満、および糖尿病と関連する。Zauraら（Zaura, E. et al. 「Defining the healthy ‘core microbiome’ of oral microbial communities.」 BMC Microbiology (2009) 9: 259）は、無関係の健常な個人の細菌配列の大部分が同一であること、およびその比率は口腔疾患を有する個人において変移することを報告した。アームPCR法は、高スループット配列決定と組み合わせて、例えば様々なヒトまたは動物組織において微生物のD50値を算出するよう微生物集団の多様性を評価する、比較的迅速、非常に高感度、特異的、かつ半定量的な方法を提供する。アームPCRは、臨床サンプルから得られた混合集団内の細菌を特定する上で極めて効果的であることが示されている。
実施例
個々のサンプル
10個の肺および10個の結腸、ならびに10名の乳癌の個人からヘパリンナトリウム中に収集された全血サンプル（40 ml）を、Conversant Healthcare Systems（Huntsville, Alabama）から購入した。8個の正常対照サンプルからヘパリンナトリウム中に収集された全血サンプル（40 ml）を、ProMedDx（Norton, MA）から購入した。
個々のサンプル
10個の肺および10個の結腸、ならびに10名の乳癌の個人からヘパリンナトリウム中に収集された全血サンプル（40 ml）を、Conversant Healthcare Systems（Huntsville, Alabama）から購入した。8個の正常対照サンプルからヘパリンナトリウム中に収集された全血サンプル（40 ml）を、ProMedDx（Norton, MA）から購入した。
T細胞サブセットの単離
T細胞の単離を、各T細胞サブセットに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた超常磁性ポリスチレンビーズ（MiltenyiBiotec）を用いて行った。全血から、単核細胞をFicoll沈降によって得、抗CD14マイクロビーズを用いて単球を除去した。この単球除去単核画分を、その後、個別のT細胞サブセット画分の供給源として使用した。
T細胞の単離を、各T細胞サブセットに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた超常磁性ポリスチレンビーズ（MiltenyiBiotec）を用いて行った。全血から、単核細胞をFicoll沈降によって得、抗CD14マイクロビーズを用いて単球を除去した。この単球除去単核画分を、その後、個別のT細胞サブセット画分の供給源として使用した。
細胞傷害性CD8+ T細胞は、抗CD4マルチソートビーズ（MiltenyiBiotec）を用いた負選択、その後の抗CD8ビーズを用いた正選択により単離した。CD4+ T細胞は、抗CD4ビーズを用いた正選択により単離した。抗CD25ビーズ（MiltenyiBiotec）を使用して、CD4+CD25+制御性T細胞を選択した。すべての単離された細胞集団を直ちにRNAprotect（Qiagen）で再懸濁した。
RNAの抽出およびレパートリーの増幅
RNAの抽出は、製造元のプロトコルにしたがいRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いてネスト型配列特異的プライマーセット（順方向外側、Fo；順方向内側、Fi；逆方向外側、Ro；および逆方向内側、Ri）を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー（FiおよびRi）に連結した。最初の数回の増幅サイクルでこれらのタグ配列をPCR産物に組み込んだ後、共同プライマー対を用いて指数関数増幅相を実行した。増幅の第1ラウンドでは、配列特異的ネスト型プライマーのみを使用した。ついで、ネスト型プライマーをエキソヌクレアーゼ消化により除去し、第1ラウンドPCR産物を、共同プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによる増幅の第2ラウンドにおけるテンプレートとして使用した。各々個々のバーコードタグを、PCRプライマーを通じて同じサンプル由来のアンプリコンに導入した。
RNAの抽出は、製造元のプロトコルにしたがいRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いてネスト型配列特異的プライマーセット（順方向外側、Fo；順方向内側、Fi；逆方向外側、Ro；および逆方向内側、Ri）を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー（FiおよびRi）に連結した。最初の数回の増幅サイクルでこれらのタグ配列をPCR産物に組み込んだ後、共同プライマー対を用いて指数関数増幅相を実行した。増幅の第1ラウンドでは、配列特異的ネスト型プライマーのみを使用した。ついで、ネスト型プライマーをエキソヌクレアーゼ消化により除去し、第1ラウンドPCR産物を、共同プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによる増幅の第2ラウンドにおけるテンプレートとして使用した。各々個々のバーコードタグを、PCRプライマーを通じて同じサンプル由来のアンプリコンに導入した。
配列決定
