CN110511900B - 精子细胞表面标志物的筛选与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及精子细胞表面标志物的筛选与应用，本发明的筛选方法包括：提供表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠；对所述雄鼠实施精子发生同步化处理；获取所述雄鼠同步化后的不同发育阶段的生精细胞；和对所述生精细胞进行转录组测序，建立精子发生过程中的转录图谱，对转录图谱进行分析，从而筛选获得生精细胞内差异表达的表面蛋白，作为生精细胞表面标志物。本发明建立了一种便捷、高效的获取特定发育阶段精子细胞的方式，为科学研究生精细胞发育提供了技术支撑，同时为开发分离获取人不同发育阶段生精细胞的技术提供重要参考。

Description

精子细胞表面标志物的筛选与应用
技术领域
本发明涉及精子细胞表面标志物的筛选与应用。
背景技术
人口数量和质量关乎全球民生，而精子健康与之直接相关。值得注意的是，全球人类精子的数量和质量正在持续下降，而由此造成的男性不育症影响着5％以上的育龄夫妇，并且呈日益增加趋势。临床上的非阻塞性无精症、少精症、弱精症及畸精症是精子发生障碍的主要表现；同时，精子发生障碍也是导致自发性流产和胚胎发育异常的重要原因之一。然而，目前对精子发生异常的确切机制所知不多，而基于精子发生调控机制的动物临床诊疗手段的开发更是少之又少。
哺乳动物的精子发生是一个高度复杂和有序的过程，以小鼠为例，精子发生包括三个主要阶段：1)精原细胞增殖：包括精原干细胞的自我更新和分化，在维持精原细胞数目稳定的同时保证了精子发生的持续性；2)精母细胞减数分裂：减数分裂为生殖细胞所特有的生物学事件，是生物有性生殖的基础。在减数分裂过程中，染色体复制一次，但是分离两次，依次包括同源染色体分离和姐妹染色单体分离，从而产生单倍体的配子。在此过程中，同源染色体的非姐妹染色单体间发生配对、联会和重组交换，而非同源染色体分配时自由组合，从而使配子呈现遗传多样化，增加了后代的适应性；3)精子形成：单倍体的圆形精子细胞通过一系列(十六步)的形态变化过程，最终变态转化为精子在此过程中主要发生了顶体形成、组蛋白-鱼精蛋白转换、核浓缩和包装重建等精子细胞特异的生物学事件。
然而，关于哺乳动物精子发生调控机制的研究目前仍存在着巨大挑战，其主要表现在：一方面，目前尚没有成熟的生殖细胞体外培养体系；另一方面，由于精子发生是连续且非同步的，目前没有很好的手段从体内分离、纯化高纯度的各级生精细胞。由于上述技术瓶颈，当前关于精子发生机制的研究大多是采用了纯度有限的混合细胞为实验材料。而精子发生中即使相邻发育阶段的细胞内发生的生物学事件都可能差异很大，以混合细胞为实验材料研究精子发生的分子机制可能会导致重要信息的丢失。因此，建立不同发育阶段生精细胞的分离纯化体系，将为科学研究生精细胞发育提供技术支撑，同时为开发分离获取人不同发育阶段的生精细胞技术提供重要参考。
发明内容
本发明的目的在于建立一种便捷的分离纯化不同发育阶段生精细胞的体系，其内容包括应用精子发生同步化技术分离获取不同发育阶段的生精细胞并进行转录组测序，从中筛选能够区分不同发育阶段精子细胞的表面标志物，并应用所筛选的表面标志物分离纯化特定类型的精子细胞。
本发明的第一方面提供一种生精细胞表面标志物的筛选方法，所述方法包括：
(1)提供表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠；
(2)对所述雄鼠实施精子发生同步化处理；
(3)获取所述雄鼠同步化后的不同发育阶段的生精细胞；和
(4)对所述生精细胞进行转录组测序，对测序结果进行分析，筛选获得生精细胞内差异表达的表面蛋白，作为不同发育阶段生精细胞表面标志物。
在一个或多个实施方案中，所述生殖细胞特异性表达基因为Vasa基因。
在一个或多个实施方案中，所述报告基因含有所述生殖细胞特异性表达基因和荧光蛋白的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠还表达未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因。
在一个或多个实施方案中，所述未分化型精原细胞特异性表达基因为Lin28基因。
在一个或多个实施方案中，所述未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因含有未分化型精原细胞特异性表达基因和荧光蛋白编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因中的荧光蛋白颜色不同于所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因中的荧光蛋白颜色。
