JP7011228B2 - ダウン症モデルラット及びその作製法 - Google Patents
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Description
(1)ヒト21番染色体もしくはその断片上の少なくとも1つの遺伝子と相同なラット遺伝子がトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット。
(2)ヒト21番染色体もしくはその断片、又はヒト21番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片、を含み、当該ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも1つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット。
(3)上記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、子孫ラットの組織内で80~90%以上の保持率で保持されている、上記(2)に記載のダウン症モデルラット。
(4)正常ラットと比較して、不安様行動又は記憶障害を含む行動異常を有する、上記(2)又は(3)に記載のダウン症モデルラット。
(5)上記ヒト21番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片が、セントロメア領域を含み、かつ10~34Mbのサイズを有する、上記(2)~(4)のいずれかに記載のダウン症モデルラット。
(6)上記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするDNAを含む、上記(2)~(5)のいずれかに記載のダウン症モデルラット。
(7)上記(2)~(6)のいずれかに記載の子孫伝達可能なダウン症モデルラットの作製方法であって、ヒト21番染色体もしくはその断片を含む、又はヒト21番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片を含む、ミクロセルと雄系統のラットES細胞とを微小核細胞融合法により融合し、それによりヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を含み、上記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも1つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーであるES細胞を作製する工程、上記ES細胞をラット胚盤胞期胚又は8細胞期胚に導入し、得られた胚をラット仮親の子宮に移植してキメララットを作製する工程、得られた雄キメララットから得た円形精子細胞をラットの卵子に卵子内円形精子注入法(ROSI)により顕微受精し、或いは卵子内延長精子細胞注入法(ELSI)により上記雄キメララットの延長精子細胞とラットの卵子を顕微受精し、或いは卵細胞質内精子注入法(ICSI)により上記雄キメララットの精子とラットの卵子を顕微受精し、子孫ラットを作製する工程、並びに、上記子孫ラットからヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を保持する子孫伝達可能なラットを選別する工程を含む方法。
(8)上記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするDNAを含む、上記(7)に記載の方法。
(9)上記ヒト21番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片が、セントロメア領域を含み、かつ10~34Mbのサイズを有する、上記(7)又は(8)に記載の方法。
1.ダウン症モデルラットの作製
本発明のダウン症モデルラットは、ラットES細胞(雄系統)の作製、微小核細胞融合(MMCT)、卵子内円形精子注入(ROSI)もしくは卵細胞質内精子注入(ICSI)もしくは卵子内延長精子細胞注入(ELSI)、並びに選別を組み合わせた方法によって作製することができる。
(1)ラットES細胞(雄系統)の作製
ラットのES細胞は、マウスES細胞の場合と同様に(M.J.Evans and M.H.Kaufman,Nature 1981;292(5819):154-156)、ラット胚盤胞期胚又は8細胞期胚の内部細胞塊から樹立される、多分化能と自己複製能をもつ細胞株である。例えば、卵透明帯を溶解したラット胚盤胞を、白血病抑制因子(LIF)を含有する培地を用いてマウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー上で培養し、7~10日後に胚盤胞から形成されるアウトグロウス(outgrowth)を分散し、これをMEFフィーダー上に移して培養し、約7日後、ES細胞が出現する。ラットES細胞の作製については、例えばK.Kawaharada et al.,World J Stem Cells 2015;7(7):1054-1063に記載されている。
微小核細胞融合法は、ミクロセル仲介染色体移入(Microcell-Mediated Chromosome Transfer;MMCT)とも称される。
ラットES細胞を胚盤胞期胚に導入し、仮親の子宮に移植してキメララットを作製し、キメララットから交配により子孫を得たところ、蛍光遺伝子発現陽性ラット、すなわち子孫伝達ラットが得られなかった。このため、ROSI法による子孫伝達の可能性を検討したところ、非常に低い確率で目的の子孫伝達可能なヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を安定に保持するラットを得ることができた。
