CN107209187A

CN107209187A - 用于诊断血液癌症的方法

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Publication number: CN107209187A
Application number: CN201580037526.XA
Authority: CN
Inventors: 马丁·维拉尔巴·冈萨雷斯; 埃韦利纳·克兹文斯卡
Original assignee: Montpelier University Medical Center; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Montpelier University Medical Center; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM; Universite de Montpellier
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: EP3167288B1; JP2017526938A; JP6805137B2; CA2954562C; EP3167288A1; US20210278409A1; CA2954562A1; CN107209187B; WO2016005548A1; US20180052166A1; US10969391B2

Abstract

本发明涉及一种用于诊断血液癌症的方法。具体地，本发明涉及一种用于诊断患者中的血液癌症的方法，所述方法包括：i)检测由所述患者获得的样品中的CD45RARO NK细胞的存在，以及ii)在所述样品中检测到CD45RARO NK细胞的存在并且至少一种表型标志物的存在表明血液癌症的性质的情况下，推断患者患有血液癌症。

Description

用于诊断血液癌症的方法

技术领域

本发明涉及一种诊断血液癌症的方法。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞谱系的成员且属于固有免疫系统。它们显示出天然细胞毒性并产生细胞因子^1,2。大多数外周血中的人NK细胞是CD3^-CD56^暗细胞，少数显示CD3^-CD56^亮表型。后一群体擅长产生细胞因子，而CD56^暗细胞主要显示细胞毒性活性³。与此相反，CD3^-CD56^亮细胞在淋巴结和扁桃体中占多数。体外证据表明CD56^亮细胞是CD56^暗细胞的前体，在体内也是这种情况⁴。此外，CD16表达暗示NK细胞发育遵循此路径：CD56^亮CD16^-→CD56^亮CD16^暗→CD56^暗CD16^暗→CD56^暗CD16⁺。额外的标志物可以鉴定这些群体中的其他的亚类^5,6。相比之下，活化NK细胞的体内鉴定更加困难。虽然CD69长期表达是未知的，但CD69表达在NK细胞刺激后增加，并且被认为是包括人类在内的活化的真正标志物⁷。在小鼠中，长期刺激后CD69的稳定表达存在争议：鼠CMV感染后CD69表达是瞬时的⁸，而IL-15处理后是CD69表达是稳定的⁹。

NK细胞在遇到它们的靶标后被活化，所述靶标主要是主要组织相容性复合物I(MHC-I)的表达改变的细胞，上述细胞包括转化的细胞或病毒感染的细胞(其下调MHC-I表达以逃避细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的识别)。“丧失自我(missing self)”假说提出NK细胞基于MHC-I表达区分靶细胞与其他健康的“自身”细胞。NK细胞活化取决于由活化和抑制性受体介导的复杂信号机制。主要的NK细胞抑制性受体识别MHC-I(在人类中称为HLA)复合物，且包括识别HLA-E的NKG2A和识别自身经典I类分子HLA-A、HLA-B和HLA-C的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。活化NK细胞的受体感知细胞上的应激和/或非自身配体，即通过激活受体NKG2D来识别应激诱导的配体UL16结合蛋白(ULBP)和MHC I类多肽相关序列(MIC)²。

NK细胞识别并消除血源性癌细胞。然而，这些肿瘤细胞发现了不同的免疫逃避机制^10,11，并且显著数量的这类患者显示出有限的长期存活。治疗这些患者的一些选择包括可以与免疫治疗相关的新化学物质¹²。最近发表了使用抗KIR的首次临床试验，其中抗KIR能阻断KIR介导的对NK细胞的抑制⁷。与可比较的急性骨髓性白血病(AML)患者群体的报道相比，其显示出没有毒性、总体有利且无复发存活的特点。该治疗的一个令人关注的替代方法是使用同种异体NK细胞，这是因为已证明同种异体NK细胞临床级产品是有效的¹³且造血细胞移植后NK细胞介导的治疗似乎是安全的^14-16。然而，NK细胞不是同质群体，有保持不同生理活性的不同亚类。此外，NK细胞的不同活化模式(例如细胞因子vs靶细胞)源自不同的转录模式¹⁷。鉴定具有较高抗肿瘤活性的群体并选择它们进行扩增和/或患者输注将是令人关注的。

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)调节细胞过程，包括分化，有丝分裂周期，细胞生长和致癌转化¹⁸。CD45是由PTPRC基因编码的PTP，其在造血细胞中特异性表达¹⁹。CD45通过与受体复合物的组分直接相互作用，或通过去磷酸化和活化各种Src家族激酶(SFK)(即Lck)，来调节受体信号传导²⁰。但是它可以通过抑制JAK激酶²¹或通过使Src的活化残基去磷酸化²⁰来抑制细胞因子受体信号传导。CD45活性对于有效的免疫应答是关键的，因为CD45缺陷在小鼠^22-24和人^25,26中均导致重症综合性免疫缺陷(SCID)表型。这可以解释这种磷酸酶的高表达及其复杂的调节。

CD45表达随细胞成熟而增加²⁷。CD45家族包括衍生自单个复杂基因的几个成员²⁷。初始T淋巴细胞对于长CD45RA同种型通常是阳性的。通过CD45mRNA前体进行活化诱导的选择性剪切，活化和记忆T细胞表达CD45RO(最短的CD45同种型)^27-30。已经提出CD45RO表达也识别记忆NK细胞³¹。

大多数关于CD45功能的研究已在T细胞中进行。但关于其对NK细胞的功能了解甚少，尽管通常认为CD45通过其使SFK的抑制位点去磷酸化的能力正调节这些细胞的活化，导致细胞因子和趋化因子产生。然而，在来自CD45缺陷小鼠的NK细胞中，体外细胞毒性仅轻微受损^32-34。此外，与T细胞和B细胞相比，CD45缺陷型NK细胞显示多种磷酸化蛋白的基础磷酸化增加，这表明CD45使NK细胞中包括SFK的活化酪氨酸残基的多种底物去磷酸化³⁴。体内研究显示由于所有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)依赖的NK细胞功能(包括脱粒)受损，CD45缺陷的NK细胞无法保护小鼠免受巨细胞病毒感染³⁵。以上引用的结果大多数是从小鼠模型中获得的，并不能反映人类概况。因此，取决于活化的类型和强度，CD45在人类NK细胞中的作用是一个开放的问题。

发明内容

本发明涉及一种用于诊断血液癌症的方法。具体地，本发明通过权利要求来限定。

NK细胞淋巴细胞谱系在抗肿瘤免疫应答中起重要的作用。完全成熟的CD56^暗CD16⁺群体对该功能显示出可靠的较高细胞溶解活性，但对负责它的细胞知之甚少。淋巴细胞谱系的主要标志物之一是磷酸酶CD45，磷酸酶CD45在T淋巴细胞中以两种主要同种型存在，其中静息T细胞中表达大CD45RA同种型，而效应/记忆T细胞中表达短CD45RO同种型。在本文中，发明人表明来自健康供体的NK细胞主要是CD45RA^高RO^-，而它们中的3％是CD45RA^暗RO^-，CD45RA^暗RO^-在HSC同种异体移植患者中丰富10倍且主要对应于未成熟细胞。血液癌症患者的这一群体也示出5倍增加，在他们完全成熟的NK细胞区室中也发现了这一群体。但是这些细胞未显示高脱粒活性。来自这些患者的一些NK细胞获得CD45RO表达，产生少数属于CD56^暗CD16^暗区室的CD45RA^暗RO细胞，并产生了大多数不丢失CD45RA表达的细胞CD45RARO细胞。该群体属于完全成熟的区室并代表了抗肿瘤NK细胞。这是基于以下事实，即CD45RARO细胞：i)最近脱粒了；ii)显示大的尺寸(FS)和粒度(SS)；iii)显示高代谢(CD71⁺)；和iv)是增殖的(Ki-67⁺)。这些细胞在人类白血病患者体内进行了胞啃作用的事实为它们执行抗肿瘤功能提供了明确的证据。在血液或骨髓中存在的CD45RARO NK细胞鉴定了血源性癌症患者并且可以用作诊断工具。

因此，本发明涉及一种用于诊断患者中的血液癌症的方法，所述方法包括：i)检测从所述患者获得的样品中CD45RARO NK细胞的存在，以及ii)当在所述样品中检测到CD45RARO NK细胞存在时，推断所述患者患有血液癌症。

如本文所使用的，术语“血液癌症”或“血源性癌症”具有其在本领域中的通常含义且是指通常起因于血细胞或骨髓细胞的癌症。

在一些实施方式中，本发明的方法尤其适合于诊断选自由白血病、淋巴瘤和骨髓瘤所组成的组中的血液癌症。

在一些实施方式中，血液癌症例如淋巴瘤是成熟(外周)B细胞肿瘤。在具体的实施方式中，成熟B细胞肿瘤选自由B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤，如脾边缘区B细胞淋巴瘤(+/-绒毛淋巴细胞)、淋巴结边缘区淋巴瘤(+/-单核细胞B细胞)和粘膜相关淋巴组织(MALT)型结外边缘区B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤；滤泡型淋巴瘤、滤泡中心；套细胞淋巴瘤；弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(包括纵隔大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤和原发性渗出性淋巴瘤)；和伯基特淋巴瘤/伯基特细胞白血病所组成的组。

在一些实施方式中，血液癌症例如淋巴瘤选自由多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡型淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)或B细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)所组成的组。在一些实施方式中，非霍奇金淋巴瘤(NHL)属于侵袭性NHL或惰性NHL两种类型之一。侵袭性NHL生长快速，并可能相对快地导致个体死亡。可以在数月或甚至数周中来测量未经治疗的存活率。侵袭性NHL的例子包括B细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、T/NK细胞肿瘤、间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、前体T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病(HTLV1+)、原发性CNS淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多形性移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、AIDS相关淋巴瘤、真性组织细胞性淋巴瘤和母细胞性NK细胞淋巴瘤。最常见的侵袭性NHL类型是弥漫性大细胞淋巴瘤。惰性NHL生长缓慢，大多数个体直到疾病进展到晚期才显示明显的症状。可以在数年中来测量惰性NHL个体的未治疗的存活率。非限制性例子包括滤泡型淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(例如结外边缘区淋巴瘤(也称为粘膜相关淋巴组织-MALT淋巴瘤)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(单核细胞B细胞淋巴瘤)、脾边缘区淋巴瘤)，和淋巴浆细胞淋巴瘤(瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)。在某些情况下，可发生组织学转化，例如，个体的惰性NHL可转化为侵袭性NHL。

