WO2020040210A1 - 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー - Google Patents

筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー Download PDF

Info

Publication number
WO2020040210A1
WO2020040210A1 PCT/JP2019/032673 JP2019032673W WO2020040210A1 WO 2020040210 A1 WO2020040210 A1 WO 2020040210A1 JP 2019032673 W JP2019032673 W JP 2019032673W WO 2020040210 A1 WO2020040210 A1 WO 2020040210A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ighv3
variables
cfs
ighv1
ighv4
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/032673
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
山村　隆
和貴郎 佐藤
紘彦 小野
隆治 松谷
征史 中村
一孝 北浦
Original Assignee
国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社 filed Critical 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
Priority to CN201980066179.1A priority Critical patent/CN112840033A/zh
Priority to US17/269,958 priority patent/US20220364170A1/en
Priority to EP19853005.7A priority patent/EP3842547A4/en
Priority to JP2020538443A priority patent/JPWO2020040210A1/ja
Publication of WO2020040210A1 publication Critical patent/WO2020040210A1/ja
Priority to JP2024016661A priority patent/JP2024036563A/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/306—Chronic fatigue syndrome

Definitions

  • This disclosure relates to the field of diagnosis of diseases, especially myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS).
  • diseases especially myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS).
  • Myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) has core symptoms of remarkable fatigue, wasting after exertion, sleep disorders, cognitive dysfunction, and orthostatic intolerance, pain, autonomic nervous disorder, light, and sound. It is a disease accompanied by various symptoms such as hypersensitivity to food and chemicals. Although it may develop after an infection, the pathology is unclear and there are no biomarkers to identify the onset, so there are various diagnostic criteria, which hinder diagnosis and research. Also, no effective treatment has been established.
  • the present disclosure provides a method of using a B cell receptor (BCR) repertoire as an indicator of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS). It has been demonstrated herein that the frequency of use of genes in the IgGR chain variable region of the BCR is altered in ME / CFS patients compared to healthy controls, and such information can be used to make a diagnosis of ME / CFS. It is possible. In addition to genes in the IgGR chain variable region of the BCR, the amount of immune cell subpopulations (B cells, regulatory T cells, etc.) in the subject can also be used as an indicator. Gene usage can be determined by methods including large-scale, high-efficiency BCR repertoire analysis.
  • (Item 1) A method of using a B cell receptor (BCR) repertoire in a subject as an indicator of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) in the subject.
  • BCR B cell receptor
  • One or more variables, including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in the subject, may be used as an indicator of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) in the subject.
  • ME / CFS myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome
  • (Item 2A) The method according to any of the preceding items, further characterized in that the one or more variables are indicators that the subject has ME / CFS rather than another disease.
  • the one or more genes are IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV1-8, IGHV1-18, IGHV1-24, IGHV1-38-4, IGHV1-45, IGHV1-46, IGHV1-58, IGHV1-69, IGHV1-69-2, IGHV1-69D, IGHV1 / OR15-1, IGHV1 / OR15-5, IGHV1 / OR15-9, IGHV1 / OR21-1, IGHV2-5, IGHV2-26, IGHV2-70, IGHV2-70D, IGHV2 / OR16-5, IGHV3-7, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV3-16, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-23D, IGHV3-25, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-30-5, IGHV3-33, IGHV3-35, IGHV1
  • the one or more genes are IGHV3-73, IGHV1-69-2, IGHV5-51, IGHV4-31, IGHV3-23D, IGHV1 / OR15-9, IGHV4-39, IGHD5-12, IGHV3-43D, IGHD4-17, IGHV5-10-1, IGHD4 / OR15-4a / b, IGHG4, IGHV1 / OR15-5, IGHV3 / OR16-9, IGHD1-7, IGHV3-21, IGHD6-6, IGHV3- 33, IGHD4-23, IGHV3-30-5, IGHV3-23, IGHD6-13, IGHV3-64D, IGHV3-48, IGHV3-64, IGHG1, IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHJ6, The method according to any of the preceding items, comprising at least one gene selected from the group consisting of IGHV3-30, IGHV3-23
  • the one or more genes are IGHD6-6, IGHV3-33, IGHD4-23, IGHV3-30-5, IGHV3-23, IGHD6-13, IGHV3-64D, IGHV3-48, IGHV3- 64, IGHG1, IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHJ6, IGHV3-30, IGHGP, at least one gene selected from the group consisting of IGHV1-3 and IGHD3-22, The method according to any of the above.
  • the one or more genes are selected from the group consisting of IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHJ6, IGHV3-30, IGHGP, IGHV1-3 and IGHD3-22.
  • the method according to any of the preceding items comprising at least one gene.
  • the one or more genes are at least one gene selected from the group consisting of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6.
  • the amount of the immune cell subpopulation is the amount of B cells, the amount of naive B cells, the amount of memory B cells, the amount of plasma blast, the amount of activated naive B cells, or the amount of transitional B cells.
  • the amount of regulatory T cells, the amount of memory T cells, the amount of follicular helper T cells, the amount of Tfh1 cells, the amount of Tfh2 cells, the amount of Tfh17 cells, the amount of Th1 cells, the amount of Th2 cells and the amount of Th17 cells A method according to any of the preceding items selected from: (Item 5-1) The method according to any of the preceding items, wherein the one or more variables include the frequency of use of two or more genes in the IgGR chain variable region of BCR in the subject. (Item 5-2) The method according to any of the preceding items, wherein the one or more variables show AUC ⁇ 0.7 in a ROC curve by regression analysis for discriminating between a normal control and ME / CFS.
  • the one or more variables are the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of BCR in the subject, the BCR diversity index in the subject, and the one or more immunity in the subject.
  • the one or more variables are IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHV3-30, IGHJ6, IGHGP, IGHV4-31, IGHV3-64, IGHD3-22, IGHV3-33, The method according to any of the preceding items, comprising the frequency of use of at least one gene selected from the group consisting of IGHV3-73, IGHV5-10-1 and IGHV4-34.
  • (Item 12) (a) making a part of the one or more variables an index of ME / CFS in the subject; (B) making a part of the one or more variables an indicator that the subject has ME / CFS rather than another disease.
  • (Item 13) The method according to any of the preceding items, wherein (b) is performed a plurality of times for a plurality of other diseases.
  • (Item 14) The method according to any of the preceding items, wherein the other disease comprises multiple sclerosis (MS).
  • MS multiple sclerosis
  • One or more variables, including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in the subject, may be used to determine whether the subject has myosinous encephalomyelitis / chronic, A method as an indicator of suffering from fatigue syndrome (ME / CFS).
  • (Item 15A) The method of the preceding item comprising the features of one or more of the above item.
  • the one or more genes are IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV1-8, IGHV1-18, IGHV1-24, IGHV1-38-4, IGHV1-45, IGHV1-46, IGHV1-58, IGHV1-69, IGHV1-69-2, IGHV1-69D, IGHV1 / OR15-1, IGHV1 / OR15-5, IGHV1 / OR15-9, IGHV1 / OR21-1, IGHV2-5, IGHV2-26, IGHV2-70, IGHV2-70D, IGHV2 / OR16-5, IGHV3-7, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV3-16, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-23D, IGHV3-25, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-30-5, IGHV3-33, IGHV3-35, IGHV1
  • the one or more genes include at least one gene selected from the group consisting of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHV3-49 and IGHJ6.
  • the method described in any of the items. (Item 18) The method according to any of the preceding items, wherein the one or more variables include the frequency of use of two or more genes in the IgGR chain variable region of BCR in the subject. (Item 19) The method according to any of the preceding items, wherein the one or more variables show AUC ⁇ 0.7 in a ROC curve by regression analysis for discriminating between MS and ME / CFS.
  • (Item A1) A method for diagnosing that a subject suffers from myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS), comprising measuring a B cell receptor (BCR) repertoire in the subject. Diagnosing the subject as suffering from myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) based on the BCR repertoire. (Item A1-1) The method according to the above items, comprising the features according to one or more of the above items.
  • BCR B cell receptor
  • (Item A2) A method for treating myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS), comprising: measuring a B cell receptor (BCR) repertoire in a subject; A method comprising diagnosing that a subject has myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) and administering treatment to the subject. (Item A2-1) The method according to the above items, comprising the features according to one or more of the above items. (Item A3) The subject has myopathic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) based on one or more variables including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in the subject.
  • BCR B cell receptor
  • the method according to any of the preceding items, wherein the method diagnoses that the subject is suffering from. (Item A4) By calculating the value of the expression including the variable for the subject and comparing the value with a threshold, the subject suffers from myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) The method according to any of the preceding items, wherein the diagnosis is made.
  • (Item A5) (A) providing a plurality of variables, including mycelial encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS), including the frequency of use of one or more genes in the IgGR variable region of the BCR; (B) providing a discriminant generated by performing a multivariate analysis on the variable; (C) calculating the probability of having ME / CFS by applying the value of the target variable to the discriminant; and (D) determining the probability of having ME / CFS from a predetermined value.
  • the method of any of the preceding items comprising determining, if high, that the subject has ME / CFS.
  • (Item A6) (A) providing a plurality of variables, including mycelial encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS), including the frequency of use of one or more genes in the IgGR variable region of the BCR; (B) providing a discriminant generated by performing a multivariate analysis on the variable, wherein (B) (B-1) performing univariate or multivariate logistic regression on the variable using a patient / normal person classification as an objective variable; (B-2) calculating constants and coefficients of a discriminant from the constants and partial regression coefficients of the logit model formula generated in the logistic regression; (B-3) generating a discriminant based on the constants and coefficients obtained in the process of B-2, and (C) calculating the probability of having ME / CFS by applying the value of the target variable to the discriminant; and (D) determining the probability of having ME / CFS from a predetermined value.
  • B mycelial encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome
  • a variable logistic analysis is performed, or a multivariate logistic analysis is performed using two or more genes in the variable region of the IgG chain of the BCR as independent variables to obtain a logistic regression model formula, and measure the fitness of the logistic regression model formula.
  • any of the preceding items comprising, if high, determining that the subject has ME / CFS.
  • (Item A7) (A) providing a plurality of variables, including mycelial encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS), including the frequency of use of one or more genes in the IgGR variable region of the BCR; (B) providing a discriminant generated by performing a multivariate analysis on the variable; (C) calculating the probability of having ME / CFS by applying the value of the variable of the subject to the discriminant, and (AA) other than myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) Providing a plurality of variables including the frequency of use of one or more genes in the IgGR variable region of the BCR for the disease of (BB) providing a discriminant generated by performing a multivariate analysis on the variable; (CC) applying the value of the variable of interest to the discriminant to calculate the probability of having a disease other than ME / CFS
  • any of the preceding items including determining that the subject has ME / CFS if higher and the probability of having other than ME / CFS is lower than a predetermined value.
  • the method described in Crab. An in vitro method for diagnosing a subject as suffering from myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) based on a B cell receptor (BCR) repertoire in the subject Diagnosing that the subject has myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS). (Item A8-1) The method according to the above items, comprising the characteristics according to one or more of the above items.
  • (Item B1) When executed by one or more processors, causes the processor to acquire one or more variables, including variables associated with the BCR repertoire of the subject, and based on the one or more variables, the / Instruction to determine whether or not CFS.
  • (Item B1-1) The program according to the above item, comprising the features according to one or more of the above items.
  • (Item B2) When executed by one or more processors, causes the processor to acquire one or more variables, including variables related to the BCR repertoire of the subject, and based on the one or more variables, the / A storage medium storing a program including an instruction for determining whether or not CFS.
  • (Item B2-1) The storage medium according to the item, comprising the feature according to one or more of the items.
  • (Item B2-2) The storage medium according to any one of the above items, which is a non-transitory storage medium.
  • (Item C1) A recording unit configured to record information of one or more variables including a variable related to a target BCR repertoire, and acquiring the information and determining whether the target is ME / CFS. And a determination unit configured to perform the determination.
  • (Item C1-1) The system according to the item, comprising the feature according to one or more of the items.
  • the present disclosure accurate diagnosis of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) can be performed.
  • the present disclosure can be used for prediction of the onset and prognosis of ME / CFS, and can also be used as a marker for developing a therapeutic agent for ME / CFS.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of comparison of the frequency of use of each IGHV gene (IGHV family) of BCR, obtained from ME / CFS disease patient and healthy control sample. The vertical axis indicates the frequency of use (%) of each gene, and the bar indicates the standard error.
  • HC healthy control
  • ME / CFS ME / CFS disease patient.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of comparison of the frequency of use of each IGHD and IGHJ family of BCRs obtained from ME / CFS disease patients and healthy control samples. The vertical axis indicates the frequency of use (%) of each gene, and the bar indicates the standard error.
  • HC healthy control
  • ME / CFS ME / CFS disease patient.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of comparison of the frequency of use of each IGHV gene (IGHV family) of BCR, obtained from ME / CFS disease patient and healthy control sample. The vertical axis indicates the frequency of use (%) of each gene, and the bar indicates the
  • FIG. 3A is a dot plot of the frequency of use of the described IGHV genes of ME / CFS disease patient and healthy control sample.
  • HC healthy control
  • ME / CFS ME / CFS disease patient.
  • FIG. 3A is a dot plot of the frequency of use of the described IGHV genes of ME / CFS disease patient and healthy control sample.
  • HC healthy control
  • ME / CFS ME / CFS disease patient.
  • FIG. 4 is a dot plot of the amount of B cell population described for ME / CFS disease patient and healthy control sample.
  • HC healthy control
  • ME / CFS ME / CFS disease patient.
  • FIG. 5 is a dot plot of the amount of regulatory T cell population in ME / CFS disease patient and healthy control sample.
  • FIG. 6 is a dot plot of the amount of T cell population described for ME / CFS disease patient and healthy control sample.
  • HC healthy control
  • ME / CFS ME / CFS disease patient.
  • FIG. 7 is a regression analysis using the frequency of use of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6, and the B cell cell amount (%) as variables.
  • FIG. 4 is a diagram showing an ROC curve according to FIG. FIG.
  • FIG. 8 shows ROC by regression analysis using the frequency of use of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6 and the Treg amount (%) as variables. It is a figure showing a curve.
  • ME / CFS ME / CFS disease patient, MS: MS disease patient.
  • ME / CFS ME / CFS disease patient, MS: MS disease patient.
  • ME / CFS ME / CFS disease patient
  • non-ME / CFS healthy control + MS disease patient.
  • ME / CFS Myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome
  • ME / CFS Myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome
  • B-cell depletion therapy with rituximab is effective, and attention has been focused on the immunopathology of ME / CFS worldwide.
  • B cells control antibody production in the acquired immune system, but B cell receptors by gene rearrangement are extremely diverse to cope with various antigens.
  • autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and in B-cell hematologic malignancies, specific B-cell receptors (clones) are increased and detected as bias in the individual's diverse B-cell receptor aggregate (repertoire). Is done.
  • repertoire analysis using a method that eliminates bias using a next-generation sequencer has become possible, and may be useful for detecting abnormalities in the B cell line of ME / CFS.
  • ME / CFS The diagnosis of ME / CFS is made based on criteria such as Fukuda criteria, Canada ricriteria, and International consensus criteria based on symptoms and interviews.
  • criteria such as Fukuda criteria, Canada ricriteria, and International consensus criteria based on symptoms and interviews.
  • Fukuda @ criteria is the oldest (1994), followed by the Canadian Standards (2003) and then the International Standards (2011), during which expert experts discuss essential symptoms of the disease (core symptoms). With a common understanding, the creation of new diagnostic criteria is still under consideration.
  • ME / CFS can refer to a disease defined by Fukuda @ criteria, which is a research standard, but can also refer to a disease defined by other medical standards as needed.
  • confirmation of ME / CFS can be made by any of the art-recognized diagnostic criteria.
  • a subject indicated to be ME / CFS a subject indicated to be likely to be ME / CFS, a subject indicated to be likely to develop ME / CFS, or ME / CFS having a poor prognosis.
  • Subjects shown to be suffering from may be appropriately treated.
  • immunomodulators such as
  • BCR repertoire In one embodiment, the disclosure provides a method of using a B cell receptor (BCR) repertoire as an indicator of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) in a subject.
  • B cell receptor (BCR) is also called a B cell receptor, a B cell antigen receptor, or a B cell antigen receptor, and includes Ig ⁇ / Ig ⁇ (Ig ⁇ / Ig ⁇ ) associated with a membrane-bound immunoglobulin (mIg) molecule.
  • CD79a / CD79b) refers to those composed of heterodimers ( ⁇ / ⁇ ).
  • the mIg subunit binds to the antigen and causes receptor aggregation, while the ⁇ / ⁇ subunit transmits signals into the cell. Aggregation of BCR is said to rapidly activate Src family kinases Lyn, Blk and Fyn, as well as tyrosine kinases Syk and Btk.
  • Src family kinases Lyn, Blk and Fyn as well as tyrosine kinases Syk and Btk.
  • the complexity of BCR signaling has many different consequences, including survival, resistance (anergy; lack of hypersensitivity to antigen) or apoptosis, cell division, differentiation into antibody-producing cells or memory B cells. Is included. Hundreds of millions of T cells with different TCR variable region sequences are generated, and hundreds of millions of B cells with different BCR (or antibody) variable region sequences.
  • the antigen specificity of T cells and B cells can be determined by determining the genomic sequence of TCR / BCR or the sequence of mRNA (cDNA). Get clues.
  • V region refers to the variable region (V) of the variable region of a TCR or BCR chain.
  • the “D region” refers to the D region of the variable region of a TCR chain or BCR chain.
  • J region refers to a J region region of a variable region of a TCR chain or a BCR chain.
  • C region refers to a constant region (C) region of a TCR chain or a BCR chain.
  • variable region repertoire refers to a set of V (D) J regions arbitrarily created by gene rearrangement using TCR or BCR.
  • TCR repertoire BCR repertoire
  • BCR repertoire and the like are used, and these may be referred to as, for example, T cell repertoire, B cell repertoire and the like. It can be said that repertoire has two aspects: information on the degree of diversity as a whole and information on how frequently individual genes are used.
  • one or more variables including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in the subject, is used as an indicator of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) in the subject. Is provided.
  • the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of BCR can be derived as follows.
  • One method of determining the BCR repertoire is to determine, in part, how much B cells in a sample use individual V chains by using specific V ⁇ chain specific antibodies to express T cells expressing individual V ⁇ chains. (FACS analysis) for analyzing the ratio of by flow cytometry.
  • TCR repertoire analysis by molecular biological techniques has been devised based on information on TCR genes obtained from human genome sequences. There is a method of extracting RNA from a cell sample, synthesizing a complementary DNA, and then quantifying the TCR gene by PCR amplification.
  • Extraction of nucleic acids from cell samples can be performed using tools known in the art, such as the RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN).
  • Total RNA can be extracted and purified from cells dissolved in TRIzol LS reagent using the RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN).
  • Synthesis of complementary DNA from the extracted RNA can be performed using any reverse transcriptase known in the art, such as Superscript III TM (Invitrogen).
  • PCRPCR amplification of the BCR gene can be appropriately performed by those skilled in the art using any polymerase known in the art. However, in the case of amplification of a gene having a large fluctuation such as the BCR gene, it can be said that if amplification can be carried out “without bias”, there is an advantageous effect for accurate measurement.
  • a method of designing a large number of individual BCR @ V chain-specific primers and separately quantifying them by real-time PCR or the like, or a method of simultaneously amplifying those specific primers has been used.
  • Multiple @ PCR a method of simultaneously amplifying those specific primers
  • all isotypes and subtypes can be obtained with one set of one primer consisting of one forward primer and one reverse primer.
  • the BCR genes, including the genes, are amplified without altering the frequency of occurrence to determine BCR diversity.
  • the following primer design is advantageous for unbiased amplification.
  • a gene containing all V regions is amplified by adding an adapter sequence to its 5 'end without setting primers to the highly diverse V regions.
  • This adapter has an arbitrary length and sequence on the base sequence, and is optimally about 20 base pairs, but a sequence of 10 bases to 100 bases can be used.
  • the adapter added to the 3 'end is removed by a restriction enzyme, and all the BCR genes are amplified by amplifying with an adapter primer having the same sequence as the 20 base pair adapter and a reverse primer specific to the C region which is a common sequence. I do.
  • a complementary strand DNA is synthesized from the BCR gene messenger RNA by reverse transcriptase, and then a double-stranded complementary DNA is synthesized.
  • Double-stranded complementary DNA containing V regions of different lengths is synthesized by reverse transcription reaction or double-stranded synthesis reaction, and an adapter consisting of 20 base pairs and 10 base pairs is attached to the 5 'end of these genes by DNA ligase reaction. To add.
  • reverse primers can be set in the C region of the heavy chain of the ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, the ⁇ chain, and the light chain of the ⁇ chain to amplify these genes.
  • the reverse primer set in the C region is a primer having a mismatch that matches the sequence of each of C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ , and C ⁇ with respect to BCR and does not prime to other C region sequences.
  • the reverse primer of the C region is optimally prepared in consideration of the base sequence, the base composition, the DNA melting temperature (Tm), and the presence or absence of a self-complementary sequence so that amplification with the adapter primer can be performed.
  • all alleles can be uniformly amplified.
  • nested @ PCR in multiple steps is performed.
  • the length (number of bases) of the primer candidate sequence is not particularly limited, but is preferably 10 to 100 bases, and preferably 15 to 50 bases, relative to a sequence that does not contain a sequence that differs between allele sequences in any of the primers. And more preferably 20 to 30 bases. Use of such non-biased amplification is advantageous and is preferable for identifying low-frequency (1 / 10,000 to 1 / 100,000 or less) genes.
  • the sequencing method is not limited as long as the sequence of the nucleic acid sample can be determined, and any method known in the art can be used, but it is preferable to use next-generation sequencing (NGS).
  • Next-generation sequencing includes, but is not limited to, pyrosequencing, sequencing by synthesis (sequencing bi-synthesis), ligation sequencing, ion semiconductor sequencing, and the like.
  • the reference database used is prepared for each V, D, J, C gene region.
  • a nucleic acid sequence data set for each region and allele disclosed by the IMGT is used, but the present invention is not limited thereto, and any data set in which a unique ID is assigned to each sequence can be used.
  • a homology search was performed with a reference database for each gene region, and the closest reference allele and its sequence were compared. Record the alignment.
  • an algorithm having a high degree of mismatch tolerance except C is used for the homology search.
  • general BLAST is used as a homology search program
  • settings such as a reduction in window size, a reduction in mismatch penalty, and a reduction in gap penalty are performed for each region.
  • the homology score, alignment length, kernel length (length of a sequence of consecutively matching bases), and the number of matching bases are used as indices, and these are applied in accordance with a defined priority.
  • the CDR3 sequence is extracted using the CDR3 head on the reference V and the CDR3 end on the reference J as markers. This is translated into an amino acid sequence, which is used to classify the D region.
  • the combination of the homology search result and the amino acid sequence translation result is used as the classification result.
  • alleles of V, D, J, and C are assigned to each sequence in the input set. Subsequently, the BCR repertoire is derived by calculating the appearance frequency of each of V, D, J, and C or the appearance frequency of a combination thereof in the entire input set. Depending on the accuracy required for classification, the frequency of appearance is calculated in allele units or gene name units. The latter is made possible by translating each allele into a gene name.
  • the matching reads are totaled, and the number of reads detected in the sample for each unique read (a read that does not have the same sequence). And the ratio (frequency) to the total number of leads can be calculated.
  • a diversity index or a similarity index can be calculated using statistical data such as ESTIMATES or R (vegan) using data such as the number of samples, the type of read, and the number of reads.
  • ESTIMATES ESTIMATES
  • R vehicle
  • data such as the number of samples, the type of read, and the number of reads.
  • TCR repertoire analysis software Repertoire @ Genesis @ Inc. Is used.
  • BCR diversity refers to the diversity of a B cell receptor repertoire (repertoire) of a subject, and can be measured by those skilled in the art using various means known in the art. .
  • An index indicating BCR diversity is called a “BCR diversity index”.
  • the BCR diversity index includes any known in the art, such as the Shannon-Weaver index, the Simpson index, the inverse Simpson index, and the Pielou's uniformity.
  • a diversity index such as an index, a normalized Shannon-Weaver index, a DE index (eg, a DE50 index, a DE30 index, a DE80 index) or a Unique index (eg, a Unique50 index, a Unique30 index, a Unique80 index). Examples applied to BCR are given.
  • the BCR repertoire is measured using a large-scale, high-efficiency BCR repertoire analysis.
  • large-scale high-efficiency repertoire analysis is described in WO2015 / 075939 (the disclosure of this document is incorporated herein by reference in its entirety as necessary). Is BCR, it is called "large-scale high-efficiency BCR repertoire analysis”.
  • the large-scale high-efficiency repertoire analysis is a method for quantitatively analyzing a subject's repertoire (variable region of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR)) using a database.
  • Using a database to quantitatively analyze the T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a database comprising: Providing a non-biased amplified nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence; (2) determining the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample; and (3) Based on the determined nucleic acid sequence, the frequency of appearance of each gene or a combination thereof is calculated, and the TCR of the subject is also calculated.
  • the step (2) comprises the steps of:
  • the nucleic acid sequence can be determined by a single sequencing used, which can preferably be accomplished by a method comprising: (1) T-cell receptor (TCR) or Providing a nucleic acid sample comprising a B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence; (2) determining the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample; and (3) determining each of the nucleic acid sequences based on the determined nucleic acid sequence.
  • the C region-specific primer of the second TCR or BCR is a sequence downstream of the sequence of the C region-specific primer of the first TCR.
  • the C region-specific primer of the second TCR or BCR is a sequence downstream of the sequence of the C region-specific primer of the first TCR.
  • the first additional adapter nucleic acid sequence is DNA
  • the second additional adapter nucleic acid sequence is a sequence that is suitable for an emPCR reaction
  • the molecule identification ( The MID Tag) sequence includes a step that is a sequence for imparting uniqueness so that an amplification product can be identified.
  • a method of using a B cell receptor (BCR) repertoire in a subject as an indicator of myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) in the subject may include diagnosing that the subject has ME / CFS, as well as providing a predictive or prognostic diagnosis of ME / CFS, or providing an indication when developing a therapeutic agent for ME / CFS.
  • the method may be in vitro or in silico.
  • the method can include using one or more variables, including variables associated with the BCR repertoire.
  • one or more variables are used as an index for ME / CFS, for example, an appropriate expression including the one or more variables is used, the value of the expression is calculated for a certain object, and the value is used as an appropriate reference. This can be done by comparing with.
  • the expression may be obtained by logistic regression or the like.
  • the variables used are one or more genes selected from the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in the subject, the BCR diversity index in the subject, and the amount of one or more immune cell subpopulations in the subject. Examples include, but are not limited to, a variable, or a combination of two or more variables.
  • one or more variables including the frequency of use of one or more IGH genes of BCR in a subject may be used as an indicator of ME / CFS.
  • This may allow the one or more variables to be used as an indicator that the subject has ME / CFS rather than another disease (ie, differential diagnosis).
  • the amount of the immune cell subpopulation and the BCR repertoire diversity index can vary due to other diseases affecting the overall immune status, so that ME / CFS in a subject may vary. Although suggestive of presence, it may not be possible to rule out other diseases.
  • the frequency of use of the IGH gene is considered to have changed reflecting the mechanism of some disease, so that it can serve as an indicator that the subject has ME / CFS instead of other diseases, would be very useful in the diagnosis of
  • mental disorders eg, depression, adaptation disorders, physical expression disorders
  • primary sleep disorders eg, sleep apnea, narcolepsy
  • endocrine disorders eg, hypopituitarism, thyroid disease
  • infections eg, chronic infectious diseases such as AIDS, hepatitis B, hepatitis C
  • autoimmune diseases eg, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, etc.
  • inflammatory diseases eg, inflammatory bowel disease
  • Chronic inflammatory diseases such as chronic pancreatitis
  • nervous system diseases eg, multiple sclerosis (MS), autoimmune encephalitis
  • a method for differentiating ME / CFS from other diseases in a subject.
  • An example of another disease is multiple sclerosis (MS).
  • MS multiple sclerosis
  • BCR B cell receptor
  • a B cell receptor (BCR) repertoire in a subject can be treated with myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME /
  • the matter described as a method of setting an index of (CFS) may be applied.
  • the diagnosis of ME / CFS is made by a “combination of clinical symptoms”, and the exclusion of other diseases and other causes is a very important process. Lifestyle (irregularity, overwork, etc.) may also satisfy the "criteria for combination of clinical symptoms", and other causes, such as malignant tumors, metabolic disorders and cranial nerve disorders, may also meet the criteria for clinical symptoms. obtain. Therefore, as shown in the examples of the present specification, the frequency of use of the B cell repertoire or each gene therein, which is considered to reflect the cause of the disease, is considered to be very useful in clinical diagnosis. For example, it is considered that more accurate differential diagnosis can be achieved by adding a differential method using the BCR repertoire (frequency of use of the IGH gene) described in the present specification to a clinical diagnostic protocol.
  • clinical information (clinical findings, MRI image findings, cerebrospinal fluid findings, etc.) may be used in combination as needed.
  • systemic symptoms including ME / CFS
  • the possibility of suffering from each disease is determined by a discriminant model or discriminant using the frequency of use of the IGH gene.
  • sensitivity refers to the probability of correctly determining what should be determined to be positive as positive, and has a relationship in that false sensitivity decreases as sensitivity increases. High sensitivity is useful for exclusion diagnosis (rule out).
  • the term “specificity” refers to the probability of correctly determining a negative one as a negative, and has a relationship that a high specificity reduces false positives. High specificity is useful for definitive diagnosis.
  • the “ROC curve” refers to a curve in which (sensitivity) and (1-specificity) are plotted when a cutoff value based on a regression equation of a marker is changed as a parameter.
  • the AUC of the ROC curve is considered to indicate the performance of the prediction model.
  • many variables or combinations of variables exhibiting high predictive performance such as AUC ⁇ 0.7, AUC ⁇ 0.8, and AUC ⁇ 0.9 in the ROC curve by regression analysis are demonstrated. If the AUC is about 7, it is considered that the AUC may be used as a diagnostic model.
  • one or more variables used as an indicator of ME / CFS in a subject and one or more variables indicating AUC ⁇ 0.7 in a ROC curve by regression analysis (a combination of variables may be used as necessary. ) Enables ME / CFS diagnosis which has been difficult to diagnose until now.
  • the method may include obtaining one or more variables to be used as indicators of ME / CFS in the subject.
  • obtaining the variable may include analyzing a sample of the subject, for example, measuring the repertoire of BCR in the subject, and / or measuring the amount of a cell subpopulation in the subject. May be included.
  • Measuring the BCR repertoire can include determining BCR diversity in the subject and / or determining the frequency of use of one or more genes in the IgG H chain variable region of the BCR of the subject.
  • the amount of a cell subpopulation in a subject may be measured by any technique known to one of skill in the art, including flow cytometry. It is also possible to acquire, as variables, data on values previously determined for the target.
  • the method can include determining whether the subject is ME / CFS based on one or more variables described herein. The determining may be performed by comparing the value of the dependent variable of the function including the one or more variables to an appropriate threshold.
  • the methods described herein can be performed in silico.
  • the method includes obtaining one or more variables, including variables associated with a subject's BCR repertoire, and determining whether the subject is ME / CFS based on the one or more variables.
  • a program, a storage medium storing the program, or a system that implements any of the methods described herein is also within the scope of the present disclosure.
  • the processor when executed by one or more processors, causes the processor to obtain one or more variables, including variables associated with the BCR repertoire of interest, and based on the one or more variables, Is provided, and a storage medium storing the program is provided.
  • a recording unit configured to record information of one or more variables, including variables related to a BCR repertoire of a subject, and configured to acquire such information and determine whether the subject is a ME / CFS
  • a system including the determined determination unit may also be provided.
  • the system can be a computer system as necessary, and can include the program described in this specification or a storage medium on which the program is recorded.
  • IGH gene One embodiment of the present disclosure provides a method of using one or more variables including the frequency of use of one or more genes (IGH genes) in the IgGR chain variable region of the BCR in a subject as an indicator of ME / CFS in the subject. provide.
  • the frequency of use of various IGH genes can be an indicator of ME / CFS.
  • the number of at least one IGH gene used is not particularly limited, and any number of 1 to 117 genes can be used.
  • One or more variables used as indices in the present disclosure may be about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 15, about 20, It can include the frequency of use of about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 110, or more IGH genes.
  • the one or more variables can also be a single variable.
  • the one or more IGH genes are IGHV3-73, IGHV1-69-2, IGHV5-51, IGHV4-31, IGHV3-23D, IGHV1 / OR15-9, IGHV4-39, IGHD5-12 , IGHV3-43D, IGHD4-17, IGHV5-10-1, IGHD4 / OR15-4a / b, IGHG4, IGHV1 / OR15-5, IGHV3 / OR16-9, IGHD1-7, IGHV3-21, IGHD6-6, IGHV3 -33, IGHD4-23, IGHV3-30-5, IGHV3-23, IGHD6-13, IGHV3-64D, IGHV3-48, IGHV3-64, IGHG1, IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHJ6 IGHV3-30, IGHGP, IGHV1-3 and IGHD3-22.
  • the one or more IGH genes are IGHD6-6, IGHV3-33, IGHD4-23, IGHV3-30-5, IGHV3-23, IGHD6-13, IGHV3-64D, IGHV3-48, IGHV3-64, It contains at least one gene selected from the group consisting of IGHG1, IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHJ6, IGHV3-30, IGHGP, IGHV1-3 and IGHD3-22.
  • one or more IGH genes are at least selected from the group consisting of IGHV3-49, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHJ6, IGHV3-30, IGHGP, IGHV1-3 and IGHD3-22. Contains one gene.
  • the one or more genes comprises at least one gene selected from the group consisting of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6. . It is suggested in the examples of the present specification that the above-mentioned genes can be used alone for prediction.
  • a method of using, as one or more variables, a variable comprising the frequency of use of two or more genes in the IgGR chain variable region of BCR in a subject It is believed that the accuracy of the method can be further increased by using the frequency of use of two or more genes.
  • the one or more variables may be selected to show AUC ⁇ 0.7, AUC ⁇ 0.8, or AUC ⁇ 0.9 in the ROC curve by regression analysis.