異なるサンプル由来のバーコードタグ付加されたアンプリコン産物をプールしてひとまとめにし、2％アガロースゲルに投入した。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250～500bpフラグメントに対応するDNAバンドからDNAフラグメントを精製した。454 GS FLXシステムをチタンキット（SeqWright, Inc.）と共に用いてDNAを配列決定した。
異なるサンプル由来のバーコードタグ付加されたアンプリコン産物をプールしてひとまとめにし、2％アガロースゲルに投入した。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250～500bpフラグメントに対応するDNAバンドからDNAフラグメントを精製した。454 GS FLXシステムをチタンキット（SeqWright, Inc.）と共に用いてDNAを配列決定した。
配列決定データの分析
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがい選別した。配列の分離の後、Wangら（Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523）により報告されたアプローチと同様の様式で配列分析を行った。簡単に説明すると、IMGTサーバ（http://www.imgt.org）からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、プログラムIRmapを用いて配列リードにマップした。マッピング情報を通じて、参照配列においてCDR3領域を定義する境界を配列リードに反映させた。配列決定リード内に含まれるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがい選別した。配列の分離の後、Wangら（Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523）により報告されたアプローチと同様の様式で配列分析を行った。簡単に説明すると、IMGTサーバ（http://www.imgt.org）からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、プログラムIRmapを用いて配列リードにマップした。マッピング情報を通じて、参照配列においてCDR3領域を定義する境界を配列リードに反映させた。配列決定リード内に含まれるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
本願は様々な刊行物を参照している。これらの刊行物の開示は、本願の属する技術分野の最先端をより十分に説明するよう、それらの全体が参照により本願に組み入れられる。開示される参考文献はまた、その参考文献が依拠する背景で議論されているそれらに含まれる情報に関して、個別にかつ具体的に参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書に記載されるシステム、方法およびそれらの様々な態様は、例示的なものである。本明細書に記載されるシステムおよび方法の様々な他の態様も実現可能である。
Claims (8)
- 使用者の免疫レパートリープロフィールを使用者に提示する方法であって、
使用者から血液サンプルを得る工程、
クローン型指標、エッセンシャル指標、および多様性指標からなる群より選択される少なくとも1つの指標を決定し、使用者の血液サンプルについての免疫レパートリープロフィールを作成する工程、ならびに
使用者の免疫レパートリープロフィールに関して使用者に情報を出力する工程
を含む、方法。 - 使用者に関連する特徴データセットを得る工程をさらに含み、
使用者に関連する特徴データが、使用者の年齢および性別を含む、
請求項1記載の方法。 - 特徴データが、任意の疾患の存在をさらに含む、請求項2記載の方法。
- 血液サンプルが、全血を含む、請求項1記載の方法。
- 血液サンプルが、乾燥血液スポットを含む、請求項1記載の方法。
- 血液採集カードを含むキットを使用者に提供する工程であって、血液採集カードが少なくとも1カ所の血液採集領域およびQRコード（登録商標）を含む、工程、ならびに
使用者がQRコード（登録商標）をスキャンし、ソフトウェアアプリケーション上で使用者のアカウントと血液サンプルを関連付ける工程
の追加工程を含む、請求項5記載の方法。 - 使用者に情報を出力する工程が、ソフトウェアアプリケーションを用いて行われる、請求項1記載の方法。
- 使用者の免疫レパートリープロフィールを使用者に提示する方法であって、
血液採集カードを含むキットを使用者に提供する工程であって、血液採集カードが少なくとも1カ所の血液採集領域およびQRコード（登録商標）を含む、工程、ならびに
使用者がQRコード（登録商標）をスキャンし、ソフトウェアアプリケーション上で使用者のアカウントと血液サンプルを関連付ける工程、
使用者に関連する特徴データセットを得る工程であって、使用者に関連する特徴データが、使用者の年齢、性別、および任意の疾患の存在または非存在を含む、工程、
使用者から血液サンプルを得る工程、
クローン型指標、エッセンシャル指標、および多様性指標からなる群より選択される少なくとも1つの指標を決定し、使用者の血液サンプルについての免疫レパートリープロフィールを作成する工程、ならびに
ソフトウェアアプリケーションを用いて、使用者の免疫レパートリープロフィールに関して使用者に情報を出力する工程
を含む、方法。
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