在一些实施方式中，血液癌症例如白血病选自由急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)所组成的组。急性淋巴细胞白血病也称为急性淋巴母细胞白血病，并且在本文中可以互换使用。两个术语都描述了起始于骨髓中的白细胞、淋巴细胞的一种类型的癌症。

在一些实施方式中，样品是血液样品或是骨髓样品。

如本文所使用的，术语“血液样品”具有其本领域的通常含义且一般指从患者获得的全血样品。在一些实施方式中，血液样品是PBMC样品。如本文所使用的，术语“PBMC”或“外周血单核细胞”或“未分级的PBMC”是指还未富集指定亚群的完整的PBMC，即具有圆形核的白细胞群体。PBMC样品通常可能已经过选择步骤，以包含非粘附性PBMC(其含有T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞和DC前体)。因此，根据本发明的PBMC样品含有淋巴细胞(B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞)。这些细胞通常可以使用Ficoll(分离血液层的亲水性多糖)从全血中提取，其中PBMC在血浆层下方形成细胞环。此外，可以使用优先裂解红细胞的低渗裂解缓冲液从全血中提取PBMC。这些方法是本领域专家已知的。可以通过Percoll密度梯度、负消减方法或通过FACS分选方法来制备NK细胞。也可以通过使用亲和素-生物素系统的免疫吸附柱或通过接入有抗体的微珠的免疫选择来分离这些细胞。也可以将这些不同技术的组合使用，任选地与塑料粘附方法组合。

如本文所使用的，术语“骨髓样品”具有其在本领域中的通常含义。术语骨髓样品包括“骨髓抽吸物”，其指通过抽吸(包括但不限于骨髓抽吸和骨髓活检)从骨髓腔抽出的物质。

如本文所用，术语“NK细胞”具有其在本领域中的通常含义且是指自然杀伤(NK)细胞。本领域技术人员能够通过测定例如特异性表型标志物(例如CD56)的表达，和表达不同种类的细胞因子的能力或诱导细胞毒性的能力，来容易地鉴定NK细胞。

在一些实施方式中，本发明的方法包括由分离样品(例如PBMC样品)中的NK细胞群体组成的步骤。分离NK细胞的方法是本领域熟知的。通过去除非靶细胞(例如T细胞、B细胞、树突状细胞...)来分离NK细胞。用微珠鸡尾酒和针对谱系特异性抗原的生物素缀合的抗体鸡尾酒间接磁性标记非靶细胞。通过将磁性标记的非靶细胞保留在MACS分离器磁场中的MACS柱内来将其去除，而未标记的NK细胞穿过柱子。可以通过流式细胞术或荧光显微镜来评价富集的NK细胞的纯度。

如本文所使用的，术语“CD45RARO NK细胞”是指表达CD45RA和CD45RO两种标志物的NK细胞亚类。

如本文所使用的，术语“CD45”具有其在本领域中的通常含义且是指由PTPRC基因编码的在造血细胞中特异性表达的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)¹⁹。CD45通过与受体复合物的成分直接相互作用，或通过激活和去磷酸化各种Src家族激酶(SFK)(即Lck)来调节受体信号传导²⁰。但它可以通过抑制JAK激酶或通过使Src的活化残基去磷酸化来抑制细胞因子受体的信号传导²⁰。通常可区分CD45的两种同种型：CD45RA和CD45RO。术语“CD45RA”是其中CD45基因的外显子4不表达的CD45同种型。术语“CD45RO”是指其中CD45基因的外显子4、5和6不表达的CD45同种型。

患者血液样品中CD45RARO NK细胞的存在通常在于检测一些特异性细胞表面标志物的存在和/或缺失。用于检测细胞表面(例如NK细胞表面)的特异性表面标志物表达的标准方法是本领域众所周知的。通常由检测CD45RARO NK细胞的存在组成的步骤包括使用：适合于将NK细胞与其他细胞区分开的一组结合配偶体，以及包括特异性针对CD45RA的至少一种差异性结合配偶体和特异性针对CD45RO的至少一种差异性结合配偶体的一组结合配偶体。

如本文所使用的，术语“特异性针对表面标志物的结合配偶体”是指任何能够以高亲和力结合所述表面标志物(例如CD4RA或CD45RO)的分子(天然的或非天然的)。所述结合配偶体包括但不限于抗体、适体(aptamer)和肽。结合配偶体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体(例如Kit Milteny CD45RA&CD45RO抗体)。在一些实施方式中，结合配偶体可以是一组适体。

本发明的多克隆抗体或其片段可以根据已知方法，通过向选自例如猪、牛、马、兔、山羊、绵羊和小鼠等的宿主动物施用适当的抗原或表位来产生。可用本领域已知的各种佐剂来提高抗体产量。尽管可用于实施本发明的抗体可以是多克隆抗体，但优选单克隆抗体。可通过培养连续细胞系，使用提供产生抗体分子的任何技术，来制备和分离本发明的单克隆抗体或其片段。用于制备和分离的技术包括但不限于最初的杂交瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术；以及EBV-杂交瘤技术。

在一些实施方式中，结合配偶体可以是适体。适体是就分子识别而言代表抗体替代物的一类分子。适体是具有以高亲和力和特异性识别几乎任何类别的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。这样的配体可以通过采用随机序列文库的指数富集配体系统进化(SELEX)来分离。随机序列文库可通过DNA或RNA的组合化学合成获得。在该文库中，每个分子均是具有独特序列的最终经化学修饰的线性寡聚体。肽适体由通过平台蛋白(例如大肠杆菌的硫氧还蛋白A)展示的构象约束的抗体可变区组成，这些构象约束的抗体可变区通过两种杂交方法选自组合文库。

本发明的结合配偶体(例如抗体或适体)通常标记有可检测的分子或物质，例如优选荧光分子或放射性分子或本领域已知的任何其它标记。本领域中已知标记通常(直接或间接地)提供信号。如本文所使用的，对于抗体或适体，术语“经标记的”旨在包括通过使可检测的物质例如荧光团[例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5)]或放射性试剂与抗体或适体偶联(即物理地连接)来直接标记抗体或适体，以及通过与可检测物质的反应来间接标记探针或抗体。本发明的抗体或适体可以通过本领域已知的任何方法用放射性分子进行标记。例如，放射性分子包括但不限于用于闪烁法研究的放射性原子，例如I¹²³、I¹²⁴、In¹¹¹、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸。在一些实施方式中，抗体已经缀合至荧光团(例如FITC缀合的抗体和/或PE缀合的抗体)。

上述测定通常包括结合配偶体(即抗体或适体)与固体支持物的结合。固体表面可以是包被有结合配偶体的微量滴定板。在孵育NK细胞样品后，可以用针对共同NK细胞标志物的抗体检测与结合配偶体特异性结合的NK细胞。或者，固体表面可以是珠子，例如活化珠、磁响应珠。珠子可以由不同的材料制成，包括但不限于玻璃、塑料、聚苯乙烯和丙烯酸。此外，珠子优选是经荧光标记的。在优选的实施方式中，荧光珠是被容纳在可从BectonDickinson Biosciences(圣何塞,加利福尼亚)购买的TruCount(TM)管中的那些珠子。

根据本发明，用于检测CD45RARO NK细胞的优选方法是流式细胞术方法。所述方法是本领域公知的。例如，因此可以使用荧光激活细胞分选(FACS)。通常使用如下文实施例中所描述的FACS方法。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括检测所述CD45RARO NK细胞上至少一种表型标志物的存在的步骤，其中该至少一种表型标志物的存在表明血液癌症的性质。

在一些实施方式中，本发明的方法包括检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种表型标志物的步骤。

在一些实施方式中，所述表型标志物是CD分子，所述CD分子选自由CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15u、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD46、CD47R、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CDw113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CDw156C、CD157、CD158、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD162R、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CDw186、CD191、CD192、CD193、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CDw197、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CDw210、CD212、CD213a1、CD213a2、CDw217、CDw218a、CDw218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD235ab、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240D、CD240DCE、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD289、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CDw325、CD326、CDw327、CDw328、CDw329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CDw338、和CD339所组成的组。

选自由CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD79a、CD103、Pax-5、κ、λ、CD200、细胞质κ或细胞质λ所组成的组中的至少一种表型标志物的存在通常表明血液癌症源自于B细胞。例如，表A显示了源自于B细胞的血液癌症的典型表型标志物。

表A：源自于B细胞的血液癌症(CLL B细胞慢性淋巴细胞白血病；B-PL B细胞幼淋巴细胞白血病；MCL套细胞淋巴瘤；MZLB边缘区淋巴瘤B细胞淋巴瘤；sMZLB脾边缘区B-细胞淋巴瘤；FL滤泡型淋巴瘤)的典型表型标志物

CD19

CD5

CD23

CD20

CD22

CD10

CD11c

CD25

CD103

CLL

+

B-PL

+

MCL

+

MZLB

+

sMZLB

+

FL

+

选自由CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、TCRα-β、TCRγ-δ,和CD3所组成的组中的至少一种表型标志物的存在通常表明血液癌症起源于T细胞。

选自由CD11b、CD13，CD14(Mo2)、CD14(MY4)、CD15、CD33、CD41、CD61、CD64、CD117、CD235a和髓过氧化物酶所组成的组中的至少一种表型标志物的存在通常表明血液癌症起源于骨髓细胞。

通常根据与检测CD45RA和CD45RO同样的方法来检测表型标志物。因此，一组结合配偶体可用于确定表型标志物的存在，优选使用荧光激活细胞分选(FACS)。

一旦患者被诊断为患有血液癌症，医生就可以选择将最准确的治疗施用于患者。治疗通常包括化学疗法、放射疗法和免疫疗法。

因此，本发明还涉及一种用于在有需要的主体中治疗血液癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)根据本发明的方法来进行所述方法以鉴定患有血液癌症的主体，

(ii)用化疗剂、靶向癌症疗法、免疫治疗剂或放射治疗剂治疗所述患有血液癌症的主体。

在一些实施方式中，患者一旦诊断为患有血液癌症则施用化疗剂。术语“化疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的化合物。化疗剂的例子包括烷化剂，例如硫替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐/酯，例如白消安、右苯丙胺和哌泊硫磺；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基化三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔素(特别是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(carnptothecin)(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；自念珠藻环肽(cryptophycin)(特别是自念珠藻环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；电穿孔素；泛曲霉素；珊瑚类二萜(sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥例如苯丁酸氮芥、氯萘哒嗪、环磷酰胺、雌氮芥(estrarnustine)、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、诺啡比林、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、尿嘧啶芥子；亚硝脲如卡莫司汀、氯唑菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素例如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素，特别是卡里奇霉素11和卡里奇霉素211，参见例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)包括达内霉素A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二抗生素发色团)、阿克拉希霉素、放线菌素、阿托霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉索(canninomycin)、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地多柔比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯烷-多柔比星和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马赛洛霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培罗霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、杆菌霉素、链霉素、链佐星、结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素如卡鲁斯特、丙酸色丙酸托烷酯、表薄甾烷醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如糠酸；乙酰葡醛酯；醒磷酰胺糖苷(aldophospharnide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝塔布辛；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；去甲胆碱；二嗪酮；埃洛磷；乙酸椭圆梨酯；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱如美登素和安莎霉素；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹达莫；硝唑兰；戊糖他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；拉佐生；根霉素；西佐呋喃；有机锗化合物(spirogennanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(特别是T-2毒素、鞣花素A、咯里啶A和蛇形菌素)；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；丝溴酮(mitobromtol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,普林斯顿,N.].)和多烯紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；塞罗达；伊班膦酸盐/酯；CPT-1 1；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；以及任何上述药物可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制肿瘤上的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、三氧嘧啶、酮替芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方式中，一旦患者被诊断为患有血液癌症则施用靶向癌症疗法。靶向癌症疗法是通过干扰参与癌症生长、进展和扩散的特定分子(“分子靶标”)来阻断癌症的生长和扩散的药物或其他物质。靶向癌症疗法有时被称为“分子靶向药物”、“分子靶向疗法”、“精确药物”或类似名称。在一些实施方式中，靶向疗法由向患者施用酪氨酸激酶抑制剂组成。术语“酪氨酸激酶抑制剂”是指作为受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂的多种治疗剂或药物的任一种。酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物是本领域公知的并且描述于美国专利公开2007/0254295中，其通过以引用的方式整体并入本文。本领域技术人员应当理解，酪氨酸激酶抑制剂相关的化合物将重演酪氨酸激酶抑制剂的作用，例如相关化合物将作用于酪氨酸激酶信号传导通路上的不同成员，以产生与酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂相同的效果。适用于本发明实施方式的方法的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物的例子包括但不限于达沙替尼(BMS-354825)、PP2、BEZ235、沙拉卡尼、吉非替尼(Iressa)、舒尼替尼(Sutent；SU11248)、埃罗替尼(Tarceva；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡那替尼(CI 1033)、塞玛辛尼(Semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(Bayer 43-9006)、伊马替尼(Glleevec；STI571)、来氟米特(SU101)、凡德他尼(Zactima；ZD6474)、MK-2206(8-[4-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-1,2,4-三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮盐酸盐)，它们的衍生物，它们的类似物，及它们的组合。适用于本发明的其它酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物描述于例如美国专利公开2007/0254295、美国专利No.5,618,829、5,639,757、5,728,868、5,804,396、6,100,254、6,127,374、6,245,759、6,306,874、6,313,138、6,316,444、6,329,380、6,344,459、6,420,382、6,479,512、6,498,165、6,544,988、6,562,818、6,586,423、6,586,424、6,740,665、6,794,393、6,875,767、6,927,293和6,958,340中，所有这些全部内容以引用的方式并入本文。在某些实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂是小分子激酶抑制剂，已口服给药，并且经过了至少一个I期临床试验，更优选至少一个II期临床试验，甚至更优选至少一个III期临床试验且最优选由FDA批准用于至少一种血液学或肿瘤学适应症。这样的抑制剂的例子包括但不限于吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、BMS-599626(AC-480)、来那替尼、KRN-633、CEP-11981、伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、AZM-475271、CP-724714、TAK-165、舒尼替尼、瓦他拉尼、CP-547632、凡德他尼、博舒替尼、来他替尼、坦度替尼、米哚妥林、恩扎妥林、AEE-788、帕唑帕尼、阿西替尼、莫塔塞尼、OSI-930、西地尼布、KRN-951、多韦替尼、赛丽西丽(Seliciclib)、SNS-032、PD-0332991、MKC-I(Ro-317453；R-440)、索拉非尼、ABT-869、布立尼布(BMS-582664)、SU-14813、替拉替尼、SU-6668、(TSU-68)、L-21649、MLN-8054、AEW-541和PD-0325901。

在一些实施方式中，患者一旦被诊断为患有血液癌症则施用免疫治疗剂。如本文所使用的，术语“免疫治疗剂”是指间接或直接增强、刺激或增加机体针对癌细胞的免疫应答和/或减少其它抗癌疗法的副作用的化合物、组合物或治疗。因此，免疫疗法是直接或间接刺激或增强免疫系统对癌细胞的应答，和/或减轻可能由其它抗癌剂引起的副作用的疗法。免疫疗法在本领域中也称为免疫学治疗、生物学治疗、生物反应调节剂治疗和生物治疗。本领域已知的常见免疫治疗剂的例子包括但不限于细胞因子、癌症疫苗、单克隆抗体和非细胞因子佐剂。或者，免疫疗法的治疗可以由向患者施用一定量的免疫细胞(T细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞……)组成。

免疫治疗剂可以是非特异性的，即通常增强免疫系统以使得人体能更有效地对抗癌细胞的生长和/或扩散，或者它们可以是特异性的，即靶向癌细胞本身，免疫治疗方案可以将非特异性和特异性免疫治疗剂组合使用。

非特异性免疫治疗剂是刺激或间接改善免疫系统的物质。非特异性免疫治疗剂已经单独用作治疗癌症的主要疗法，以及除主要疗法之外的情况下，非特异性免疫治疗剂用作佐剂以增强其它治法的有效性(例如癌症疫苗)。在后一种情况下，非特异性免疫治疗剂还可以起到减小其它疗法的副作用(例如由某些化疗剂诱导的骨髓抑制)的效果。非特异性免疫治疗剂可以作用于关键的免疫系统细胞并引起次级应答，例如细胞因子和免疫球蛋白产量的增加。或者，非特异性免疫治疗剂本身可包含细胞因子。非特异性免疫治疗剂通常分类为细胞因子或非细胞因子佐剂。

已经发现许多细胞因子可用于癌症治疗中，作为设计用于加强免疫系统的普通非特异性免疫疗法，或者作为与其它疗法一起提供的佐剂。合适的细胞因子包括但不限于干扰素、白细胞介素和集落刺激因子。

本发明考虑的干扰素(IFN)包括常见的IFN类型，IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN可以直接作用于癌细胞，例如通过减缓它们的生长，促进它们发展成具有更正常表现的细胞，和/或增加它们的抗原产量从而使得癌细胞更容易被免疫系统识别和破坏。IFN还可以间接作用于癌细胞，例如通过减缓血管生成，增强免疫系统和/或刺激自然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞。重组IFN-α可作为Roferon(Roche Pharmaceuticals)和Intron A(ScheringCorporation)商购获得。

本发明考虑的白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-11和IL-12。市售的重组白细胞介素的实例包括(IL-2；Chiron Corporation)和(IL-12；WyethPharmaceuticals)。Zymogenetics有限公司(西雅图,Wash.)目前正在测试重组形式的IL-21，其也被考虑用于本发明的组合中。

本发明考虑的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF或非格司亭)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭)和促红细胞生成素(阿法依泊汀、达比波廷)。用一种或多种生长因子治疗可以帮助在接受传统化疗的患者中刺激产生新的血细胞。因此，用CSF治疗可有助于减少与化疗相关的副作用，并允许使用更高剂量的化疗剂。各种重组集落刺激因子可商购获得，例如(G-CSF；Amgen)，Neulasta(培非格司亭；Amgen)，Leukine(GM-CSF；Berlex)，Procrit(促红细胞生成素；Ortho Biotech)，Epogen(促红细胞生成素；Amgen)，Arnesp(促红细胞生成素)。

除了具有特异性或非特异性靶标之外，免疫治疗剂可以是主动的(即刺激身体自身的免疫应答)，或者它们可以是被动的(即包含在身体外部产生的免疫系统组分)。

被动特异性免疫治疗通常涉及使用特异性针对在癌细胞表面上发现的特定抗原或特异性针对特定细胞生长因子的一种或多种单克隆抗体。单克隆抗体可以多种方式用于癌症治疗，例如，增强主体对特定类型癌症的免疫应答，通过靶向特异性细胞生长因子(例如参与血管生成的那些细胞生长因子)，或者在连接或缀合于诸如化疗剂、放射性粒子或毒素的试剂情况下，通过增强其它抗癌剂递送至癌细胞能力，来干扰癌细胞的生长。

目前用作癌症免疫治疗剂的适合包括在本发明组合中的单克隆抗体包括但不限于，利妥昔单抗曲妥珠单抗替伊莫单抗托西莫单抗西妥昔单抗(C-225,)、贝伐单抗吉妥单抗阿仑珠单抗和BL22。其它例子包括抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗TIMP3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体或抗B7H6抗体。在一些实施方式中，抗体包括B细胞清除抗体。典型的B细胞清除抗体包括但不限于抗CD20单克隆抗体[例如利妥昔单抗(Roche)、替伊莫单抗(Bayer Schering)、托西莫单抗(GlaxoSmithKline)、AME-133v(Applied Molecular Evolution)、奥克雷珠单抗(Roche)、奥法木单抗(HuMax-CD20,Gemnab)、TRU-015(Trubion)和IMMU-106(Immunomedics)]、抗CD22抗体[例如依帕珠单抗，Leonard et al.,Clinical Cancer Research(Z004)10:53Z7-5334]、抗CD79a抗体、抗CD27抗体或抗CD19抗体(例如美国专利号7,109,304)、抗BAFF-R抗体(例如贝利木单抗，GlaxoSmithKline)、抗APRIL抗体(例如抗人APRIL抗体，ProSci inc.)和抗IL-6抗体[例如此前由De Benedetti et al.,J Immunol(2001)166:4334-4340和Suzuki et al.,Europ J of Immunol(1992)22(8)1989-1993描述的，在此通过以引用的方式整体并入本文]。

免疫疗法的治疗可以为同种异体移植，具体为用造血干细胞HSC进行同种异体移植。免疫疗法治疗还可能是由Nicholas P.Restifo,Mark E.Dudley and StevenA.Rosenberg “Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing the T cellresponse,Nature Reviews Immunology,Volume 12,April 2012描述的过继性免疫疗法。在过继性免疫疗法中，分离患者循环的淋巴细胞、NK细胞，在体外扩增并重新施用予患者。活化的淋巴细胞或NK细胞最优选是先前从血液或肿瘤样品中分离并在体外活化(或“扩增”)的患者自身的细胞。

在一些实施方式中，患者一旦被诊断为患有血液癌症则施用放射治疗剂。如本文所使用的，术语“放射治疗剂”是指但不限于本领域技术人员已知的有效治疗或改善癌症的任何放射治疗剂。例如，放射治疗剂可以是诸如在近距离放射治疗或放射性核素治疗中施用的那些治疗剂。这样的方法可以任选地进一步包括施用一种或多种额外的癌症疗法，例如但不限于化学疗法和/或另一种放射疗法。

本发明的又一方面涉及用于监测患有血液癌症的患者的治疗有效性的方法，所述方法包括i)检测来自所述患者的血液样品中的CD45RARO NK细胞的存在，以及ii)当在血液样品中未检测到CD45RARO NK细胞的存在时，推断所述患者的治疗是有效的。

通常对患者施用上述的治疗。

将通过以下附图和实施例进一步对本发明进行说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1.血液恶性肿瘤患者和健康供体具有不同的NK细胞亚类谱。A)对来自健康供体和多发性骨髓瘤(MM)患者的血液样品(bs)的PBMC或来自MM患者的骨髓(bms)的PBMC进行染色。小图中示出了表达不同CD45同种型的NK细胞的百分比。B)源自MM患者血液样品的不同NK细胞亚类(基于CD45同种型的表达)的FS和SS值以及成熟情况(CD56/CD16表达)。C)健康供体和血液癌症患者中的这些NK细胞群体的百分比。误差棒显示每种医疗状况的至少四个不同个体的平均值±SD。HD，健康供体；MM，多发性骨髓瘤；B-CLL，B细胞慢性淋巴细胞白血病；BCL，B细胞淋巴瘤；AML，急性骨髓性白血病；bs，血液样品；bms，骨髓样品。D)在NK成熟的不同阶段(CD56/16表达)的CD45RA、CD45RARO、CD45RA^暗和CD45RA^暗RO细胞的百分比。每个点表示一个供体。同样显示了平均值±SD。

图2.CMV+患者和血液癌症患者具有不同的NK细胞亚类谱。A)纯化来自肾移植后CMV感染再活化(CMV+)或未再出现CMV感染(CMV阴性)患者的PBMC，并计算NK细胞的百分比。B)分析(A)中所述样品中处于不同成熟阶段(CD56/CD16)的NK细胞的丰度(以百分比计)。C)显示了每种NK细胞亚类(CD45同种型/CD69)的百分比。在(B)和(C)中误差棒表示每种医疗状况的至少四个个体的平均值±SD。

图3.CD69、CD45RA和CD45RO鉴定不同的NK细胞亚类。A)纯化来自健康供体(HD)和患不同血液恶性肿瘤的患者的PBMC，并计算处于NK细胞成熟(CD56/CD16)的不同阶段的CD69⁺细胞的百分比。还描述了平均值±SD。B)显示了来自健康供体(HD)和患不同血液恶性肿瘤的患者的PBMC中表达或不表达CD45RA、CD45RO和CD69的NK细胞的百分比。误差棒表示每种医疗状况的至少四个个体的平均值±SD。C～D)显示来自患不同血源性癌症的患者的血液样品(bs)或骨髓样品(bms)的NK细胞中CD45RO或CD45RA对CD69表达的代表图。没有获得用于分析的健康供体的骨髓样品。

图4.CD45RO鉴定不同的NK细胞群体。纯化来自健康供体(HD)和患不同血液恶性肿瘤的患者的PBMC。A)每百万个NK细胞中每种NK细胞亚类(CD45/CD69表达)中CD107a⁺细胞数量。误差棒表示每种医疗状况的至少四个个体的平均值±SD。B)六种不同亚类(CD45/CD69)中CD107a⁺NK细胞的百分比。C)上部的图片，分离自MM患者(用于比较也显示，相应血液样品bs中的百分比)或AML患者的骨髓样品(bms)的不同NK细胞亚类中的CD107a⁺细胞的百分比。底部的图片，暴露于靶K562肿瘤细胞后，不同NK细胞亚类中CD107a⁺细胞的百分比(体外细胞毒性试验描述于图7中)。D～E)来自健康供体(HD)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)或B细胞淋巴瘤(BCL)患者的血液样品的六种不同NK细胞亚类(CD45/CD69)中，表达CD71或Ki-67的NK细胞的百分比。误差棒表示每种医疗状况的至少四个个体的平均值±SD。

图5.CD45RARO细胞对肿瘤细胞进行了胞啃。纯化来自BCL(A)或AML(B)患者的PBMC并用不同的抗体染色。在该实验中，NK细胞群体对应于CD56⁺NKP46⁺细胞。图中描述了每种NK细胞亚类中关于CD45RA/RO的细胞的百分比。

图6.血液恶性肿瘤患者和健康供体具有不同的NK细胞亚类谱。A)用抗CD19(B细胞)抗体、抗CD3(T细胞，CD3⁺CD56^-)抗体和抗CD56(NK细胞，CD56⁺CD3^-)抗体，对健康供体和多发性骨髓瘤(MM)患者的血液样品(bs)中或MM患者的骨髓样品(bms)中或其他血液学疾病患者的样品中的PBMC进行染色以用于FACS分析，从而鉴定不同的淋巴细胞群体，并且还用抗CD16抗体来染色从而鉴定处于不同成熟阶段的NK细胞亚类，以及用抗CD45RA抗体和抗CD45RO抗体来染色。表达不同CD45同种型的NK细胞的百分比显示在小图中。B)在健康供体和血液癌症患者中基于CD45RA和RO表达的不同NK细胞群体的百分比。所述群体对应于图1A中的象限：左上(CD45RA)、左下(CD45RA^暗)，右上(CD45RARO)和右下(CD45RA^暗RO)。误差棒显示了每种医学状况平均值±SD，与健康供体血液(左图)或骨髓(右图)样品相比的学生t检验：*p<0.01；**p<0.001；***p<0.0001。HD，健康供体；MM，多发性骨髓瘤；B-CLL，B细胞慢性淋巴细胞白血病；BCL，B细胞淋巴瘤；AML，急性骨髓性白血病；bs，血液样品；bms，骨髓样品。

图7.CD45RARO NK细胞的功能表征。A)源自MM患者血液样品的不同NK细胞亚类(基于CD45同种型的表达)的FS和SS数值。B～C)在代表性BCL患者中，不同的NK细胞亚类中CD71和Ki67的表达。D～E)显示来自不同血源性癌症患者的血液样品(bs)或骨髓样品(bms)的NK细胞中CD45RO或CD45RA对CD69表达的代表图。

图8.CD45RARO鉴定脱粒的NK细胞。纯化来自健康供体(HD)和患不同血液恶性肿瘤的患者的PBMC。A)每百万个NK细胞中每种NK细胞亚类(CD45RA/RO表达)中的CD107a⁺细胞数量。误差棒表示每种医疗状况的平均值±SD；与健康供体样品相比的学生t检验。B)四种不同亚类中CD107a⁺NK细胞的百分比。C)上部的图片，分离自MM患者(用于比较，也显示了相应血液样品bs中的百分比)或AML患者的骨髓样品(bms)的不同NK细胞亚类中的CD107a⁺细胞的百分比。底部的图片，暴露于靶K562肿瘤细胞后，不同NK细胞亚类中CD107a⁺细胞的百分比(在体外细胞毒性试验中)。将PBMC与靶K562肿瘤细胞以效应子：靶标10:1的比例孵育4小时。

附加图1.血源性癌症患者中NK细胞亚类被调节。用针对CD45RA、CD45RO、CD56和CD16的抗体对来自不同血液恶性肿瘤患者的PBMC进行染色，并如图3所示进行分析。图中示出表达不同CD45同种型的NK细胞的百分比。B-CLL，B细胞慢性淋巴细胞白血病；BCL，B细胞淋巴瘤；AML，急性骨髓性白血病；bs，血液样品；bms，骨髓样品。

附加图2.CD45RA^暗细胞在体外活化后获得CD69表达。将从血液样品分离的PBMC与靶K562肿瘤细胞以效应子：靶标10:1的比例孵育4小时。在体外细胞毒性测定结束时(之后)或测定前(之前)，用针对CD45RA和CD69的抗体对离体PBMC进行标记。显示了每种NK细胞亚类中的细胞百分比(基于CD45RA和CD69表达)；来自患B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)或B细胞淋巴瘤(BCL)的两个患者的代表性数据。

附加图3.CD45RARO细胞对B-CLL患者的肿瘤细胞进行了胞啃。纯化来自B-CLL患者的PBMC并用不同的抗体进行染色。在该实验中，NK细胞群对应于CD56⁺NKP46⁺细胞。图中描述了每种NK细胞亚类中关于CD45RA/RO的细胞的百分比。

具体实施方式

材料与方法

细胞培养

将K562细胞系(ATTC CCL 243)在具有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(GlutaMAX^TM培养基)中保持对数生长。细胞用含5％CO₂的空气于37℃下在湿润室中培养，并每周以1:10传代两次。在获得知情同意后，从具有不同血液疾病的患者和健康供体获得骨髓和外周血样品。通过Ficoll-Hypaque(Sigma)密度梯度离心纯化细胞。将原代细胞在37℃和5％CO₂的条件下于湿润气氛中培养，所述培养是在补充有10％FBS的RPMI1640培养基(GlutaMAX^TM培养基)中进行。

外周血单核细胞(PBMC)纯化

使用Histopaque-1077(Sigma)回收PBMC。简言之，将3ml～6ml在RPMI中以1:2稀释的血液或以1:3稀释的骨髓样品添加到5ml Histopaque的顶部。将细胞在20℃下1600rpm不间断地离心30分钟。从中间白色环收集单核细胞。在RPMI中洗涤后，将细胞悬浮于补充有10％FBS(Invitrogen)的完全RPMI培养基中。

患者/健康供体的选择

在患者知情同意后，在法国蒙彼利埃CHU的肿瘤学和临床血液部门收集来自不同血液癌症患者的数据和样品。患者参加了由“南地中海保护协会I(Comités de Protectiondes Personnes Sud Méditerranée I)(ref 1324)”和ID-RCB:2011-A00924-37批准的两个独立的临床计划。

细胞表面标志物的多色染色

用7AAD(Beckman)将PBMC染色以鉴定活细胞，并为了细胞表型分型用针对表面标志物的以下抗CD25-FITC抗体、抗CD45RO-FITC抗体、抗CD69-PE抗体、抗CD138-PE抗体、抗CD62L-PE抗体、抗CD19-PE抗体、抗CD3-PE抗体、抗CD19-ECD抗体、抗CD38-ECD抗体、抗CD56-PECy7抗体、抗CD56-APC抗体、抗CD3-APC抗体、抗CD45-APC AlexaFluor750抗体、抗CD45RA-APC AlexaFluor750抗体、抗CD16-PacificBlue抗体、抗CD57-PacificBlue抗体、抗CD45-KromeOrange抗体、抗CD16-KromeOrange(Beckman)抗体、抗CD158b-FITC抗体、抗CD158a-PE抗体、抗CD107a-HV500抗体、抗Ki-67-V450抗体(BD Biosciences)和抗CD71-APC抗体(ImmunoTools)抗体进行染色。简言之，将1×10⁶个细胞与不同的抗体在PBS/2％FBS中于37℃下孵育30分钟。然后洗涤细胞并悬浮于200μl～250μl PBS/2％FBS中并使用Gallios流式细胞仪(Beckman)和Kaluza软件对染色进行分析。

使用FSC/SSC和7AAD染色对存活的淋巴细胞进行筛选。B淋巴细胞(CD19+)、T淋巴细胞(CD3+CD56-)和NK细胞(CD56+CD3-)是基于CD19、CD3或CD56的表达来区分的。然后基于CD45RA和CD45RO表达：CD45RA⁺RO^-(CD45RA)、CD45RA⁺RO⁺(CD45RARO)、CD45RA^暗RO^-(CD45RA^暗)、CD45RA^暗RO⁺(CD45RA^暗RO)，将NK细胞分为四个不同的群体。然后分析这些不同群体的CD16、CD69、CD62L、CD57和CD107a的表达和细胞尺寸/粒度(FSC/SSC)。

体外CD107a脱粒试验

在PBMC纯化和NK细胞定量后，将300万个细胞于37℃下与K562靶细胞(效应子(NK细胞):靶标的比率为1:10)在500μl终体积(具有10％FBS和10u/ml IL2的RPMI Glutamax)中孵育4小时。培养基还含有1.5μl抗CD107a抗体(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)和1μl用于防止CD107a降解的莫能菌素(BD Golgi-Stop BD Biosciences)。然后，将细胞重悬于含有抗CD45RO-FITC抗体、抗CD69-PE抗体、抗CD19-ECD抗体、抗7AAD抗体、抗CD56-PECy7抗体、抗CD3-APC抗体、抗CD45RA-APCAlexaFluor750抗体、抗CD107a-HV500抗体和抗CD16-KO抗体(BD Biosciences,Beckman)的50μl抗体鸡尾酒中。在一些实验中，还在暴露于靶细胞之前将PBMC与抗CD69抗体和抗CD45RA抗体一起孵育。在Beckman Coulter FACS Gallios流式细胞仪上使用Kaluza软件分析样品。最初在前向角散射和侧向角散射(SSC)上对事件进行筛选以鉴定淋巴细胞。使用CD56相对CD3的双变量图获得至少10000个NK细胞。

细胞表面和细胞内标志物的多色染色

在纯化了PBMC后，通过与10％正常人血清在室温下孵育15分钟来预封闭1百万个细胞，然后用50μl针对细胞表面标志物的PANEL Ki-67抗体鸡尾酒(抗CD45RO-FITC抗体、抗CD69-PE抗体、抗CD19-ECD抗体、抗CD3-PE-Cy5.5抗体、抗CD56-APC抗体、抗CD45RA-APCAlexaFluor750抗体、抗Ki-67抗体和抗CD16-KO抗体)(BD Biosciences,Beckman)进行染色。用染色缓冲液洗涤细胞两次并在4℃下重悬浮于250μl BD Cytofix/Cytoperm溶液中20分钟。将细胞在BD Perm/Wash溶液中洗涤两次。接下来将细胞在50μl含有针对图中所述细胞内标志物的抗体鸡尾酒的BD Perm/Wash溶液中，于4℃下在黑暗中固定/透化30分钟。将细胞在BD Perm/Wash溶液中洗涤两次，并重悬于染色缓冲液中，然后使用Kaluza软件的Beckman Coulter FACS Gallios流式细胞仪上进行流式细胞术分析。最初在前向角散射和侧向角散射(SSC)上对事件进行门选(gate)以鉴定淋巴细胞。使用CD56相对CD3的双变量图获得至少10000个NK细胞。

EBV细胞培养：

将K562细胞系(ATCC CCL 243)和类淋巴母细胞EBV细胞系PLH(IHW编号：9047)在具有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(GlutaMAX^TM培养基)中保持对数生长。细胞用含5％CO₂空气于37℃下在湿润室中培养，并每周以1:10传代两次。

单个纯NK细胞的鉴定

用CD56+NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)从B细胞淋巴瘤患者的PBMC中富集并纯化原代CD56+NK细胞。通过流式细胞术测量的CD56+NK细胞的纯度(CD56+CD3-的％)为>90％。纯化的CD56+NK细胞已经用抗CD335(NKp46)-PE进行染色，以与抗CD45RA-FITC抗体、抗CD45RO-APC抗体和抗CD19-VioBlue抗体(检测能胞啃的NK细胞)一起正式鉴定NK细胞。纯化和染色的NK细胞用DEPArray^TM系统(Silicon Biosystems,Menarini)进行了分析。这种新技术使我们能够对单个细胞进行检测、枚举和拍摄。

DEPArray^TM步骤

根据制造商的说明书和文章(Lianidou et al.,2013)中所述进行细胞分选实验。简言之，DEPArray盒中手动装载14μl样品和800μl缓冲液，纯化和染色的NK细胞必须回收在其中。将盒子装入DEPArray系统中后，系统将样品自动注射到盒子的微室中，在其中细胞自发地组织成由16000个电笼组成的预编程电场，单个细胞被捕获在这些电笼中。捕获图像帧和明场图像，对于四个荧光滤光片立方体(FITC、PE、APC和DAPI/Hoechst/VioBlue/PacificBlue)每一个，该图像帧都覆盖微室的整个表面。捕获的图像被数字化处理并呈现在能够由操作者对感兴趣的细胞进行选择的软件模块中。

体外NK细胞刺激方案

用高剂量的IL-2(1000U/ml，eBiosciences)，或用淋巴母细胞EBV细胞系PLH连同IL-2(100U/ml)和IL-15(5ng/ml,Miltenyi)在10或20天期间内刺激PBMC(1.10⁶个细胞/ml)。

统计

图中所示的所有实验都使用来自针对每种恶性肿瘤的6个患者和相同人数的健康供体的样品来进行。

结果：

CD45是成熟的人类NK细胞的标志物

为了确定在人类NK细胞中CD45高表达是否与在其他淋巴细胞类型中一样也是细胞成熟的标志物(26)，我们分析了来自PBMC的三种主要类型的人淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)中的CD45表达。B细胞和T细胞显示具有相当水平的CD45表达的相对同质的群体。CD56^亮(因此相对不成熟的)NK细胞显示较低的总CD45表达，这与CD45是淋巴细胞成熟标志物的观点一致。大多数NK细胞和B细胞表达CD45RA，而极少表达CD45RO。相反，大部分T细胞群体表达CD45RO，而不是CD45RA。

然后我们分析了总CD45表达与已知NK细胞标志物的关联。NK细胞中CD45的表达与KIR CD158a和CD158b的表达以及CD16(NK细胞成熟的标志物(14,34))的表达相关。相反，CD45在CD25(细胞增殖的标志物)阳性的细胞中表达较低。与CD45阴性细胞相比，CD45阳性细胞还更频繁地表达与NK细胞溶解活性相关的CD69(35)。这些结果表明在NK细胞中，总CD45表达主要与NK细胞成熟标志物(例如CD16和KIR)的高表达以及CD56和CD25(未成熟NK细胞的标志物)的低表达相关。

不同CD45同种型在体内的表达：健康供体

以前的结果表明：与T细胞相比，很少的NK细胞表达CD45RO。对来自健康供体的NK细胞中的细胞表面标志物表达的更详细分析显示，绝大多数NK细胞是CD45RACD69^-细胞，且仅有5％的NK细胞表达CD69。在具有低CD45RA表达的4％的NK细胞(CD45RA^暗)中仅1％是CD69⁺。此外，基于CD56和CD16的表达，可以认为CD45RA⁺RO^-(CD45RA)细胞是完全成熟的细胞，而在未成熟的群体中一致地发现了CD45RA^暗RO^-(CD45RA^暗)细胞。非常少的CD45RA⁺RO⁺(CD45RARO)细胞是CD56^暗CD16⁺，而CD45RA^暗RO⁺(CD45RA^暗RO)细胞是CD56^暗CD16^暗。这些结果表明CD45RA和CD45RO表达与健康供体中的NK细胞成熟相关。

不同CD45同种型在体内的表达：同种异体移植的患者

然后我们调查了同种异体移植患者中的NK细胞谱，在这些同种异体移植患者中NK细胞群体由供体造血干细胞重建。在这些患者中，CD45RO和/或CD45RA^暗NK细胞比健康对照组中更丰富，在用两个标志物在图中绘制时产生了彗星样形状。与所预期的相同，基于CD56和CD16表达，来自同种异体移植患者的血液样品中的未成熟NK细胞的数目大于健康对照组。这些CD56^亮细胞是CD16^-，这表明它们是从头产生的NK细胞而不是在活化后获得CD56表达的CD56^暗细胞。CD56^亮细胞在体内成熟期间变为产生穿孔素的CD56^暗CD62L⁺CD57^-细胞，同时响应细胞因子维持高IFN-γ产量(12,36)。然后，CD56^暗CD62L^-CD57⁺细胞显示对细胞因子的低响应和更高的细胞毒能力(12,37)。事实上，与CD16表达相独立，在同种异体移植患者中CD56^亮细胞的CD62L表达高于CD56^暗细胞。并且CD56^暗细胞中CD57表达的密度高于CD56^亮细胞。此外，与健康供体相比，来自同种异体移植患者的所有NK细胞群体都富含CD45RA^暗和CD45RO细胞。然而，如在健康供体中观察到的，更成熟的NK细胞亚类中CD45RA^暗细胞的百分比逐渐降低。

不同CD45同种型在体内的表达：血液恶性肿瘤的患者

对先前描述的患者进行骨髓移植，作为对不同血液癌症的治疗。在所有这些患者中，CD45RO和/或CD45RA^暗NK细胞比健康对照中更丰富。具体的，一些CD45RA细胞也是CD45RO⁺。因此，我们假设除了CD45RA表达降低的未成熟NK细胞群之外，一些NK细胞可能已被靶标肿瘤细胞活化。因此，我们调查了患不同血液恶性肿瘤的患者的NK细胞谱。

如先前在健康供体中所述的，发现NK细胞主要是具有少量CD45RA^暗细胞的成熟CD45RA细胞，尤其是在未成熟NK细胞亚类中。CD45RARO细胞占所有NK细胞的约0.2％(图1A顶部的图片)。令人惊讶的是，来自多发性骨髓瘤(MM)患者的血液样品含有四倍多的CD45RA^暗细胞和约5％的CD45RO细胞，其通常保持CD45RA表达(图3A中间的图片)。由于MM的特征在于肿瘤细胞在骨髓中的积累，我们还研究了应该与肿瘤细胞更密切接触的骨髓NK细胞是否比循环NK细胞更具活性。但情况并不是这样，因为CD45RA^暗和CD45RO细胞在血液和骨髓样品中百分比是相似的(图1A，中间的图片和下部的图片)。

此外，来自MM患者的NK细胞亚类的尺寸(FS)更大并且具有高粒度(SS)(图1B)。这个群体主要对应于几乎完全属于CD56^暗CD16⁺亚类的CD45RARO细胞(图1A和图1B下部的图片)。尽管CD45RA^暗RO细胞(主要是CD56^暗CD16^暗)的尺寸和粒度也略有增加(1B)，这些CD45RARO细胞的大尺寸(FS)和粒度(SS)表明它们与其他NK亚类相比具有更高的代谢活性。与此相反，CD45RA^暗细胞具有低的FS和SS值并明显富集在未成熟区室中。

在来自其他血液癌症例如急性骨髓性白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和B细胞淋巴瘤(BCL)的患者的血液样品中也观察到CD45RA^暗和CD45RO群体的类似增加(附加图1)。总之，与健康对照相比，来自血液恶性肿瘤患者的所有分析样品中CD45RA群体减少，而CD45RA^暗、CD45RA^暗RO和C45RARO细胞部分增加(图1C)。

最后，我们在来自血癌患者和健康供体的样品中在四个NK细胞发育阶段(基于CD56/CD16表达)对不同CD45同种型的表达进行定量(图1D)。在健康供体中，未成熟区室含有15％的CD45RA^暗细胞，而在完全成熟的NK细胞亚型中基本上不存在该群体。然而，CD45RARO细胞仅发现于成熟的区室中。在所有血液癌症患者(不依赖于肿瘤类型)中，CD45RA^暗细胞数目在成熟NK细胞区室中的增加。CD45RA^暗RO细胞在未成熟区室中增加且CD45RARO细胞尤其是在最成熟的NK细胞亚类中大量增加。事实上，来自血液癌症患者的CD56^暗CD16⁺NK细胞亚类中的CD45RA^暗和CD45RARO群体的大量增加将它们与健康供体清楚地区分开并且可以用作诊断工具。

不同CD45亚型在体内的表达：CMV再活化的患者

我们接下来询问导致NK细胞活化的其他病症(例如病毒感染)是否可以产生相似的表型。因此我们分析了肾移植后CMV感染的再活化(CMV+)或未再活化(CMV阴性)患者的PBMC样品。CMV再活化诱导NK细胞总数的增加(图2A)。此外，与CMV阴性患者相比，CMV+患者显示与CD56^亮亚类的减少相关的CD56^暗CD16^暗细胞的增加(图2B)。我们不清楚这些变化的原因，但可能是由于不同的因素，如CMV诱导的NK细胞成熟(38)，或对CMV感染细胞中不同NK细胞标志物表达的影响，如之前描述的蜕膜NK细胞(39)。这些变化伴随着CD45同种型的表达模式的微小变化，主要是表达CD69和CD45RO的CD45RA^暗细胞的增加(图2C)。这些结果表明，由病毒感染或血液癌症活化的NK细胞中CD45同种型的表达模式不同。具体来说，CD45RARO细胞主要存在于来自患有血液癌症患者的样品中，而它们在同种异体移植或病毒感染的患者中代表较小的部分。

CD45同种型和CD69表达之间的关系

CD69表达在NK细胞刺激后增加被认为是NK细胞活化(包括体内)的真正标志物(17)。在健康供体中，CD69主要由完全成熟的CD56^暗CD16⁺细胞表达(图3A)，而在血液恶性肿瘤患者中，在其他NK细胞亚类中也检测到CD69⁺细胞(图3A)。事实上，与健康供体相比，在这样的患者中所有的NK亚类都观察到CD69表达，而与其成熟程度无关(图3B)。对患者的不同CD45群体中CD69表达的分析显示：与健康对照相比，存在共表达CD69和CD45RO的较大量的CD45RA和CD45RA^暗细胞(图3B和图3C)。CD45RO⁺细胞主要是CD69⁺(图3C)；然而，反过来并不成立，这是由于大多数CD69⁺细胞不是CD45RO。健康供体中CD45RO⁺细胞数量非常少，无法对该群体进行任何有意义的分析。

在健康供体中，CD45RA^暗细胞主要是CD69^-(图3B和图3D)。CD45RA^暗细胞在患者中显著增加且许多也是CD69⁺。然而，CD45RA表达的减少并不总是与CD69表达的获得相关。事实上，患者的样品尤其在CD45RA^暗CD69^-和CD45RA CD69⁺中富集，在CD45RA^暗CD69⁺细胞中富集较低。由于无法获得AML患者的血样，我们使用骨髓(bm)样品并获得相似的结果(图3C和图3D)。来自MM患者的骨髓显示出相似的模式。不幸的是，我们不能分析来自健康供体的骨髓样品，因此我们不能确定地、如血液样品中那样推断出血液恶性肿瘤患者和健康供体的骨髓样品中的NK细胞是不同的。然而，来自MM患者的血液和骨髓样品中NK细胞群体相似表明在血液中发现的健康供体-患者差异也存在于骨髓中。

总之，患者在所有NK细胞亚类中均显示出CD69表达的增加，但CD45RA中CD69⁺细胞的相对百分比高于CD45RA^暗细胞(图3B)。这些数据表明CD69上调与CD45RA下调和CD45RO上调一起与NK细胞活化相配。CD69⁺细胞主要在终末分化的CD56^暗CD16⁺亚类(图3A)中，而CD45RA^暗细胞主要在未成熟群体(CD56^亮和CD56^暗CD16^暗)中。这一发现表明CD45RA的丢失和CD69表达的获得鉴定两种不同的生理过程且这两种群体可能具有不同的功能。相反，与CD45同种型的表达相比，不同NK细胞亚类中的CD69表达没能改善对血液恶性肿瘤患者的鉴定。

不同CD45同种型的表达离体鉴定不同的NK细胞功能

为了鉴定不同NK细胞亚类的功能，首先我们通过用抗CD107a抗体体外染色PBMC来测试细胞脱粒(图4A)。在健康供体中，约40×10³个细胞/百万个NK细胞为CD107a⁺。这些细胞中的大多数是CD45RA(要么是CD69⁺要么是CD69^-)，少量细胞是CD45RO⁺。显著地，所有CD45RARO和大多数CD45RA^暗RO细胞是CD107a⁺(图4B)。总体而言，在CD69⁺中观察到CD107a表达比在CD69^-细胞中高，并且CD45RA下调与CD107a表达的获得并不相关。

来自血液癌症患者的NK细胞显示出CD107a⁺细胞的大量增加(图4A)，尤其是在这些患者中特异性增加的CD69⁺和/或CD45RO⁺亚类中大量增加。此外，与CD69^-亚类相比，CD69⁺亚类中CD107a⁺细胞的百分比更高，而CD45RA表达的减少与脱粒的增加无关(图4B)。与健康供体一样，CD45RARO CD69⁺和CD45RA^暗RO CD69⁺部分(以较低的程度)主要含有已脱粒的细胞。这不仅在循环NK细胞中出现，因为对于来自MM和AML患者的骨髓样品的NK细胞也获得了相似的结果(图4C上部的图片)。

然后，我们测试了从转铁蛋白到细胞的铁递送所需的转铁蛋白受体蛋白1(TfR1或CD71)的表达。CD71表达在活性代谢细胞中增加，这是因为铁是用于基本生物化学活性(如氧转运、能量代谢和DNA合成)的辅因子(40)。与CD45RARO细胞的高代谢活性一致(图4B)，CD71表达在健康对照和血液恶性肿瘤患者的CD45RO⁺细胞中都更高(图4D)。此外，这些细胞中的大多数也表达增殖标志物Ki-67(图4E)。与CD69^-亚类相比，CD69⁺中CD71和Ki-67表达也适度地提高。

总之，我们的结果表明CD45RO⁺细胞(尤其是在它们也表达CD45RA的情况下)获得CD69表达，更大并具有更高的粒度和代谢(图4D)、增殖(图4E)和脱粒(图4B)。这些发现表明CD45RARO细胞，以及可能还有CD45RA^暗RO细胞，是识别肿瘤细胞和脱粒的NK细胞。CD45RAROCD107a⁺细胞主要属于CD56^暗CD16⁺部分，而CD45RA^暗RO CD107a⁺细胞主要是CD56^暗CD16^暗细胞。

来自血液癌症患者的其他NK细胞亚类在体外显示针对K562细胞的细胞溶解活性

为了研究来自血液癌症患者的其他NK细胞亚类是否具有脱粒的内在缺陷，我们使用K562靶细胞培养来自健康供体或患者的PBMC。在健康供体中，离体时已经较高的脱粒CD45RO⁺细胞的数目几乎增加到100％。CD107a⁺细胞的百分比尤其在CD45RA^暗亚类和CD69⁺亚类中增加。类似地，来自血液恶性肿瘤患者的所有NK细胞群体(尤其是CD45RA^暗细胞)也保留了脱粒的能力。

然而，在我们的分析中，我们可能低估了脱粒的CD69^-或CD45RA^暗细胞的百分比，这是因为在与靶细胞孵育4小时后，CD69和/或CD45同种型的表达可能已经改变。因此，我们首先用抗CD69和抗CD45RA抗体孵育PBMC以确定基础NK细胞表型，然后我们分析暴露于K562细胞后的CD107a表达(附加图2)。事实上，在与靶细胞接触之前的NK细胞谱与体外观察到的表型相似，表明这是一种有效的方法。与靶细胞在体外孵育(4小时)后，CD45RA和CD45RA^暗群体中CD69⁺细胞的数目迅速增加(两种亚类中均有约100％的增加)。然而，CD45RA和CD45RA^暗细胞的整体百分比在此期间保持稳定(附加图2)。我们认识到来自健康供体的CD69^-NK细胞的脱粒比图7A中所示的高(图7C)。活化的细胞可能同时获得CD69和CD107a表达。这在来自血液癌症患者的NK细胞中更加明显，血液癌症患者中大部分细胞在CD69^-细胞初期脱粒。暴露于靶细胞后获得CD69表达的CD45RA^暗细胞主要为CD56^暗CD16^暗和完全成熟的CD56^暗CD16⁺。总之，CD45RA^暗细胞也可以至少通过获得CD69和CD107a表达来响应刺激。

CD45RARO NK细胞在体内进行胞啃(trogocytosis)

为了研究CD45RARO细胞是否在体内表现出抗肿瘤活性，我们研究了这些细胞是否对肿瘤靶标进行胞啃。胞啃是一种淋巴细胞从相互作用的细胞中提取表面分子并在其自身表面上表达它们的过程，该过程已在离体B淋巴母细胞白血病(B ALL)中观察到。因为在这个实验中我们研究了其他细胞类型的标志物，我们使用双标记来鉴定NK细胞并对CD56⁺NKP46⁺细胞进行门选。我们观察到来自BCL患者的14％的NK细胞在其膜中表达BCL标志物CD19(图5A)。该数值在CD45RARO群体中增加至52％，而在其他群体中低得多。尽管NK细胞群体主要是CD45RA^暗RO，但该群体也获得了骨髓标志物CD14的较低水平的表达。然而，两种标志物染色均呈阳性的NK细胞非常罕见。这表明两个不同的NK细胞群体进行着胞啃，而CD45RARO正在对肿瘤细胞进行胞啃。我们在另一种CD19⁺疾病B-CLL中观察到非常相似的结果(附加图3)。为了排除NK细胞不是在所有肿瘤中都获得CD19，我们研究了来自AML患者的NK细胞(图5B)。约10％的NK细胞表达AML标志物CD14，且仅有3％表达所有NK细胞群中均表达的CD19。相比之下，90％的CD45RARO表达CD14，这表明他们在AML患者的CD14⁺群体中大规模地进行胞啃。总之，我们的数据显示NK细胞对肿瘤细胞进行胞啃且由CD45RARO群体对此负责。因此，CD45RARO NK细胞的应用可以用作鉴定血液癌症患者(如果该群体存在)和疾病种类(在膜中表达的标志物)的诊断工具。

CD45RARO群体的表型表征

CD45RARO细胞属于CD56⁺CD16⁺亚类且大部分表达成熟标志物CD57，尽管它们的一半共表达CD62L。CD45RARO群体包含较高百分比的表达KIR的细胞，尽管其仅对CD158e在统计学上是显著的。GzmB+细胞的百分比与其他亚类相似，但该细胞因子的细胞内水平较低。这可能是由于生产的缺乏或近期的脱粒已经清空细胞内的存储。CD45RARO细胞与另一个成熟标志物的CD45RA相比也表达相似水平的CD161/杀伤细胞凝集素样受体亚家族B成员1(KLRB1)或天然细胞毒性受体(NCR)NKP46以及稍高水平的活化NKG2D受体。然而，他们显示较低水平的CD94糖蛋白和可能较低水平的抑制性NK受体NKG2A。总之，CD45RARO细胞是完全成熟的NK细胞，主要表达成熟细胞的NK受体。

CD45RARO群体的代谢表征

活化的淋巴细胞通常增大了它们的尺寸(Skak et al.,2008；Zarcone et al.,1987)并且变成高代谢活性细胞(Sanchez-Martinez et al.,2015；Sanchez-Martinez etal.,2014)。丝氨酸/苏氨酸激酶mTor可能在NK细胞活化后使代谢转变与细胞骨架组织相联系(Marcais and Walzer,2014)。我们观察到来自MM患者的NK细胞亚型尺寸(FS)更大，粒度(SS)高，且对应于CD45RARO细胞(图7A)。这表明它们是与其他NK亚类相比具有更高的代谢活性的活化的细胞。因此，我们通过将NK细胞与爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)类淋巴母细胞细胞系PLH孵育来在体外活化NK细胞。为了支撑NK细胞的存活，我们添加了低浓度的两种NK细胞活化细胞因子：IL-2(100U/ml)和IL-15(5ng/ml)(Anel et al.,2012)。我们孵育NK细胞长达20天以反映长期活化。与以前的报道(Skak et al.,2008；Zarcone et al.,1987)一致，10天的活化诱导了尺寸(FCS)和粒度(SSC)增加，这在第20天更加相关。

在体外活化3天后，NK细胞开始丢失CD45RA。然而，如果真正的CD45RARO群体出现或细胞丢失CD45RA而获得CD45RO，则是有问题的。在最初活化的10天后，大多数细胞是CD45RA^-CD45RO⁺。然而，在第20天，培养物中出现了CD45RARO群体。这不排除辅佐细胞的存在，因为用细胞因子的长期活化产生了类似的模式。总之，CD45RARO NK细胞在长期活化后也在体外存活下来。接下来，我们评估了患者CD45RARO群体的体外活化。细胞因子诱导活化三天引起了CD45同种型表达的强烈重排，且无法评估个别群体的真实性。这些结果进一步表明，CD45RARO细胞至少在体外可以改变它们的CD45表型。

然后，我们测定了从转铁蛋白到细胞的铁递送所需的转铁蛋白受体蛋白1(TfR1或CD71)的表达。CD71表达在活性代谢细胞中增加，这是因为铁是用于基本生物化学活性(如氧转运、能量代谢和DNA合成)的辅因子(Wang and Pantopoulos,2011)。与CD45RARO细胞的高FS和SS所表明的较高代谢活性一致，健康对照和血液恶性肿瘤患者的CD45RO⁺细胞中的CD71表达均较高(图7B)。此外，这些细胞中的大多数也表达增殖标志物Ki-67(图7C)。总之，CD45RARO细胞代表处于增殖的高代谢细胞的NK亚类。

CD69表达在NK细胞刺激后增加，且被认为是NK细胞活化的真正标志物(Elpek etal.,2010)，包括离体情况(Vey et al.,2012)。患者中不同的CD45群体中的CD69表达分析显示CD45RO⁺细胞主要是CD69⁺(图7D)；但反过来并不成立，这是由于大多数CD69⁺细胞不是CD45RO。健康供体中CD45RO⁺细胞数量非常少，无法对该群体进行任何有意义的分析。

在健康供体中，CD45RA^暗细胞主要是CD69^-(图7E)。在患者中，CD45RA^暗细胞显著增加且许多也是CD69⁺。然而，CD45RA表达的减少并不总与CD69表达获得相关。事实上，患者的样品尤其在CD45RA^暗CD69^-和CD45RA CD69⁺中富集，在CD45RA^暗CD69⁺细胞中富集程度较低。这一发现表明CD45RA的丢失和CD69表达的获得识别两种不同的生理过程，且这两种群体可能具有不同的功能。

CD45RARO群体的功能表征

为了鉴定不同NK细胞亚类的功能，首先我们通过用抗CD107a抗体在体外对PBMC进行染色来评估细胞脱粒(图8A)。在健康供体中，约1％的NK细胞是CD107a⁺。这些细胞中的大多数是CD45RA，少量是CD45RO⁺细胞。显著地，大多数CD45RARO和一半的CD45RA^暗RO细胞是CD107a⁺(图8B)。

来自血液癌症患者的NK细胞显示CD107a⁺细胞大量增加(图8A)，尤其是在这些患者中特异性增加的CD45RO⁺亚类中大量增加。CD45RA表达的减少与脱粒的增加无关(图8B)。与健康供体一样，CD45RARO和较少的CD45RA^暗RO部分主要含有已脱粒的细胞(图8B)。与CD45RO^-群体相比，这两个群体的中值CD107a-MFI大大增加。这不仅是循环NK细胞的情况，因为对于来自MM和AML患者的骨髓样品的NK细胞也获得了相似的结果(图8B和图8C上部的图片)。相比之下，CD45RARO细胞显示低GzmB含量。我们的解释是CD45RARO细胞近期在体内进行了脱粒。

在使用K562作为靶标细胞进行体外分析之后，尽管其他群体脱粒显著增加，但CD45RARO细胞继续显示出更高的脱粒率(图8C底部的图片)。令人关注的是，不同的CD45NK细胞亚类在4小时体外细胞毒性试验后没有改变。该结果和体外活化结果显示CD45RA和CD45RO的表达在短时间内是稳定的，但是可以在长期持续活化后改变。

讨论：

鉴定新的人类NK细胞群体对于理解其生理学和改善其在临床中的治疗用途是重要的。在这里，我们表明鉴定不同的NK细胞群体也可以提供关于主体生理状态的有价值的信息。事实上，在成熟区室中存在的大量CD45RA^暗和CD45RO⁺细胞可以清楚地鉴定血液恶性肿瘤患者。因此，我们假设它们的检测可以用作血液癌症的诊断工具，且由于这些特定的NK细胞群体会在消除靶向的肿瘤细胞时减少，因此它们还可以用于评估抗肿瘤治疗的功效。

在宿主免疫系统受损时，增强了白血病发生(41,42)。其他人和我们已经表明在几个小鼠模型中需要完全功能性NK细胞(43～48)来根除血源性肿瘤，并且NK细胞浸润与几种癌症的良好预后相关联(49～51)。同种异体反应性NK细胞的使用可代表新的癌症疗法(特别是对于造血起源的肿瘤)。事实上，移植物与宿主(GvH)定向中的KIR-KIR配体不相容性改善了临床中不相关的脐带血干细胞移植(UCBT)后的结果(52,53)，其中移植物与宿主(GvH)定向主要基于NK细胞的同种异体反应性。此外，NK细胞：i)对GvH疾病(GvHD)不负责；ii)可以作为“分化的”细胞注射，因此不需要在患者体内长时间存活；iii)防止机会性感染(52)，这可能通过它们对B细胞和T细胞、巨噬细胞和更重要的多形核细胞的免疫调节作用来实现(54)。然而，体内NK细胞活化的评估是困难的，这是因为我们缺乏对它们进行分析的有效方法。通常使用的是CD69表达(6,17)；然而，我们的结果显示CD69表达不意味着脱粒和溶细胞活性，而脱粒和溶细胞活性被认为是NK细胞抗肿瘤活性的最重要的组成部分(12)。与此相反，我们的工作表明CD45RO表达在血液恶性肿瘤患者中鉴定了脱粒的NK细胞亚类。我们认为，同样涉及NK细胞活性的有效抗肿瘤疗法(例如抗肿瘤抗原的单克隆抗体)应该也增加了这类NK细胞群体。

此外，在临床上标准使用同种异体NK细胞之前最重要的未解决问题是移植足够数量的显示有效抗肿瘤活性的细胞。为此，关键是确定不同的NK细胞群体及其细胞溶解活性。在这里，我们证明CD45同种型的表达应有利于这项任务且在CD45RARO群体中脱粒是增强的。因此，在自体NK细胞扩增期间增加CD45RO⁺亚类的方案应会得出更好的临床结果。

CD45活性通过二聚化调节，在质膜上自发的CD45同源二聚化抑制了其活性(55)。CD45胞外结构域的大小与CD45二聚化的程度成反比，因此与自身抑制作用成反比(55)。较大的CD45同种型(例如CD45RA)较不有效地二聚化，因此它们应比较小的同种型(例如CD45RO)更好地促进TCR信号传导(19)。然而，CD45活性也取决于其质膜定位，并因此取决于其胞外结构域(19,56)。至少在T细胞中，太高的CD45活性导致Src激酶中的活化残基去磷酸化，而太低的CD45活性可能留下磷酸化的抑制性残基。因此，对于有效的NK细胞活化重要的是CD45活性保持在特定窗口内(26)，并且特定的CD45同种型的量将调节最终的活性。我们发现CD45RARO NK细胞显示出最大的溶细胞活性，这表明CD45RA和CD45RO同种型的表达可能给予NK细胞适当水平的CD45活性来进行有效的信号传导以提高其细胞溶解活性。这与小鼠体内的结果一致，其中CD45是NK细胞的完全细胞毒性活性所需的(57)。然而，CD45不是体外NK细胞毒性所必需的(31～33)。与此相一致，我们观察到在体外其他表达不同CD45同种型的NK细胞亚类也显示出细胞毒性活性。

此外，不同CD45同种型的表达改变CD45配体的识别。例如，不同CD45同种型上的O-聚糖的丰度和类型调节细胞对半乳凝素-1的敏感性(58)。由肿瘤细胞大量产生的半乳凝素-1阻断了T细胞介导的细胞毒性反应(59)并诱导胸腺细胞和T细胞的凋亡(58)。通过CD45RO的表达，基于其对半乳凝素-1或其它配体的抗性来选择抗肿瘤NK细胞是可能的。实际上，由于O-聚糖主要结合CD45胞外结构域，因此表达短CD45同种型的细胞(如CD45RO)将具有相对较少的O-聚糖，从而对半乳凝素-1更具抗性。

在体外，我们发现来自健康供体的外周血样品中非常少的、表达CD45RO的NK细胞。这是令人惊讶的，特别是如果像已经提出的那样：CD45RO表达鉴定记忆NK细胞(30)。该发现表明，在血液样品中记忆NK细胞的量可能极低或者CD45RO可能不是记忆NK细胞的标志物。或者，NK细胞中的CD45RO表达可能在离体样品处理期间特异性减少。我们认为这是不可能的，因为NK细胞比其他淋巴细胞类型表达的总CD45水平稍高(图1)。事实上，我们发现CD45RO多数与效应NK细胞相关；然而，与在大多数T细胞群体中观察到的不同，CD45RA的下调不需要NK细胞活化。这表明在NK细胞中，不同CD45同种型的表达与在T细胞中所起作用不同。

参考文献：

在本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的状态。这些参考文献的公开内容通过引用的方式并入本公开中。

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Claims

1.一种用于诊断患者中的血液癌症的方法，所述方法包括：i)检测从所述患者获得的样品中的CD45RARO NK细胞的存在，以及ii)当在所述样品中检测到CD45RARO NK细胞的存在时，推断所述患者患有血液癌症。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血液癌症选自由白血病、淋巴瘤和骨髓瘤所组成的组。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述血液癌症是成熟(外周)B细胞肿瘤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述血液癌症选自由B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤，如脾边缘区B细胞淋巴瘤(+/-绒毛淋巴细胞)、淋巴结边缘区淋巴瘤(+/-单核细胞B细胞)和粘膜相关淋巴组织(MALT)型结外边缘区B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤；滤泡型淋巴瘤、滤泡中心；套细胞淋巴瘤；弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(包括纵隔大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤和原发性渗出性淋巴瘤)；和伯基特淋巴瘤/伯基特细胞白血病所组成的组。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述血液癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡型淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)或B细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)所组成的组。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述血液癌症选自由B细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、T/NK细胞肿瘤、间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、前体T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病(HTLV1+)、原发性CNS淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多形性移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、AIDS相关淋巴瘤、真性组织细胞性淋巴瘤和母细胞性NK细胞淋巴瘤所组成的组。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述白血病选自由急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)所组成的组。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是血液样品或骨髓样品。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，由检测CD45RARO NK细胞存在所组成的步骤涉及使用：适合于将NK细胞与其他细胞区分开的一组结合配偶体；以及，包括特异性针对CD45RA的至少一种差异性结合配偶体和特异性针对CD45RO的至少一种差异性结合配偶体的一组结合配偶体。

10.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括检测所述CD45RARO NK细胞上的至少一种表型标志物的存在的步骤，其中，所述至少一种表型标志物的存在表明所述血液癌症的性质。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括由检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种表型标志物所组成的步骤。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述表型标志物是CD分子，所述CD分子选自由CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15u、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD46、CD47R、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CDw113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CDw156C、CD157、CD158、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD162R、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CDw186、CD191、CD192、CD193、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CDw197、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CDw210、CD212、CD213a1、CD213a2、CDw217、CDw218a、CDw218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD235ab、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240D、CD240DCE、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD289、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CDw325、CD326、CDw327、CDw328、CDw329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CDw338和CD339所组成的组。

13.一种用于监测患血液癌症的患者的治疗有效性的方法，所述方法包括：i)检测来自所述患者的血液样品中的CD45RARO NK细胞的存在，以及ii)当在所述血液样品中未检测到CD45RARO NK细胞的存在时，推断所述患者的治疗是有效的。

14.一种用于在有需要的主体中治疗血液癌症的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)通过执行根据权利要求1～12中任一项所述的方法，鉴定患有血液癌症的主体，