CN113238061B - 以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用 - Google Patents
以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113238061B CN113238061B CN202110777321.2A CN202110777321A CN113238061B CN 113238061 B CN113238061 B CN 113238061B CN 202110777321 A CN202110777321 A CN 202110777321A CN 113238061 B CN113238061 B CN 113238061B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- centrifuge tube
- negative
- cells
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 title abstract description 52
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims description 4
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 abstract description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 abstract description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 3
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 101001018028 Homo sapiens Lymphocyte antigen 86 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100033485 Lymphocyte antigen 86 Human genes 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010006444 Leucine-Rich Repeat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000002567 electromyography Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- ALWKGYPQUAPLQC-UHFFFAOYSA-N neostigmine Chemical compound CN(C)C(=O)OC1=CC=CC([N+](C)(C)C)=C1 ALWKGYPQUAPLQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002362 neostigmine Drugs 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 208000013315 neuromuscular junction disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/686—Anti-idiotype
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用，该试剂盒包括如下抗体：明亮蓝色515标记的抗人CD19抗体、藻红蛋白标记的抗人CD180抗体和藻红蛋白‑花青素7标记的抗人IgG抗体；该试剂盒用于抗AChR抗体分泌活动的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用。
背景技术
重症肌无力是由抗体介导的，T细胞、B细胞过度激活导致神经肌肉接头障碍，而出现的一类自身免疫性疾病，表现为波动性骨骼肌肌肉无力，易疲劳。在目前临床实践中，重症肌无力的诊断主要依靠临床医师对症状、体征的判断、肌电图、新斯的明实验以及自身抗体的检查。研究表明抗AChR抗体是导致重症肌无力的主要自身抗体之一，但是外周血清中抗AChR抗体的滴度往往与患者的临床严重程度不相关。目前仍缺乏反映重症肌无力自身抗体分泌活动及疾病严重程度的生物学标志物。B细胞在重症肌无力的发病中起着关键作用，B细胞最终生成了攻击神经肌肉接头的自身抗体。因此，B细胞相关的标志物可能可以反映自身抗体的分泌活动及疾病的严重程度。
流式细胞术可以高速分析上万个细胞，并从同一个细胞测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点。流式细胞术在常规临床实验室中越来越多地用于疾病的诊断、预后和监测。如流式细胞术用于血液肿瘤患者诊断和分期，用于检测白细胞的功能异常等等。因此，进行流式细胞术分析，寻找重症肌无力的生物学标志物，具有重要的临床意义。
CD180是一种Toll样蛋白，通常与MD-1结合成二聚体，CD180/MD-1二聚体主要表达与B细胞、DC细胞和巨噬细胞表面。CD180的胞外部分含有Toll样蛋白典型的富亮氨酸重复域LRR，却没有Toll样蛋白通常的胞内结构。
研究表明，在不同的细胞上，CD180功能不同，巨噬细胞或DC细胞中，CD180能抑制TLR4通路活化，CD180敲除小鼠对LPS的炎症反应更强，产生更多的炎性因子。而在B细胞中，CD180的作用似乎是相反的，敲除CD180明显抑制TLR4通路活化对B细胞增殖及活化的促进作用。除了与TLR4关系密切，激活CD180通路本身能促进B细胞增殖及CD86的表达。此外，动物实验表明，敲除CD180后，老鼠的抗体分泌减少，因此，CD180与B细胞的激活和抗体分泌有关，其异常表达可能参与了免疫性疾病的发生与发展。然而，CD180在重症肌无力疾病中的表达情况目前还没有研究报道，其与自身抗体的关系仍旧未知。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用，以弥补现有生物标志物的不足，通过检测生物标志物的水平，可以判断患者重症肌无力病情的严重程度及抗体分泌活动，从而为指示重症肌无力病情和抗体分泌活动的提供一种新的手段。
为解决上述的技术问题，本发明采用的第一种技术方案是：
一种试剂盒，包括如下抗体：明亮蓝色515标记的抗人CD19抗体、藻红蛋白标记的抗人CD180抗体和藻红蛋白-花青素7标记的抗人IgG抗体。
进一步的技术方案是，还包括用于处理样本的试剂，所述试剂包括PBS、固定液和透化液。
本发明采用的第二种技术方案是：
