TW202022121A - 肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(me/cfs)之生物標記 - Google Patents

Abstract

於本揭示中，提供一種進行肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷之方法。本揭示提供一種以B細胞受體(BCR)庫作為肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法。可採用選自由對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度、對象中之BCR多樣性指數、及對象中之1個以上之免疫細胞亞群量所組成之群中之一個或複數個變數作為對象中之ME/CFS之指標。

Description

肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之生物標記

本揭示係關於疾病、尤其是肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷之領域。

肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)係以明顯疲勞、勞作後之消耗、睡眠障礙、認知功能障礙、成骨不全症為核心症狀，並伴有疼痛、自主神經障礙、對光線、聲響、食品、化學物質之過敏症等各種症狀之疾病。亦有感染症之後發病之情況，病態尚未解明，且無識別發病之生物標記，因此存在多種診斷標準，而成為診斷或研究之阻礙。又，亦未確立有效之治療法。

[解決問題之技術手段]

本揭示提供一種以B細胞受體(BCR)庫作為肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法。於本說明書中證實ME/CFS患者與健康正常對照相比於BCR之IgGH鏈可變區中之基因之使用頻度上存在變化，利用該資訊，而能夠進行ME/CFS之診斷。除了BCR之IgGH鏈可變區中之基因，亦可採用對象中之免疫細胞亞群(B細胞、控制性T細胞等)之量作為指標。基因之使用頻度可藉由包含大規模高效率BCR庫解析之方法確定。

於以下之項目中揭示本揭示之實施形態之例。 (項目1)一種以B細胞受體(BCR)庫作為肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法，其係以對象中之B細胞受體(BCR)庫作為該對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標。 (項目2)如上述項目記載之方法，其以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為該對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標。 (項目2A)如上述項目之任一項記載之方法，其進而特徵在於上述1個以上之變數為上述對象罹患ME/CFS而非其他疾病之指標。 (項目3)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV(immunoglobulin heavy chain variable genes，免疫球蛋白重鏈可變區基因)1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD(immunoglobulin heavy chain diversity genes，免疫球蛋白重鏈多樣化基因)1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ(immunoglobulin heavy chain joining genes，免疫球蛋白重鏈連接區基因)1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4及IGHGP所組成之群中之至少一個基因。 (項目3-1)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。 (項目3-2)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。 (項目3-3)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。 (項目3-4)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6所組成之群中之至少一個基因。 (項目4-1)如上述項目之任一項記載之方法，其特徵在於上述1個以上之變數進而包含1個以上之免疫細胞亞群量。 (項目4-2)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。 (項目4-3)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。 (項目4-4)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述免疫細胞亞群量選自B細胞之量、初始B細胞之量、記憶B細胞之量、漿母細胞之量、活化初始B細胞之量、移行B細胞之量、控制性T細胞之量、記憶T細胞之量、濾泡輔助(follicular helper)T細胞之量、Tfh1細胞之量、Tfh2細胞之量、Tfh17細胞之量、Th1細胞之量、Th2細胞之量及Th17細胞之量之中。 (項目5-1)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因之使用頻度。 (項目5-2)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。 (項目5-2)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。 (項目5-2)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。 (項目6-1)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含選自由上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度、上述對象中之BCR多樣性指數、及上述對象中之1個以上之免疫細胞亞群量所組成之群中之2個以上之變數之組合，且該1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。 (項目6-2)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之3個以上之變數。 (項目6-3)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之4個以上之變數。 (項目6-4)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之5個以上之變數。 (項目6-5)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之6個以上之變數。 (項目6-7)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。 (項目6-3)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。 (項目7)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6。 (項目8)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之B細胞之量。 (項目9)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之控制性T細胞(Treg)之量。 (項目10)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因之使用頻度係藉由包含大規模高效率BCR庫解析之方法確定。 (項目11)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含選自由IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1及IGHV4-34所組成之群中之至少一個基因之使用頻度。 (項目12)如上述項目之任一項記載之方法，其包括： (a)將上述1個以上之變數中之一部分設為上述對象中之ME/CFS之指標；及 (b)將上述1個以上之變數中之一部分設為上述對象為ME/CFS而非其他疾病之指標。 (項目13)如上述項目之任一項記載之方法，其中針對複數種其他疾病進行複數次(b)。 (項目14)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述其他疾病包含多發性硬化症(MS)。 (項目15)一種以1個以上之變數作為罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)而非多發性硬化症(MS)之指標之方法，其係以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)而非多發性硬化症(MS)之指標。 (項目15A)如上述項目記載之方法，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 (項目16)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4及IGHGP所組成之群中之至少一個基因。 (項目17)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49及IGHJ6所組成之群中之至少一個基因。 (項目18)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因之使用頻度。 (項目19)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。 (項目20)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。 (項目21)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。 (項目22)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之3個以上之基因之使用頻度。 (項目23)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。 (項目24)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。 (項目25)如上述項目之任一項記載之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。 (項目26)如上述項目之任一項記載之方法，其特徵在於上述(b)係藉由如上述項目之任一項記載之方法進行。 (項目A1)一種診斷對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之方法，其包括：測定對象中之B細胞受體(BCR)庫；及基於該BCR庫診斷該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)。 (項目A1-1)如上述項目記載之方法，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 (項目A2)一種對肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)進行處置之方法，其包括：測定對象中之B細胞受體(BCR)庫；基於該BCR庫診斷該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)；及對該對象實施治療。 (項目A2-1)如上述項目記載之方法，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 (項目A3)如上述項目之任一項記載之方法，其基於包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數而診斷該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)。 (項目A4)如上述項目之任一項記載之方法，其藉由針對上述對象算出包含上述變數之式之值，並將該值與閾值進行比較，而診斷該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)。 (項目A5) 如上述項目之任一項記載之方法，其包括： (A)關於肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)，提供包含BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數； (B)提供對該變數進行多變量解析所生成之判別式； (C)將對象之該變數之值代入該判別式中算出罹患ME/CFS之機率；及 (D)於該罹患ME/CFS之機率高於特定值之情形時，確定該對象罹患ME/CFS。 (項目A6) 如上述項目之任一項記載之方法，其包括： (A)關於肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)，提供包含BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數； (B)提供對該變數進行多變量解析所生成之判別式，且(B)包括 (B-1)針對該變數，將患者/健康正常人之區分設為目標變數進行單變量或多變量羅吉斯回歸， (B-2)由該羅吉斯回歸中生成之羅吉斯模型式之常數及偏回歸係數，算出判別式之常數及係數，及 (B-3)於藉由B-2之處理獲得之常數及係數之基礎上生成判別式； (C)將對象之該變數之值代入該判別式中算出罹患ME/CFS之機率；及 (D)於該罹患ME/CFS之機率高於特定值之情形時，確定該對象罹患ME/CFS。 (項目A6-A) 如上述項目之任一項記載之方法，其包括： (A)特定出變數之組合，且(A)包括 (A-1)針對包含肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之患者及健康正常人之受驗者，將該健康正常人與該ME/CFS之患者進行比較，提供包含檢測出有意義差之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數，及/或 (A-2)將該BCR之IgGH鏈可變區中之1個基因設為獨立變數實施單變量羅吉斯解析、或將該BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因設為獨立變數實施多變量羅吉斯解析，而獲得羅吉斯回歸模型式，實施測定該羅吉斯回歸模型式之適配度之ROC解析，選擇顯示特定值以上之AUC值之基因作為判別式用變數； (B)提供對該判別式用變數進行多變量解析所生成之判別式，且(B)包括 (B-1)針對該判別式用變數，將患者/健康正常人之區分設為目標變數進行單變量或多變量羅吉斯回歸， (B-2)由B-1之該羅吉斯回歸中生成之羅吉斯模型式之常數及偏回歸係數，算出判別式之常數及係數，及 (B-3)於藉由B-2之處理獲得之常數及係數之基礎上生成判別式； (C)將對象之該變數之值代入該判別式中算出罹患ME/CFS之機率；及 (D)於該罹患ME/CFS之機率高於特定值之情形時，確定該對象罹患ME/CFS。 (項目A7) 如上述項目之任一項記載之方法，其包括： (A)關於肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)，提供包含BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數； (B)提供對該變數進行多變量解析所生成之判別式； (C)將對象之該變數之值代入該判別式中算出罹患ME/CFS之機率； (AA)提供包含肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)以外之疾病之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數； (BB)提供對該變數進行多變量解析所生成之判別式； (CC)將對象之該變數之值代入該判別式中算出罹患ME/CFS以外之疾病之機率；及 (D)於該罹患ME/CFS之機率高於特定值之情形、且該罹患ME/CFS以外之疾病之機率低於特定值之情形時，確定該對象罹患ME/CFS。 (項目A8)一種診斷對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之體外之方法，其包括基於對象中之B細胞受體(BCR)庫診斷該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)。 (項目A8-1)如上述項目記載之方法，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 (項目B1)一種程式，其包含如下命令：若藉由1個以上之處理器執行該命令，則使處理器取得包含與對象之BCR庫有關之變數之1個以上之變數，基於該1個以上之變數，判定該對象是否為ME/CFS。 (項目B1-1)如上述項目記載之程式，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 (項目B2)一種記憶媒體，其記錄有包含如下命令之程式，若藉由1個以上之處理器執行該命令，則使處理器取得包含與對象之BCR庫有關之變數之1個以上之變數，基於該1個以上之變數，判定該對象是否為ME/CFS。 (項目B2-1)如上述項目記載之記憶媒體，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 (項目B2-2)如上述項目之任一項記載之記憶媒體，其為非臨時記憶媒體。 (項目C1)一種系統，其具備：記錄部，其以記錄包含與對象之BCR庫有關之變數之1個以上之變數之資訊之方式構成；及判定部，其以取得該資訊並判定該對象是否為ME/CFS之方式構成。 (項目C1-1)如上述項目記載之系統，其具備上述項目之一項或複數項記載之特徵。 [發明之效果]

根據本揭示，能夠確切地診斷肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)。又，本揭示亦能夠活用於ME/CFS之發病預測或預後診斷，亦能夠活用作ME/CFS之治療劑開發時之標記。