上記(3)で交配によって作製されたラットの中から子孫伝達可能なダウン症モデルラットを選別する方法は、蛍光遺伝子発現の陽性率を血液細胞や、末梢血、骨髄又は脾臓でFCM測定すること、尻尾DNA等を用いてPCRやCGHアレイや次世代シークエンサー等を用いて網羅的な解析を行い、ヒト21番染色体もしくはその断片の保持領域を解析すること、各種組織(例えば、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、精巣など)をFISH(Fluorescence In Situ Hybridization)法により解析し、ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の保持又は保持率を測定すること、明暗試験、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験などにより行動異常、認知機能異常などを測定すること、MRI、CTなどにより脳や心臓の異常を測定すること、ヒト21番染色体もしくはその断片上の遺伝子発現をRT-PCR法、マイクロアレイ法、次世代シークエンス法により確認することなどを含む。FISH法では、蛍光標識した特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒト21番染色体もしくはその断片上の遺伝子とハイブリダイゼーションさせ蛍光顕微鏡を用いて当該染色体を検出する。このような手法によって、選抜されたラットは、ダウン症の表現型をもつ、ヒト21番染色体もしくはその断片を安定的に有し、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラットであると判定することができる。
具体的な作製手順は、例えば次のようなステップを含むことができる。
(ステップ1)
CHO細胞等のげっ歯類細胞中において、セントロメア領域にloxPを保持する上記定義のヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上にEGFP遺伝子をCre-loxPシステムを用いて導入し、ヒト21番染色体領域もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が保持されているかをPCR法およびFISH法で確認する。
(ステップ2)
上記改変ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を微小核細胞融合法にてラットES細胞(雄系統)に導入し、ヒト21番染色体もしくはその断片の領域又は外因性ラット染色体もしくはその断片の領域が保持されているかをPCR法およびFISH法で確認する。
(ステップ3)
上記ラットES細胞を胚盤胞期胚に注入し、仮親の子宮に移植することによってキメララットを作製する。
(ステップ4)
上記キメララット雄からの円形精子細胞、精子又は延長精子細胞とラット雌からの卵子を用いて、卵子内円形精子細胞注入法、卵細胞質内精子注入法又は卵子内延長精子細胞注入法により顕微授精を行って子孫伝達ラットを作製し、尻尾のDNA及び細胞を用いて、ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が保持されているかをPCR法およびFISH法で確認する。
(ステップ5)
交配によりトリソミーラットを繁殖させる。
(ステップ6)
FCM解析により、血液細胞でのGFP陽性率を測定する。
(ステップ7)
血液細胞系譜特異的な各種抗体を用いたフローサイトメトリー(FCM)解析により、血液細胞系譜での蛍光遺伝子発現陽性率を測定する。
(ステップ8)
各組織を採取し、FISH解析によりヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の保持率を測定する。
(ステップ9)
各組織におけるヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の遺伝子発現をRT-PCR法により確認する。
(ステップ10)
各種行動解析、脳や心臓の異常解析等により、正常ラットとの比較を行う。
本発明のダウン症モデルラットの特徴は、以下のとおりである。
上記定義のヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の遺伝子類(例えば非特許文献4及び5に記載される遺伝子類)の存在をPCR解析によって確認できる。また、ラットの血液細胞及び各種の組織においてヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の存在や保持率をFISH解析、又はフローサイトメトリー解析によって確認できる。
ダウン症ラットモデルには、行動解析により不安様行動、記憶障害などの表現型が認められる。
ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が後代(子孫)にジャームライントランスミッションにより子孫伝達される。ダウン症モデルラットではヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が極めて安定に保持されている。
[A.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞にはヒト21番染色体の長腕セントロメア近傍にloxP配列の導入された改変ヒト21番染色体を保持するKazukiら(Gene Therapy, 18:384-393,2011)に記載のDT40(hChr.21-loxP)を用いた。DT40(hChr.21-loxP)を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20%FBS、1%ニワトリ血清、10-4M 2-メルカプトエタノール、0.05μg/mlコルセミドを添加したRPMI1640培地に交換し、さらに12時間培養してミクロセルを形成させた。培養液を24mlの無血清DMEM培地に置換し、予め100μ/mlのポリL-リジンでコートした遠心用25cm2フラスコ12本(コーニング)に2mlずつ分注し、37℃で30分培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。上清を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm、5μm及び3μmフィルターにて精製した。精製後、1700rpmで10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。
[A.2.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、hChr.21-loxPがCHO細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
#21CEN<1>2L:5'-aaatgcatcaccattctcccagttaccc -3'( 配列番号1)
PGKr1:5'-ggagatgaggaagaggagaaca-3'( 配列番号2)
D21S265-L: 5'-gggtaagaaggtgcttaatgctc-3'(配列番号3)
D21S265-R: 5'-tgaatatgggttctggatgtagtg-3'(配列番号4)
D21S261-L: 5'-gagggggactgggacaagccctttgctggaagaga-3'(配列番号5)
D21S261-R: 5'-acattaggaaaaatcaaaaggtccaattattaagg-3'(配列番号6)
D21S268-L: 5'-caacagagtgagacaggctc-3'(配列番号7)
D21S268-R: 5'-ttccaggaaccactacactg-3'(配列番号8)
D21S266-L: 5'-ggcttggggacattgagtcatcacaatgtagatgt-3'(配列番号9)
D21S266-R: 5'-gaagaaaggcaaatgaagacctgaacatgtaagtt-3'(配列番号10)
D21S1259-L: 5'-gggactgtaataaatattctgttgg-3'(配列番号11)
D21S1259-R: 5'-cactggctctcctgacc-3'(配列番号12)
CBR-L:5'-gatcctcctgaatgcctg-3'(配列番号13)
CBR-R:5'-gtaaatgccctttggacc-3'(配列番号14)
上記で得られたCHO(HPRT-;hChr.21-loxP))のうち6クローンについて松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(東京、日本国)、1994)に記された方法でhuman cotI DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ6クローン中、3クローンで80%以上の割合でCHO(HPRT-;hChr.21-loxP)がCHO細胞に導入されていることを確認した。
[B.1]トランスフェクション及びHAT耐性クローンの単離
上記で得られたCHO(HPRT-;hChr.21-loxP)-3にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90%コンフルエント状態になった6ウエル(well)の細胞に対して、Cre1μgとKazukiら(Gene Therapy,18:384-393,2011)に記載のEGFP挿入ベクター(I-EGFP-I-loxP-3’HPRT)2μgを市販(インビトロジェン)のプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得た合計6個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:CHO(hChr.21-loxP-EGFP))。
[B.2.1]蛍光顕微鏡観察によるGFP挿入体の確認
クローニングした6個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてGFP陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ100%であった。
HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的にGFP遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1:5'-tggaggccataaacaagaagac-3'(配列番号15)
TRANS R1:5'-ccccttgacccagaaattccA-3'(配列番号16)
上記で得られたCHO(hChr.21-loxP-EGFP))のうち6クローンについて松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に記載された方法でhuman cotI DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、6クローン中、6クローンで80%以上の割合でhChr.21-loxP-EGFPが1コピーCHO細胞に導入されていることを確認した。
hChr.21-loxP-EGFPを保持するキメララットを作製するために、実施例1で得られたhChr.21-loxP-EGFPを保持するCHO細胞からラットES細胞へ微小核細胞融合法により導入した。
[A]hChr.21-loxP-EGFPを保持するキメララットの作製
上記実施例2で得られたhChr.21-loxP-EGFP保持ラットES細胞クローンを用いてHirabayashiらの方法(Mol Reprod Dev.2010 Feb;77(2):94.doi:10.1002/mrd.21123.)でキメララットを作製した。宿主としてはCrlj:WIラット(白色、日本チャールスリバー社(横浜、神奈川、日本国)より購入)の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔ラットは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。hChr.21-loxP-EGFP保持ESクローン(例えばRat ES(hChr.21-loxP-EGFP)2、上記実施例2で取得したもの)を注入した125個の胚を仮親に移植した結果、65匹のキメララット(毛色に濃茶色の部分の認められる)が誕生した。そのうち53匹は毛色が有色と観察できるキメラ個体であった(図3)。すなわち、hChr.21-loxP-EGFPを保持するラットES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちラット個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
上記キメララットから交配により繁殖させようと試みたが、GFP陽性個体得られなかった。次に上記原因はトリソミー個体の雄の不妊が考えられたことから、精細管におけるGFP陽性率を観察した結果、18匹中1匹で陽性個体が観察された(図4、図5)。上記GFP陽性キメラマウス雄(キメラ個体番号#1753-2)(図5上図)のGFP陽性の精細管から円形精子細胞を取り出し、FACSにてGFP陽性画分をソーティングしてから以下の実験に用いた。
[A]実体蛍光顕微鏡観察
上記で得られたTC(hChr.21-loxP-EGFP)ラットについて脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、骨格筋及び精巣を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察したところ、全ての組織にてGFP陽性が観察され、その陽性率は100%であった。その代表的な結果を図8に示す。
末梢血でのGFP陽性率が90%以上であった個体について、血液細胞系譜特異的な各種抗体(バイオレジェンド、ebioscience)を用いたFCM解析により、血液細胞系譜でのGFP陽性率を検討したところ、末梢血、骨髄及び脾臓のいずれにおいてもCD61+/CD45RA-(NK細胞様)、CD3+/CD4+(CD4+T細胞)、CD3+/CD8+(CD8+T細胞)、CD45R+(B細胞様)におけるGFP陽性率は90%以上であった。その代表的な結果を図9に示す。
上記と同様の個体の組織において、Shinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163-1175,2001)に記された方法でHuman CotI DNA(R)(Thermo Fisher Scientific)をプローブにしたFISH解析を行ったところ、視覚的にhChr.21-loxP-EGFPの存在を確認し、84~100%の細胞でhChr.21-loxP-EGFPが存在していることが確かめられた。その代表的な結果を図10に示す。
TC(hChr.21-loxP-EGFP)雌ラットとCrlj:WIラット(白色、日本チャールスリバー社(横浜、神奈川、日本国)より購入)雄を交配することで伝達率を検討した。F2世代からF6世代までで309匹の仔ラットが得られ、181匹がGFP陰性、128匹がGFP陽性個体であった(伝達率は41.4%)。すなわち、伝達率はメンデル遺伝の法則(理論値50%)よりも少し低下しているものの、hChr.21-loxP-EGFP形質が41.4%の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるhChr.21-loxP-EGFPの保持率が80%以上であることが示された。
TC(hChr.21-loxP-EGFP)ラットの脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、骨格筋及び精巣において、トータルRNAを市販のプロトコール(QIAGEN)に従い抽出後、市販のプロトコール(Invitrogen)に従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、ヒト21番染色体上の遺伝子発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。
ヒト21番染色体上の遺伝子発現検出用プライマー:
APP-L:5'-gccccgtaaaagtgttaca-3'(配列番号17)
APP-R:5'-acgtttgtttcttcgtgcct-3'(配列番号18)
SOD1-1L:5'-attctgtgatctcactctcagg-3'(配列番号19)
SOD1-1R:5'-tcgcgactaacaatcaaagt-3'(配列番号20)
IFNAR2-1L:5'-cgaagtttcagtcggtgag-3'(配列番号21)
IFNAR2-1R:5'-ggcattcaggttttatccc-3'(配列番号22)
TTC3-1L:5'-tggacaaatataaggcatgttca-3'(配列番号23)
TTC3-1R:5'-gtcaccttcctctgcctttg-3'(配列番号24)
ETS2-1L:5'-taccatgccaatggtttataagg-3'(配列番号25)
ETS2-1R:5'-atgtgactgggaacatcttgc-3'(配列番号26)
PCP4-1L:5'-gaattcactcatcgtaacttcattt-3'(配列番号27)
PCP4-1R:5'-ccttgtaggaaggtatagacaatgg-3'(配列番号28)
MX1-1L:5'-tggactgacgacttgagtgc-3'(配列番号29)
MX1-1R:5'-ctcatgtgcatctgagggtg-3'(配列番号30)
TFF3-1L:5'-ggctgtgattgctgccag-3'(配列番号31)
TFF3-1R:5'-gtggagcatgggacctttat-3'(配列番号32)
TFF1-1L:5'-cagggatctgcctgcatc-3'(配列番号33)
TFF1-1R:5'-atcgatctcttttaatttttaggcc-3'(配列番号34)
コントロール遺伝子発現検出用プライマー:
GAPDH-F: 5’-ccatcttccaggagcgaga-3’(配列番号35)
GAPDH-R: 5’-tgtcataccaggaaatgagc-3’(配列番号36)
[A]明暗往来試験