一种试剂盒的应用，包括上述试剂盒，将所述试剂盒用于抗AChR抗体分泌活动的检测。
本发明采用的第三种技术方案是：
一种检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，包括如下步骤：
S201、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；
S202、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；
S203、取第三离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第三离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；
S204、将第三离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；
S205、吸取第三离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第四离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；
S206、将第四离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第四离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；
S207、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后加入250μl固定液的试剂固定细胞，在4℃下孵育20min，然后用1ml的透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min；
S208、向离心5min的溶液中加入anti-IgG抗体，并在4℃避光孵育30min，然后用1ml透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min，最后重悬于300μl的PBS再流式上机。
更进一步的技术方案是，S101中-80℃的环境由冰箱提供，用于存储血浆样本。
更进一步的技术方案是，所述第一离心管和第二离心管的容积均为15ml。
本发明采用的第四种技术方案是：
一种用于评估重症肌无力免疫抑制剂药物治疗效果的方法，包括如下步骤：
S301、收集患有重症肌无力的受试者提供第一样本，同时收集患者重症肌无力的定量评分信息；
S302、使用梯度离心法从第一样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第一CD180阴性群；
S303、收集服用免疫抑制剂药物的受试者的第二样本，使用梯度离心法从第二样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第二CD180阴性群；
S304、将第一CD180阴性群、第二CD180阴性群结合重症肌无力的定量评分信息进行比较，评估此重症肌无力患者的治疗效果。
与现有技术相比，本发明至少具有以下的有益效果之一：
1、采用本试剂盒可以对CD180阴性B细胞进行筛查，重症肌无力患者病情的病情严重程度进行判断以及对抗AChR抗体分泌活动的检测；
2、将CD180阴性B细胞作为重症肌无力的生物标志物，可以对重症肌无力的判断、评估重症肌无力的严重程度、对重症肌无力的疗效以及抗体分泌活动提供重要指标。
附图说明
图1为本发明中CD180阴性B细胞在60例重症肌无力患者及15例健康对照示意图。
图2（a）为本发明中重症肌无力患者CD180阴性B细胞与QMG评分相关性的示意图。
图2（b）为本发明中重症肌无力患者CD180阴性B细胞与分泌的抗AChR抗体相关性的示意图。
图3（a）为本发明中正常人的CD180阴性B细胞与CD180阳性B细胞分泌IgG的示意图。
图3（b）为本发明中重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与CD180阳性B细胞分泌IgG的示意图。
图4（a）为本发明中重症肌无力患者经过治疗前后CD180阴性B细胞的比例变化示意图。
图4（b）为本发明中重症肌无力患者经过治疗前后CD180阴性B细胞QMG评分变化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1-4示出了本发明以CD180阴性B细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用的实施例。
实施例1：
本实施例提供一种试剂盒，包括如下抗体：明亮蓝色515标记的抗人CD19抗体、藻红蛋白标记的抗人CD180抗体和藻红蛋白-花青素7标记的抗人IgG抗体。后续染色推荐各加入2ul与细胞孵育。其中CD19抗体用于确定B细胞群，CD180抗体为此试剂盒的核心生物学标志物，IgG抗体用于观察细胞内的免疫球蛋白的分泌状态。
还包括用于处理样本的试剂，所述试剂包括PBS、固定液和透化液。
其中试剂盒配套有使用说明书，以便于医护人员知晓如何使用。
实施例2：
在前述实施例1的基础上，本实施例提供一种试剂盒的应用，将所述试剂盒用于CD180阴性B细胞的筛查，和/或，重症肌无力患者病情的指示，和/或，抗AChR抗体分泌活动的检测。
其中，重症肌无力患者病情的指示为利用试剂盒评估受试者重症肌无力的病情严重程度。
实施例3：
本实施例提供一种检测CD180阴性B细胞的方法，包括如下步骤：
S101、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml ，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；
S102、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；
S103、取第一离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第一离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；
S104、将第一离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；
S105、吸取第一离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第二离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；
S106、将第二离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第二离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；