以下，揭示其最佳形態對本揭示進行說明。於本說明書全文範圍內，只要無特別說明，單數形之表達應理解為亦包含其複數形之概念。因此，單數形之冠詞(例如英語中之「a」、「an」、「the」等)只要無特別說明應理解為亦包含其複數形之概念。又，本說明書中使用之用語只要無特別說明應理解為以該領域通常採用之含義使用。因此，只要未另作定義，本說明書中使用之所有專業用語及科學技術用語具有與本揭示所屬領域之業者之一般理解相同之含義。於矛盾之情形時，以本說明書(包括定義)為準。

以下，對本說明書中特別使用之用語之定義及/或基本技術內容進行適宜說明。

(ME/CFS) 肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome：ME/CFS)係以連續6個月以上感到難以名狀之高度疲勞、勞作後之極度消耗、睡眠障礙、認知功能障礙為核心症狀，並常伴有成骨不全症、疼痛、消化系統症狀、對光線或聲響、氣味、化學物質之過敏症等之嚴重之慢性疾病，推測國內患者數達10萬人以上，但由於病態尚未解明且無針對疾病之特異性檢查法或有效之治療法，故現狀為無法接受恰當之醫療。

近年自挪威傳來報告，藉由利妥昔單抗之B細胞去除療法有效，ME/CFS之免疫病態受到世界關注。於獲得性免疫系統中B細胞統括抗體之產生，但由於對應於多樣之抗原，故藉由基因重組獲得之B細胞受體極為多樣。於如全身性紅斑狼瘡之自體免疫疾病或B細胞系之血液腫瘤中，特定之B細胞受體(株)增加，可作為個體之多樣之B細胞受體之全體(庫)中之偏差被檢測出。近年來，實現了藉由利用新一代定序儀排除偏差之方法進行庫解析，有望用於ME/CFS之B細胞系之異常檢測。

ME/CFS之診斷係根據症狀、問診等，依據Fukuda標準(Fukuda criteria)、加拿大標準(Canadian criteria)及國際共識標準(International consensus criteria)等標準進行。關於ME/CFS，迄今尚未開發出表示疾病之生物標記，存在藉由症狀之組合進行診斷之複數個診斷標準。最早為Fukuda標準(1994年)、其次為加拿大標準(2003年)、之後為國際標準(2011年)，於此期間，專家們關於疾病之本質症狀(核心症狀)推進了共同理解，目前亦正在討論制定新診斷標準。認為診斷標準亦將舊標準包含在內併存之原因在於：1)用以推進研究、促進疾病之病態理解、治療法開發之詳細/嚴密之標準(研究標準)、與2)用以幫助普通內科醫生作出診斷以推進對患者之醫療/社會介入之簡易之標準(診療用標準)兩者均為必須。具體而言，認為Fukuda標準作為研究標準，現在亦為研究所必須，另一方面，新標準著眼於診療。此種雙重標準通常於其他疾病中不被認可，但ME/CFS例外，已得到專家們之認可/接受。日本厚生勞動省製作之診斷標準即係於該等國外標準之基礎上，接合日本實情(PS之設定等)製成。於本揭示中，ME/CFS可以指依據作為研究標準之Fukuda標準所規定之疾病，但視需要亦可以參照依據其他診療用標準所規定之疾病。於本揭示中，為ME/CFS之確認可依據本技術領域所接受之任一診斷標準進行。

於本揭示中，可針對顯示為ME/CFS之對象、顯示有可能為ME/CFS之對象、顯示有ME/CFS發病可能性之對象、或顯示罹患預後不良之ME/CFS之對象恰當地進行處置。作為ME/CFS之處置，可採用免疫調整劑(利妥昔單抗等)、非類固醇系抗炎症劑、抗抑鬱劑及抗不安劑等。

(BCR庫) 於一實施形態中，本揭示提供一種以B細胞受體(BCR)庫作為對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法。於本說明書中，所謂「B細胞receptor(BCR)」，亦稱為B細胞受體、B細胞抗原receptor、B細胞抗原受體，指由與膜結合型免疫球蛋白(mIg)分子締合之Igα/Igβ(CD79a/CD79b)異型二聚物(α/β)所構成者。mIg次單元結合於抗原而引起受體凝集，另一方面，α/β次單元向細胞內傳遞訊號。一般認為若BCR發生凝集，則與酪胺酸激酶之Syk及Btk同樣地，使Src家族激酶之Lyn、Blk及Fyn快速活化。由於BCR訊號傳遞之複雜性，故會產生多種不同之結果，其中包括存活、耐受性(失能(anergy)；缺乏對抗原之過敏反應)或細胞凋亡、細胞分裂、向抗體產生細胞或記憶B細胞之分化等。會生成幾億種TCR可變區序列不同之T細胞，又，亦會生成幾億種BCR(或抗體)可變區序列不同之B細胞。TCR與BCR之各個序列因基因組序列之重組或變異導入而不同，因此，關於T細胞或B細胞之抗原特異性，可藉由確定TCR、BCR之基因組序列或mRNA(cDNA)之序列而獲得線索。

於本說明書中，所謂「V區」係指TCR鏈或BCR鏈之可變區之可變部(V)區域。

於本說明書中，所謂「D區」係指TCR鏈或BCR鏈之可變區之D區域。

於本說明書中，所謂「J區」係指TCR鏈或BCR鏈之可變區之J區域。

於本說明書中，所謂「C區」係指TCR鏈或BCR鏈之恆定部(C)區域。

於本說明書中，所謂「可變區之庫(repertoire)」係指由TCR或BCR經過基因重組所任意作出之V(D)J區之集合。一般使用TCR庫、BCR庫等熟語，但該等有時亦被稱為例如T細胞庫、B細胞庫等。庫可謂存在整體上多樣性如何之資訊、與各個基因以何程度之頻度使用之資訊該兩個側面。於一實施形態中，提供一種以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法。BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度可如下所述般推導。

作為BCR庫之確定方法之一，有如下方法：使用特定之Vβ鏈特異性抗體，利用流式細胞儀解析各表現Vβ鏈之T細胞之比率(FACS解析)，從而解析樣本中之B細胞使用多少之各V鏈。另外，於由人基因組序列獲得之TCR基因之資訊之基礎上，逐步設計出基於分子生物學手法之TCR庫解析。有如下方法：自細胞樣本提取RNA，合成互補DNA後，將TCR基因進行PCR擴增而定量。

自細胞樣本之核酸之提取可使用RNeasy Plus 通用迷你套組(RNeasy Plus Universal Mini Kit)(QIAGEN)等本技術領域中公知之工具進行。可使用RNeasy Plus通用迷你套組(QIAGEN)，自經TRIzol LS試劑溶解之細胞進行全RNA之提取及純化。自所提取之RNA向互補DNA之合成可使用Superscript III^TM (Invitrogen)等本技術領域中公知之任意之反轉錄酶進行。

BCR基因之PCR擴增可使用本技術領域中公知之任意之聚合酶，由業者適當進行。但於如BCR基因之變動較大之基因之擴增中，若能夠「無偏差地」擴增，則可謂具有有利於正確測定之效果。

作為用於PCR擴增之引子，採用設計多個對各BCR V鏈具特異性之引子，分別藉由即時PCR法等進行定量之方法，或將該等具特異性之引子同時擴增之方法(多重PCR(Multiple PCR))法。然而，即便於對各V鏈使用內在性對照進行定量之情形時，若利用之引子較多，則亦無法正確解析。進而，多重PCR法存在引子間擴增效率之差異引起PCR擴增時之偏差之缺點。

於本揭示之較佳實施形態中，利用如WO2015/075939 (Repertoire Genesis Inc.)中記載之包含1種前置引子與1種反置引子之一組引子，於不改變存在頻度之情況下擴增全部之包含同型或亞型基因之BCR基因，而確定BCR多樣性。如以下之引子設計有利於無偏差擴增。

著眼於BCR基因之基因結構，不對具有高度多樣性之V區設定引子，於其5'末端附加接頭序列，藉此擴增全部之包含V區之基因。該接頭係鹼基序列上任意長度之序列，最佳為20鹼基對左右，可使用10鹼基至100鹼基之序列。利用限制酶去除附加於3'末端之接頭，利用20鹼基對之接頭與同一序列之接頭引子與對作為共通序列之C區具特異性之反置引子進行擴增，藉此擴增全部之BCR基因。

由BCR基因信使RNA藉由反轉錄酶合成互補鏈DNA，繼而合成雙鏈互補DNA。根據反轉錄反應或雙鏈合成反應而合成不同長度之包含V區之雙鏈互補DNA，於該等基因之5'末端部藉由DNA連接酶反應附加包含20鹼基對與10鹼基對之接頭。

關於BCR，可對μ鏈、α鏈、δ鏈、γ鏈、ε鏈之重鏈、κ鏈、λ鏈之輕鏈之C區設定反置引子，將該等基因擴增。對C區設定之反置引子關於BCR係設定與各Cμ、Cα、Cδ、Cγ、Cε、Cκ、Cλ之序列一致、且與其他C區序列具有不引發(priming)程度之錯配的引子。C區之反置引子係以可進行與接頭引子之擴增之方式，考慮到鹼基序列、鹼基組成、DNA融解溫度(Tm)、有無自身互補序列而最佳地製作。藉由對C區序列中之對偶基因序列間不同之鹼基序列以外之區域設定引子，可使全部之對偶基因均勻地擴增。為了增強擴增反應之特異性，進行複數個階段之巢式PCR(nested PCR)。

針對任一引子均不含對偶基因序列間不同之序列的序列，引子候補序列之長度(鹼基數)並無特別限制，為10～100鹼基數，較佳為15～50鹼基數，更佳為20～30鹼基數。採用此種無偏差擴增有利於低頻度(1/10,000～1/100,000或其以下)之基因之鑑定，從而較佳。

對以如上方式擴增之BCR基因進行定序，藉此可由所獲得之測序讀段資料(read data)確定BCR庫。

關於定序之手法，只要能夠確定核酸樣本之序列則無限定，可利用本技術領域中公知之任意者，較佳為利用新一代定序(NGS)。作為新一代定序，可列舉：焦磷酸定序、合成法定序(邊合成邊定序(sequencing by synthesis))、連接法定序、離子半導體定序等，但並不限定於該等。

將所獲得之測序讀段資料映射(mapping)至包含V、D、J基因之參考序列，藉此可推導出獨特測序讀段(unique read)數量，確定BCR庫。

於一實施形態中，所使用之參考資料庫係針對V、D、J、C基因區域分別準備。典型而言，使用IMGT中公開之每個區域、每個對偶基因之核酸序列資料集，但並不限定於此，只要為各序列被分配唯一之ID之資料集，則可利用。

將所獲得之測序讀段資料(包括視需要進行修整(trimming)等適當處理者)設為輸入序列集，與每個基因區域之參考資料庫進行同源性檢索，記錄最接近之參考對偶基因及與該序列之匹配。此處，同源性檢索係使用除C以外錯配容許度較高之演算法。例如於使用一般之BLAST作為同源性檢索程式之情形時，針對每個區域進行縮短窗口尺寸、減小錯配罰分、減小空位罰分等設定。關於最接近之參考對偶基因之選擇，以同源性得分、匹配長度、核心長度(連續且一致之鹼基列之長度)、一致鹼基數作為指標，按照規定之優先順序應用該等。針對本揭示中使用之V及J確定之輸入序列，將參考V上之CDR3開頭及參考J上之CDR3末尾作為記號，擷取CDR3序列。將其轉譯為胺基酸序列，藉此用於D區之分類。於備有D區之參考資料庫之情形時，將同源性檢索結果與胺基酸序列轉譯結果之組合作為分類結果。

藉由上述操作，針對輸入集中之各序列分配V、D、J、C之各對偶基因。繼而，算出於輸入集整體中V、D、J、C之各出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出BCR庫。根據所要求之分類精確度，出現頻度係以對偶基因單元或基因名稱單元算出。後者可將各對偶基因轉換為基因名稱。

對測序讀段資料分配V區、D區、J區、C區後，統計一致之測序讀段，除獨特測序讀段(此外不具有相同序列之測序讀段)外，可算出於樣本中檢出之測序讀段數量及於總測序讀段數量中所占之比率(頻度)。

另外，可利用樣本數量、測序讀段種類、測序讀段數量等資料，使用ESTIMATES或R(vegan)等統計解析軟體，算出多樣性指數或類似性指數。於較佳實施形態中，使用TCR庫解析軟體(Repertoire Genesis Inc.)。

於本說明書中，所謂「BCR多樣性」係指某受驗體之B細胞受體之庫(repertory/repertoire)之多樣性，業者可採用該領域中公知之各種方法進行測定。表示BCR多樣性之指數稱為「BCR多樣性指數」。作為BCR多樣性指數，於該領域中有公知之任意者，例如可列舉將香農-韋弗指數(Shannon-Weaver index)、辛普森指數(Simpson index)、反辛普森指數(Inverse Simpson index)、皮洛均度指數(Pielou's species evenness index)、標準化香農-韋弗指數(Normalized Shannon-Weaver index)、DE指數(例如DE50指數、DE30指數、DE80指數)或Unique指數(例如Unique50指數、Unique30指數、Unique80指數)等多樣性指數應用於BCR者。

(大規模高效率BCR庫解析) 於本揭示之較佳實施形態中，使用大規模高效率BCR庫解析對BCR庫進行測定。本說明書中，所謂「大規模高效率庫解析」，於WO2015/075939(本說明書中視需要以參考之形式援用該文獻所揭示之全部內容)中有記載，在對象為BCR之情形時稱為「大規模高效率BCR庫解析」。於大規模高效率庫解析中，係使用資料庫，定量地解析受驗體之庫(Repertoire)(T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區)之方法，該方法係使用資料庫，定量地解析受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之庫(repertoire)之方法，且該方法包括如下步驟：(1)提供包含自該受驗者無偏差地擴增之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸樣本；(2)確定該核酸樣本所含之該核酸序列；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，導出該受驗體之TCR或BCR庫；該核酸樣本包含複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列，該步驟(2)可藉由利用使用共通接頭引子之單一之序列確定來確定上述核酸序列之方法實現，較佳為該方法包括如下步驟：(1)提供包含自該受驗者無偏差地擴增之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸樣本；(2)確定該核酸樣本所含之該核酸序列；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，導出該受驗體之庫；上述(1)包括以下之步驟：(1-1)以源自靶細胞之RNA樣本作為模板合成互補DNA；(1-2)以該互補DNA作為模板合成雙鏈互補DNA；(1-3)對該雙鏈互補DNA附加共通接頭引子序列而合成附接頭之雙鏈互補DNA；(1-4)使用該附接頭之雙鏈互補DNA、包含該共通接頭引子序列之共通接頭引子、及第一TCR或BCR之C區特異性引子，進行第一PCR擴增反應，並且，該第一TCR或BCR之C區特異性引子係以如下方式設計：包含對該TCR或BCR之目標C區具有充分之特異性、且與其他基因序列無同源性的序列，且於經擴增之情形時於下游在亞型間包含不一致鹼基；(1-5)使用(1-4)之PCR擴增產物、該共通接頭引子、及第二TCR或BCR之C區特異性引子，進行第二PCR擴增反應，並且，該第二TCR或BCR之C區特異性引子係以如下方式設計：包含於較該第一TCR之C區特異性引子之序列之下游之序列中具有與該TCR或BCR之C區完全匹配之序列、但與其他基因序列無同源性的序列，且於經擴增之情形時於下游在亞型間包含不一致鹼基；及(1-6)使用(1-5)之PCR擴增產物、於該共通接頭引子之核酸序列中包含第一追加接頭核酸序列之附加共通接頭引子、對第三TCR或BCR之C區特異性序列附加第二追加接頭核酸序列及分子鑑定(MID Tag)序列而獲得之附接頭之第三TCR之C區特異性引子，進行第三PCR擴增反應，並且，該第三TCR之C區特異性引子係以如下方式設計：包含於較該第二TCR或BCR之C區特異性引子之序列之下游之序列中具有與該TCR或BCR之C區完全匹配之序列、但與其他基因序列無同源性的序列，且於經擴增之情形時於下游在亞型間包含不一致鹼基，該第一追加接頭核酸序列為適於結合於DNA捕捉珠粒及適於進行乳化PCR(emPCR)反應之序列，該第二追加接頭核酸序列為適於進行乳化PCR反應之序列，該分子鑑定(MID Tag)序列為用於賦予獨特性以能夠鑑定擴增產物之序列。該方法之具體詳細之說明記載於WO2015/075939，業者可適當參照該文獻及本說明書之實施例等而實施解析。

(診斷) 於本揭示之一實施形態中，提供一種以對象中之B細胞受體(BCR)庫作為對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法。該方法不僅包括對象之ME/CFS發病之診斷，亦可包括ME/CFS之發病預測或預後診斷、或提供ME/CFS之治療劑開發時之指標。方法可為體外或計算機模擬(in silico)者。

方法可包括使用包含與BCR庫有關之變數之1個以上之變數。使用1個以上之變數設為ME/CFS之指標之情形時，例如可藉由使用包含該1個以上之變數之恰當之式，針對某對象算出該式之值，將該值與恰當之基準加以比較等而進行。式可為藉由羅吉斯回歸等所求出者。作為使用之變數，可列舉選自對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度、對象中之BCR多樣性指數、及對象中之1個以上之免疫細胞亞群量中的1個以上之變數或2個以上之變數之組合，但並不限定於該等。

於本揭示之實施形態中，較佳為可使用包含對象中之BCR之1個以上之IGH基因之使用頻度的1個以上之變數作為ME/CFS之指標。藉此，有可能實現將該1個以上之變數用作對象罹患ME/CFS而非其他疾病之指標(即鑑別診斷)。並不希望拘泥於理論，但例如，免疫細胞亞群之量及BCR庫多樣性指數亦可能因會對整體免疫狀態產生影響之其他疾病而出現變動，因此，儘管可以暗示對象中之ME/CFS之存在，但存在無法排除其他疾病之可能性。另一方面，認為IGH基因之使用頻度係反映某疾病之機制而相應變化，因此認為可成為對象罹患ME/CFS而非其他疾病之指標，對於實際之臨床診斷非常有用。

作為相對於ME/CFS而言之「其他疾病」，可列舉呈現與作為ME/CFS症狀之「以連續6個月以上感到難以名狀之高度疲勞、勞作後之極度消耗、睡眠障礙、認知功能障礙為核心症狀，成骨不全症、疼痛、消化系統症狀、對光線或聲響、氣味、化學物質之過敏症等」類似之症狀之所有疾病，以及可能對免疫狀態產生影響之任意疾病。例如可列舉：精神疾病(例如抑鬱症或適應障礙、身體表達性障礙)、原發性睡眠障礙(例如睡眠呼吸暫停、發作性嗜睡症)、內分泌疾病(例如腦下垂體功能低下症、甲狀腺疾病)、感染性疾病(例如AIDS、B型肝炎、C型肝炎等慢性感染性疾病)、自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、薛格連氏症候群(sjogren's syndrome)等)、炎症性疾病(例如炎症性腸病、慢性胰臟炎等慢性炎症性疾病)、神經系統疾病(例如多發性硬化症(MS)、自體免疫性腦炎)。於本揭示之實施形態中，提供一種於對象中將ME/CFS與其他疾病進行區別之方法。作為其他疾病之一例，可列舉多發性硬化症(MS)。於本說明書中之將ME/CFS與其他疾病進行區別之方法之實施中，視需要可應用關於以對象中之B細胞受體(BCR)庫作為對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法所記載之事項。

ME/CFS之診斷係根據「臨床症狀之組合」進行，此時，其他疾病或其他原因之除外成為非常重要之環節。存在亦會因生活習慣(不規律、過勞等)導致符合「臨床症狀之組合之基準」之情況，亦可能因其他原因、例如惡性腫瘤、代謝性疾病及腦神經疾病等導致符合臨床症狀之基準。因此認為，如本說明書之實施例所示般，被認作反映疾病原因之B細胞庫或其中各基因之使用頻度對於臨床診斷非常有用。例如認為，藉由在臨床診斷基準上輔以本說明書中記載之使用BCR庫(IGH基因使用頻度)之鑑別法，能夠獲得更正確之鑑別診斷。或於本揭示之方法中，視需要可組合使用臨床(臨床所見、MRI圖像所見、腦脊髓液所見等)資訊。於一實施形態中，針對呈現含ME/CFS之全身症狀之患者，分別藉由利用IGH基因之使用頻度之判別模型或判別式逐一判定罹患各疾病之可能性，從而最終能夠特定一種疾病。

於本說明書中，所謂「感度」係指將應判定陽性者正確地判定為陽性之機率，存在若感度較高則偽陰性減小之關係。若感度較高，則對於除外診斷(rule out)有用。

於本說明書中，所謂「特異度」係指將陰性者正確地判定為陰性之機率，存在若特異度較高則偽陽性減小之關係。若特異度較高，則對於確定診斷有用。

於本說明書中，所謂「ROC曲線」係指將基於標記之回歸式之臨界值設為媒介變數並使其變化時對(感度)及(1-特異度)進行繪圖而獲得之曲線。業者可針對ROC曲線，恰當地求出AUC(曲線下面積)。認為ROC曲線之AUC顯示預測模型之性能。於本說明書之實施例中，於藉由回歸分析獲得之ROC曲線中證實了多個AUC≧0.7、AUC≧0.8及AUC≧0.9等表示較高預測性能之變數或變數之組合。認為若AUC為0.7左右，則存在作為診斷模型之使用可能性。

於本揭示中，藉由使用用作對象中ME/CFS之指標之1個以上之變數、且藉由回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7之1個以上之變數(視需要可為變數之組合)，能夠對迄今難以診斷之ME/CFS進行診斷。

方法可包括取得用作對象中ME/CFS之指標之1個以上之變數之步驟。於一實施形態中，取得變數之步驟可包括對對象之樣本進行分析之步驟，例如可包括對對象中之BCR之庫進行測定之步驟、及/或對對象中之細胞亞群之量進行測定之步驟。對BCR之庫進行測定之步驟可包括確定對象中之BCR多樣性之步驟、及/或確定對象之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度之步驟。對象中之細胞亞群之量可藉由包括流式細胞儀在內之業者公知之任意手法測定。又，作為變數，亦可取得先前針對對象所確定之值之相關資料。

方法可包括基於本說明書中記載之1個以上之變數而判定對象是否為ME/CFS之步驟。判定步驟可藉由將包含該1個以上之變數之函數之從屬變數之值與恰當之閾值加以比較而進行。

於一實施形態中，本說明書中記載之方法可藉由計算機模擬進行。方法包括如下步驟：取得包含與對象之BCR庫有關之變數之1個以上之變數；及基於該1個以上之變數，判定該對象是否為ME/CFS。實現本說明書中記載之任意方法之程式、記錄程式之記憶媒體、或系統亦包含於本揭示之範圍內。

於一實施形態中，提供一種包含如下命令之程式、或記錄該程式之記憶媒體，上述命令係若藉由1個以上之處理器執行該命令，則使處理器取得包含與對象之BCR庫有關之變數之1個以上之變數，基於該1個以上之變數，判定該對象是否為ME/CFS。亦可提供一種系統，該系統具備：記錄部，其以記錄包含與對象之BCR庫有關之變數之1個以上之變數之資訊之方式構成；及判定部，其以取得該資訊並判定該對象是否為ME/CFS之方式構成。系統視需要可為電腦系統，可包含本說明書中記載之程式或記錄其之記憶媒體。

(指標) (IGH基因) 本揭示之一實施形態提供一種以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因(IGH基因)之使用頻度的1個以上之變數作為對象中之ME/CFS之指標之方法。作為IGH基因，可使用選自由IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4及IGHGP、以及該等之任意組合所組成之群中之至少一個基因。

於本說明書之實施例中揭示，各種IGH基因之使用頻度可成為ME/CFS之指標。於本揭示中，可使用之至少一個IGH基因之數量並無特別限制，可使用1～117之任意數量之基因。本揭示中用作指標之1個以上之變數可包含約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、或超過該數量之IGH基因之使用頻度。於恰當之情形時，1個以上之變數亦可為1個變數。

於一較佳實施形態中，1個以上之IGH基因包含選自由IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。更佳為1個以上之IGH基因包含選自由IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。進而更佳為1個以上之IGH基因包含選自由IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。於另一實施形態中，1個以上之基因包含選自由IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6所組成之群中之至少一個基因。本說明書之實施例中暗示上述基因能夠單獨地用於預測。

於本揭示之另一實施形態中，提供一種使用包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因之使用頻度的變數作為1個以上之變數之方法。認為藉由使用2個以上之基因之使用頻度，可進一步提高方法之精度。業者可鑒於本說明書之記載，選用恰當之2個以上之基因之使用頻度之組合。1個以上之變數可為以於藉由回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7、AUC≧0.8或AUC≧0.9之方式所選擇者。作為基因之組合之一例，可列舉：IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6。業者可依據本案說明書中記載之方法恰當地算出某基因之組合於藉由回歸分析獲得之ROC曲線中之AUC，判定某基因之組合是否為顯示所期望之AUC者。回歸分析例如可為用以判別正常對照與ME/CFS者。

於本說明書之實施例中揭示，關於2種IGH基因之組合，於將117種基因之任一者與恰當之其他IGH基因加以組合之情形時，均可實現於藉由回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7之組合。

(多樣性指數) 於本揭示中，於對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷中，可使用對象中之BCR多樣性指數代替其他變數或與之一起作為變數。

作為BCR多樣性指數，可利用該領域中公知之任意者，例如可列舉：香農-韋弗指數(Shannon-Weaver index)、辛普森指數(Simpson index)、反辛普森指數(Inverse Simpson index)、皮洛均度指數(Pielou's species evenness index)、標準化香農-韋弗指數(Normalized Shannon-Weaver index)、DE指數(例如DE50指數、DE30指數、DE80指數)等。

於本說明書之實施例3-2、表7中，若干多樣性指數係基於在單回歸分析中0.1≦P＜0.2之有意義性被擷取。又，於本說明書之實施例6中發現，於複數個變數之組合中，包含多樣性指數之若干變數之組合於ROC解析中顯示AUC值0.8以上(表18)。

(細胞亞群) 於本揭示中，於對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷中，可使用細胞亞群量代替其他變數或與之一起作為變數。作為細胞亞群量，例如可使用免疫細胞亞群量。於本說明書中，所謂「細胞亞群」係指包含多樣特性之細胞之細胞群中之具有某些共通特徵之任意細胞之集合。對於特定之名稱為本技術領域中已知者，可採用相關用語來表述特定之細胞亞群，亦可記載任意之性質(例如細胞表面標記之表現)來表述特定之細胞亞群。

作為細胞亞群之例，例如可列舉：B細胞、初始B細胞、記憶B細胞、漿母細胞、活化初始B細胞、移行B細胞、控制性T細胞、記憶T細胞、濾泡輔助T細胞、Tfh1細胞、Tfh2細胞、Tfh17細胞、Th1細胞、Th2細胞及Th17細胞，但並不限定於該等。

細胞亞群之量可由業者利用例如流式細胞儀來確定。例如，可於採集樣本後，藉由溶血法或比重離心法去除紅血球後，使之與螢光標記抗體(針對目標抗原之抗體與其對照抗體)反應，充分洗淨後使用流式細胞儀進行觀察。將檢測出之散射光或螢光轉換為電氣訊號，藉由電腦進行解析。其結果為，FSC之強度表示細胞之大小，SSC之強度表示細胞內結構，藉此能夠區分淋巴細胞、單核細胞、粒細胞。其後，視需要對目標細胞群設門，研究該等細胞中之抗原表現樣式。於本揭示之方法之實施中，業者可恰當地識別所示細胞之表面標記，對細胞進行區分或計數。

作為特別有用之細胞亞群，可列舉B細胞及控制性T細胞(Treg)。於本揭示中，可使用包含B細胞之量及/或Treg之量的1個以上之變數代替其他變數或與之一起作為ME/CFS之指標。

細胞亞群之量可使用相對於恰當基準之比率。B細胞之量例如為末梢血單核細胞中之B細胞之頻度(%)。Treg之量例如為全部CD4陽性T細胞中之Treg之頻度(%)。

於本說明書之實施例3-2、表7中，若干細胞亞群變數係基於在單回歸分析中0.1≦P＜0.2之有意義性被擷取。又，於本說明書之實施例6中發現，於複數個變數之組合中，包含細胞亞群變數之若干變數之組合於ROC解析中顯示AUC值0.8以上(表18)。

(組合) 如本說明書中所示，可使用包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為對象中之ME/CFS之指標。1個以上之變數可為本說明書中記載之變數之任意之組合。較佳為包含選自由對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度、對象中之BCR多樣性指數、及對象中之1個以上之免疫細胞亞群量所組成之群中之2個以上之變數之組合。2個以上之變數可為3個以上、4個以上、5個以上、6個以上或超過該數量之任意數量之變數。

於本說明書之實施例中，證實多個變數之組合於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示較高之AUC，業者可恰當地組合變數，使用顯示特定之AUC之組合而實施。於一實施形態中，變數之組合於藉由回歸分析獲得之ROC曲線中可顯示AUC≧0.7、AUC≧0.8、AUC≧0.85、AUC≧0.9、AUC≧0.95或AUC≧0.99。業者可依據本案說明書中記載之方法恰當地算出某變數之組合於藉由回歸分析獲得之ROC曲線中之AUC，判定某變數之組合是否為顯示所期望之AUC者。作為變數之組合之一例，可列舉：對象中之IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6之使用頻度與B細胞之量的組合、或對象中之IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6之使用頻度與Treg之量的組合等，但並不限定於該等。

雖然並非必須，但進而組合藉由單回歸分析而顯示預測性能之變數可能關係到更高之預測性能。於本說明書之實施例中，關於在單回歸分析中於患者群與對照群之間顯示P＜0.2之有意義差之變數彼此之組合，於2個變數之組合之情形時，組合中之46%於ROC解析中顯示AUC≧0.7，於3個變數之組合之情形時，組合中之81%於ROC解析中顯示AUC≧0.7，於4個變數之組合之場情形時，組合中之96%於ROC解析中顯示AUC≧0.7。

於本揭示中，關於對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷例如可藉由如下所述之步驟進行。可關於肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)，提供包含BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數。其次，可提供對該變數進行多變量解析所生成之判別式。判別式之提供例如可包括：針對變數，將患者/健康正常人之區分設為目標變數進行單變量或多變量羅吉斯回歸；根據羅吉斯回歸中生成之羅吉斯模型式之常數及偏回歸係數，算出判別式之常數及係數；及於藉由該處理所獲得之常數及係數之基礎上生成判別式。其次，可將對象之變數之值代入判別式中算出罹患ME/CFS之機率。於罹患ME/CFS之機率高於特定值之情形時，可確定對象罹患ME/CFS。

更詳細而言，於本揭示中，關於對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷例如可藉由如下所述之步驟進行。於方法中，特定變數之組合。變數之組合之特定可包括：(1)針對包含肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之患者及健康正常人之受驗者，將該健康正常人與該ME/CFS之患者進行比較，提供包含檢測出有意義差之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的複數個變數；及/或(2)將該BCR之IgGH鏈可變區中之1個基因設為獨立變數實施單變量羅吉斯解析、或將該BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因設為獨立變數實施多變量羅吉斯解析，而獲得羅吉斯回歸模型式，實施測定該羅吉斯回歸模型式之適配度之ROC解析，選擇顯示更高AUC值之基因作為判別式用變數。

其次，可提供對判別式用變數進行多變量解析所生成之判別式。判別式之提供例如可包括：針對變數，將患者/健康正常人之區分設為目標變數進行單變量或多變量羅吉斯回歸；根據羅吉斯回歸中生成之羅吉斯模型式之常數及偏回歸係數，算出判別式之常數及係數；及於藉由該處理所獲得之常數及係數之基礎上生成判別式。其次，可將對象之變數之值代入判別式中算出罹患ME/CFS之機率。於罹患ME/CFS之機率高於特定值之情形時，可確定對象罹患ME/CFS。

(鑑別診斷) 於本揭示之實施形態中，提供於對象中將ME/CFS與其他疾病進行區別之方法。於本揭示之一實施形態中，藉由使用包含於包括正常對照及其他疾病之患者之非ME/CFS群與ME/CFS群之間產生差值之指標(變數)的式，進行鑑別診斷。於該情形時，例如可將健康正常人＋MS疾病設為非ME/CFS群，選擇對於與ME/CFS群之鑑別有效之IGH基因，使用包含該所選基因之一個判別式。可列舉根據本說明書之實施例中之ME/CFS群與非ME/CFS群間之有意義差檢定而存在有意義差之IGH基因，可使用包含選自由IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1及IGHV4-34所組成之群中之至少一個基因之使用頻度的變數作為1個以上之變數。

或於另一實施形態中，設想如下形態：藉由區別正常對照與ME/CFS患者之判別式進行判別後，分別代入判別其他疾病(例如MS)之判別式來逐一否定為其他疾病之可能性。於該情形時，進行本說明書中記載之將ME/CFS與正常對照加以區別之判別，其後(或之前或同時)，進而使用其他判別式進行與其他疾病之鑑別。即，可提供一種方法，其包括：(a)將1個以上之變數中之一部分設為上述對象中之ME/CFS之指標；及(b)將1個以上之變數中之一部分設為上述對象為ME/CFS而非其他疾病之指標。其他疾病可包含多發性硬化症(MS)。可針對複數種其他疾病進行複數次(b)。

本揭示之一實施形態係一種以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)而非其他疾病(例如多發性硬化症、MS)之指標之方法。可將此種方法與本說明書中記載之將ME/CFS與正常對照加以區別之判別視需要組合進行。此處，於期望與MS進行區別之情形時，1個以上之基因可包含選自由IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49及IGHJ6所組成之群中之至少一個基因。此外，作為上述1個以上之基因，可為以於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7、AUC≧0.8或AUC≧0.9之方式所選擇者。於本揭示中，用於判別MS與ME/CFS之至少一個IGH基因之數量並無特別限制，可使用1～117之任意數量之基因。於本揭示中用作指標之1個以上之變數可包含約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、或超過該數量之IGH基因之使用頻度。於恰當之情形時，1個以上之變數亦可為1個變數。

於本說明書中，所謂「對象」係指成為本揭示之診斷或檢測等之對象的任意之生物。較佳為對象為人。

於本說明書中，所謂「樣本」係指自對象獲得之任意之物質，例如包括末梢血、組織活檢樣本、細胞樣本、淋巴液、唾液、尿液等。業者可基於本說明書之記載，選擇適宜較佳之樣本。

於本說明書中，所謂「或」係於可採用文章中列舉事項之「至少1個以上」時使用。「或者」亦同樣。本說明書中明確表示「2個值」之「範圍內」之情形時，該範圍亦包括2個值本身。

本說明書中引用之科學文獻、專利、專利申請等參考文獻係與各自之具體記載同程度地將其整體以參考之形式援用至本說明書中。

以上，為了易於理解，揭示較佳實施形態對本揭示進行了說明。以下，基於實施例對本揭示進行說明，但上述說明及以下之實施例僅基於例示之目的而提供，並非意在限定本揭示。因此，本揭示之範圍僅由申請專利範圍進行限定，而非限定於本說明書中具體記載之實施形態或實施例。 [實施例]

本說明書於以下記載之實施例中適當使用以下之簡稱。 [表A]

[實施例1] 使用ME/CFS疾病患者末梢血單核細胞之新一代B細胞受體庫解析 1.材料與方法 1.1.末梢血單核細胞分離與RNA提取 自表1所示之ME/CFS疾病患者(37例)及健康正常人對照者(23例)採集10 mL全血至含肝素採血管內，藉由Ficoll-Paque PLUS密度梯度離心分離而分離末梢血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells、PBMCs)。使用RNeasy脂質組織迷你套組(RNeasy Lipid Tissue Mini Kit)(Qiagen，Germany)，自所單離之PBMC提取全RNA並純化。RNA係使用Agilent 2100生物分析器(Agilent)進行定量。 [表1]

1.2.互補DNA及雙鏈互補DNA之合成 BCR基因之擴增係採用接頭連接PCR(adaptor-ligation PCR)法實施。藉由含限制酶消化部位之寡胸腺嘧啶(Oligo dT)引子(BSL-18E：表2)與反轉錄酶而合成互補鏈DNA(cDNA)。繼而，使用大腸桿菌DNA連接酶(E.coli DNA Ligase)(Invitrogen)、DNA聚合酶I(DNA polymerase I)(Invitrogen)及核糖核酸酶H(RNaseH)(Invitrogen)，進行雙鏈互補鏈DNA(ds-cDNA)合成。其後，藉由T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)進行5'末端平滑化反應，利用限制酶NotI切割末端。使用MinElute反應純化套組(MinElute Reaction Cleanup Kit)(QIAGEN)進行管柱純化後，藉由利用T4連接酶(T4 Ligase)之連接(Ligation)反應而附加P20EA/P10EA接頭，利用NotI限制酶消化附接頭之ds-cDNA。

1.3.PCR 為了特異性地擴增B細胞受體(B cell receptor、BCR)之免疫球蛋白γ鏈(IgG)之重鏈(IGH)基因，藉由KAPA HiFi HS ReadyMix(Nippon Genetics)使用溫控循環機(Thermal cycler)T100(Bio Rad)進行3次巢式PCR。使用P20EA與CG1進行第一次PCR反應，繼而使用P20EA與CG2進行第二次PCR反應。進而，藉由P22EA-ST1-R及CG-ST1-R附加定序所需之Tag序列。使用Agencourt AMPure磁珠去除所帶入之殘存引子後，使用Nextera XT Index Kit v2 Set A(Illumina)附加index。 [表2]

1.4.新一代定序解析 針對擴增產物，使用Qubit(註冊商標)3.0螢光計(Thermo Fisher Scientific)進行濃度測定，稀釋成4 nM後，混合一部分PhiX Control v3(Illumina)，而製成最終製備檢體。使用Illumina公司之Miseq定序儀對Miseq Reagent Kit v3(600Cycle，Illumina)及最終製備檢體進行雙端定序(paired-end sequencing)。

1.5.利用庫解析軟體之解析 使用藉由Miseq定序獲得之1對Fastq鹼基序列資料集，藉由庫解析軟體Repertoire Genesis，確定IGH基因V區序列(IGHV)、D區序列(IGHD)、J區序列(IGHJ)及C區序列(IGHC)之對照、以及CDR3序列。將具有相同之IGHV、IGHD、IGHJ、IGHC及CDR3胺基酸序列之測序讀段設為獨特測序讀段，計數各樣本中之獨特測序讀段之複製數。根據獨特測序讀段之統計結果，算出各樣本之IGHV、IGHD、IGHJ、IGHC使用頻度、以及多樣性指數。

2.結果 自ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本獲得20萬～30萬測序讀段之序列資料(表3)。關於總測序讀段數量、分配測序讀段、讀框內(in-frame)測序讀段數量及獨特測序讀段數量，於ME/CFS疾病患者與健康正常對照者間未見差異。針對由測序讀段資料算出之IGHV、IGHD、IGHJ、IGHC使用頻度、以及多樣性指數，於ME/CFS疾病患者與健康正常對照者間進行比較。於ME/CFS疾病患者中，關於IGHV之IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3及IGHV3-49之使用頻度顯著高於健康正常對照者(圖1，曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗之有意義水準：P＜0.05、P＜0.05、P＜0.001及P＜0.001)。與健康正常對照者相比，於ME/CFS疾病患者中，關於IGHD之IGHD1-26、關於IGHJ之IGHJ6顯示顯著較高之頻度(圖2，P＜0.01及P＜0.05)。於圖3A及圖3B中示出點陣圖。該等結果暗示，藉由新一代BCR庫解析，可將IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49及IGHJ6之使用頻度之測定用於無有效生物標記之ME/CFS疾病之鑑別(表4)。 [表3]