TC(hChr.21-loxP-EGFP)ラット系統を用い、GFP陽性の個体をダウン症モデルラット(以下、「DS」と称する。)、GFP陰性の個体をコントロール(以下、「Control」と称する。)として使用した。10週齢の雄を各グループ7匹ずつ準備した。実験者に触られることによるストレスを減らすため、9週齢の時点でヒトへの馴化(ハンドリング5分)を行った。これらの動物を使用して、RIKENのウェブページ(http://ja.brc.riken.jp/lab/bpmp/SOPs/index_mc.html)に記された方法を参考にして明暗往来試験を実施した。
10週齢のTC(hChr.21-loxP-EGFP)ラットの雄をDS,controlグループそれぞれで7匹ずつ準備した。9週齢の時点でヒトへの馴化(ハンドリング5分)を行い、明暗往来試験終了後1日以上空けてオープンフィールド試験を行った。Kaloudaらの報告(Pharmacology,Biochemistry and Behavior,138:111-116,2015)に記された方法を参考にして、以下のようにオープンフィールド試験を実施した。行動解析部屋に動物を慣れさせるため、飼育部屋から行動解析部屋に動物を移動してから1時間以上経過して実験を開始した。昼光色の電球により装置中央の光量を30ルクスに設定されたラット用角型オープンフィールド(70cm×70cm、室町機械株式会社(東京、日本国))の角から壁に沿って動物を入れ、10分間の動物の行動データをビデオトラッキングソフトウェア(ANY-maze、Stoelting社)により取得した。総移動距離に対する中心滞在時間(中心エリア:30cm×30cm)を解析したところ、DSでその割合が低い傾向にあった(図13)。以上の結果から、DSで不安様行動増加が示された。
10週齢のTC(hChr.21-loxP-EGFP)ラットの雄をDS,controlグループそれぞれで6匹ずつ準備した。9週齢の時点でヒトへの馴化(ハンドリング5分)を行い、明暗往来試験、オープンフィールド試験に使用した動物を高架式十字迷路試験にも使用した。
Claims (6)
- ヒト21番染色体もしくはその断片を含み、前記ヒト21番染色体もしくはその断片上の少なくとも1つの遺伝子と、当該遺伝子と相同なラット遺伝子とが加わりトリソミーである、かつ、前記ヒト21番染色体もしくはその断片が子孫伝達可能であることを特徴とし、並びに、
前記ヒト21番染色体もしくはその断片は、子孫ラットの組織内で全細胞あたり80~90%以上の細胞で保持され、及び、前記ヒト21番染色体の断片は、セントロメア領域を含み、かつ10~34Mbのサイズを有する、
ダウン症モデルラット。 - ヒト21番染色体もしくはその断片、又はヒト21番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片、を含み、前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも1つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーである、かつ、前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が子孫伝達可能であることを特徴とし、並びに、
前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片は、子孫ラットの組織内で全細胞あたり80~90%以上の細胞で保持され、及び、前記ヒト21番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片は、セントロメア領域を含み、かつ10~34Mbのサイズを有する、
ダウン症モデルラット。 - 正常ラットと比較して、不安様行動又は記憶障害を含む行動異常を有する、請求項1又は2に記載のダウン症モデルラット。
- 前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするDNAを含む、請求項2又は3に記載のダウン症モデルラット。
- 請求項2~4のいずれか1項に記載の子孫伝達可能なダウン症モデルラットの作製方法であって、
ヒト21番染色体もしくはその断片を含む、又はヒト21番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片を含む、ミクロセルと雄系統のラットES細胞とを微小核細胞融合法により融合し、それによりヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を含み、前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも1つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーであるES細胞を作製する工程、
前記ES細胞をラット胚盤胞期胚又は8細胞期胚に導入し、得られた胚をラット仮親の子宮に移植してキメララットを作製する工程、
得られた雄キメララットから得た円形精子細胞をラットの卵子に卵子内円形精子注入法(ROSI)により顕微受精し、或いは卵子内延長精子細胞注入法(ELSI)により前記雄キメララットの延長精子細胞とラットの卵子を顕微受精し、或いは卵細胞質内精子注入法(ICSI)により前記雄キメララットの精子とラットの卵子を顕微受精し、子孫ラットを作製する工程、並びに、
前記子孫ラットからヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を保持する、かつ、前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が子孫伝達可能であるラットを選別する工程、
を含み、ここで前記ヒト21番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片は、セントロメア領域を含み、かつ10~34Mbのサイズを有する、方法。 - 前記ヒト21番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするDNAを含む、請求項5に記載の方法。
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