S107、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后重悬于300μl的PBS中，最后进行流式上机。
流式细胞术具有每秒测量数百至数千个细胞的优势，所获得的信息既是定性的，也是定量的。流式细胞术用于对各种标本进行免疫表型分析，包括全血、骨髓、浆液、脑脊液、尿液和实体组织等等。可以测量的特征包括细胞大小（由前向角光散射表示）、细胞质复杂性（由直角散射表示）、 DNA 或 RNA 含量，以及大范围的膜结合和细胞内蛋白质。过去流式细胞仪只能在大型学术中心使用，流式细胞术在常规临床实验室中越来越多地用于疾病的诊断、预后和监测。该方法允许快速对每个外周血的单个核细胞包括B细胞的CD180表达水平进行可视化，对同一样本的测量具有高重复性和高准确的特点。
其中，S101中-80℃的环境由冰箱提供。第一离心管和第二离心管的容积均为15ml。
实施例4：
本实施例提供一种检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，包括如下步骤：
S201、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml ，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；
S202、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；
S203、取第三离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第三离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；
S204、将第三离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；
S205、吸取第三离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第四离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；
S206、将第四离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第四离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；
S207、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后加入250μl固定液的试剂固定细胞，在4℃下孵育20min，然后用1ml的透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min；
S208、向离心5min的溶液中加入anti-IgG抗体，并在4℃避光孵育30min，然后用1ml透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min，最后重悬与300μl的PBS再流式上机。
该方法的优势在于它可以通过同时表征CD180阳性B细胞和CD180阴性B细胞中IgG的表达来评估免疫球蛋白的分泌情况。
其中，S201中-80℃的环境由冰箱提供。第三离心管和第四离心管的容积均为15ml。
实施例5：
本实施例提供一种CD180阴性B细胞的应用，将其作为重症肌无力的生物标志物。
实施例6：
本实施例提供一种用于评估重症肌无力免疫抑制剂药物治疗效果的方法，包括如下步骤：
S301、收集患有重症肌无力的受试者提供第一样本，同时收集患者重症肌无力的定量评分信息；
S302、使用梯度离心法从第一样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第一CD180阴性群；
S303、收集服用免疫抑制剂药物的受试者的第二样本，使用梯度离心法从第二样本中获取外周血单个核细胞，并进行流式染色，得到第二CD180阴性群；
S304、将第一CD180阴性群、第二CD180阴性群结合重症肌无力的定量评分信息进行比较，评估此重症肌无力患者的治疗效果。
该方法的优势在于可以获得疗效相关的生物学指标，指导临床用药。
本发明中，已检测了CD180阴性B细胞在60例重症肌无力患者及15例健康对照中的表达，如图1，CD180阴性B细胞在重症肌无力中表达升高，与对照组相比，p=0.0041，具有明显统计学意义。
同时CD180阴性B细胞群也与重症肌无力患者分泌的抗AChR抗体及患者病情程度呈正向相关性（如图2（a）和图2（b）所示）。说明CD180阴性B细胞可以反映重症肌无力患者抗AChR抗体的分泌情况和疾病的严重程度。图2（a）说明重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与QMG评分是相关的，具有统计学意义。即说明CD180阴性B细胞与重症肌无力患者严重程度相关。图2（b）说明重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与抗AChR抗体是相关的，具有统计学意义。即说明CD180阴性B细胞与重症肌无力患者分泌的致病抗AChR抗体相关。
进一步检测CD180阴性B细胞抗体分泌发现，重症肌无力患者的CD180阴性B细胞与CD180阳性B细胞分泌抗体存在明显差异，并且是CD180阴性B细胞主要的分泌IgG抗体的细胞（如图3（a）和图3（b）所示）。说明CD180阴性B细胞可以反映IgG抗体的分泌活动。
此外，重症肌无力患者经过治疗后，CD180阴性B细胞比例下降。说明CD180阴性B细胞可以反映重症肌无力患者治疗疗效（如图4（a）和图4（b）所示）。
综上所述，本发明的试剂盒通过流式细胞术，表明CD180阴性B细胞可以作为重症肌无力诊断、评估疾病的严重程度、评估疗效、抗体分泌活动的重要指标。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
Claims (3)
1.一种检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，其特征在于包括如下步骤：
S201、利用EDTA紫管抽取新鲜外周血5ml，在600g下离心10min后取上层血浆，分装于-80℃的环境中暂存；
S202、向分装的血浆中加入等体积的1×PBS，用巴氏管吹打混合均匀，形成PBS稀释的血液标本；
S203、取第三离心管向其中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第三离心管，向其中加入前述PBS稀释的血液标本；