  • gene combinations include IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6.
  • a person skilled in the art can appropriately calculate the AUC in the ROC curve by regression analysis of a certain combination of genes according to the method described herein, and determine whether a certain combination of genes exhibits a desired AUC. Can be determined.
  • the regression analysis can be, for example, for discriminating between a normal control and ME / CFS.
  • the BCR diversity index in the subject can be used as a variable instead of or in addition to other variables.
  • any known in the art can be used, such as the Shannon-Weaver index, the Simpson index, and the inverse Simpson index. , Pielou's uniformity index, standardized Shannon-Weaver index, DE index (for example, DE50 index, DE30 index, DE80 index).
  • Example 3-2 and Table 7 in this specification several diversity indexes were extracted with a significance of 0.1 ⁇ P ⁇ 0.2 in the simple regression analysis. Further, in Example 6 of the present specification, it has been found that, among combinations of a plurality of variables, a combination of some variables including a diversity index shows an AUC value of 0.8 or more in ROC analysis ( Table 18).
  • the cell subpopulation quantity in diagnosing myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) in a subject, can be used as a variable instead of or in addition to other variables.
  • the cell subpopulation amount for example, an immune cell subpopulation amount can be used.
  • “cell subpopulation” refers to any collection of cells having some common characteristic in a cell population that includes cells of various characteristics. Where specific names are known in the art, such terms may also be used to refer to a particular cell subpopulation, and may be described by describing any property (eg, expression of a cell surface marker). Can also be referred to.
  • cell subpopulations include, for example, B cells, na ⁇ ⁇ ve B cells, memory B cells, plasma blasts, activated na ⁇ ⁇ ve B cells, transitional B cells, regulatory T cells, memory T cells, focal helper T cells, Tfh1 Cells, Tfh2 cells, Tfh17 cells, Th1 cells, Th2 cells, and Th17 cells, but are not limited thereto.
  • the amount of cell subpopulation can be determined by one skilled in the art, for example, by flow cytometry. For example, after collecting a sample, red blood cells are removed by hemolysis or specific gravity centrifugation, and then reacted with a fluorescently labeled antibody (an antibody to the target antigen and its control antibody). Can be observed. The detected scattered light and fluorescence are converted into electrical signals and analyzed by a computer. As a result, it is possible to distinguish lymphocytes, monocytes, and granulocytes by expressing the strength of FSC as the size of a cell and the strength of SSC as an intracellular structure. Thereafter, the target cell population is gated as necessary, and the antigen expression mode in those cells is examined. In practicing the methods of the present disclosure, one of skill in the art can appropriately identify the surface markers of the indicated cells and fractionate or count the cells.
  • Particularly useful cell subpopulations include B cells and regulatory T cells (Tregs).
  • Tregs regulatory T cells
  • one or more variables including the amount of B cells and / or the amount of Tregs, in addition to or in place of other variables, can be used as an indicator of ME / CFS.
  • the amount of the cell subpopulation can be a ratio to an appropriate standard.
  • the amount of B cells is, for example, the frequency (%) of B cells in peripheral blood mononuclear cells.
  • the amount of Treg is, for example, the frequency (%) of Treg in all CD4-positive T cells.
  • Example 3-2 Table 7 herein, several cell subpopulation variables were extracted with significance 0.1 ⁇ P ⁇ 0.2 in simple regression analysis. Further, in Example 6 of the present specification, it was found that, in a combination of a plurality of variables, a combination of several variables including a cell subpopulation variable exhibited an AUC value of 0.8 or more in ROC analysis. (Table 18).
  • one or more variables including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in a subject can be used as an indicator of ME / CFS in a subject.
  • the one or more variables can be any combination of the variables described herein.
  • two or more selected from the group consisting of the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in the subject, the BCR diversity index in the subject, and the amount of one or more immune cell subpopulations in the subject Including combinations of variables.
  • the two or more variables can be three or more, four or more, five or more, six or more, or any number of more than them.
  • the combination of variables can be implemented using combinations that indicate the specified AUC.
  • the combination of variables is AUC ⁇ 0.7, AUC ⁇ 0.8, AUC ⁇ 0.85, AUC ⁇ 0.9, AUC ⁇ 0.95, or AUC ⁇ 0.7 in the ROC curve by regression analysis. ⁇ 0.99.
  • One skilled in the art can appropriately calculate the AUC of the ROC curve by regression analysis for a certain combination of variables according to the method described herein, and determine whether the certain combination of variables indicates the desired AUC. Can be determined.
  • Examples of combinations of variables include the combination of the frequency of use of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6 in a subject, and the amount of B cells, or Use of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHV3-49, IGHD1-26, and IGHJ6, and the combination of the amount of Treg and the like, but are not limited thereto. .
  • diagnosing that a subject has myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome can be performed, for example, by the following steps.
  • myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS)
  • multiple variables can be provided, including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR.
  • a discriminant generated by performing a multivariate analysis on the variable can be provided.
  • the provision of the discriminant is performed, for example, by performing a univariate or multivariate logistic regression with the patient / healthy person as the objective variable for the variable, and a constant and a partial regression coefficient of a logit model formula generated in the logistic regression It may include calculating a constant and a coefficient of the discriminant, and generating a discriminant based on the constant and the coefficient obtained in the processing. Then, the value of the target variable can be applied to a discriminant to calculate the probability of having ME / CFS. If the probability of having ME / CFS is higher than a predetermined value, it can be determined that the subject has ME / CFS.
  • diagnosing a subject as suffering from myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome can be performed, for example, by the following steps.
  • a combination of variables is specified.
  • the identification of the combination of the variables is as follows.
  • a discriminant generated by performing a multivariate analysis on the variables for the discriminant can be provided.
  • the provision of the discriminant is performed, for example, by performing a univariate or multivariate logistic regression with the patient / healthy person as the objective variable for the variable, and a constant and a partial regression coefficient of a logit model formula generated in the logistic regression. It may include calculating a constant and a coefficient of the discriminant, and generating a discriminant based on the constant and the coefficient obtained in the processing. Then, the value of the target variable can be applied to a discriminant to calculate the probability of having ME / CFS. If the probability of having ME / CFS is higher than a predetermined value, it can be determined that the subject has ME / CFS.
  • a method for differentiating ME / CFS from other diseases in a subject.
  • using an equation that includes an index (variable) that produces a difference between the non-ME / CFS group, which includes normal controls and patients with other diseases, and the ME / CFS group Make a differential diagnosis.
  • one discriminant that includes an IGH gene that is effective in differentiating from the ME / CFS group with the healthy person + MS disease as the non-ME / CFS group can be used.
  • a significant difference test between the ME / CFS group and the non-ME / CFS group in the examples of the present specification indicates that there is a significant difference between IGH genes, and one or more variables include IGHV3-49, IGHV3-30 -3, IGHD1-26, IGHV3-30, IGHJ6, IGHGP, IGHV4-31, IGHV3-64, IGHD3-22, IGHV3-33, IGHV3-73, IGHV5-10-1, and IGHV4-34 It is possible to use variables that include the frequency of use of at least one gene.
  • the discriminant for discriminating from another disease may be applied to each of the discriminants to determine whether the disease is another disease.
  • another disease eg, MS
  • a further discriminant is used to distinguish the disease from other diseases. That is, (a) using a part of one or more variables as an index of ME / CFS in the subject, and (b) using a part of one or more variables in the case where the subject has another disease. And an indication of being ME / CFS.
  • Other diseases may include multiple sclerosis (MS).
  • B) may be performed a plurality of times for a plurality of other diseases.
  • One embodiment of the present disclosure provides that one or more variables, including the frequency of use of one or more genes in the IgGR chain variable region of the BCR in a subject, can be used to determine whether the subject has another disease (eg, multiple sclerosis, MS). Rather than an indicator of suffering from myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS). Such methods can be performed in combination with discriminating ME / CFS as described herein from normal controls, as needed.
  • one or more genes are selected from the group consisting of IGHV1-3, IGHV3-30, IGHV3-30-3, IGHD1-26, IGHV3-49 and IGHJ6. At least one gene to be expressed.
  • the one or more genes are selected so as to show AUC ⁇ 0.7, AUC ⁇ 0.8, or AUC ⁇ 0.9 in a ROC curve by regression analysis for discriminating between MS and ME / CFS. May be done.
  • the number of at least one IGH gene used for discriminating between MS and ME / CFS is not particularly limited, and any number of 1 to 117 genes can be used.
  • One or more variables used as indices in the present disclosure may be about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 15, about 20, It can include the frequency of use of about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 110, or more IGH genes. Where appropriate, the one or more variables can also be a single variable.
  • the term “subject” refers to any living organism to be diagnosed or detected in the present disclosure.
  • the subject is a human.
  • sample refers to any substance obtained from a subject, and includes, for example, peripheral blood, tissue biopsy samples, cell samples, lymph, saliva, urine, and the like. Those skilled in the art can appropriately select a preferable sample based on the description in this specification.
  • Example 1 Next-generation B cell receptor repertoire analysis using peripheral blood mononuclear cells in patients with ME / CFS disease
  • Materials and methods 1.1 Peripheral blood mononuclear cell separation and RNA extraction 10 mL of whole blood was collected into heparin-containing blood collection tubes from patients with ME / CFS disease (37 cases) and healthy controls (23 cases) shown in Table 1, and the density of Ficoll-Paque PLUS Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) were separated by gradient centrifugation. Total RNA was extracted and purified from the isolated PBMC using the RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Germany). RNA was quantified using an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent).
  • PCR In order to specifically amplify the heavy chain (IGH) gene of the immunoglobulin ⁇ chain (IgG) of the B cell receptor (B cell receptor, BCR), a thermal cycler T100 (BioRad) by KAPA HiFi HS ReadyMix (Nippon Genetics). ) was performed three times. First PCR was performed using P20EA and CG1, followed by 2nd PCR using P20EA and CG2. Further, a Tag sequence required for the sequence was added by P22EA-ST1-R and CG-ST1-R. After removing remaining primers using Agencourt AMPure beads, an index was added using Nextera XT Index Kit v2 Set A (Illumina).
  • Example 2 Comparative study of lymphocytes in patients with ME / CFS disease by flow cytometry Method Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) were separated by the method described in [Example 1]. Thereafter, the cells were stained with various fluorescent dye-labeled monoclonal antibodies, and the frequency of the following lymphocyte subfraction was calculated using a flow cytometer (FACS Canto II and FACS Aria II flow cytometer (BD Biosciences)).
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • B cells CD19 + cells / PBMC; Naive B cells (nB): CD19 + CD27 ⁇ / CD19 + cells; memory B cells (mBs), CD19 + CD27 + CD180 + / CD19 +; plasmablasts (PBs): CD19 + CD27 + CD180 ⁇ CD38high / CD19 +; TrB): CD19 + CD27-CD24 + Mito tracker green high / CD19 +; Memory CD4 T cells (mCD4T): CD3 + CD4 + CD127 + CD45RA- / CD3 + CD4 +; D45RA-CXCR5-CXCR3 + CCR6- / CD3 + CD4 + CD127 + CD45RA-; helper T cell 2 (Th2 cells): CD3 + CD4 + CD127 + CD45RA-CXCR5-CXCR3-CCR6- / CD3 + CD4 + CD127 + CD45RA-; helper T cells 17 (Th17 cells): CD3 + CD4 + CD127 + CD45 + CD
  • Example 3-1 Predictive differentiation of ME / CFS using the IGH gene and cell subpopulation frequency data for which a significant difference was observed between the two groups.
  • Methods Frequency data of six IGH genes (Table 5) and cell subpopulations in which significant differences were detected between the two groups of patients with ME / CFS disease (37 cases) and healthy controls (23 cases) (%) ) B cells or (%) regulatory T cells were added to investigate whether ME / CFS could be predicted.
  • Multivariate logistic analysis was performed using SPSS software (IBM), and a receiver operating characteristic (ROC) curve was generated using the predicted values of the dependent variables of the regression equation. Furthermore, the area under the ROC curve (Area Under the Curve, AUC) value was obtained as a performance evaluation value for the prediction determination of these variables.
  • Example 3-2 Extraction of IGH genes and cell subpopulation variables with high prediction performance of ME / CFS disease by simple regression analysis Methods
  • IGHV Injection of IGH genes and cell subpopulation variables with high prediction performance of ME / CFS disease by simple regression analysis Methods
  • One of 74 types of IGHV, 32 types of IGHD, 6 types of IGHJ, 5 types of IGHC, 4 types of diversity index, and 15 types of cell subpopulation frequency data were taken as independent variables, and binary variables of ME / CFS disease and healthy controls were used as dependent variables.
  • a simple regression analysis was performed. The variables used are shown in Table 6. Variables satisfying the significance levels P ⁇ 0.05, 0.05 ⁇ P ⁇ 0.1, and 0.1 ⁇ P ⁇ 0.2 were extracted.
  • glm () of R was used, and for ROC analysis, pROC of the R package was used.
  • Example 4 Predictive differentiation of ME / CFS disease using two types of IGH genes
  • Method A multivariate logistic regression analysis was performed on a combination of any two IGH genes from a total of 117 IGH genes of 74 types of IGHV, 32 types of IGHD, 6 types of IGHJ and 5 types of IGHC, and predicted values of dependent variables of each regression equation were obtained.
  • An AUC value indicating the predictive performance of ME / CFS disease was calculated for those ROC curves, and a combination of IGH genes having an AUC value of 0.7 or 0.8 or more and a list of IGH genes used for the combination were extracted. did.
  • For logistic regression analysis glm () of R was used, and for ROC analysis, pROC of the R package was used.
  • the highest AUC was 0.87 (Treg, Tfh17), but when a combination of cell subpopulation variables and IGH gene, Treg + IGHV1-3, Treg + IGHV3-23 , Treg + IGHGP, an AUC value of more than 0.87 was obtained.
  • Example 7 Differentiation of patients with ME / CFS disease from patients with other diseases
  • Methods In addition to the 37 myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS) disease patient samples performed in Example 1, whole blood was collected from 10 new multiple sclerosis (MS) patients. . 1. of Embodiment 1 PBMC was isolated and RNA was extracted according to the method described in Materials and Methods. Next, after performing synthesis of complementary strand DNA and double-stranded complementary DNA, PCR, and next-generation sequence analysis, analysis was performed using repertoire analysis software.
  • IGHV IGH gene V region sequence
  • IGHD D region sequence
  • IGHJ J region sequence
  • IGHC C region sequence
  • ROC analysis Using frequency of use data of ME / CFS patients and MS patients, simple regression analysis and logistic regression analysis utilized glm of R, and ROC analysis utilized pROC of R package.
  • the ROC analysis created a receiver operating characteristic (ROC) curve using the predicted values of the dependent variables of the regression equation.
  • AUC area under the ROC curve
  • IGHV3-7 **, IGHV3-33 *, IGHV3-73 *, IGHV3-NL1 *, IGHV4-28 *, IGHV4-39 *, IGHD4-17 *, IGHD5-5 *, and IGHD5-18 *
  • the IGH gene use frequency was significantly higher in MS patients than in ME / CFS patients (Mann-Whitney test: * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • IGHV3-23 ** and IGHV3-23D * showed significantly lower usage frequency in MS patients than in ME / CFS patients (FIG. 9).
  • the CFS patient group was higher (Table 33, FIG. 11).
  • the combination of variables can be specified, for example, as follows. (1) comparing a healthy person and a ME / CFS patient, and selecting a variable in which a significant difference is detected (for example, the frequency of use of a gene in the IgGR chain variable region of BCR); or (2) one variable (for example, , A univariate logistic analysis using one gene in the variable region of the IgGH chain of BCR as an independent variable, or a multivariate logistic analysis using two or more variables (for example, two or more genes) as independent variables. Obtain the regression model formula. An ROC analysis is performed to measure the degree of fit of the regression model, and a variable showing a higher AUC value is selected.
  • a variable in which a significant difference is detected for example, the frequency of use of a gene in the IgGR chain variable region of BCR
  • one variable for example, A univariate logistic analysis using one gene in the variable region of the IgGH chain of BCR as an independent variable, or a multivariate logistic analysis using two or more variables (
  • variables eg, gene frequency data
  • logistic analysis is performed on a brute force basis using a plurality of variables.
  • glm a function for the generalized linear model of the R package, can be used, but the analysis is not limited to this package.
  • the following logit model equation is obtained with the probability of ME / CFS being ⁇ , and at the same time, the constant of b0 and the partial regression coefficient corresponding to b1 to bp are obtained. That is, the coefficients of the logit model equation can be determined using a data set of patient / healthy classification and variables (such as gene frequency).
  • the probability ⁇ that is ME / CFS can be obtained by the following equation.
  • discrimination prediction can be performed by inputting the value (for example, discrimination prediction of 0.5 or more as ME / CFS).
  • the probability can be predicted by inputting frequency data into the same logit model equation as described above.
  • ME / CFS patients are predicted by discriminating ME / CFS from healthy persons by discriminant equation 1, and then excluding other disease patients such as MS by discriminant equation 2. The determination is made in two steps based on one of the following examples or a combination of other predictive variables. 1) Discrimination between ME / CFS patients and healthy individuals (Discriminant 1) 2) Exclusion discrimination of other diseases (MS patients) from ME / CFS patients (discrimination formula 2)
  • the present disclosure can be used as a diagnostic agent for myalgic encephalomyelitis / chronic fatigue syndrome (ME / CFS).
  • SEQ ID NO: 1 BSL18E primer
  • SEQ ID NO: 2 P20EA primer
  • SEQ ID NO: 3 P10EA primer
  • SEQ ID NO: 4 CG1 primer
  • SEQ ID NO: 5 CG2 primer
  • SEQ ID NO: 6 P22EA-ST1-R primer
  • SEQ ID NO: 7 CG-ST1-R primer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示において、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断を行う方法が提供される。本開示は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法を提供する。対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、対象におけるＢＣＲ多様性指数、および対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される１つまたは複数の変数を、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標として用いることができる。

Description

筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）のバイオマーカー
　本開示は、疾患、とりわけ、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断の分野に関する。
　筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）は、著しい疲労、労作後の消耗、睡眠障害、認知機能障害、起立不耐症を中核症状とし、痛み、自律神経障害、光、音、食品、化学物質に対する過敏症など様々な症状が付随する疾患である。感染症の後に発症する場合もあるが、病態は未解明であり、発症を識別するバイオマーカーがないため、様々な診断基準があり、診断や研究の障害になっている。また、有効な治療法も確立されていない。
　本開示は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法を提供する。ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における遺伝子の使用頻度が、ＭＥ／ＣＦＳ患者において健常対照と比較して変化することが本明細書において実証され、かかる情報を用いて、ＭＥ／ＣＦＳの診断を行うことが可能である。ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における遺伝子に加えて、対象における免疫細胞亜集団（Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞など）の量を指標として用いることもできる。遺伝子の使用頻度が、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を含む方法によって決定することができる。
　本開示の実施形態の例が、以下の項目に示される。
（項目１）　対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法。
（項目２）　対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする、前記項目に記載の方法。
（項目２Ａ）　前記１つ以上の変数が、前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標であることをさらに特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３－１）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３－２）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３－３）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３－４）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４－１）　前記１つ以上の変数が、１つ以上の免疫細胞亜集団量をさらに含むことを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４－２）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４－３）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４－４）　前記免疫細胞亜集団量が、Ｂ細胞の量、ナイーブＢ細胞の量、メモリーＢ細胞の量、プラズマブラストの量、活性化ナイーブＢ細胞の量、トランジショナルＢ細胞の量、制御性Ｔ細胞の量、メモリーＴ細胞の量、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ細胞の量、Ｔｆｈ１細胞の量、Ｔｆｈ２細胞の量、Ｔｆｈ１７細胞の量、Ｔｈ１細胞の量、Ｔｈ２細胞の量およびＴｈ１７細胞の量から選択される前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５－１）　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５－２）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５－２）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５－２）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－１）　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、前記対象におけるＢＣＲ多様性指数、および前記対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される２つ以上の変数の組み合わせを含み、該１つ以上の変数は、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－２）　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される３つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－３）　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される４つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－４）　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される５つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－５）　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される６つ以上の変数を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－７）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６－３）　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢ細胞の量を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）　前記１つ以上の変数が、前記対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）　前記１つ以上の遺伝子の使用頻度が、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を含む方法によって決定される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）　前記１つ以上の変数が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1およびIGHV4-34からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）　（ａ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とすることと、
（ｂ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳであることの指標とすることと
を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）　複数の他の疾患について（ｂ）を複数回行う、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）　前記他の疾患が多発性硬化症（ＭＳ）を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）　対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象が多発性硬化症（ＭＳ）ではなく筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることの指標とする、方法。
（項目１５Ａ）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目１６）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における３つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）　前記（ｂ）が、前記項目のいずれかに記載の方法によって行われることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１）　対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断する方法であって、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを測定することと、該ＢＣＲレパトアに基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断することとを含む、方法。
（項目Ａ１－１）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ａ２）　筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）を処置する方法であって、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを測定することと、該ＢＣＲレパトアに基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断することと、該対象に治療を施すこととを含む、方法。
（項目Ａ２－１）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ａ３）　前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数に基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ４）　前記対象について前記変数を含む式の値を算出し、該値を閾値と比較することにより、該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ５）
（Ａ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（Ｂ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳ罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ６）
（Ａ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（Ｂ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することであって、（Ｂ）は、
　（Ｂ－１）該変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、
　（Ｂ－２）該ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、
　（Ｂ－３）Ｂ－２の処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含む、ことと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ６－Ａ）
（Ａ）変数の組合せを特定することであって、（Ａ）は、
　（Ａ－１）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の患者および健常人を含む被験者について、該健常人と該ＭＥ／ＣＦＳの患者を比較し、有意な差が検出されたＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供すること；および／または
　（Ａ－２）該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つの遺伝子を独立変数として単変量ロジスティック解析を行うか、または該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子を独立変数として多変量ロジスティック解析を実施し、ロジスティック回帰モデル式を得、該ロジスティック回帰モデル式の適合度を測るROC解析を実施して、所定の値以上のＡＵＣ値を示した遺伝子を判別式用の変数として選択することを含む、
ことと、
（Ｂ）該判別式用の変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することであって、（Ｂ）は、
　（Ｂ－１）該判別式用の変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、
　（Ｂ－２）Ｂ－１の該ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、
　（Ｂ－３）Ｂ－２の処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含む、ことと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ７）　
（Ａ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（Ｂ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することと、
（Ｃ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することと
（ＡＡ）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）以外の疾患のＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することと、
（ＢＢ）該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することと、
（ＣＣ）対象の該変数の値を、該判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳ以外に罹患している確率を算出することと
（Ｄ）該ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合で、かつ、該ＭＥ／ＣＦＳ以外に罹患している確率が所定の値より低い場合に、該対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定すること
を包含する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ８）　対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断するインビトロの方法であって、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアに基づいて該対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断することを含む、方法。
（項目Ａ８－１）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１）　１つ以上のプロセッサによって実行されると、プロセッサに、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得させ、該１つ以上の変数に基づき、該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定させる命令、を含むプログラム。
（項目Ｂ１－１）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のプログラム。
（項目Ｂ２）　１つ以上のプロセッサによって実行されると、プロセッサに、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得させ、該１つ以上の変数に基づき、該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定させる命令、を含むプログラムを記録した記憶媒体。
（項目Ｂ２－１）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の記憶媒体。
（項目Ｂ２－２）　非一時的記憶媒体である、前記項目のいずれかに記載の記憶媒体。
（項目Ｃ１）　対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数の情報を記録するように構成された記録部と、該情報を取得し、該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定するように構成された判定部とを備えた、システム。
（項目Ｃ１－１）　前記項目の１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載のシステム。
　本開示により、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の的確な診断が可能となる。また、本開示は、ＭＥ／ＣＦＳの発症予測や予後診断にも活用することができ、ＭＥ／ＣＦＳの治療剤開発時のマーカーとしても活用され得る。
図１は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料から得られた、ＢＣＲの各ＩＧＨＶ遺伝子（ＩＧＨＶファミリー）の使用頻度の比較の結果を示す図である。縦軸は各遺伝子の使用頻度（％）であり、バーは標準誤差を示す。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図２は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料から得られた、ＢＣＲの各ＩＧＨＤおよびＩＧＨＪファミリーの使用頻度の比較の結果を示す図である。縦軸は各遺伝子の使用頻度（％）であり、バーは標準誤差を示す。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図３Ａは、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＩＧＨＶ遺伝子の使用頻度のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図３Ａは、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＩＧＨＶ遺伝子の使用頻度のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図４は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＢ細胞集団の量のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図５は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、制御性Ｔ細胞集団の量のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図６は、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料の、記載されるＴ細胞集団の量のドットプロットである。ＨＣ：健常人対照者、ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者。 図７は、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｂ細胞細胞量（％）を変数として用いた場合の、回帰分析によるＲＯＣ曲線を示す図である。 図８は、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｔｒｅｇ量（％）を変数として用いた場合の、回帰分析によるＲＯＣ曲線を示す図である。 図９は、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）とＭＳ患者（ｎ＝１０）間のＩＧＨ遺伝子使用頻度の差異を示す図である。ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者、ＭＳ：ＭＳ疾患患者。 図１０は、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）とＭＳ患者（ｎ＝１０）間の多様性指数の差異を示す図である。ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者、ＭＳ：ＭＳ疾患患者。いずれの多様性指数についても、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）とＭＳ患者（ｎ＝１０）間では有意差が検出されなかった。 図１１は、ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３７）と非ＭＥ／ＣＦＳ患者（ｎ＝３３）のＩＧＨ遺伝子使用頻度の差異を示す図である。ＭＥ／ＣＦＳ：ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者、ｎｏｎ－ＭＥ／ＣＦＳ：健常対照＋ＭＳ疾患患者。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　（ＭＥ／ＣＦＳ）
　筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｙａｌｇｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ／ｃｈｒｏｎｉｃ　ｆａｔｉｇｕｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＭＥ／ＣＦＳ）は６か月以上続く説明困難な高度の疲労、労作後の極端な消耗、睡眠障害、認知機能障害を中核症状とし、起立不耐症、痛み、消化器症状、光や音、匂い、化学物質に対する過敏症などをしばしば伴う深刻な慢性疾患であり、国内患者数は１０万人以上と推定されるが、病態が未解明で疾患特異的な検査法や有効な治療法がないため、適切な医療が受けられていないのが現状である。
　近年ノルウェーからリツキシマブによるＢ細胞除去療法が有効であると報告され、世界的にＭＥ／ＣＦＳの免疫病態に注目が集まっている。獲得免疫系の中でＢ細胞は抗体産生を統括しているが、多様な抗原に対応するために遺伝子再構成によるＢ細胞受容体は極めて多様である。全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患やＢ細胞系の血液腫瘍においては特定のＢ細胞受容体（クローン）が増加しており、個体の多様なＢ細胞受容体の総体（レパトア）における偏りとして検出される。近年次世代シークエンサーを用いてバイアスを排除した方法によるレパトア解析が可能となり、ＭＥ／ＣＦＳのＢ細胞系の異常の検出に有用な可能性がある。
　ＭＥ／ＣＦＳの診断は、症状・問診などから、Ｆｕｋｕｄａ　ｃｒｉｔｅｒｉａ、Ｃａｎａｄｉａｎ　ｃｒｉｔｅｒｉａおよびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｃｒｉｔｅｒｉａなどの基準によって行われている。ＭＥ／ＣＦＳにおいては、疾患を示すバイオマーカーが今日まで開発されておらず、症状の組合せによって診断する複数の診断基準が存在している。Ｆｕｋｕｄａ　ｃｒｉｔｅｒｉａは最も古く（１９９４年）、次にカナダ基準（２００３年）、その後国際基準（２０１１年）が作成されているが、この間に、疾患の本質的な症状（中核症状）について専門家の共通理解が進み、新たな診断基準の作成が現在も検討されている。診断基準が古い基準も含め併存している理由は、１）研究を推進し疾患の病態理解・治療法開発を進めるための詳細／厳密な基準（リサーチ基準）と、２）一般内科医が診断をつけ、患者への医療的／社会的介入を推進できるようにするための簡易な基準（診療用基準）の両者が必要と考えられているからである。具体的には、Ｆｕｋｕｄａ基準はリサーチ基準として現在も研究用に必須と考えられている一方、新しい基準は診療を意識したものになっている。このようなダブルスタンダードは、通常他の疾患では認められないものだが、ＭＥ／ＣＦＳにおいては例外的に専門家の間で認知／受容されている。日本の厚生労働省が作成した診断基準はこれら海外の基準を元に、日本の実情に合わせたもの（ＰＳの設定など）となっている。本開示において、ＭＥ／ＣＦＳは、リサーチ基準であるＦｕｋｕｄａ　ｃｒｉｔｅｒｉａによって規定される疾患を指すことができるが、必要に応じて、他の診療用の基準によって規定される疾患も参照することができる。本開示において、ＭＥ／ＣＦＳであることの確認は、当技術分野で受け入れられている診断基準のいずれかによって行うことができる。
　本開示において、ＭＥ／ＣＦＳであることが示された対象、ＭＥ／ＣＦＳである可能性が示された対象、ＭＥ／ＣＦＳを発症する可能性が示された対象、または予後不良のＭＥ／ＣＦＳに罹患していることが示された対象に対し、適切に処置を行ってもよい。ＭＥ／ＣＦＳの処置として、免疫調整剤（リツキシマブなど）、非ステロイド系抗炎症剤、抗うつ剤、および抗不安剤などが用いられ得る。
　（ＢＣＲレパトア）
　一実施形態において、本開示は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法を提供する。本明細書において「Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）」とは、Ｂ細胞受容体、Ｂ細胞抗原レセプター、Ｂ細胞抗原受容体とも呼ばれ、膜結合型免疫グロブリン（ｍＩｇ）分子と会合したＩｇα／Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）ヘテロ二量体（α／β）から構成されるものをいう。ｍＩｇサブユニットは抗原に結合し、受容体の凝集を起こすが、一方、α／βサブユニットは細胞内に向かってシグナルを伝達する。ＢＣＲが凝集すると、チロシンキナーゼのＳｙｋ及びＢｔｋと同様に、ＳｒｃファミリーキナーゼのＬｙｎ、Ｂｌｋ、及びＦｙｎを速やかに活性化するといわれる。ＢＣＲシグナル伝達の複雑さによって多くの異なる結果が生じるが、その中には、生存、耐性（アネルギー；抗原に対する過敏反応の欠如）またはアポトーシス、細胞分裂、抗体産生細胞または記憶Ｂ細胞への分化などが含まれる。ＴＣＲの可変領域の配列が異なるＴ細胞が何億種類も生成し、またＢＣＲ（または抗体）の可変領域の配列が異なるＢ細胞が何億種類も生成する。ＴＣＲとＢＣＲの個々の配列はゲノム配列の再構成や変異導入により異なるので、Ｔ細胞やＢ細胞の抗原特異性については、ＴＣＲ・ＢＣＲのゲノム配列またはｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列を決定することにより手掛かりを得ることができる。
　本明細書において「Ｖ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域の可変部（Ｖ）領域をいう。
　本明細書において「Ｄ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域のＤ領域をいう。
　本明細書において「Ｊ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の可変領域のＪ領域領域をいう。
　本明細書において「Ｃ領域」とは、ＴＣＲ鎖またはＢＣＲ鎖の定常部（Ｃ）領域をいう。
　本明細書において「可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」とは、ＴＣＲまたはＢＣＲで遺伝子再構成により任意に作り出されたＶ（Ｄ）Ｊ領域の集合をいう。ＴＣＲレパトア、ＢＣＲレパトア等と熟語で使用されるが、これらは例えば、Ｔ細胞レパトア、Ｂ細胞レパトアなどと称されることもある。レパトアには、全体として多様性がどのくらいかという情報と、個々の遺伝子がどの程度の頻度で用いられているかという情報との２つの側面があるということができる。一実施形態において、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法が提供される。ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度は、以下のとおり導出することが可能である。
　ＢＣＲレパトアの決定の方法として、１つには、試料中のＢ細胞が個々のＶ鎖をどれくらい使用するかを、特定のＶβ鎖特異的抗体を用いて、個々のＶβ鎖を発現するＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析する方法（ＦＡＣＳ解析）がある。その他に、ヒトゲノム配列から入手されるＴＣＲ遺伝子の情報をもとに、分子生物学的手法によるＴＣＲレパトア解析が考案されてきた。細胞試料からＲＮＡを抽出し、相補的ＤＮＡを合成後、ＴＣＲ遺伝子をＰＣＲ増幅して定量する方法がある。
　細胞試料からの核酸の抽出は、RNeasy　Plus　Universal　Mini　Kit　(QIAGEN)などの当技術分野で公知のツールを用いて行うことができる。TRIzol　LS試薬に溶解した細胞からRNeasy　Plus　Universal　Mini　Kit　(QIAGEN)を用いて全RNAの抽出および精製を行うことができる。抽出されたRNAからの相補的DNAの合成は、Superscript　IIITM　(Invitrogen)などの、当技術分野で公知の任意の逆転写酵素を用いて行うことができる。
　ＢＣＲ遺伝子のＰＣＲ増幅は、当技術分野で公知の任意のポリメラーゼを用いて、当業者が適宜行うことができる。しかしながら、ＢＣＲ遺伝子のような変動の大きい遺伝子の増幅においては、「非バイアス」で増幅することができれば、正確な測定のためには有利な効果があるといえる。
　ＰＣＲ増幅のために用いるプライマーとしては、個々のＢＣＲ　Ｖ鎖特異的プライマーを多数設計して、別個にリアルタイムＰＣＲ法等で定量する方法、あるいはそれら特異的プライマーを同時に増幅する方法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ）法が用いられてきた。しかしながら、各Ｖ鎖について内在性コントロールを用いて定量する場合でも、利用するプライマーが多いと正確な解析ができない。さらに、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ法ではプライマー間の増幅効率の差が、ＰＣＲ増幅時のバイアスを引き起こす欠点がある。
　本開示の好ましい実施形態では、WO2015/075939（Repertoire　Genesis　Inc.）に記載されているような、１種のフォーワードプライマーと１種のリバースプライマーからなる１セットのプライマーですべてのアイソタイプやサブタイプ遺伝子を含むＢＣＲ遺伝子を、存在頻度を変えることなく増幅して、ＢＣＲ多様性を決定する。以下のようなプライマー設計は、非バイアス的な増幅に有利である。
　ＢＣＲ遺伝子の遺伝子構造に着目し、高度な多様性をもつＶ領域にプライマーを設定することなく、その５’末端にアダプター配列を付加することにより、すべてのＶ領域を含む遺伝子を増幅する。このアダプターは塩基配列上において任意の長さと配列であり、２０塩基対程度が最適であるが、１０塩基から１００塩基までの配列を使用することができる。３’末端に付加されたアダプターは制限酵素により除去され、２０塩基対のアダプターと同一配列のアダプタープライマーと共通配列であるＣ領域に特異的なリバースプライマーにより増幅することですべてのＢＣＲ遺伝子を増幅する。
　ＢＣＲ遺伝子メッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡを合成し、続いて二本鎖相補的ＤＮＡを合成する。逆転写反応や二本鎖合成反応によって異なる長さのＶ領域を含む二本鎖相補的ＤＮＡが合成され、それら遺伝子の５’末端部に２０塩基対と１０塩基対からなるアダプターをＤＮＡリガーゼ反応によって付加する。
　ＢＣＲに関しては、μ鎖、α鎖、δ鎖、γ鎖、ε鎖の重鎖、κ鎖、λ鎖の軽鎖のＣ領域にリバースプライマーを設定し、これらの遺伝子を増幅することができる。Ｃ領域に設定されるリバースプライマーは、ＢＣＲに関しては各Ｃμ、Ｃα、Ｃδ、Ｃγ、Ｃε、Ｃκ、Ｃλの配列に一致し、かつ他のＣ領域配列にはプライミングしない程度のミスマッチをもつプライマーを設定する。Ｃ領域のリバースプライマーはアダプタープライマーとの増幅ができるように、塩基配列、塩基組成、ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）、自己相補配列の有無を考慮し、最適に作製する。Ｃ領域配列におけるアレル配列間で異なる塩基配列を除く領域にプライマーを設定することで、すべてのアレルを均一に増幅することができる。増幅反応の特異性を高めるため、複数段階のｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行う。
　いずれのプライマーもアレル配列間で異なる配列を含まない配列に対して、プライマー候補配列の長さ（塩基数）は、特に制限されないが、１０～１００塩基数であり、好ましくは、１５～５０塩基数であり、より好ましくは、２０～３０塩基数である。このような非バイアス的な増幅を用いることは、低頻度（１／１０，０００～１／１００，０００またはそれ以下）の遺伝子の同定に有利であり、好ましい。
　以上のように増幅したＢＣＲ遺伝子をシークエンシングすることによって、得られたリードデータからＢＣＲレパトアを決定することができる。
　シークエンシングの手法は、核酸試料の配列を決定することができる限り限定されず、当技術分野で公知の任意のものを利用することができるが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いることが好ましい。次世代シークエンシングとしては、パイロシーケンシング、合成によるシークエンシング（シークエンシングバイシンセシス）、ライゲーションによるシーケンシング、イオン半導体シーケンシングなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　得られたリードデータを、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子を含む参照配列にマッピングすることで、ユニークリード数を導出して、ＢＣＲレパトアを決定することができる。
　１つの実施形態では、使用される参照データベースは、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃ遺伝子領域ごとに準備する。典型的にはＩＭＧＴより公開されている領域ごと、アリルごとの核酸配列データセットを使用するが、それに限らず、各配列に一意のＩＤが割り振られているデータセットであれば利用可能である。
　得られたリードデータ（トリミングなどの適当な処理を必要に応じて行ったものを含む）を入力配列セットとして、遺伝子領域ごとの参照データベースと相同性検索し、最も近しい参照アリルおよびその配列とのアラインメントを記録する。ここで相同性検索には、Ｃを除きミスマッチ許容性の高いアルゴリズムを使用することになる。例えば相同性検索プログラムとして一般的なＢＬＡＳＴを使用する場合、ウィンドウサイズの短縮、ミスマッチペナルティの低減、ギャップペナルティの低減といった設定を、領域ごとに行うことになる。最も近しい参照アリルの選択においては、相同性スコア、アラインメント長、カーネル長（連続して一致する塩基列の長さ）、一致塩基数を指標とし、これらを定められた優先順位にしたがって適用する。本開示で使用されるＶおよびＪが確定した入力配列については、参照Ｖ上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出する。これをアミノ酸配列に翻訳することで、Ｄ領域の分類に使用する。Ｄ領域の参照データベースが準備できている場合は、相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする。
　上記により、入力セット中の各配列についてＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃの各アリルがアサインされる。続いて、入力セット全体でＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃの各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＢＣＲレパトアを導出する。分類に要請される精確さに応じて、出現頻度はアリル単位もしくは遺伝子名単位で算出される。後者は、各アリルを遺伝子名に翻訳することで可能となる。
　リードデータにＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、Ｃ領域がアサインされたのち、一致するリードを集計し、ユニークリード（他に同じ配列をもたないリード）別に、試料中に検出されたリード数および全リード数に占める割合（頻度）を算出することができる。
　加えて、サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出することができる。好ましい実施形態では、ＴＣＲレパトア解析ソフトウェア（Repertoire　Genesis　Inc.）を用いる。
　本明細書において「ＢＣＲ多様性」とは、ある被験体のＢ細胞受容体のレパートリー（レパトア）の多様性をいい、当業者は当該分野で公知の様々な手段を用いて測定することができる。ＢＣＲ多様性を示す指数を「ＢＣＲ多様性指数」という。ＢＣＲ多様性指数としては、当該分野で公知の任意のものがあり、例えば、シャノン－ウィーバー指数（Shannon-Weaver　index）、シンプソン指数（Simpson　index）、逆シンプソン指数（Inverse　Simpson　index）、Pielou’s均等度指数、標準化シャノン－ウィーバー指数（Normalized　Shannon-Weaver　index）、ＤＥ指数（例えば、ＤＥ５０指数、ＤＥ３０指数、ＤＥ８０指数）またはＵｎｉｑｕｅ指数（例えば、Ｕｎｉｑｕｅ５０指数、Ｕｎｉｑｕｅ３０指数、Ｕｎｉｑｕｅ８０指数）などの多様性指数をＢＣＲに適用したものが挙げられる。
　（大規模高効率ＢＣＲレパトア解析）
　本開示の好ましい実施形態では、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を用いてＢＣＲレパトアを測定する。本明細書において、「大規模高効率レパトア解析」とは、ＷＯ2015/075939（この文献の開示は本明細書においてその全体が必要に応じて参考として援用される。）に記載されており、対象がＢＣＲの場合「大規模高効率ＢＣＲレパトア解析」と称する。大規模高効率レパトア解析では、データベースを用いて被験体のレパトア（Repertoire）（Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域）を定量的に解析する方法であり、この方法は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法であって、該方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程を包含し、該核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、該工程（２）は、共通アダプタープライマーを用いる単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、方法によって実現することができ、好ましくは、この方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のレパトアを導出する工程を包含し、前記（１）は、以下の工程（１－１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；（１－２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；（１－３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；（１－４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；（１－５）（１－４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および（１－６）（１－５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列および分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、該第１の追加アダプター核酸配列は、ＤＮＡ捕捉ビーズへの結合およびｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、該第２の追加アダプター核酸配列は、ｅｍＰＣＲ反応に適切な配列であり、該分子同定（ＭＩＤ　Ｔａｇ）配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程を包含する。この方法の具体的な詳細はＷＯ2015/075939に記載されており、当業者はこの文献および本明細書の実施例等を適宜参照して解析を実施することができる。
　（診断）
　本開示の一実施形態において、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法が提供される。この方法は、対象がＭＥ／ＣＦＳを発症していることの診断を含む他、ＭＥ／ＣＦＳの発症予測または予後診断、あるいは、ＭＥ／ＣＦＳの治療剤開発時の指標を提供することを含み得る。方法は、インビトロまたはインシリコのものであってもよい。
　方法は、ＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を用いることを含み得る。１つ以上の変数を用いてＭＥ／ＣＦＳの指標とする場合、例えば、当該１つ以上の変数を含む適切な式を用い、ある対象についてその式の値を算出し、かかる値を適切な基準と比較することなどによって行うことができる。式は、ロジスティック回帰等によって求められたものであってよい。用いられる変数として、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、対象におけるＢＣＲ多様性指数、および対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量から選択される１つ以上の変数、または２つ以上の変数の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本開示の実施形態において、好ましくは、対象におけるＢＣＲの１つ以上のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、ＭＥ／ＣＦＳの指標として用い得る。これにより、当該１つ以上の変数を、対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標として用いること（すなわち、鑑別診断）が可能となり得る。理論に拘束されることは望まないが、例えば、免疫細胞亜集団の量およびＢＣＲレパトア多様性指数は、免疫状態全体に影響を与える他の疾患によっても変動し得るため、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの存在を示唆し得るものではあるが、他の疾患であることを排除することができない可能性がある。一方で、ＩＧＨ遺伝子の使用頻度は、何らかの疾患のメカニズムを反映して変化していると考えられるため、対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標となり得、実臨床の診断において非常に有用であると考えられる。
　ＭＥ／ＣＦＳに対する「他の疾患」としては、ＭＥ／ＣＦＳの症状である「６か月以上続く説明困難な高度の疲労、労作後の極端な消耗、睡眠障害、認知機能障害を中核症状とし、起立不耐症、痛み、消化器症状、光や音、匂い、化学物質に対する過敏症など」に類似した症状を呈するあらゆる疾患の他、免疫状態に影響を与え得る任意の疾患が挙げられる。例えば、精神疾患（例えば、うつ病や適応障害、身体表現性障害）、原発性睡眠障害（例えば、睡眠時無呼吸、ナルコレプシー）、内分泌疾患（例えば、下垂体機能低下症、甲状腺疾患）、感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などの慢性感染性疾患）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群など）、炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、慢性膵炎などの慢性炎症性疾患）、神経系疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性脳炎）が挙げられる。本開示の実施形態において、対象において、ＭＥ／ＣＦＳを他の疾患と区別する方法が提供される。他の疾患の一例として、多発性硬化症（ＭＳ）が挙げられる。本明細書におけるＭＥ／ＣＦＳを他の疾患と区別する方法の実施において、必要に応じて、対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法について記載されている事項を適用してもよい。
　ＭＥ／ＣＦＳの診断は「臨床症状の組み合わせ」によって行われるが、その際、他疾患や他の原因の除外は非常に重要なプロセスである。生活習慣（不規則、過労等）によっても「臨床症状の組み合わせの基準」が満たされる場合があり、その他の原因、例えば悪性腫瘍、代謝性疾患および脳神経疾患等によっても臨床症状の基準が満たされ得る。そのため、本明細書の実施例で示されるように、疾患の原因を反映していると考えられるＢ細胞レパトアまたはその中の各遺伝子の使用頻度は臨床診断において非常に有用であると考えられる。例えば、臨床的診断プロトコルに、本明細書に記載のＢＣＲレパトア（ＩＧＨ遺伝子使用頻度）を用いた鑑別法を加えることでより正確な鑑別診断が可能になると考えられる。あるいは、本開示の方法において、必要に応じて、臨床的（臨床所見、ＭＲＩ画像所見、脳脊髄液所見等）な情報を組み合わせて使用してもよい。１つの実施形態では、ＭＥ／ＣＦＳを含めた全身症状を呈する患者について、１つ１つの疾患に罹患している可能性を、それぞれＩＧＨ遺伝子の使用頻度を用いた判別モデルまたは判別式によって判定し、最終的に１つの疾患を特定することが可能である。
　本明細書において「感度」とは、陽性と判定されるべきものを正しく陽性と判定する確率をいい、感度が高いと偽陰性が減るという関係にある。感度が高いと除外診断(rule　out)に有用である。
　本明細書において「特異度」とは、陰性のものを正しく陰性と判定する確率をいい、特異度が高いと偽陽性が減るという関係にある。特異度が高いと確定診断に有用である。
　本明細書において、「ＲＯＣ曲線」とは、マーカーの回帰式に基づくカットオフ値を媒介変数として変化させた際の、（感度）および（１－特異度）をプロットした曲線を指す。ＲＯＣ曲線について、当業者は、ＡＵＣ（曲線下面積）を適切に求めることができる。ＲＯＣ曲線のＡＵＣは、予測モデルの性能を示しているものと考えられる。本明細書の実施例において、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、およびＡＵＣ≧０．９といった高い予測性能を示す変数または変数の組合せが多数実証されている。ＡＵＣが７程度であれば、診断モデルとしての使用可能性があると考えられる。
　本開示において、対象においてＭＥ／ＣＦＳの指標として用いる１以上の変数であって、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す１以上の変数（必要に応じて、変数の組み合わせであり得る）を用いることによって、今まで診断が難しかったＭＥ／ＣＦＳの診断が可能になる。
　方法は、対象においてＭＥ／ＣＦＳの指標として用いる１以上の変数を取得する工程を含み得る。１つの実施形態において、変数を取得する工程は、対象の試料を分析する工程を含み得、例えば、対象におけるＢＣＲのレパトアを測定する工程、および／または対象における細胞亜集団の量を測定する工程を含み得る。ＢＣＲのレパトアを測定する工程は、対象におけるＢＣＲ多様性を決定する工程、および／または対象のＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を決定する工程を含み得る。対象における細胞亜集団の量は、フローサイトメトリーを含めた当業者に公知の任意の手法によって測定してよい。また、変数として、以前に対象について決定された値についてのデータを取得することも可能である。
　方法は、本明細書に記載される１つ以上の変数に基づき、対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定する工程を含み得る。判定する工程は、当該１つ以上の変数を含む関数の従属変数の値を、適切な閾値と比較することによって行ってよい。
　１つの実施形態において、本明細書に記載される方法はインシリコで行うことができる。方法は、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得する工程と、当該１つ以上の変数に基づき、当該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定する工程を含む。本明細書に記載される任意の方法を実装するプログラム、プログラムを記録した記憶媒体、またはシステムも、本開示の範囲内である。
　１つの実施形態において、１つ以上のプロセッサによって実行されると、プロセッサに、対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数を取得させ、当該１つ以上の変数に基づき、当該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定させる命令、を含むプログラム、またはそれを記録した記憶媒体が提供される。対象のＢＣＲレパトアに関連する変数を含む１つ以上の変数の情報を記録するように構成された記録部と、かかる情報を取得し、当該対象がＭＥ／ＣＦＳであるかを判定するように構成された判定部とを備えた、システムも提供され得る。システムは、必要に応じて、コンピュータシステムであり得、本明細書において記載されるプログラムまたはそれを記録した記憶媒体を含み得る。
　（指標）
　（ＩＧＨ遺伝子）
　本開示の１つの実施形態は、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子（ＩＧＨ遺伝子）の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とする方法を提供する。ＩＧＨ遺伝子として、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGP、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を用いることができる。
　本明細書の実施例において、種々のＩＧＨ遺伝子の使用頻度が、ＭＥ／ＣＦＳの指標となり得ることが示されている。本開示において、用いられる少なくとも１つのＩＧＨ遺伝子の数は特段制限されず、１～１１７遺伝子の任意の遺伝子数を用いることができる。本開示において指標として用いられる１つ以上の変数は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、またはそれら超の数のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を含み得る。適切な場合には、１つ以上の変数は１つの変数でもあり得る。
　１つの好ましい実施形態では、１つ以上のＩＧＨ遺伝子が、IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。より好ましくは、１つ以上のＩＧＨ遺伝子が、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。さらにより好ましくは、１つ以上のＩＧＨ遺伝子が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。さらなる実施形態においては、１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。上述の遺伝子について、本明細書の実施例において、単独で予測に使用可能であることが示唆されている。
　本開示のさらなる実施形態では、１つ以上の変数として、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む変数を用いる方法が提供される。２つ以上の遺伝子の使用頻度を用いることによって、方法の精度をさらに高めることができると考えられる。当業者は、本明細書の記載に鑑みて、適切な２つ以上の遺伝子の使用頻度の組合せを選択して用いることができる。１つ以上の変数は、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、またはＡＵＣ≧０．９を示すように選択したものであってよい。遺伝子の組合せの一例としては、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6を挙げることができる。当業者は、ある遺伝子の組合せの、回帰分析によるＲＯＣ曲線におけるＡＵＣを、本願明細書に記載される方法に従って適切に算出することができ、ある遺伝子の組合せが所望のＡＵＣを示すものであるかを判定することができる。回帰分析は、例えば、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のためのものであり得る。
　本明細書の実施例においては、２種のＩＧＨ遺伝子の組合せについて、117遺伝子のいずれも、適切な他のＩＧＨ遺伝子と組み合わせた場合に、回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す組み合わせを実現することができることが示されている。
　（多様性指数）
　本開示において、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断において、他の変数に換えてもしくは加えて、対象におけるＢＣＲ多様性指数を変数として用いることができる。
　ＢＣＲ多様性指数としては、当該分野で公知の任意のものを利用することができ、例えば、シャノン－ウィーバー指数（Shannon-Weaver　index）、シンプソン指数（Simpson　index）、逆シンプソン指数（Inverse　Simpson　index）、Pielou’s均等度指数、標準化シャノン－ウィーバー指数（Normalized　Shannon-Weaver　index）、ＤＥ指数（例えば、ＤＥ５０指数、ＤＥ３０指数、ＤＥ８０指数）などが挙げられる。
　本明細書の実施例３－２、表７において、いくつかの多様性指数が、単回帰分析において０．１≦Ｐ＜０．２の有意性で抽出されている。また、本明細書の実施例６では、複数の変数の組み合わせにおいて、多様性指数を含むいくつかの変数の組み合わせが、ＲＯＣ解析においてＡＵＣ値０．８以上を示すことが見出されている（表１８）。
　（細胞亜集団）
　本開示において、対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断において、他の変数に換えてもしくは加えて、細胞亜集団量を変数として用いることができる。細胞亜集団量としては、例えば、免疫細胞亜集団量を用いることができる。本明細書において、「細胞亜集団」とは、多様な特性の細胞を含む細胞集団中の、何らかの共通する特徴を有する任意の細胞の集合を指す。特定の名称が当技術分野で知られているものについては、かかる用語を用いて特定の細胞亜集団に言及することもでき、任意の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現）を記載して特定の細胞亜集団に言及することもできる。
　細胞亜集団の例としては、例えば、Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、プラズマブラスト、活性化ナイーブＢ細胞、トランジショナルＢ細胞、制御性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ細胞、Ｔｆｈ１細胞、Ｔｆｈ２細胞、Ｔｆｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、およびＴｈ１７細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞亜集団の量は、当業者は、例えば、フローサイトメトリーによって決定することが可能である。例えば、サンプルを採取後、溶血法か比重遠心法にて赤血球を除いた後に蛍光標識抗体（目的とする抗原に対する抗体とそのコントロール抗体）と反応させ、十分に洗浄してからフローサイトメトリーを用いて観察することができる。検出された散乱光や蛍光は電気信号に変換されコンピュータにより解析される。その結果は、ＦＳＣの強さは細胞の大きさを表しＳＳＣの強さは細胞内構造を表すことによりリンパ球、単球、顆粒球を区別することが可能である。その後、必要に応じて目的とする細胞集団にゲートをかけて、それらの細胞における抗原発現様式を検討する。本開示の方法の実施において、当業者は、示される細胞の表面マーカーを適切に識別して、細胞を分画または計数することが可能である。
　特に有用な細胞亜集団としては、Ｂ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられる。本開示において、他の変数に加えてもしくは換えて、Ｂ細胞の量および／またはＴｒｅｇの量を含む１つ以上の変数を、ＭＥ／ＣＦＳの指標として用いることができる。
　細胞亜集団の量は、適切な基準に対する割合を用いることができる。Ｂ細胞の量は、例えば、末梢血単核球細胞におけるＢ細胞の頻度（％）である。Ｔｒｅｇの量は、例えば、全ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＴｒｅｇの頻度（％）である。
　本明細書の実施例３－２、表７において、いくつかの細胞亜集団変数が、単回帰分析において０．１≦Ｐ＜０．２の有意性で抽出されている。また、本明細書の実施例６では、複数の変数の組み合わせにおいて、細胞亜集団変数を含むいくつかの変数の組み合わせが、ＲＯＣ解析においてＡＵＣ値０．８以上を示すことが見出されている（表１８）。
　（組み合わせ）
　本明細書において示されるように、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標として用いることができる。１つ以上の変数は、本明細書に記載される変数の任意の組合せであり得る。好ましくは、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、対象におけるＢＣＲ多様性指数、および対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される２つ以上の変数の組み合わせを含む。２つ以上の変数は、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上またはそれら超の任意の数の変数であり得る。
　本明細書の実施例において、多数の変数の組合せが、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線において高いＡＵＣを示すことが実証されており、当業者は、適切に変数を組み合わせて、特定されるＡＵＣを示す組み合わせを用いて実施することができる。１つの実施形態において、変数の組合せは、回帰分析によるＲＯＣ曲線において、ＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、ＡＵＣ≧０．８５、ＡＵＣ≧０．９、ＡＵＣ≧０．９５、またはＡＵＣ≧０．９９を示し得る。当業者は、ある変数の組合せの、回帰分析によるＲＯＣ曲線におけるＡＵＣを、本願明細書に記載される方法に従って適切に算出することができ、ある変数の組合せが所望のＡＵＣを示すものであるかを判定することができる。変数の組合せの一例としては、対象におけるIGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｂ細胞の量との組合せ、あるいは、対象におけるIGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6の使用頻度と、Ｔｒｅｇの量との組合せなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　必須ではないが、単回帰分析によって予測性能が示された変数をさらに組み合わせることは、より高い予測性能に繋がり得る。本明細書の実施例において、単回帰分析で患者群と対照群の間でＰ＜０．２の有意差を示した変数同士の組合せについて、２変数の組合せでは、組み合わせのうち４６％がＲＯＣ解析においてＡＵＣ≧０．７を示し、３変数を組み合わせた場合には、組み合わせのうち８１％がＲＯＣ解析においてＡＵＣ≧０．７を示し、４変数を組み合わせた場合には、組み合わせのうち９６％がＲＯＣ解析においてＡＵＣ≧０．７を示した。
　本開示において、対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断するには、例えば、以下のような工程によって行い得る。筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に関して、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供することができる。次いで、当該変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することができる。判別式の提供は、例えば、変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、当該処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含み得る。次いで、対象の変数の値を、判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することができる。ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定することができる。
　より詳細に述べると、本開示において、対象が筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることを診断するには、例えば、以下のような工程によって行い得る。方法において、変数の組合せを特定する。変数の組合せの特定は、（１）筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の患者および健常人を含む被験者について、該健常人と該ME/CFSの患者を比較し、有意な差が検出されたＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む複数の変数を提供すること、および／または（２）該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つの遺伝子を独立変数として単変量ロジスティック解析を行うか、または該ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における2つ以上の遺伝子を独立変数として多変量ロジスティック解析を実施し、ロジスティック回帰モデル式を得、該ロジスティック回帰モデル式の適合度を測るROC解析を実施してより高いAUC値を示した遺伝子を判別式用の変数として選択することとを含み得る。
　次いで、判別式用の変数について多変量解析を行って生成された判別式を提供することができる。判別式の提供は、例えば、変数について、患者／健常人の区分を目的変数として単変量または多変量ロジスティック回帰を行うことと、ロジスティック回帰において生成されたロジットモデル式の定数および偏回帰係数から、判別式の定数および係数を算出することと、当該処理で得られた定数および係数をもとに判別式を生成することとを含み得る。次いで、対象の変数の値を、判別式に当てはめてＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率を算出することができる。ＭＥ／ＣＦＳに罹患している確率が、所定の値より高い場合に、対象がＭＥ／ＣＦＳに罹患していると決定することができる。
　（鑑別診断）
　本開示の実施形態において、対象において、ＭＥ／ＣＦＳを他の疾患と区別する方法が提供される。本開示の１つの実施形態においては、正常対照および他の疾患の患者を含む非ＭＥ／ＣＦＳ群と、ＭＥ／ＣＦＳ群との間で差が生じる指標（変数）を含む式を用いることで、鑑別診断を行う。この場合、例えば、健常人＋MS疾患を非ME/CFS群として、ME/CFS群との鑑別に有効なIGH遺伝子を選択して含めた1つの判別式を用いることができる。本明細書の実施例におけるME/CFS群と非ME/CFS群間の有意差検定から、有意差のあるIGH遺伝子が挙げられており、１つ以上の変数として、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1およびIGHV4-34からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の使用頻度を含む変数を使用することが可能である。
　あるいは、他の実施形態において、正常対照とME/CFS患者とを区別する判別式で判別したあと、その他の疾患（例えば、MS）と判別する判別式をそれぞれあてはめて他の疾患である可能性を否定していくといった形が想定される。この場合、本明細書に記載されるME/CFSを正常対照と区別する判別を行い、その後（あるいはその前または同時に）、さらに別の判別式を使用して他の疾患との鑑別を行う。すなわち、（ａ）１つ以上の変数のうちの一部を前記対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とすることと、（ｂ）１つ以上の変数のうちの一部を前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳであることの指標とすることとを含む、方法が提供され得る。他の疾患は多発性硬化症（ＭＳ）を含み得る。複数の他の疾患について（ｂ）を複数回行ってもよい。
　本開示の１つの実施形態は、対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、対象が他の疾患（例えば、多発性硬化症、ＭＳ）ではなく筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることの指標とする、方法である。このような方法を、本明細書に記載されるME/CFSを正常対照と区別する判別を行うことと必要に応じて組み合わせて行い得る。ここで、ＭＳとの区別を行うことが望まれる場合、１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含み得る。その他、前記１つ以上の遺伝子として、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７、ＡＵＣ≧０．８、またはＡＵＣ≧０．９を示すように選択したものであってよい。本開示において、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のために用いられる少なくとも１つのＩＧＨ遺伝子の数は特段制限されず、１～１１７遺伝子の任意の遺伝子数を用いることができる。本開示において指標として用いられる１つ以上の変数は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、またはそれら超の数のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を含み得る。適切な場合には、１つ以上の変数は１つの変数でもあり得る。
　本明細書において「対象」とは、本開示の診断または検出等の対象となる任意の生物を指す。好ましくは、対象はヒトである。
　本明細書において「試料」とは、対象から得られた任意の物質をいい、例えば、末梢血、組織生検試料、細胞試料、リンパ液、唾液、尿等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　本明細書の以下に記載される実施例において、適宜以下の略語が用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［実施例１］
ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者末梢血単核球を用いた次世代Ｂ細胞受容体レパトア解析
１．材料と方法
１．１．末梢血単核球分離とＲＮＡ抽出
　表１に示すＭＥ／ＣＦＳ疾患患者（３７例）および健常人対照者（２３例）から１０ｍＬの全血をヘパリン含採血管に採取し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）を分離した。単離したＰＢＭＣからＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全ＲＮＡを抽出・精製した。ＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
１．２．相補的ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成
　ＢＣＲ遺伝子の増幅はａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＰＣＲ法を用いて実施した。制限酵素消化部位含Ｏｌｉｇｏ　ｄＴプライマー（ＢＳＬ－１８Ｅ：　表２）と逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、二本鎖相補鎖ＤＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ）合成を行った。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる５’末端平滑化反応を行い、制限酵素ＮｏｔＩで末端を切断した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてカラム精製した後、Ｐ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターをＴ４　ＬｉｇａｓｅによるＬｉｇａｔｉｏｎ反応にて付加し、アダプター付加ｄｓ－ｃＤＮＡはＮｏｔＩ制限酵素により消化された。
１．３．ＰＣＲ
　Ｂ細胞受容体（Ｂ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＢＣＲ）の免疫グロブリンγ鎖（ＩｇＧ）の重鎖（ＩＧＨ）遺伝子を特異的に増幅するため、ＫＡＰＡ　ＨｉＦｉ　ＨＳ　ＲｅａｄｙＭｉｘ（日本ジェネティクス）によりサーマルサイクラー　Ｔ１００（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を用いＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを３回行った。Ｐ２０ＥＡとＣＧ１を用いて１ｓｔ　ＰＣＲを、続いてＰ２０ＥＡとＣＧ２を用いて２ｎｄ　ＰＣＲ反応を行った。さらに、Ｐ２２ＥＡ－ＳＴ１－ＲおよびＣＧ－ＳＴ１－Ｒによりシーケンスに必要なＴａｇ配列を付加した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅビーズを用いて、残存プライマーの持ち込みを除去した後、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　Ｉｎｄｅｘ　Ｋｉｔ　ｖ２　Ｓｅｔ　Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてｉｎｄｅｘを付加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
１．４．次世代シーケンス解析
　増幅産物は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）　３．０フルオロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度測定し、４ｎＭに希釈後、ＰｈｉＸ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を一部混合して最終調製検体とした。Ｍｉｓｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ３（６００Ｃｙｃｌｅ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）および最終調製検体をｉｌｌｕｍｉｎａ社Ｍｉｓｅｑシーケンサでｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンスを行った。
１．５．レパトア解析ソフトウェアによる解析
　Ｍｉｓｅｑシーケンスにより獲得された１対のＦａｓｔｑ塩基配列データセットを用いて、レパトア解析ソフトＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓにより、ＩＧＨ遺伝子Ｖ領域配列（ＩＧＨＶ）、Ｄ領域配列（ＩＧＨＤ）、Ｊ領域配列（ＩＧＨＪ）およびＣ領域配列（ＩＧＨＣ）の照合、およびＣＤＲ３配列を決定した。同一のＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＨＣおよびＣＤＲ３アミノ酸配列を持つリードをユニークリードとし、各サンプルにおけるユニークリードのコピー数をカウントした。ユニークリードの集計結果から、各サンプルのＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＨＣ使用頻度、ならびに多様性指数を算出した。
２．結果
　ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者および健常人対照者試料より２０万～３０万リードのシーケンスデータを獲得した（表３）。全リード数、アサインリード、ｉｎ－ｆｒａｍｅリード数およびユニークリード数はＭＥ／ＣＦＳ疾患患者と健常対照者間で差が見られなかった。リードデータから算出されたＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪ、ＩＧＨＣ使用頻度、ならびに多様性指数について、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者と健常対照者間で比較した。ＩＧＨＶに関し、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－３０－３およびＩＧＨＶ３－４９の使用頻度が、健常対照者に比較してＭＥ／ＣＦＳ疾患患者で有意に高かった（図１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　ｔｅｓｔの有意水準：Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．００１）。ＩＧＨＤに関してはＩＧＨＤ１－２６が、ＩＧＨＪではＩＧＨＪ６が健常対照者に比しＭＥ／ＣＦＳ疾患患者で有意に高い頻度を示した（図２、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０５）。ドットプロットを図３Ａおよび図３Ｂに示した。これらの結果は、次世代ＢＣＲレパトア解析により、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－３０－３、ＩＧＨＤ１－２６、ＩＧＨＶ３－４９およびＩＧＨＪ６の使用頻度の測定が、有効なバイオマーカがないＭＥ／ＣＦＳ疾患の鑑別に利用することができると示唆される（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　［実施例２］
ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者リンパ球のフローサイトメトリーによる比較検討
１．方法
　［実施例１］で示した方法により末梢血単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）を分離した。その後、各種蛍光色素標識モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩ　および　ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ　（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））にて、以下のリンパ球亜分画の頻度を算出した。（％）Ｂ細胞：ＣＤ１９＋細胞／ＰＢＭＣ；ナイーブＢ細胞（ｎＢ）：ＣＤ１９＋ＣＤ２７－／ＣＤ１９＋細胞；メモリーＢ細胞（ｍＢｓ），ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＣＤ１８０＋／ＣＤ１９＋；ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓ（ＰＢｓ）：ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＣＤ１８０－ＣＤ３８ｈｉｇｈ／ＣＤ１９＋；ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞（ＴｒＢ）：ＣＤ１９＋ＣＤ２７－ＣＤ２４＋Ｍｉｔｏ　ｔｒａｃｋｅｒ　ｇｒｅｅｎ　ｈｉｇｈ／ＣＤ１９＋；メモリーＣＤ４Ｔ細胞（ｍＣＤ４Ｔ）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ３＋ＣＤ４＋；濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋；ヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５－ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－；ヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５－ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６－／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－；ヘルパーＴ細胞１７（Ｔｈ１７細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５－ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－；濾胞性ヘルパーＴ細胞１（Ｔｆｈ１細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋；濾胞性ヘルパーＴ細胞２（Ｔｆｈ２細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６－／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋；濾胞性ヘルパーＴ細胞１７（Ｔｆｈ１７細胞）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＸＣＲ５＋；制御性Ｔ細胞　（Ｔｒｅｇ）：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ１２７－ＣＤ２５＋＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋。得られた頻度について、ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者と健常人対象者間でＭａｎｎ　Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔを行い、２群間の有意差を検定した。ｐ＜０．０５を統計学的有意とした。
２．結果
　図４、図５および図６に示すように、疾患群において有意に（％）Ｂ細胞が高く、疾患群において有意に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度が低く、疾患群において有意に濾胞性ヘルパーＴ細胞１７（Ｔｆｈ１７）の頻度が高かった。
　［実施例３－１］
２群間で有意な差が観察されたＩＧＨ遺伝子と細胞亜集団頻度データを利用したＭＥ／ＣＦＳの予測鑑別
１．方法
　ＭＥ／ＣＦＳ疾患患者（３７例）および健常人対照者（２３例）の２群間で有意な差が検出された６つのＩＧＨ遺伝子（表５）および細胞亜集団の頻度データである（％）Ｂ細胞、あるいは（％）制御性Ｔ細胞を加えて、ＭＥ／ＣＦＳの予測が可能かどうかの検討を行った。多変量ロジスティック解析をＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ）、を用いて実施し、回帰式の従属変数の予測値を用いて受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ、ＲＯＣ）曲線を作出した。さらに、これら変数の予測判定の性能評価値としてＲＯＣ曲線下面積（Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）値を求めた。
２．結果
　ＩＧＨ遺伝子６変数と（％）Ｂ細胞ではＡＵＣ値が０．９４６と良好な評価が得られた（図７）。また、ＩＧＨ遺伝子６変数と（％）制御性Ｔ細胞を用いた回帰式に基づいた解析ではＡＵＣ値が０．９５７と極めて良好な評価が得られた（図８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　［実施例３－２］
単回帰分析によるＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測性能の高いＩＧＨ遺伝子および細胞亜集団変数の抽出
１．方法
　ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種、多様性指数４種、細胞亜集団頻度データ１５種のうち１種を独立変数として、ＭＥ／ＣＦＳ疾患と健常人対照の２値変数を従属変数とする単回帰分析を実施した。使用した変数は表６に示す。有意水準Ｐ＜０．０５、０．０５≦Ｐ＜０．１、および０．１≦Ｐ＜０．２を満たす変数を抽出した。単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
２．結果
　ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種、多様性指数４種、細胞亜集団データ１５種の計１３６種の変数から、有意水準Ｐ＜０．０５を満たす変数としてＩＧＨ遺伝子８種、細胞亜集団変数２種の計８種が抽出された（表７）。０．０５≦Ｐ＜０．１を満たす変数は、ＩＧＨ遺伝子１０種、細胞亜集団頻度データ４種であった。０．１≦Ｐ＜０．２を満たす変数は、ＩＧＨ遺伝子１６種、多様性指数３種、細胞亜集団変数２種であった。有意水準Ｐ＜０．２を満たす変数については、単独でＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測に有効であることが示唆される。とりわけ、有意水準Ｐ＜０．０５を満たす変数は単独でもＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測に非常に有効であると示唆される（表８）。有意水準Ｐ＜０．２を満たす変数は、多変数ロジスティック回帰分析による分析に用いた。
　なお、いくつかの変数単独について、ＲＯＣ解析を行ったところそれぞれ、IGHV3-49:0.764、IGHV3-30-3:0.759、IGHD1-26:0.731、IGHJ6:0.672、IGHV3-30:0.693、IGHV1-3:0.659、B　cell:0.771、Treg:0.817、Shannon:0.617、Inverse:0.636のＡＵＣ値が得られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　［実施例４］
２種のＩＧＨ遺伝子を用いたＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測鑑別
１．方法
　ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種およびＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の２種のＩＧＨ遺伝子の組み合わせについて、多変量ロジスティック回帰分析を実施し、各回帰式の従属変数の予測値を用いてＲＯＣ曲線を作成した。それらＲＯＣ曲線についてＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測性能を示すＡＵＣ値を算出し、ＡＵＣ値が０．７あるいは０．８以上を示したＩＧＨ遺伝子の組み合わせ、およびそれら組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子リストを抽出した。ロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。
２．結果
　２種の任意のＩＧＨ遺伝子を用いたＲＯＣ解析にて、ＡＵＣ値が０．８、０．７以上を示したＩＧＨ遺伝子の組み合わせはそれぞれ３０組、６３７組であった。2変数ロジスティック回帰およびROC解析によりAUC≧0.7を示す変数の組み合わせについて、表１１に示す。また、それら組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子は、ＡＵＣ値が０．８以上のものは２６遺伝子、０．７以上は１１７遺伝子であった（表９）。また、ＡＵＣ値が０．８以上を示す３０組の遺伝子組み合わせのうち１０組（３３％）は単回帰分析で有意性が示された変数同士の組み合わせであり、２０組（６７％）は片方が単回帰分析で有意性が示されたＩＧＨであった（表１０）。これらの結果は、ＩＧＨ遺伝子を任意に組み合わせることでＭＥ／ＣＦＳ患者の予測鑑別が可能であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　［実施例５］
複数のＩＧＨ遺伝子を用いた多変量ロジスティック回帰分析
１．方法
　ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種およびＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の２種以上のＩＧＨ遺伝子の組み合わせについて、多変量ロジスティック回帰分析を総当たりで実施した。得られた回帰式の従属変数の予測値を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣ値を算出した。単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。
２．結果
　１１７種のＩＧＨから任意の２変数を用いた多変量ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ分析では、ＡＵＣ値が０．８以上を示したものは６，７８６組の組み合わせ総数のうち３０組（０．４４％）であった（表１２）。この組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子は２６遺伝子であった（表１３）。任意の３変数を用いた場合、ＡＵＣ値が０．８以上を示したものは２６０，１３０組のうち４，４６９組（１．７％）、０．８５以上は３４９組（０．１３％）、０．９以上は４組（０．００１５％）であった（表１２）。また、これら組み合わせに使用されたＩＧＨ遺伝子はそれぞれ１１７遺伝子（１００％）、１０２遺伝子（８７％）、および６遺伝子（５．１％）であった（表１３）。４変数を使用した場合は、ＡＵＣ値０．９以上のものは３，２６４組（０．０４４％）、０．８５以上は９９，４５８組（１．４％）、０．８以上は４８９，５２９組（６．６％）に上った。４変数を使った場合、ＡＵＣ０．８以上を示す組み合わせに１１７遺伝子すべてが少なくとも一つ使用されていた。ＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測鑑別に活用可能なＩＧＨ遺伝子は表１４に示した。高い予測性能を示すと考えられるＡＵＣ値０．９以上の遺伝子の組み合わせについては表１５および表１６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　［実施例６］
変数の組合せによる多変量ロジスティック回帰分析
１．方法
　単回帰分析により有意水準Ｐ＜０．２を満たす４６種の変数（ＩＧＨ３５種、細胞亜集団８種および多様性指数３種）を用いて、２変数、３変数および４変数の組み合わせによる多変量ロジスティック回帰分析を実施した。得られた回帰式の従属変数の予測値を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣ値を算出した。単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ（）、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。
２．結果
　選抜された４６種の変数から任意の２変数を用いた多変量ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ分析によりＡＵＣ値が０．８以上のものは１０２組（９．９％）、０．７以上０．８未満のものは３８２組（３６．９％）であった（表１７）。また、３変数を使った場合、ＡＵＣ値が０．９以上のものは８５組（０．６％）、０．８以上０．９未満は３４７２組（２２．９％）、０．７以上０．８未満のものは８８２６組（５８．１％）であった。４変数を使った場合、ＡＵＣ値が０．９以上のものは５３３０組（３．３％）、０．８以上０．９未満は６３９８１組（３９．２％）、０．７以上０．８未満のものは８７２９１組（５３．５％）であった。多くの変数を組み合わせることで、ＭＥ／ＣＦＳ疾患の予測性能が向上すると考えられる。２変数でＡＵＣ値０．８以上を示した組み合わせを表１８に、３変数でＡＵＣ値０．９以上の組み合わせを表１９に示した。Ｔｒｅｇとの組み合わせが上位を占め、変数にＴｒｅｇを用いることでより予測性能が高くなると推測された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　なお、細胞亜集団変数同士の組合せでは、AUC最高値は0.87(Treg、Tfh17)であったが、細胞亜集団変数とIGH遺伝子とを組み合わせた場合、Treg+IGHV1-3、Treg+IGHV3-23、Treg+IGHGPにおいて、0.87を上回るAUC値が得られた。また、Ｂ細胞量について、Tregとの組み合わせた場合の最大値AUC=0.84よりも、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26と組み合わせた場合に高いＡＵＣ値が得られた。細胞亜集団変数に特定のIGH遺伝子を加えて用いることで、細胞亜集団変数同士の組合せによって得られるものよりも高い予測性能を得ることが可能である。
　［実施例７］
ME/CFS疾患患者と他の疾患患者からの鑑別
１．方法
　実施例１で実施した３７例の筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ME/CFS）疾患患者試料に加え、新たに１０例の多発性硬化症（ＭＳ）患者から全血を採取した。実施例１の１．材料と方法に記載の方法に従ってＰＢＭＣの分離とＲＮＡの抽出を行った。次いで、相補鎖ＤＮＡおよび二本鎖相補的ＤＮＡの合成、ＰＣＲおよび次世代シーケンス解析を行った後に、レパトア解析ソフトウェアによって解析を行った。各サンプルのリードデータからＩＧＨ遺伝子Ｖ領域配列（ＩＧＨＶ）、Ｄ領域配列（ＩＧＨＤ）、Ｊ領域配列（ＩＧＨＪ）およびＣ領域配列（ＩＧＨＣ）の照合とＣＤＲ３配列を決定した。各サンプルのユニークリード数の集計とＩＧＨＶの７４種、ＩＧＨＤの３２種、ＩＧＨＪの６種およびＩＧＨＣの５種について使用頻度を算出した。リードデータ、ＩＧＨＶ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＪおよびＩＧＨＣ使用頻度について、ＭＥ／ＣＦＳとＭＳ群間でＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｅｎｅｙ法で有意差検定を行った。ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者の使用頻度データを用いて、単回帰およびロジスティック回帰分析はＲのｇｌｍ、ＲＯＣ解析はＲパッケージのｐＲＯＣを利用した。ＲＯＣ解析は回帰式の従属変数の予測値を用いて受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作出した。これら変数の予測判定の性能評価値としてＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）値を求めた。
２．結果
２－１．ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間のＩＧＨ遺伝子使用頻度の差異
　１０例のＭＳ患者試料より１４万～２８万リードのシーケンスデータを獲得した（表２０）。全リード数、アサインリード、in-frameリード数およびユニークリード数はＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間で有意な差は見られなかった。その結果、ＩＧＨＶ３－７＊＊、ＩＧＨＶ３－３３＊、ＩＧＨＶ３－７３＊、ＩＧＨＶ３－ＮＬ１＊、ＩＧＨＶ４－２８＊、ＩＧＨＶ４－３９＊、ＩＧＨＤ４－１７＊、ＩＧＨＤ５－５＊、およびＩＧＨＤ５－１８＊においてＭＥ／ＣＦＳ患者に比べＭＳ患者の方が、ＩＧＨ遺伝子使用頻度が有意に高かった（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。他方、ＩＧＨＶ３－２３＊＊およびＩＧＨＶ３－２３Ｄ＊では、ＭＥ／ＣＦＳ患者に比べＭＳ患者の方が有意に低い使用頻度を示した（図９）。同様に、ＩＧＨ遺伝子以外の変数である多様性指数（Ｓｈａｎｎｏｎ指数、逆Ｓｉｍｐｓｏｎ指数、Ｐｉｅｌｏｕ‘ｓ指数、ＤＥ50指数）について、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間で差があるかどうかを調べた（図１０）。いずれの多様性指数もＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間で有意な差は見られなかった。これらの結果から、多様性指数はＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者との鑑別には有用ではない一方で、ＩＧＨ遺伝子の使用頻度は疾患特異性を反映しており、鑑別に有効であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
２－２．多変量ロジスティック解析を用いたＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間の鑑別
　次に、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者で有意な差が検出された上記１１種のＩＧＨ遺伝子について、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を鑑別できるかどうかを、多変量ロジスティック解析を用いて検証した。１１種のＩＧＨ遺伝子のうち任意の２種のＩＧＨ遺伝子、あるいは任意の３種のＩＧＨ遺伝子の使用頻度を利用してロジスティック回帰分析を行い、ＡＵＣ値を算出した。ＡＵＣ高値の組み合わせを予測性能が優れたＩＧＨ遺伝子の組み合わせとして列記した（表２１および表２２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者を鑑別できることが示されたＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を用いて、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を鑑別できるかどうかを多変数ロジスティック解析にて調べた（表２３～表３０）。その結果、高い多変量ロジスティックモデル性能を示すＡＵＣ高値の組み合わせが多数獲得され、ＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を高い特異性と感度で予測できることが分かった。健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者間でｐ＜０．２の有意差を示した３５種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数を使った場合、４８の組み合わせがＡＵＣ≧０．８を示し、任意の３変数を使った場合は２１の組み合わせがＡＵＣ≧０．９を示した。また、健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者間でｐ＜０．１の有意差を示した１８種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を使った場合は、それぞれ１７の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８）および２１の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８７５）が高値を示した。健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者間でｐ＜０．０５の有意差を示した８種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を使った場合は、それぞれ７の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８）および２２の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．８）が高値を示した。実施例３－１において試験された６種のＩＧＨ遺伝子の任意の２変数および３変数を使った場合は、それぞれ１の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．７）および１１の組み合わせ（ＡＵＣ≧０．７）が高値を示した。以上の結果から、単独、あるいは複数のＩＧＨ遺伝子使用頻度を用いることでＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者を高精度に鑑別できることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
２－３．任意のＩＧＨ遺伝子を用いた多変量ロジスティック解析によるＭＥ／ＣＦＳ患者とＭＳ患者間の鑑別
　ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の２種のＩＧＨの組み合わせ（組み合わせ総数６７８６組）を用いて、多項ロジスティック解析を実施し、高い予測性能を示すＡＵＣ高値のものを選抜した（表３１）。ＡＵＣ≧０．９、ＡＵＣ≧０．８およびＡＵＣ≧０．７を示した組み合わせは、それぞれ４組、２５２組および１８７９組であった。ＩＧＨＤ３－３およびＩＧＨＧＰの２変数は最もＡＵＣが高く、０．９２を示した。次に、１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意の３種のＩＧＨの組み合わせ（組み合わせ総数２６０１３０組）を用いて、多項ロジスティック解析を実施し、高い予測性能を示すＡＵＣ高値のものを選抜した（表３２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
２－４．ＭＥ／ＣＦＳ患者と非ＭＥ／ＣＦＳ患者の比較
　ＭＥ／ＣＦＳ患者を非ＭＥ／ＣＦＳ患者から鑑別するＩＧＨ遺伝子を調べる目的で、健常人２３例に１０例のＭＳ患者を加え非ＭＥ／ＣＦＳ群とし、３７例のＭＥ／ＣＦＳ患者群とＩＧＨ遺伝子の指標頻度を比較した。2群間のＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定から、ＩＧＨＶ３－４９（Ｐ＝０．００１３）、ＩＧＨＶ３－３０－３（Ｐ＝０．００２２）、ＩＧＨＤ１－２６（Ｐ＝０．００５３）、ＩＧＨＶ４－３４（Ｐ＝０．０１１８）、ＩＧＨＶ３－３０（Ｐ＝０．１８６）、ＩＧＨＶ４－３１（Ｐ＝０．０２０５）、ＩＧＨＶ３－６４（Ｐ＝０．０２８６）、ＩＧＨＪ６（Ｐ＝０．０３０４）、およびＩＧＨＤ５－１０－１（Ｐ＝０．０３７３）の９種において、ＭＥ／ＣＦＳ患者が非ＭＥ／ＣＦＳ患者に比べ高いことが明らかになった。一方、ＩＧＨＧＰ（Ｐ＝０．００６１）、ＩＧＨＤ３－２２（Ｐ＝０．０３１３）、ＩＧＨＶ３－３３（Ｐ＝０．０３３２）、およびＩＧＨＶ３－７３（Ｐ＝０．０３３２）では有意に非ＭＥ／ＣＦＳ患者群が高かった（表３３、図１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
２－５．任意のＩＧＨ遺伝子を用いた多変量ロジスティック解析によるＭＥ／ＣＦＳ患者と非ＭＥ／ＣＦＳ患者間の鑑別
　ＩＧＨＶ７４種、ＩＧＨＤ３２種、ＩＧＨＪ６種、ＩＧＨＣ５種の計１１７種のＩＧＨ遺伝子から任意のＩＧＨの２変数（組み合わせ総数６７８６組）を用いて多項ロジスティック回帰分析を行い、ＭＥ／ＣＦＳ患者と非ＭＥ／ＣＦＳ患者間の鑑別に高い予測性能を示すＡＵＣ高値のものを選抜した（表３４）。また、３変数（組み合わせ総数２６０１３０組）を用いた場合のＡＵＣ高値を示すＩＧＨも同様に選抜した（表３５）。任意の２変数では、ＡＵＣ≧０．８およびＡＵＣ≧０．７を示した組み合わせは、それぞれ５組および４６９組であった。任意の３変数を用いた場合は、ＡＵＣ≧０．８５およびＡＵＣ≧０．８を示した組み合わせは、それぞれ３７組および１１６４組であった。２変数では、ＩＧＨＧＰおよびＩＧＨ３－３０－３の組み合わせがＡＵＣ＝０．８２０と最も高く、任意の３変数では、ＩＧＨＧＰ、ＩＧＨＶ３－３０およびＩＧＨＶ３－４９の組み合わせが最も高くＡＵＣ＝０．８８９であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
３．ＭＥ／ＣＦＳ鑑別診断のための予測判別モデル
　診断時において、ＢＣＲレパトア解析から得られるＩＧＨ遺伝子の使用頻度データを用いてＭＥ／ＣＦＳ患者を鑑別するための予測モデル式を作出した。２群間の有意差検定あるいは多項ロジスティック解析におけるＡＵＣ高値のＩＧＨ遺伝子の組み合わせを用いて、ロジスティック回帰式による判別モデルを作成した。鑑別診断の例を以下に示す。
　変数の組み合わせは、例えば、以下のように特定され得る。
（１）健常人とＭＥ／ＣＦＳ患者を比較し、有意な差が検出された変数（例えば、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における遺伝子の使用頻度）を選択する；または
（２）１つの変数（例えば、ＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つの遺伝子）を独立変数として単変量ロジスティック解析を、または２つ以上の変数（例えば、２つ以上の遺伝子）を独立変数として多変量ロジスティック解析を実施し、ロジスティック回帰モデル式を得る。この回帰モデルの適合度を測るＲＯＣ解析を実施してより高いＡＵＣ値を示した変数を選択する。
　変数の組み合わせが提供された場合、各変数（例えば、遺伝子の頻度データ）（x1, x2, x3,…）に対して、ME/CFS患者である（y=1)、あるいは健常人である（y=0）ことを目的変数として単変量あるいは多変量ロジスティック回帰分析を行う。（２）の場合は、複数の変数を使って総当たりでロジスティック解析を行う。
　ロジスティック回帰分析には、Ｒパッケージの一般化線形モデル用の関数であるｇｌｍを利用できるが、分析はこのパッケージに限定されない。ロジスティック回帰分析では、ME/CFSである確率をπとして以下のロジットモデル式が得られ、同時にb0の定数およびb1～bpに相当する偏回帰係数が求められる。すなわち、患者／健常人区分と変数（遺伝子頻度など）のデータセットを使用して、ロジットモデル式の係数を定めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000060
　ME/CFSである確率πは定数および偏回帰係数が定まれば、以下の式で求めることができる。新たに頻度データが得られた場合にその値を入力することで判別予測することができる（0.5以上をME/CFSとして判別予測する等）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000061
　２ステップでは、ME/CFSと健常人を区別する判別式でME/CFSを予測し、さらにME/CFSとMSを区別する判別式でMS患者を除外するような予測方法が可能である。基本的には上記と同じロジットモデル式に頻度データを入力することでその確率を予測できる。
３－１．１ステップ予測モデル
　ＭＥ／ＣＦＳと非ＭＥ／ＣＦＳ（健常人およびＭＳ患者）を１つの判別式により予測する。下記のいずれかの例、または他の予測変数の組み合わせにより１ステップで判別する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000062
３－２．２ステップ予測モデル
　ＭＥ／ＣＦＳを健常人より判別式１により判別し、次にＭＳなどの他の疾患患者を判別式２により除外することでＭＥ／ＣＦＳ患者を予測する。下記のいずれかの例、または他の予測変数の組み合わせにより２ステップで判別する。
１）ME/CFS患者と健常人の判別（判別式１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000063
２）ME/CFS患者からの他疾患（MS患者）の除外判別（判別式２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000064
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　（関連出願）
　本出願は、２０１８年８月２２日に出願された特願２０１８－１５５３８０号および２０１９年３月１２日に出願された特願２０１９－４４８８５号の優先権を主張する。これら出願の内容は、その全体が全ての目的のために本明細書において参考として援用される。
　本開示は、筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の診断・診断薬において利用可能である。
配列番号１：BSL18Eプライマー
配列番号２：P20EAプライマー
配列番号３：P10EAプライマー
配列番号４：CG1プライマー
配列番号５：CG2プライマー
配列番号６：P22EA-ST1-Rプライマー
配列番号７：CG-ST1-Rプライマー

Claims (43)

  1. 　対象におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）レパトアを、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする方法。
  2. 　対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象における筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）の指標とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記１つ以上の変数が、前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳに罹患していることの指標であることをさらに特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3およびIGHD3-22からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記１つ以上の変数が、１つ以上の免疫細胞亜集団量をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  10. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記免疫細胞亜集団量が、Ｂ細胞の量、ナイーブＢ細胞の量、メモリーＢ細胞の量、プラズマブラストの量、活性化ナイーブＢ細胞の量、トランジショナルＢ細胞の量、制御性Ｔ細胞の量、メモリーＴ細胞の量、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ細胞の量、Ｔｆｈ１細胞の量、Ｔｆｈ２細胞の量、Ｔｆｈ１７細胞の量、Ｔｈ１細胞の量、Ｔｈ２細胞の量およびＴｈ１７細胞の量から選択される、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、請求項２に記載の方法。
  14. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度、前記対象におけるＢＣＲ多様性指数、および前記対象における１つ以上の免疫細胞亜集団量からなる群から選択される２つ以上の変数の組み合わせを含み、該１つ以上の変数は、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項２に記載の方法。
  18. 　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される３つ以上の変数を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される４つ以上の変数を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される５つ以上の変数を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 　前記１つ以上の変数が、前記群から選択される６つ以上の変数を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記１つ以上の変数が、正常対照とＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26、およびIGHJ6を含む、請求項２に記載の方法。
  25. 　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢ細胞の量を含む、請求項２～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　前記１つ以上の変数が、前記対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量を含む、請求項２～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 　前記１つ以上の遺伝子の使用頻度が、大規模高効率ＢＣＲレパトア解析を含む方法によって決定される、請求項２～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 　前記１つ以上の変数が、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1およびIGHV4-34からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の使用頻度を含む、請求項２～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. （ａ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象におけるＭＥ／ＣＦＳの指標とすることと、
    （ｂ）前記１つ以上の変数のうちの一部を前記対象が他の疾患ではなくＭＥ／ＣＦＳであることの指標とすることと
    を含む、請求項１～２７に記載の方法。
  30. 　複数の他の疾患について（ｂ）を複数回行う、請求項２９に記載の方法。
  31. 　前記他の疾患が多発性硬化症（ＭＳ）を含む、請求項２９または２８に記載の方法。
  32. 　対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における１つ以上の遺伝子の使用頻度を含む１つ以上の変数を、該対象が多発性硬化症（ＭＳ）ではなく筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ＭＥ／ＣＦＳ）に罹患していることの指標とする、方法。
  33. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、およびIGHGPからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 　前記１つ以上の遺伝子が、IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49およびIGHJ6からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における２つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、請求項３２に記載の方法。
  36. 　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項３５に記載の方法。
  37. 　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項３６に記載の方法。
  38. 　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項３７に記載の方法。
  39. 　前記１つ以上の変数が、前記対象におけるＢＣＲのＩｇＧＨ鎖可変領域における３つ以上の遺伝子の使用頻度を含む、請求項３２に記載の方法。
  40. 　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．７を示す、請求項３９に記載の方法。
  41. 　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．８を示す、請求項４０に記載の方法。
  42. 　前記１つ以上の変数が、ＭＳとＭＥ／ＣＦＳとの判別のための回帰分析によるＲＯＣ曲線においてＡＵＣ≧０．９を示す、請求項４１に記載の方法。
  43. 　前記（ｂ）が、請求項３２～４２のいずれか１項に記載の方法によって行われることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
PCT/JP2019/032673 2018-08-22 2019-08-21 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー WO2020040210A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980066179.1A CN112840033A (zh) 2018-08-22 2019-08-21 肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合症（me/cfs）的生物标志物
US17/269,958 US20220364170A1 (en) 2018-08-22 2019-08-21 Biomarker for myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome (me/cfs)
EP19853005.7A EP3842547A4 (en) 2018-08-22 2019-08-21 BIOMARKER FOR MYALGIC ENCEPHALOMYELITIS/CHRONIC FATIGUE SYNDROME (ME/CFS)
JP2020538443A JPWO2020040210A1 (ja) 2018-08-22 2019-08-21 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー
JP2024016661A JP2024036563A (ja) 2018-08-22 2024-02-06 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-155380 2018-08-22
JP2018155380 2018-08-22
JP2019-044885 2019-03-12
JP2019044885 2019-03-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020040210A1 true WO2020040210A1 (ja) 2020-02-27

Family

ID=69592052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/032673 WO2020040210A1 (ja) 2018-08-22 2019-08-21 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220364170A1 (ja)
EP (1) EP3842547A4 (ja)
JP (2) JPWO2020040210A1 (ja)
CN (1) CN112840033A (ja)
TW (1) TW202022121A (ja)
WO (1) WO2020040210A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808195A (zh) * 2020-06-30 2020-10-23 中国科学院心理研究所 抗n-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎的b细胞抗体基因获取方法及其免疫组库研究
CN114381492A (zh) * 2021-11-25 2022-04-22 杭州拓宏生物科技有限公司 肌痛性脑脊髓炎标志微生物及其应用
CN114517235A (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 杭州拓宏生物科技有限公司 肌痛性脑脊髓炎标志基因及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113238061B (zh) * 2021-07-09 2021-10-01 中南大学湘雅医院 以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015075939A1 (ja) 2013-11-21 2015-05-28 Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社 Ｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用
WO2017222056A1 (ja) * 2016-06-23 2017-12-28 国立研究開発法人理化学研究所 ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016023077A1 (en) * 2014-08-15 2016-02-18 Griffith University Biological markers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015075939A1 (ja) 2013-11-21 2015-05-28 Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社 Ｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用
WO2017222056A1 (ja) * 2016-06-23 2017-12-28 国立研究開発法人理化学研究所 ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOUQUET, JEROME ET AL.: "RNA-Seq Analysis of Gene Expression, Viral Pathogen, and B- Cell /T- Cell Receptor Signatures in Complex Chronic Disease", CLINICAL INFECTIOUS DISEASES, vol. 64, no. 4, 18 January 2017 (2017-01-18), pages 476 - 481, XP055687333, ISSN: 1058-4838, DOI: 10.1093/cid/ciw767 *
HARDCASTLE, SHARNI LEE ET AL.: "Characterisation of cell functions and receptors in chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (CSF/ME", BMC IMMUNOLOGY, vol. 16, no. 1, 35, 2 June 2015 (2015-06-02), pages 1 - 12, XP021223756, ISSN: 1471-2172, DOI: 10.1186/s12865-015-0101-4 *
JAIN, VAGEESH ET AL.: "Prevalence of and risk factors for severe cognitive and sleep symptoms in ME/CFS and MS", BMC NEUROLOGY, vol. 17, no. 1, 117, 20 June 2017 (2017-06-20), pages 1 - 10, XP055687325, ISSN: 1471-2377, DOI: 10.1186/s12883-017-0896-0 *
NGUYEN,CHINH BKRONG ET AL.: "Whole blood gene expression in adolescent chronic fatigue syndrome:an exploratry cross-sectional study suggesting altered B cell differentiation and survival", J. TRANSL. MED, vol. 15, 102, 11 May 2017 (2017-05-11), pages 1 - 21, XP055687330, DOI: 10.1186/s12967-017-1201-0 *
ONO HIROHIKO ET AL: "Analysis of B-cell abnormalities in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome ((ME/CFS)", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL IMMUNOLGY, vol. 40, no. 4, 1 January 2017 (2017-01-01), pages 306, XP055687106, ISSN: 0911-4300, DOI: 10.2177/jsci.40.306b *
ONO, H. ET AL.: "Dysregulation of T and B cells in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome", JOURNAL OF THE NEUROLOGICAL SCIENCE, vol. 381, 1 January 2017 (2017-01-01), pages 899 - 900, XP085295835, ISSN: 0022-510X, DOI: 10.1016/j.jns.2017.08.2533 *
RAMOS, S. ET AL.: "Characterisation of B cell Subsets and Receptors in Chronic Fatigue Syndrome Patients", J.CLIN. CELL IMMUNOL, vol. 6, no. 1, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 1 - 5, XP055687337, ISSN: 2155-9899, DOI: 10.4172/2155-9899.1000288 *
See also references of EP3842547A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808195A (zh) * 2020-06-30 2020-10-23 中国科学院心理研究所 抗n-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎的b细胞抗体基因获取方法及其免疫组库研究
CN114381492A (zh) * 2021-11-25 2022-04-22 杭州拓宏生物科技有限公司 肌痛性脑脊髓炎标志微生物及其应用
CN114381492B (zh) * 2021-11-25 2024-04-23 杭州拓宏生物科技有限公司 肌痛性脑脊髓炎标志微生物及其应用
CN114517235A (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 杭州拓宏生物科技有限公司 肌痛性脑脊髓炎标志基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3842547A1 (en) 2021-06-30
TW202022121A (zh) 2020-06-16
JP2024036563A (ja) 2024-03-15
US20220364170A1 (en) 2022-11-17
EP3842547A4 (en) 2022-05-18
JPWO2020040210A1 (ja) 2021-08-10
CN112840033A (zh) 2021-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020040210A1 (ja) 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ｍｅ／ｃｆｓ）のバイオマーカー
CN105189783B (zh) 鉴定生物样品中定量细胞组成的方法
Shim et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis in healthy blood donors: an unexpectedly common finding
AU2003219275B2 (en) SCD fingerprints
Jiang et al. Single-cell repertoire tracing identifies rituximab-resistant B cells during myasthenia gravis relapses
JP5990542B2 (ja) 全身性エリテマトーデスのリスクスコアを算出する方法
US20120183969A1 (en) Immunodiversity Assessment Method and Its Use
CN104271759B (zh) 作为疾病信号的同种型谱的检测
WO2007008759A2 (en) Methods for detecting and confirming minimal disease in a cancer patient
WO2020211229A1 (zh) 一种免疫力水平评估的方法及装置
US20210010077A1 (en) Method of diagnosing celiac disease
Lee et al. Distinct T cell receptor repertoire diversity of clinically defined high-grade serous ovarian cancer treatment subgroups
Munoz et al. Comparative analysis of ZAP‐70 expression and Ig VH mutational status in B‐cell chronic lymphocytic leukemia
US20220148690A1 (en) Immunorepertoire wellness assessment systems and methods
WO2021129976A1 (en) Method for diagnosing cutaneous t-cell lymphoma diseases
Ghraichy et al. Maturation of the human B-cell receptor repertoire with age
JP2021175381A (ja) アトピー性皮膚炎の検出方法
Petrova-Drus et al. Clonal characterization and somatic hypermutation assessment by next-generation sequencing in chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma: a detailed description of the technical performance, clinical utility, and platform comparison
Sturgess et al. Improving the effectiveness of autoantibody testing in the clinic
JP2016013081A (ja) 浸潤性髄膜腫判別用試薬、及びその判別方法
CN112118781A (zh) 通过t细胞受体亚基库多样性的分析评估移植排斥状态
Bhatt Deep immunophenotyping whole blood and synovial fluid immune cell populations in Rheumatoid Arthritis by mass cytometry
JP2023162292A (ja) 乳幼児アトピー性皮膚炎の検出方法
WO2018085897A1 (en) Transplant rejection assay
Maas Characterization of an Autoimmune Gene Expression Signature

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19853005

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020538443

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019853005

Country of ref document: EP

Effective date: 20210322