在一个或多个实施方案中，通过CRISPR/Cas9技术构建所述雄鼠。
在一个或多个实施方案中，分别将P2A-YFP与P2A-dTomato序列插入Lin28和Vasa基因编码序列最后一个外显子的3’端，构建得到Lin28-P2A-YFP及Vasa-P2A-dTomato两种荧光报告基因，用于构建所述雄鼠。
在一个或多个实施方案中，所述精子发生同步化处理包括：从所述雄鼠出生第二天起连续7天饲喂维甲酸合成的抑制剂，在第8天给予维甲酸。
在一个或多个实施方案中，所述维甲酸合成的抑制剂为WIN18,446。
在一个或多个实施方案中，对转录组的分析中，通过t-SNE将生精细胞进行分类，并通过比较不同的表面标志物在各类细胞内的表达情况，筛选得到差异表达的表面标志物。
在一个或多个实施方案中，获取不同发育阶段的生精细胞进行转录组分析。
本发明第二方面还提供用于分离纯化特定类型的精子细胞的Cd37、Cd63、Cd96和Cd177。
具体而言，在某些实施方案中，本发明提供选自Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种任意三种或全部四种在分选不同发育阶段的圆形精子细胞中的应用，或在制备用于分选不同发育阶段的圆形精子细胞的试剂盒中的应用。
本发明第三方面提供选自Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种任意三种或全部四种的检测试剂在分选不同发育阶段的圆形精子细胞中的应用，或在制备用于分选不同发育阶段的圆形精子细胞的试剂盒中的应用。
在某些实施方案中，所述检测试剂为所述Cd37、Cd63、Cd96和Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗体携带荧光标记。
本发明第四方面提供一种试剂盒，所述试剂盒含有选自Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种任意三种或全部四种的检测试剂。
本发明第五方面提供一种分选不同发育阶段的圆形精子细胞的方法，所述方法包括：
(1)制备含生精细胞的悬液；
(2)加入选自Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种任意三种或全部四种表面标志物的检测试剂，孵育所述生精细胞；和
(3)根据所述检测试剂发出的信号分选出不同发育阶段的圆形精子细胞。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：对所述生精细胞进行染色、然后在与所述检测试剂孵育。
在一个或多个实施方案中，对所述生精细胞进行Hoechst染色。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括，根据Hoechst信号划分出单倍体精子细胞，然后根据表面标志物的荧光信号分选出不同发育阶段的圆形精子细胞。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为所述Cd37、Cd63、Cd96和Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述抗体携带荧光标记。
在一个或多个实施方案中，使用Cd63和/或Cd177的检测试剂分选获得早期圆形精子RS2；使用Cd37和/或Cd96的检测试剂分选获得晚期圆形精子RS8。
在一个或多个实施方案中，所述生精细胞为哺乳动物或啮齿类动物的生精细胞，尤其为人的生精细胞。
附图说明
图1：Vasa-P2A-dTomato和Lin28a-P2A-YFP的生殖细胞Knock-In报告子小鼠验证。(A)成年雄性Lin28a-P2A-YFP小鼠生精小管免疫荧光染色结果；(B)成年雄性Lin28a-P2A-YFP小鼠冰冻切片免疫荧光染色结果；(C)成年雄性Vasa-P2A-dTomato小鼠冰冻切片免疫荧光染色结果。标尺＝50μm。
图2：精子发生同步化获得各级生精细胞方法的建立。(A)精子发生同步化模式图；(B)应用精子发生同步化结合荧光小鼠获得各级生精细胞的策略。
图3：不同发育阶段生精细胞表面标志物的筛选。(A)(B)t-SNE分析将生精细胞划分为7个大类，分别以细胞类型(A)和Cluster(B)标记细胞；(C)箱线图展示了4种不同的表面标志物(Cd37、Cd63、Cd96和Cd177)在7个大类中的表达水平。