S204、将第三离心管放置于离心机上，以快升慢降的方式在800g下离心20min；
S205、吸取第三离心管中离心后的白雾层PBMC，并将其转移至第四离心管中，然后用10ml 1×PBS洗涤2次；
S206、将第四离心管中的PBMC重悬于100μl的PBS中，然后向第四离心管中加入anti-CD180抗体和anti-CD19抗体在4℃避光的条件下孵育30min；
S207、将孵育30min后的溶液用PBS洗两遍后加入250μl固定液的试剂固定细胞，在4℃下孵育20min，然后用1ml的透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min；
S208、向离心5min的溶液中加入anti-IgG抗体，并在4℃避光孵育30min，然后用1ml透化液洗2次，再在室温下以350g的条件离心5min，最后重悬于300μl的PBS再流式上机。
2.根据权利要求1所述的检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，其特征在于：S201中-80℃的环境由冰箱提供，用于存储血浆样本。
3.根据权利要求1或2所述的检测CD180阴性B细胞抗体分泌功能的方法，其特征在于：所述第三离心管和第四离心管的容积均为15ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110777321.2A CN113238061B (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110777321.2A CN113238061B (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113238061A CN113238061A (zh) | 2021-08-10 |
| CN113238061B true CN113238061B (zh) | 2021-10-01 |
Family
ID=77135270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110777321.2A Active CN113238061B (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113238061B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998018921A1 (en) * | 1996-10-25 | 1998-05-07 | Human Genome Sciences, Inc. | NEUTROKINE $g(a) |
| CN1529617A (zh) * | 2001-01-09 | 2004-09-15 | ��������ͨ���о�Ժ | 受试者的自身免疫疾病的治疗方法及其体外诊断测定 |
| WO2008156494A1 (en) * | 2006-11-03 | 2008-12-24 | The Johns Hopkins University | Use of high-dose oxazaphosphorine drugs in combination with monoclonal antibodies for treating immune disorders |
| CN102046660A (zh) * | 2008-03-26 | 2011-05-04 | 塞勒兰特治疗公司 | 骨髓性血液学增殖性病症相关的免疫球蛋白和/或toll样受体蛋白及其用途 |
| CN102174108A (zh) * | 2002-03-01 | 2011-09-07 | 免疫医疗公司 | 内在化抗-cd74抗体和使用方法 |
| AU2017202426A1 (en) * | 2008-11-10 | 2017-05-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating complement-associated disorders |
| CN107209187A (zh) * | 2014-07-11 | 2017-09-26 | 国立健康与医学研究所 | 用于诊断血液癌症的方法 |
| CN108602872A (zh) * | 2015-10-30 | 2018-09-28 | 艾丽塔生物治疗剂公司 | 用于治疗癌症的组合物和方法 |
| CN112840033A (zh) * | 2018-08-22 | 2021-05-25 | 国立研究开发法人国立精神·神经医疗研究中心 | 肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合症（me/cfs）的生物标志物 |
-
2021
- 2021-07-09 CN CN202110777321.2A patent/CN113238061B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998018921A1 (en) * | 1996-10-25 | 1998-05-07 | Human Genome Sciences, Inc. | NEUTROKINE $g(a) |
| CN1529617A (zh) * | 2001-01-09 | 2004-09-15 | ��������ͨ���о�Ժ | 受试者的自身免疫疾病的治疗方法及其体外诊断测定 |
| CN102174108A (zh) * | 2002-03-01 | 2011-09-07 | 免疫医疗公司 | 内在化抗-cd74抗体和使用方法 |
| WO2008156494A1 (en) * | 2006-11-03 | 2008-12-24 | The Johns Hopkins University | Use of high-dose oxazaphosphorine drugs in combination with monoclonal antibodies for treating immune disorders |
| CN102046660A (zh) * | 2008-03-26 | 2011-05-04 | 塞勒兰特治疗公司 | 骨髓性血液学增殖性病症相关的免疫球蛋白和/或toll样受体蛋白及其用途 |
| AU2017202426A1 (en) * | 2008-11-10 | 2017-05-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating complement-associated disorders |
| CN107209187A (zh) * | 2014-07-11 | 2017-09-26 | 国立健康与医学研究所 | 用于诊断血液癌症的方法 |