[表4]

[實施例2] ME/CFS疾病患者淋巴細胞之藉由流式細胞儀之比較研究 1.方法 藉由[實施例1]中揭示之方法，分離末梢血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells、PBMCs)。其後，利用各種螢光色素標記單株抗體進行染色，利用流式細胞儀(FACS Canto II及FACS Aria II flow cytometer(BD Biosciences))算出以下之淋巴細胞亞類(subclass)之頻度。(%)B細胞：CD19+細胞/PBMC；初始B細胞(nB)：CD19+CD27-/CD19+細胞；記憶B細胞(mBs)，CD19+CD27+CD180+/CD19+；漿母細胞(PBs)：CD19+CD27+CD180-CD38high/CD19+；移行B細胞(TrB)：CD19+CD27-CD24+Mito tracker green high/CD19+；記憶CD4T細胞(mCD4T)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-/CD3+CD4+；濾胞性輔助性T細胞(Tfh)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+/CD3+CD4+；輔助性T細胞1(Th1細胞)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5-CXCR3+CCR6-/CD3+CD4+CD127+CD45RA-；輔助性T細胞2(Th2細胞)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5-CXCR3-CCR6-/CD3+CD4+CD127+CD45RA-；輔助性T細胞17(Th17細胞)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5-CXCR3-CCR6+/CD3+CD4+CD127+CD45RA-；濾胞性輔助性T細胞1(Tfh1細胞)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+CXCR3+CCR6-/CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+；濾胞性輔助性T細胞2(Tfh2細胞)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+CXCR3-CCR6-/CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+；濾胞性輔助性T細胞17(Tfh17細胞)：CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+CXCR3-CCR6+/CD3+CD4+CD127+CD45RA-CXCR5+；控制性T細胞(Treg)：CD3+CD4+CD45RA-CD127-CD25++/CD3+CD4+。針對所獲得之頻度，於ME/CFS疾病患者與健康正常人對象者間進行曼-惠特尼U檢驗，檢定兩群間之有意義差。將p＜0.05視為統計學上有意義。

2.結果 如圖4、圖5及圖6所示，於疾病群中(%)B細胞顯著較高，於疾病群中控制性T細胞(Treg)之頻度顯著較低，於疾病群中濾胞性輔助性T細胞17(Tfh17)之頻度顯著較高。

[實施例3-1] 利用於兩群間觀察到有意義差之IGH基因與細胞亞群頻度資料的ME/CFS之預測鑑別 1.方法 針對將於ME/CFS疾病患者(37例)及健康正常人對照者(23例)之兩群間檢測出有意義差之6個IGH基因(表5)及作為細胞亞群之頻度資料之(%)B細胞或(%)控制性T細胞加以聯合而能否預測ME/CFS進行研究。藉由SPSS軟體(IBM)實施多變量羅吉斯解析，使用回歸式之從屬變數之預測值製作接收者操作特徵(Receiver Operating Characteristic、ROC)曲線。進而，求出ROC曲線下面積(Area Under the Curve、AUC)值作為該等變數之預測判定之性能評估值。

2.結果 於IGH基因6變數與(%)B細胞中獲得AUC值為0.946之良好評估(圖7)。又，於基於使用IGH基因6變數與(%)控制性T細胞之回歸式之解析中，獲得AUC值為0.957之極其良好之評估(圖8)。 [表5]

[實施例3-2] 藉由單回歸分析之ME/CFS疾病之預測性能較高之IGH基因及細胞亞群變數之擷取 1.方法 將74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ、5種IGHC、4種多樣性指數、15種細胞亞群頻度資料中之1種設為獨立變數，並將ME/CFS疾病與健康正常人對照之2值變數設為從屬變數，而實施單回歸分析。所使用之變數示於表6。擷取滿足有意義水準P＜0.05、0.05≦P＜0.1及0.1≦P＜0.2之變數。單回歸及羅吉斯回歸分析係利用R之glm()、ROC解析係利用R套裝之pROC。 [表6]

2.結果 從74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ、5種IGHC、4種多樣性指數、15種細胞亞群資料之共計136種變數中，擷取了共計10種滿足有意義水準P＜0.05之變數：8種IGH基因、2種細胞亞群變數(表7)。滿足0.05≦P＜0.1之變數：10種IGH基因、4種細胞亞群頻度資料。滿足0.1≦P＜0.2之變數：16種IGH基因、3種多樣性指數、2種細胞亞群變數。暗示單獨一種之滿足有意義水準P＜0.2之變數對於ME/CFS疾病之預測有效。尤其暗示，單獨一種之滿足有意義水準P＜0.05之變數亦對於ME/CFS疾病之預測非常有效(表8)。藉由多變數羅吉斯回歸分析進行分析時採用滿足有意義水準P＜0.2之變數。

再者，針對若干變數逐一進行ROC解析，結果分別獲得如下AUC值，IGHV3-49：0.764、IGHV3-30-3：0.759、IGHD1-26：0.731、IGHJ6：0.672、IGHV3-30：0.693、IGHV1-3：0.659、B cell：0.771、Treg：0.817、Shannon：0.617、Inverse：0.636。 [表7]

[表8]

[實施例4] 使用2種IGH基因之ME/CFS疾病之預測鑑別 1.方法 針對來自74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ及5種IGHC之合計117種IGH基因中之任意2種IGH基因之組合，實施多變量羅吉斯回歸分析，使用各回歸式之從屬變數之預測值製作ROC曲線。針對該等ROC曲線，算出表示ME/CFS疾病之預測性能之AUC值，擷取AUC值顯示0.7或0.8以上之IGH基因之組合、及該等組合所使用之IGH基因清單。羅吉斯回歸分析係利用R之glm()，ROC解析係利用R套裝之pROC。

2.結果 於使用任意2種IGH基因之ROC解析中AUC值顯示0.8、0.7以上之IGH基因之組合分別有30組、637組。將於2種變數羅吉斯回歸及ROC解析中顯示AUC≧0.7之變數之組合示於表11。又，該等組合所使用之IGH基因中，AUC值為0.8以上之基因有26個、AUC值為0.7以上之基因有117個(表9)。又，AUC值顯示0.8以上之30組基因組合中之10組(33%)為於單回歸分析中顯示有意義性之變數彼此之組合，20組(67%)為單方於單回歸分析中顯示有意義性之IGH(表10)。該等結果表明，藉由將IGH基因任意地組合而能夠進行ME/CFS患者之預測鑑別。 [表9]

[表10]

[表11-1]

[表11-2]

[表11-3]

[表11-4]

[表11-5]

[表11-6]

[表11-7]

[表11-8]

[表11-9]

[表11-10]

[表11-11]

[實施例5] 使用複數個IGH基因之多變量羅吉斯回歸分析 1.方法 針對來自74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ及5種IGHC之合計117種IGH基因中之任意2種以上之IGH基因之組合，以大循環實施多變量羅吉斯回歸分析。使用所獲得之回歸式之從屬變數之預測值製作ROC曲線，算出AUC值。單回歸及羅吉斯回歸分析係利用R之glm()，ROC解析係利用R套裝之pROC。

2.結果 於使用來自117種IGH中之任意2種變數之多變量羅吉斯回歸分析及ROC分析中，共計6,786組之組合中有30組(0.44%)AUC值顯示0.8以上(表12)。該組合中使用之IGH基因為26種基因(表13)。於使用任意之3種變數之情形時，260,130組中有4,469組(1.7%)AUC值顯示0.8以上，349組(0.13%)AUC值顯示0.85以上，4組(0.0015%)AUC值顯示0.9以上(表12)。又，該等組合中使用之IGH基因分別為117種基因(100%)、102種基因(87%)、及6種基因(5.1%)(表13)。於使用4種變數之情形時，AUC值0.9以上者有3,264組(0.044%)、0.85以上者有99,458組(1.4%)、0.8以上者有489,529組(6.6%)。於使用4種變數之情形時，於顯示AUC 0.8以上之組合中117種基因全部中至少一個得到使用。將能夠活用於ME/CFS疾病之預測鑑別之IGH基因示於表14。關於認為表示較高預測性能之AUC值0.9以上之基因之組合，示於表15及表16。 [表12]

[表13]

[表14-1]

[表14-2]

[表15]

[表16-1]

[表16-2]

[表16-3]

[實施例6] 基於變數之組合的多變量羅吉斯回歸分析 1.方法 使用於單回歸分析中滿足有意義水準P＜0.2之46種變數(35種IGH、8種細胞亞群及3種多樣性指數)，實施基於2種變數、3種變數及4種變數之組合的多變量羅吉斯回歸分析。使用所獲得之回歸式之從屬變數之預測值製作ROC曲線，算出AUC值。單回歸及羅吉斯回歸分析係利用R之glm()，ROC解析係利用R套裝之pROC。

2.結果 於使用來自所挑選之46種變數中之任意2種變數的多變量羅吉斯回歸分析及ROC分析中AUC值為0.8以上者有102組(9.9%)、0.7以上且未達0.8者有382組(36.9%)(表17)。又，於使用3種變數之情形時，AUC值為0.9以上者有85組(0.6%)、0.8以上且未達0.9者有3472組(22.9%)、0.7以上且未達0.8者有8826組(58.1%)。於使用4種變數之情形時，AUC值為0.9以上者有5330組(3.3%)、0.8以上且未達0.9者有63981組(39.2%)、0.7以上且未達0.8者有87291組(53.5%)。認為藉由組合多個變數，ME/CFS疾病之預測性能提高。將2種變數且AUC值顯示0.8以上之組合示於表18、將3種變數且AUC值顯示0.9以上之組合示於表19。與Treg之組合佔優勢，從而推測藉由使用Treg作為變數而進一步提高預測性能。 [表17]

[表18-1]

[表18-2]

[表18-3]

[表18-4]

[表19-1]

[表19-2]

[表19-3]

再者，於細胞亞群變數彼此之組合中，AUC最高值為0.87(Treg、Tfh17)，但於將細胞亞群變數與IGH基因加以組合之情形時，Treg＋IGHV1-3、Treg＋IGHV3-23、Treg＋IGHGP獲得超過0.87之AUC值。又，關於B細胞量，和與Treg組合之情形時最大值AUC＝0.84相較，於與IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26組合之情形時獲得更高之AUC值。藉由對細胞亞群變數聯合使用特定之IGH基因，能夠獲得比由細胞亞群變數彼此之組合可獲得之預測性能更高之預測性能。

[實施例7] ME/CFS疾病患者與其他疾病患者之鑑別 1.方法 於實施例1中實施之37例肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)疾病患者樣本之基礎上，另外再自10例多發性硬化症(MS)患者採集全血。依據實施例1之1.材料與方法中記載之方法，進行PBMC之分離與RNA之提取。繼而，進行互補鏈DNA及雙鏈互補DNA之合成、PCR及新一代定序解析後，藉由庫解析軟體進行解析。根據各樣本之測序讀段資料，確定IGH基因V區序列(IGHV)、D區序列(IGHD)、J區序列(IGHJ)及C區序列(IGHC)之對照與CDR3序列。統計各樣本之獨特測序讀段數量，並對74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ及5種IGHC算出使用頻度。針對測序讀段資料、IGHV、IGHD、IGHJ及IGHC使用頻度，於ME/CFS與MS群間藉由曼-惠特尼法進行有意義差檢定。使用ME/CFS患者與MS患者之使用頻度資料，單回歸及羅吉斯回歸分析係利用R之glm、ROC解析係利用R套裝之pROC。關於ROC解析，使用回歸式之從屬變數之預測值製作接收者操作特徵(ROC)曲線。求出ROC曲線下面積(AUC)值作為該等變數之預測判定之性能評估值。

2.結果 2-1.ME/CFS患者與MS患者間之IGH基因使用頻度之差異 自10例MS患者樣本獲得14萬～28萬測序讀段之序列資料(表20)。關於總測序讀段數量、分配測序讀段、讀框內測序讀段數量及獨特測序讀段數量，於ME/CFS患者與MS患者間未見有意義差。其結果，關於IGHV3-7＊＊、IGHV3-33＊、IGHV3-73＊、IGHV3-NL1＊、IGHV4-28＊、IGHV4-39＊、IGHD4-17＊、IGHD5-5＊及IGHD5-18＊，與ME/CFS患者相比，MS患者於IGH基因使用頻度上顯著較高(曼-惠特尼檢驗：＊P＜0.05、＊＊P＜0.01)。另一方面，關於IGHV3-23＊＊及IGHV3-23D＊，與ME/CFS患者相比，MS患者顯示出顯著較低之使用頻度(圖9)。同樣地，針對作為IGH基因以外之變數的多樣性指數(香農指數、反辛普森指數、皮洛指數、DE50指數)，調查於ME/CFS患者與MS患者間有無差異(圖10)。於ME/CFS患者與MS患者間關於各多樣性指數均未見有意義差。該等結果表明，多樣性指數對於ME/CFS患者與MS患者之鑑別不起作用，另一方面，IGH基因之使用頻度反映疾病特異性而對於鑑別有效。 [表20]

2-2.利用多變量羅吉斯解析之ME/CFS患者與MS患者間之鑑別 其次，針對於ME/CFS患者與MS患者間檢測出有意義差之上述11種IGH基因，利用多變量羅吉斯解析來驗證是否能夠鑑別ME/CFS患者與MS患者。利用11種IGH基因中之任意2種IGH基因、或任意3種IGH基因之使用頻度，進行羅吉斯回歸分析，算出AUC值。將AUC高值之組合作為預測性能優異之IGH基因之組合羅列於下表(表21及表22)。 [表21]

[表22]

藉由多變數羅吉斯解析來調查使用顯示能夠鑑別健康正常人與ME/CFS患者之IGH基因之任意之2種變數及3種變數而是否能夠鑑別ME/CFS患者與MS患者(表23～表30)。其結果，獲得多個表示較高之多變量羅吉斯模型性能之AUC高值之組合，從而可知能夠以較高之特異性與感度預測ME/CFS患者與MS患者。於使用在健康正常人與ME/CFS患者間顯示p＜0.2之有意義差的35種IGH基因之任意之2種變數之情形時，有48個組合顯示AUC≧0.8，於使用任意之3種變數之情形時，有21個組合顯示AUC≧0.9。又，於使用在健康正常人與ME/CFS患者間顯示p＜0.1之有意義差的18種IGH基因之任意之2種變數及3種變數之情形時，分別有17個組合(AUC≧0.8)及21個組合(AUC≧0.875)顯示高值。於使用在健康正常人與ME/CFS患者間顯示p＜0.05之有意義差的8種IGH基因之任意之2種變數及3種變數之情形時，分別有7個組合(AUC≧0.8)及22個組合(AUC≧0.8)顯示高值。於使用實施例3-1中經過試驗之6種IGH基因之任意之2種變數及3種變數之情形時，分別有1個組合(AUC≧0.7)及11個組合(AUC≧0.7)顯示高值。以上結果表明，藉由利用單獨一個或複數個IGH基因使用頻度，能夠高精度地鑑別ME/CFS患者與MS患者。 [表23-1]

[表23-2]

[表24]

[表25]

[表26]

[表27]

[表28]

[表29]

[表30]

2-3.藉由使用任意IGH基因之多變量羅吉斯解析的ME/CFS患者與MS患者間之鑑別 使用來自74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ、5種IGHC之合計117種IGH基因中之任意2種IGH之組合(組合總數6786組)，實施多項羅吉斯解析，挑選表示較高預測性能之AUC高值者(表31)。顯示AUC≧0.9、AUC≧0.8及AUC≧0.7之組合分別有4組、252組及1879組。IGHD3-3與IGHGP之2種變數顯示0.92之最高AUC。其次，使用來自117種IGH基因中之任意3種IGH之組合(組合總數260130組)，實施多項羅吉斯解析，挑選表示較高預測性能之AUC高值者(表32)。 [表31-1]

[表31-2]

[表32-1]

[表32-2]

2-4. ME/CFS患者與非ME/CFS患者之比較 基於調查將ME/CFS患者與非ME/CFS患者進行鑑別之IGH基因之目的，於健康正常人23例中添加10例MS患者而組成非ME/CFS群，與37例ME/CFS患者群針對IGH基因之指標頻度進行比較。根據兩群間之曼-惠特尼檢驗，可知關於IGHV3-49(P＝0.0013)、IGHV3-30-3(P＝0.0022)、IGHD1-26(P＝0.0053)、IGHV4-34(P＝0.0118)、IGHV3-30(P＝0.186)、IGHV4-31(P＝0.0205)、IGHV3-64(P＝0.0286)、IGHJ6(P＝0.0304)及IGHD5-10-1(P＝0.0373)該9種，ME/CFS患者高於非ME/CFS患者。另一方面，關於IGHGP(P＝0.0061)、IGHD3-22(P＝0.0313)、IGHV3-33(P＝0.0332)及IGHV3-73(P＝0.0332)，非ME/CFS患者群顯著較高(表33、圖11)。 [表33]

2-5.藉由使用任意IGH基因之多變量羅吉斯解析的ME/CFS患者與非ME/CFS患者間之鑑別 使用來自74種IGHV、32種IGHD、6種IGHJ、5種IGHC之合計117種IGH基因中之任意之IGH之2種變數(組合總數6786組)，進行多項羅吉斯回歸分析，挑選對ME/CFS患者與非ME/CFS患者間之鑑別表現出較高預測性能之AUC高值者(表34)。又，亦同樣地挑選於使用3種變數(組合總數260130組)之情形時顯示AUC高值之IGH(表35)。於任意之2種變數之情形時，顯示AUC≧0.8及AUC≧0.7之組合分別有5組及469組。於使用任意之3種變數之情形時，顯示AUC≧0.85及AUC≧0.8之組合分別有37組及1164組。於2種變數時，IGHGP與IGH3-30-3之組合顯示最高之AUC＝0.820，於任意之3種變數時，IGHGP與IGHV3-30及IGHV3-49之組合顯示最高之AUC＝0.889。 [表34-1]

[表34-2]

[表35-1]

[表35-2]

3.用於ME/CFS鑑別診斷之預測判別模型 於診斷時，使用由BCR庫解析獲得之IGH基因之使用頻度資料，製作用以鑑別ME/CFS患者之預測模型式。使用兩群間之有意義差檢定或多項羅吉斯解析中之AUC高值之IGH基因之組合，製作基於羅吉斯回歸式之判別模型。於以下示出鑑別診斷之例。

變數之組合可藉由例如以下之方式進行特定。 (1)將健康正常人與ME/CFS患者進行比較，選擇檢測出有意義差之變數(例如BCR之IgGH鏈可變區中之基因之使用頻度)；或 (2)將1個變數(例如BCR之IgGH鏈可變區中之1個基因)設為獨立變數實施單變量羅吉斯解析、或將2個以上之變數(例如2個以上之基因)設為獨立變數實施多變量羅吉斯解析，而獲得羅吉斯回歸模型式。實施測定該回歸模型之適配度之ROC解析，選擇顯示更高AUC值之變數。

於提供變數之組合之情形時，針對各變數(例如基因之頻度資料)(x₁ 、x₂ 、x₃ 、…)，將作為ME/CFS患者之(y＝1)或作為健康正常人之(y＝0)設為目標變數進行單變量或多變量羅吉斯回歸分析。於(2)之情形時，使用複數個變數，以大循環進行羅吉斯解析。

於羅吉斯回歸分析時，可利用作為R套裝之一般化線形模型用函數的glm，但分析並不限定於該套裝。於羅吉斯回歸分析中，將ME/CFS之機率設為π而獲得以下之羅吉斯模型式，同時求出b0之常數及相當於b1～bp之偏回歸係數。即，使用患者/健康正常人區分與變數(基因頻度等)之資料集，可確定羅吉斯模型式之係數。 [數1]

關於為ME/CFS之機率π，若確定常數及偏回歸係數，則可藉由下式求出。於新獲得頻度資料之情形時，輸入該值，藉此可進行判別預測(將0.5以上判別預測為ME/CFS等)。 [數2]

若為兩步，則能夠實現如下預測方法，即利用區別ME/CFS與健康正常人之判別式來預測ME/CFS，進而利用區別ME/CFS與MS之判別式來排除MS患者。藉由向基本上與上文相同之羅吉斯模型式中輸入頻度資料，可預測其機率。

3-1.一步預測模型 藉由1個判別式來預測ME/CFS與非ME/CFS(健康正常人及MS患者)。藉由下述任一例、或其他預測變數之組合以一步來進行判別。 [數3]

3-2.兩步預測模型 藉由判別式1對ME/CFS與自健康正常人作出判別，其次藉由判別式2排除MS等其他疾病患者，藉此預測ME/CFS患者。藉由下述任一例、或其他預測變數之組合分兩步進行判別。 1)ME/CFS患者與健康正常人之判別(判別式1) [數4]

2)自ME/CFS患者排除其他疾病(MS患者)之排除判別(判別式2) [數5]

(備註) 如上所述，使用本揭示之較佳實施形態例示了本揭示，但理解到本揭示應僅藉由申請專利範圍來解釋其範圍。理解到本說明書中所引用之專利、專利申請案及文獻應與在本說明書中具體地記載有其內容本身同樣地，將其內容作為對於本說明書之參考引用。

(相關申請) 本申請案係主張2018年8月22日提出申請之日本專利特願2018-155380號及2019年3月12日提出申請之日本專利特願2019-44885號之優先權。本說明書中出於所有目的以參考之形式援用該等申請案之全體內容。 [產業上之可利用性]

本揭示可用於肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之診斷、診斷藥。 [序列表非關鍵文字]

序列編號1：BSL18E引子 序列編號2：P20EA引子 序列編號3：P10EA引子 序列編號4：CG1引子 序列編號5：CG2引子 序列編號6：P22EΑ-ST1-R引子 序列編號7：CG-ST1-R引子

[圖1]圖1係表示由ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本獲得之BCR之各IGHV基因(IGHV家族)之使用頻度之比較之結果之圖。縱軸為各基因之使用頻度(%)，誤差工形線(bar)表示標準誤差。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖2]圖2係表示由ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本獲得之BCR之各IGHD及IGHJ家族之使用頻度之比較之結果之圖。縱軸為各基因之使用頻度(%)，誤差工形線表示標準誤差。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖3A]圖3A係ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本之所記載之IGHV基因之使用頻度之點陣圖。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖3B]圖3B係ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本之所記載之IGHD及IGHJ基因之使用頻度之點陣圖。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖4]圖4係ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本之所記載之B細胞群之量之點陣圖。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖5]圖5係ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本之控制性T細胞群之量之點陣圖。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖6]圖6係ME/CFS疾病患者及健康正常人對照者樣本之所記載之T細胞群之量之點陣圖。HC：健康正常人對照者、ME/CFS：ME/CFS疾病患者。 [圖7]圖7係表示使用IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6之使用頻度、與B細胞量(%)作為變數之情形時藉由回歸分析獲得之ROC曲線之圖。 [圖8]圖8係表示使用IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6之使用頻度、與Treg量(%)作為變數之情形時藉由回歸分析獲得之ROC曲線之圖。 [圖9]圖9係表示ME/CFS患者(n＝37)與MS患者(n＝10)間之IGH基因使用頻度之差異之圖。ME/CFS：ME/CFS疾病患者、MS：MS疾病患者。 [圖10]圖10係表示ME/CFS患者(n＝37)與MS患者(n＝10)間之多樣性指數之差異之圖。ME/CFS：ME/CFS疾病患者、MS：MS疾病患者。ME/CFS患者(n＝37)與MS患者(n＝10)間關於各多樣性指數均未檢測出有意義差。 [圖11]圖11係表示ME/CFS患者(n＝37)與非ME/CFS患者(n＝33)之IGH基因使用頻度之差異之圖。ME/CFS：ME/CFS疾病患者、non-ME/CFS：健康正常對照＋MS疾病患者。

Claims (43)

1. 一種以B細胞受體(BCR)庫作為肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標之方法，其係以對象中之B細胞受體(BCR)庫作為該對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標。
2. 如請求項1之方法，其以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為該對象中之肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)之指標。
3. 如請求項2之方法，其中進而上述1個以上之變數為上述對象罹患ME/CFS而非其他疾病之指標。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4及IGHGP所組成之群中之至少一個基因。
5. 如請求項4之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV3-73、IGHV1-69-2、IGHV5-51、IGHV4-31、IGHV3-23D、IGHV1/OR15-9、IGHV4-39、IGHD5-12、IGHV3-43D、IGHD4-17、IGHV5-10-1、IGHD4/OR15-4a/b、IGHG4、IGHV1/OR15-5、IGHV3/OR16-9、IGHD1-7、IGHV3-21、IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。
6. 如請求項5之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHD6-6、IGHV3-33、IGHD4-23、IGHV3-30-5、IGHV3-23、IGHD6-13、IGHV3-64D、IGHV3-48、IGHV3-64、IGHG1、IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。
7. 如請求項6之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHJ6、IGHV3-30、IGHGP、IGHV1-3及IGHD3-22所組成之群中之至少一個基因。
8. 如請求項7之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6所組成之群中之至少一個基因。
9. 如請求項2之方法，其中上述1個以上之變數進而包含1個以上之免疫細胞亞群量。
10. 如請求項9之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。
11. 如請求項10之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。
12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中上述免疫細胞亞群量選自B細胞之量、初始B細胞之量、記憶B細胞之量、漿母細胞之量、活化初始B細胞之量、移行B細胞之量、控制性T細胞之量、記憶T細胞之量、濾泡輔助T細胞之量、Tfh1細胞之量、Tfh2細胞之量、Tfh17細胞之量、Th1細胞之量、Th2細胞之量及Th17細胞之量之中。
13. 如請求項2之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因之使用頻度。
14. 如請求項13之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。
15. 如請求項14之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。
16. 如請求項15之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。
17. 如請求項2之方法，其中上述1個以上之變數包含選自由上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度、上述對象中之BCR多樣性指數、及上述對象中之1個以上之免疫細胞亞群量所組成之群中之2個以上之變數之組合，且該1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。
18. 如請求項17之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之3個以上之變數。
19. 如請求項18之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之4個以上之變數。
20. 如請求項19之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之5個以上之變數。
21. 如請求項20之方法，其中上述1個以上之變數包含選自上述群中之6個以上之變數。
22. 如請求項17至21中任一項之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。
23. 如請求項17至22中任一項之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別正常對照與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。
24. 如請求項2之方法，其中上述1個以上之基因包含IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-49、IGHD1-26及IGHJ6。
25. 如請求項2至24中任一項之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之B細胞之量。
26. 如請求項2至25中任一項之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之控制性T細胞(Treg)之量。
27. 如請求項2至26中任一項之方法，其中上述1個以上之基因之使用頻度係藉由包含大規模高效率BCR庫解析之方法所確定。
28. 如請求項2至27中任一項之方法，其中上述1個以上之變數包含選自由IGHV3-49、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-30、IGHJ6、IGHGP、IGHV4-31、IGHV3-64、IGHD3-22、IGHV3-33、IGHV3-73、IGHV5-10-1及IGHV4-34所組成之群中之至少一個基因之使用頻度。
29. 如請求項1至27中任一項之方法，其包括： (a)將上述1個以上之變數中之一部分設為上述對象中之ME/CFS之指標；及 (b)將上述1個以上之變數中之一部分設為上述對象為ME/CFS而非其他疾病之指標。
30. 如請求項29之方法，其中針對複數種其他疾病進行複數次(b)。
31. 如請求項29或28之方法，其中上述其他疾病包含多發性硬化症(MS)。
32. 一種以1個以上之變數作為罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)而非多發性硬化症(MS)之指標之方法，其係以包含對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之1個以上之基因之使用頻度的1個以上之變數作為該對象罹患肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞症候群(ME/CFS)而非多發性硬化症(MS)之指標。
33. 如請求項32之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-38-4、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV2/OR16-5、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-25、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-NL1、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV4-4、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV7-81、IGHD1-1、IGHD1-7、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、IGHD1/OR15-1a/b、IGHD2-2、IGHD2-8、IGHD2-15、IGHD2-21、IGHD2/OR15-2a/b、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHD3-10、IGHD3-16、IGHD3-22、IGHD3/OR15-3a/b、IGHD4-4、IGHD4-11、IGHD4-17、IGHD4-23、IGHD4/OR15-4a/b、IGHD5-5、IGHD5-12、IGHD5-18、IGHD5-24、IGHD5/OR15-5a/b、IGHD6-6、IGHD6-13、IGHD6-19、IGHD6-25、IGHD7-27、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4及IGHGP所組成之群中之至少一個基因。
34. 如請求項32或33之方法，其中上述1個以上之基因包含選自由IGHV1-3、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHD1-26、IGHV3-49及IGHJ6所組成之群中之至少一個基因。
35. 如請求項32之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之2個以上之基因之使用頻度。
36. 如請求項35之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。
37. 如請求項36之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。
38. 如請求項37之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。
39. 如請求項32之方法，其中上述1個以上之變數包含上述對象中之BCR之IgGH鏈可變區中之3個以上之基因之使用頻度。
40. 如請求項39之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.7。
41. 如請求項40之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.8。
42. 如請求項41之方法，其中上述1個以上之變數於藉由用以判別MS與ME/CFS之回歸分析獲得之ROC曲線中顯示AUC≧0.9。
43. 如請求項31之方法，其中上述(b)係藉由如請求項32至42中任一項之方法進行。

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