图4：应用表面标志物分离纯化不同时期精子细胞的方法。以Cd63和Cd37的抗体或Cd63和Cd96的抗体共同标记细胞所分离获得的不同时期圆形精子细胞的PNA荧光染色结果。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明应用精子发生同步化结合荧光标记，分离纯化出了高纯度的各级生精细胞，并应用单细胞转录组测序技术建立了精子发生过程中转录图谱。基于此，本发明人筛选了在不同类群细胞中差异表达的表面标志物，并应用所筛选的表面标志物成功分离纯化了不同发育阶段的圆形精子细胞，建立了一种便捷、高效的获取特定发育阶段精子细胞的方式，为科学研究生精细胞发育提供了技术支撑，同时为开发分离获取人不同发育阶段的生精细胞技术提供重要参考。
精子发生的不同步源于精原细胞分化的不同步。维甲酸为精原细胞分化所必需。本发明采用精子发生同步化技术，通过对新生小鼠连续7天饲喂维甲酸合成的抑制剂(如WIN18,446)使精原细胞阻滞于未分化阶段，在第8天时通过腹腔注射维甲酸，使精原细胞同步分化。由于分化后的细胞周期相对固定，可以根据维甲酸注射的时间推测同步化的细胞所处的时期，再结合细胞周期检测、核型分析、已知特异性标志物染色从而确定不同同步化时间所获得的不同细胞类型。适用于本发明的精子发生同步化技术可参见Agrimson等，Retinoic acid deficiency leads to an increase in spermatogonial stem numberin the neonatal mouse testis,but excess retinoic acid results in no change，Dev Biol 432,229-236,doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.002(2017)，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。
注射维甲酸后，可在不同时间段获得不同发育阶段的生精细胞，对该生精细胞进行单细胞转录组测序。可采用已知的方法进行转录组测序，例如可参照Li等，Single-CellRNA-Seq Analysis Maps Development of Human Germline Cells and Gonadal NicheInteractions，Cell Stem Cell 20,891-892,doi:10.1016/j.stem.2017.05.009(2017)所公开的方法，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。
测序后对转录组进行分析中，通过t-SNE将20类生精细胞划分成7个大类，通过比较不同的表面标志物在7个大类细胞内的表达情况，可筛选得到差异表达的表面标志物。
通常，可使用表达所有生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠来实施上述筛选。所有生殖细胞特异性表达基因为本领域所周知，包括但不限于Vasa基因(由Genbank中登陆号为AAI44761.1的序列编码)、Dazl基因(由Genbank中登陆号为AAH99940.1的序列编码)。通常，该报告基因还含有编码标签蛋白如荧光蛋白的核酸序列。本领域周知的荧光蛋白，如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白和橙色荧光蛋白等，都可用于本发明。例如，在某些实施方案中，可将P2A-荧光蛋白(如dTomato)的编码序列插入Vasa基因编码序列最后一个外显子的3’端，构建得到Vasa-P2A-荧光蛋白荧光报告基因。可通过CRISPR/Cas9技术构建所述雄鼠。
由于未分化型精原细胞是未同步化的细胞，为了避免未分化型精原细胞的污染，在某些实施方案中，所述表达所有生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠同时还表达未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因，即该雄鼠携带两种报告基因。本文中，未分化型精原细胞特异性表达基因包括但不限于Lin28基因(由Genbank中登陆号为NP_665832.1的序列编码)、Plzf基因(由Genbank中登陆号为AAI32442.1的序列编码)。通常，该报告基因还含有编码标签蛋白如荧光蛋白的核酸序列。本领域周知的荧光蛋白，如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白和橙色荧光蛋白等，都可用于本发明。例如，在某些实施方案中，可将P2A-荧光蛋白(如YFP)的编码序列插入Lin28基因编码序列最后一个外显子的3’端，构建得到Lin28-P2A-荧光蛋白荧光报告基因。通常，未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因中的荧光蛋白颜色不同于所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因中的荧光蛋白颜色。
可通过本领域周知的CRISPR/Cas9技术来构建本文所述的雄鼠。
将携带两种荧光标记的小鼠进行精子发生同步化处理，其荧光双阳性生精细胞为未分化型精原细胞，荧光单阳性生精细胞为同步化的生精细胞。在不同的发育阶段获得可获得相应阶段的生精细胞。采用本文所述的筛选方法，本文共获取了包括精原细胞阶段的A1型精原细胞(A1)、中间型精原细胞(In)、B型精原细胞S期(BS)、B型精原细胞G2M期(BG2)，细线前期精母细胞阶段的G1期(G1)、早期(epL)、中期(mpL)、晚期(lpL)，减数分裂阶段的细线期(L)、偶线期(Z)、粗线期早期(eP)、粗线期中期(mP)、粗线期晚期(lP)、双线期(D)、第一次减数分裂分裂期(MI)、第二次减数分裂分裂期(MII)以及圆形精子细胞阶段1-2步(RS2)、3-4步(RS4)、5-6步(RS6)、7-8步(RS8)在内共20种不同发育阶段的生精细胞。
将所获得的不同发育阶段的生精细胞进行单细胞转录组测序。在对转录组的分析中，通过t-SNE将20类生精细胞划分成7个大类，通过比较不同的表面标志物在7个大类细胞内的表达情况，筛选差异表达的表面标志物。在本发明的某些实施方案中，本发明发现，圆形精子阶段共4类细胞被聚类到了3个不同的clusters里面，其中RS2聚类到Cluster5(C5)，RS4和RS6聚类到Cluster6(C6)，RS8聚类到Cluster7(C7)。不同的表面标志物中，Cd37、Cd63、Cd96和Cd177在不同Cluster中表达差异较大，例如，Cd37只表达于C7，可作为以RS8为主的晚期精子细胞的表面标志物；Cd63在C5表达较高，几乎不表达于C6和C7，可作为以RS2为主的早期精子细胞的表面标志物。在用于分选时，其中的单个或多个表面标志物的组合可用于分选不同发育阶段的圆形精子细胞。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白、其基因序列以及它们的应用。本文中，Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白具有本领域周知的含义，包括来自不同物种如哺乳动物(尤其是人)但与周知的鼠Cd37、Cd63、Cd96和Cd177具有相同生物学功能(通常与鼠Cd37、Cd63、Cd96和Cd177具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性)的蛋白。本文中，Genbank中鼠Cd37蛋白的登陆号为CAJ18425.1，Cd63蛋白的登陆号为CAJ18387.1，Cd96蛋白的登陆号为AAH52865，Cd177蛋白的登陆号为NP_081138.2。因此，在某些实施方案中，本发明涉及分别与CAJ18425.1、CAJ18387.1、AAH52865和NP_081138.2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的蛋白或其编码序列的应用。在某些实施方案中，本文所述的Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白是来自人的Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白。Genbank中，人Cd37的登陆号为CAG46675.1，Cd63的登陆号为AHI51903.1，Cd96的登陆号为AAH20749.1，Cd177的登陆号为BAE93254.1。因此，本发明涉及人Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白或其编码序列的应用。在某些实施方案中，本发明还涉及与人Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的蛋白或其编码序列的应用。应理解的是，即便是在同一物种中Cd37、Cd63、Cd96和Cd177蛋白或其编码序列也可能存在不同的变异体，基于这些变异体的本文所述的各种应用在包括在本文的范围之内。
本发明的应用包括分离纯化特定类型的精子细胞。例如，本发明Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种、任意三种或全部四种作为表面标志物在分离纯化或分选特定类型的精子细胞，尤其是不同发育阶段的圆形精子细胞中的应用。本发明的应用还包括在制备用于分选不同发育阶段的圆形精子细胞的试剂盒中的应用。例如，可使用Cd37、Cd63、Cd96和Cd177或通过其编码序列来制备Cd37、Cd63、Cd96和Cd177各自的检测试剂，用以制备本文所述的试剂盒。通常，Cd37、Cd63、Cd96和Cd177的检测试剂可以是与Cd37、Cd63、Cd96或Cd177特异性结合的抗体或其抗原结合片段。抗体可携带荧光标记。可采用本领域已知的Cd37、Cd63、Cd96或Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段，例如可使用市售的抗体或其抗原结合片段，也可采用已知的抗体制备技术如杂交瘤技术自行制备本文所述的特异性抗体或其抗原结合片段。
因此，在某些实施方案中，本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒可用于分选特定类型的精子细胞，尤其是不同发育阶段的圆形精子细胞。该试剂盒含有Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种、任意三种或全部四种的检测试剂。试剂盒中还可含有其它分选特定类型的精子细胞所需的试剂，包括例如样品制备所需的试剂，进行流式细胞分选所需的试剂。例如，样品制备所需的试剂包括但不限于胰酶、DNA酶、FBS、DMEM、BSA等，进行流式细胞分选所需的试剂包括对细胞进行染色所需的试剂，如Hoechst试剂等。
本发明也包括以Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种、任意三种或全部四种作为表面标志物分选不同发育阶段的圆形精子细胞的方法，该方法包括：(1)提供含生精细胞的悬液；(2)加入选自Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种任意三种或全部四种表面标志物的检测试剂，孵育所述生精细胞；和(3)根据所述检测试剂发出的信号分选出不同发育阶段的圆形精子细胞。需要时，可对所述生精细胞进行染色，如进行Hoechst染色，然后在与所述检测试剂孵育。在进行染色的情况下，可根据染料发出的信号划分出单倍体精子细胞，然后根据表面标志物的荧光信号分选出不同发育阶段的圆形精子细胞。如前往所述，检测试剂可以是Cd37、Cd63、Cd96和Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段，该抗体可携带荧光标记。分选可使用流式细胞仪实施。通常，使用Cd63和/或Cd177的检测试剂分选获得早期圆形精子RS2；使用Cd37和/或Cd96的检测试剂分选获得晚期圆形精子RS8。
适用于本文所述方法和试剂盒进行分选或分离纯化的生精细胞包括哺乳动物或啮齿类动物的生精细胞，尤其是人的生精细胞。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种分选或分离纯化人生精细胞，尤其是不同发育阶段的圆形精子细胞的方法，该方法包括：(1)提供含人生精细胞的悬液；(2)加入选自人Cd37、Cd63、Cd96和Cd177中的任意一种、任意两种任意三种或全部四种表面标志物的检测试剂，孵育所述生精细胞；和(3)根据所述检测试剂发出的信号分选出不同发育阶段的圆形精子细胞。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明。实施例中所用的方法、材料和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、材料和试剂。
I、材料和方法
1、实验小鼠
Lin28-P2A-YFP和Vasa-P2A-dTomato小鼠通过CRISPR/Cas9技术构建而成。简而言之，分别将P2A-YFP与P2A-dTomato序列插入Lin28和Vasa基因编码序列最后一个外显子的3’端。这两类荧光小鼠均委托上海南方模式生物科技股份有限公司制备。所有动物实验均得到了中国科学院大学生物化学与细胞生物学研究所动物管理委员会的认证许可。
2、小鼠精子发生同步化
将携带有Lin28-P2A-YFP与Vasa-P2A-dTomato基因型雄鼠从出生第二天连续7天饲喂WIN 18,446(按照100μg/g小鼠体重的剂量饲喂，WIN 18,446用1％黄蓍胶配制，浓度为50mg/mL)，于第8天腹腔注射维甲酸(剂量为32μg/g小鼠体重，配制浓度为20mg/mL)。
3、同步化后生精细胞的获取
1)同步化小鼠安乐死(不同发育阶段的生精细胞取材时间点根据细胞发育所需时间计算并通过细胞周期检测、免疫荧光染色、核型分析等多种手段验证)，取出睾丸置于冰上的PBS中，剥掉被膜防止强光直射样品；2)将组织放入预热好的3mL胶原酶中，用塑料软管将组织稍加吹散，于32℃消化3min；4)室温沉降，去上清，加入预热好的胰酶3mL至5mL，及终浓度为10μg/mL DNase I，32℃消化约5min，具体时间以镜下观察视野内大部分细胞已分散成单细胞的时间为准；5)加入500uL FBS终止消化，70μm滤膜过滤，用常温DMEM 3mL重悬，取100μL细胞悬液加入900μL DMEM(若要看倍型，DMEM中含有Hoechst染料，浓度为6μg/mL)；6)将上述细胞悬液混匀铺于六孔细胞培养板中，室温静置30min，待细胞贴壁后，用DMEM洗涤2遍，洗去未贴壁的死细胞，于荧光显微镜下用Unipick(NeuroIndx)挑选单个细胞。
4、应用表面标志物分选不同时期精子细胞
1)野生型成年小鼠安乐死，取出睾丸置于冰上PBS中，剥掉被膜；2)将组织放入预热好的3mL胶原酶中，用塑料软管将组织稍加吹散，于32℃消化10min；3)室温沉降，去上清，加入预热好的胰酶3mL至5mL，及终浓度为10μg/mL DNase I，32℃消化约8min，具体时间以镜下观察视野内大部分细胞已分散成单细胞的时间为准；4)加入500uL FBS终止消化70μm滤膜过滤，细胞计数，室温离心1,500rpm，5min；5)用32℃预热的DMEM重悬成10^6细胞/mL浓度，加Hoechst 5μg/mL于32℃染色30min，4℃离心1,500rpm，5min；6)含2％BSA的DMEM按照10^6细胞/40uL的浓度重悬细胞，不同表面标志物的抗体按照0.1ug/40uL加入细胞悬液内，于4℃孵育30min。所用抗体分别为PE抗小鼠CD37抗体(Biolegend,146204)、PE抗小鼠CD96抗体(Biolegend,131705)。APC偶联的抗CD63抗体(eBioscience,17-0631-82)。7)离心，用预冷的DMEM重悬，用流式细胞仪根据倍型和荧光信号分选不同时期精子细胞。
II、结果
1、Vasa-P2A-dTomato和Lin28a-P2A-YFP的生殖细胞Knock-In报告子小鼠的建立
应用基因工程的方法建立了Vasa-P2A-dTomato和Lin28a-P2A-YFP Knock-In报告子小鼠。dTomato特异存在于小鼠的所有生殖细胞，与内源性表达的VASA共定位；YFP特异存在于小鼠的未分化型精原细胞，与内源性表达的LIN28A共定位。
结果如图1所示。
2、精子发生同步化获得各级生精细胞方法的建立
为获得高纯度的各级生精细胞，利用维甲酸信号失活与再激活的方法建立了精子发生同步化的技术。该技术能够使精原细胞同步分化，因此，分化型精原细胞及以后的细胞类型是同步化的均一性细胞，而未分化型精原细胞则是未同步化的细胞。借助Vasa-P2A-dTomato(红色荧光)小鼠标记所有生殖细胞和Lin28a-P2A-YFP(绿色荧光)小鼠标记未分化型精原细胞，能够通过收集红色荧光单阳性的细胞从而获得高纯度的同步化细胞(图2)。
3、不同发育阶段生精细胞表面标志物的筛选
为筛选不同发育阶段生精细胞表面标志物，首先将20类不同发育阶段的生精细胞进行了单细胞转录组测序，每类细胞至少测40组以上。通过对转录组的聚类分析，发现20类生精细胞可被划分成7个大类。其中，圆形精子细胞阶段共4类细胞被聚类到了3个不同的clusters内，RS2聚类到Cluster5(C5)，RS4和RS6聚类到Cluster6(C6)，RS8聚类到Cluster7(C7)。不同的表面标志物在不同的Cluster中表达差异较大，例如，Cd37、Cd63、Cd96和Cd177在Cluster5～Cluster7之间呈现明显的差异，其中的单个或多个组合可用于分选不同发育阶段的圆形精子细胞(图3)。
4、应用表面标志物分离纯化不同时期精子细胞的方法
为验证上述所筛选的表面标志物是否可用于分选不同时期的精子细胞，对小鼠睾丸细胞悬液进行Hoechst染色，并应用上述筛选得到的表面标志物荧光抗体孵育细胞，根据细胞核型和表面标志物的信号用流式细胞仪分选不同群体的单倍体精子细胞。同时，对分选获得的细胞进行PNA荧光染色，判断精子细胞所处的时期。
结果如图4所示。结果显示，以Cd63和Cd37的抗体共同孵育细胞，发现Cd63+Cd37-的群体富集了以RS2为主的早期圆形精子，Cd63-Cd37+的群体富集了以RS8为主的晚期圆形精子；同样，以Cd63和Cd96的抗体共同孵育细胞，发现Cd63+Cd96-的群体富集了以RS2为主的早期圆形精子，Cd63-Cd96+的群体富集了以RS8为主的晚期圆形精子。

Claims (21)

1.一种筛选生精细胞表面标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠；其中，所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因敲入雄鼠还表达未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因；
(2)对所述雄鼠实施精子发生同步化处理；
(3)获取所述雄鼠同步化后的不同发育阶段的生精细胞；和
(4)对所述生精细胞进行转录组测序，建立精子发生过程中的转录图谱，对转录图谱进行分析，从而筛选获得生精细胞内差异表达的蛋白，作为生精细胞表面标志物；其中，对转录图谱进行的分析中，通过t-SNE将生精细胞进行分类，并通过比较不同的表面标志物在各类细胞内的表达情况，筛选得到差异表达的表面标志物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述生殖细胞特异性表达基因为Vasa基因或Dazl基因；和/或
所述报告基因含有所述生殖细胞特异性表达基因和荧光蛋白的编码序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未分化型精原细胞特异性表达基因为Lin28基因或Plzf基因，和/或所述未分化型精原细胞特异性表达基因的报告基因含有未分化型精原细胞特异性表达基因和荧光蛋白编码序列。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白颜色不同于所述表达生殖细胞特异性表达基因的报告基因中的荧光蛋白颜色。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
6.如权利要求1～2中任一项所述的方法，其特征在于，所述精子发生同步化处理包括：从所述雄鼠出生第二天起连续7天饲喂维甲酸合成的抑制剂，在第8天给予维甲酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述维甲酸合成的抑制剂为WIN18,446。
8.选自以下的应用：
(1)Cd63和Cd177或其基因序列在分选早期圆形精子RS2中的应用；
(2)Cd63和Cd177的检测试剂在分选早期圆形精子RS2中的应用；
(3)Cd37和Cd96或其基因序列在分选晚期圆形精子RS8中的应用；
(4)Cd37和Cd96的检测试剂在分选晚期圆形精子RS8中的应用；
(5)Cd63和Cd177的检测试剂在制备用于分选早期圆形精子RS2的试剂盒中的应用；和
(6)Cd37和Cd96的检测试剂在制备用于分选晚期圆形精子RS8的试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为所述Cd37、Cd63、Cd96和Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗体携带荧光标记。
11.如权利要求8～10中任一项所述的应用，其特征在于，所述精子为哺乳动物的精子。
12.如权利要求8～10中任一项所述的应用，其特征在于，所述精子为啮齿类动物的精子。
13.如权利要求8～10中任一项所述的应用，其特征在于，所述精子为人的精子。
14.一种分选不同发育阶段的圆形精子细胞的方法，所述方法包括：
(1)制备含生精细胞的悬液，任选地对生精细胞进行Hoechst染色；
(2)使用Cd63和Cd177的检测试剂孵育所述生精细胞；和
(3)根据所述检测试剂发出的信号分选出早期圆形精子RS2。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述检测试剂为所述Cd63和Cd177的特异性抗体或其抗原结合片段。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体携带荧光标记。
17.如权利要求14～16中任一项所述的方法，其特征在于，所述生精细胞为人的生精细胞。
18.一种分选不同发育阶段的圆形精子细胞的方法，所述方法包括：
(1)制备含生精细胞的悬液，任选地对生精细胞进行Hoechst染色；
(2)使用Cd37和Cd96的检测试剂孵育所述生精细胞；和
(3)根据所述检测试剂发出的信号分选出晚期圆形精子RS8。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述检测试剂为所述Cd37和Cd96的特异性抗体或其抗原结合片段。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗体携带荧光标记。
21.如权利要求18～20中任一项所述的方法，其特征在于，所述生精细胞为人的生精细胞。
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