| CN108602872A (zh) * | 2015-10-30 | 2018-09-28 | 艾丽塔生物治疗剂公司 | 用于治疗癌症的组合物和方法 |
| CN112840033A (zh) * | 2018-08-22 | 2021-05-25 | 国立研究开发法人国立精神·神经医疗研究中心 | 肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合症（me/cfs）的生物标志物 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Human CD180 Transmits Signals via the PIM-1L Kinase;Nicole Egli et al;《pone》;20151110;摘要 * |
| Ｔfｈ细胞在重症肌无力患者胸腺中的表达及作用机制;张晓燕 等;《中国神经免疫学和神经病学杂质》;20150930;第22卷(第5期);第1.3节 * |
| 黄芪升麻柴胡治疗实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的量效关系及免疫学机制研究;何骁隽 等;《中国免疫学杂志》;20181231;第1.2节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113238061A (zh) | 2021-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Illingworth et al. | ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI‐deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 3–data analysis, reporting and case studies | |
| Pengo et al. | Survey of lupus anticoagulant diagnosis by central evaluation of positive plasma samples | |
| US20210285966A1 (en) | Diagnostic methods for liver disorders | |
| Favaloro | Appropriate laboratory assessment as a critical facet in the proper diagnosis and classification of von Willebrand disorder | |
| NO178647B (no) | Fremgangsmåte for gravimetrisk analyse av blod og test-sett for denne | |
| CN113238061B (zh) | 以cd180阴性b细胞指示重症肌无力病情的试剂盒及应用 | |
| CN109752548B (zh) | 评估慢性淋巴细胞白血病预后的组合试剂及系统 | |
| CN106568977A (zh) | 血清中sIL‑7R在诊断系统性红斑狼疮肾炎中的应用 | |
| AU2011215826B2 (en) | Compositions and methods for predicting cardiovascular events | |
| US20200209242A1 (en) | Cancer diagnosis using ki-67 | |
| JP6436777B2 (ja) | 精神関連疾患の検査方法および検査キット | |
| CN108931517A (zh) | 白介素31在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用 | |
| WO2023121197A1 (ko) | 면역 노화 평가용 조성물 및 키트 | |
| KR102621473B1 (ko) | 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물 | |
| Yang et al. | Performance verification of a new domestic chemiluminescence detection system | |
| Miettinen et al. | Clinical Diagnostics of Fecal Calprotectin: a Comparative Study of Actim® Calprotectin and LIAISON® Calprotectin. | |
| KR102576597B1 (ko) | 면역 노화 평가용 조성물 및 키트 | |
| CN114691947A (zh) | 类风湿性关节炎的潜在免疫分子及信号通路的筛选方法 | |
| CN107643283A (zh) | 干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用 | |
| Liu et al. | Approaches for Performance Verification Toward Standardization of Peripheral Blood Regulatory T-Cell Detection by Flow Cytometry | |
| Al-Hasan et al. | CD69 AS AN EVALUATING MARKER FOR SLE DISEASE ACTIVITY. | |
| RU2574968C1 (ru) | Способ лабораторной диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии | |
| CN114280290A (zh) | 一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒及其应用 | |
| CN115197322A (zh) | 用于慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶检测的抗体组合物及其应用 | |
| Corcuff et al. | Do intrinsic factor antibodies assays provide univocal answers in Biermer's disease? |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |