JP6775224B2 - マウス人工染色体ベクター及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、齧歯類細胞、組織又は個体内で安定に保持され、かつ、子孫伝達可能な新規マウス人工染色体ベクター、具体的にはマウス１０番染色体及びマウス１６番染色体の各々に由来するマウス人工染色体に関する。
本発明はまた、上記マウス人工染色体ベクターを含む哺乳動物由来細胞に関する。
本発明はさらに、上記マウス人工染色体ベクターを含む、齧歯類などの非ヒト動物に関する。
本発明はさらに、上記細胞又は上記非ヒト動物を用いる有用タンパク質又はヒト抗体の製造方法に関する。
人工染色体ベクターは、約２００ｋｂを超える大きなサイズのＤＮＡ（例えば、メガベースサイズの染色体断片）を導入可能であるため、例えばヒト抗体産生、薬物代謝試験、疾患モデルなどに使用可能な非ヒト動物の作製などに使用されている。このようなベクターには、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター、マウス人工染色体（ＭＡＣ）ベクターなどが知られている。具体的には、ＨＡＣベクターは、ヒト１４番染色体及びヒト２１番染色体由来のベクターに関して特許文献１、２及び３、非特許文献１，２及び３に記載されており、またＭＡＣベクターは、マウス１１番染色体由来のベクターに関して特許文献４に記載されている。
しかしながら、ＨＡＣベクター導入マウスでは、ＨＡＣベクターの保持率の低下、組織間や個体間にばらつきが生じること、子孫伝達の頻度が不安定であることなどの問題が存在するため、ＨＡＣベクターの保持率などを常に考慮する必要があり、また、特定の遺伝子領域が持つ機能や疾患との関わりについて研究する場合、目的遺伝子の発現動態や発現産物を組織細胞レベルで詳細かつ正確に解析することが難しい場合もあり、再現性の高い均一的な解析の障害となる。また、マウス細胞とヒト細胞を細胞融合するとき、マウス細胞内ではヒト染色体は不安定であることが知られている。このように、ＨＡＣベクターを含むヒト染色体はマウス細胞内では保持率が一定しないことから、ＨＡＣベクターをマウス細胞に導入する場合、及び遺伝子導入マウスを作製する場合において、人工染色体ベクターとしての利点を十分に発揮できていない。
一方、ＭＡＣベクター導入マウスでは、ＨＡＣベクターの保持率の低下などの問題は実質的に解決される。しかし、ＭＡＣベクターはマウス１１番染色体由来のベクターが知られているだけであり、他の染色体を使用する場合の問題点として、染色体の構造に関する情報が少ないためＭＡＣベクターの作製には試行錯誤が必要であるし、また、公知のＭＡＣベクター以外のベクターがいかなる特性を有するかも不明である。
このような状況のなかで本発明者らは、マウス１０番染色体及びマウス１６番染色体ベクター由来の２種類のＭＡＣベクターの作製を今回試みた。
国際公開２００９／０６３７２２号 国際公開２００４／０３１３８５号 特開２００７−２９５８６０号公報 日本国特許第５５５７２１７号公報
Ｋｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８：１０８６−１０９０，２０００ Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ，ＢＢＲＣ，３２１：２８０−２９０，２０００ Ｈｏｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１７：３０９−１７，２００９
従来公知のＭＡＣベクターではない他のＭＡＣベクターを作製するときの課題として、例えばマウス染色体の配列と構造に関係する情報が少なく、場合によっては未知であること、或いは、そのような情報は特定のマウス系統・個体の配列情報であるため系統が異なると配列が一致しないことがよくあり、したがって、ベクター内に余分なマウス遺伝子を持ち込まないようにするための遺伝子操作にはかなりの試行錯誤を要すること、天然セントロメアを含む染色体構造に違いがあることで、染色体の由来によってＭＡＣベクターの核内配置が異なり、宿主遺伝子の発現制御に影響を与える可能性があること、マウス１１番染色体由来のＭＡＣ導入精巣由来幹細胞では幹細胞培養条件下において異常増殖を示すことなどの課題があるため、それらの課題を解決する必要がある。さらに、染色体番号が異なるマウス染色体から作製されたＭＡＣベクターが、ベクター上に残存するマウス遺伝子による影響と同様に、安定性、子孫伝達能などの性質にどのように影響するかは、知見がほとんどないためはっきりしていない。
ＭＡＣベクターは、理想的には、ＭＡＣベクター導入そのものが意図しない宿主の遺伝子発現変動を引き起こさず、齧歯類細胞もしくは組織内又は齧歯類個体内で安定に維持されるとともに、子孫伝達されるベクターであるべきであるが、上記のとおり、そのようなベクターの作製には試行錯誤が必要である。
本発明は、上記の課題を解決する新規のＭＡＣベクターを提供することを目的とする。
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
（１）マウス１０番染色体及びマウス１６番染色体からなる群から選択されるマウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス１０番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ８１５５から長腕遠位を削除したマウス１０番染色体由来の長腕断片、又はセントロメア近傍のマウス１６番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ３５９７４から長腕遠位を削除したマウス１６番染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、並びに、齧歯類の細胞、組織又は個体において安定に保持される、かつ子孫伝達可能であることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。
（２）寄託細胞株ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５６）に含まれるマウス人工染色体を含む、上記（１）に記載のマウス人工染色体ベクター。
（３）寄託細胞株ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５７）に含まれるマウス人工染色体を含む、上記（１）に記載のマウス人工染色体ベクター。
（４）齧歯類がマウス又はラットである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のマウス人工染色体ベクター。
（５）１つ又は複数のＤＮＡ配列挿入部位をさらに含む、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
（６）ＤＮＡ配列挿入部位が、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ配列、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ配列、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ配列、並びに、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む、上記（５）に記載のマウス人工染色体ベクター。
（７）レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子又はその両方をさらに含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のマウス人工染色体ベクター。
（８）外来ＤＮＡ配列をさらに含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のマウス人工染色体ベクター。
（９）外来ＤＮＡ配列がヒトＤＮＡ配列である、上記（８）に記載のマウス人工染色体ベクター。
（１０）外来ＤＮＡ配列が、ヒト染色体長腕又は短腕の遺伝子もしくは遺伝子座のＤＮＡ配列である、上記（９）に記載のマウス人工染色体ベクター。
（１１）外来ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座、又はその重鎖及び軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座の両方のＤＮＡ配列である、上記（９）又は（１０）に記載のマウス人工染色体ベクター。
（１２）外来ＤＮＡ配列が、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、血液凝固・溶解因子類、Ｇ蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はＤＮＡの配列、或いは、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などの疾患に関連する治療用遺伝子又はＤＮＡの配列、並びに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの免疫系遺伝子又はＤＮＡの配列からなる群から選択される遺伝子又はＤＮＡの配列である、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載のマウス人工染色体ベクター。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のマウス人工染色体ベクターを含む哺乳動物由来細胞。
（１４）哺乳動物由来細胞が、体細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、上記（１３）に記載の細胞。
（１５）哺乳動物由来細胞が、齧歯類由来細胞である、上記（１３）又は（１４）に記載の細胞。
（１６）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のマウス人工染色体ベクターを含む非ヒト動物。
（１７）非ヒト動物が、齧歯類動物である、上記（１６）に記載の非ヒト動物。
（１８）齧歯類動物が、マウス又はラットである、上記（１７）に記載の非ヒト動物。
（１９）ヒト抗体を産生可能にする動物である、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の非ヒト動物。
（２０）マウス人工染色体ベクターに含まれる外来ＤＮＡに対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下している、上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の非ヒト動物。
（２１）外来ＤＮＡ配列を含むマウス人工染色体ベクターを含む上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の細胞を培養し、産生された該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法。
（２２）ヒト抗体重鎖及び軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む上記（１９）に記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法。
（２３）ヒト抗体軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座が、ヒト抗体λ及びκ軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座である、上記（２２）に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−０５０１７８号の開示内容を包含する。
本発明により、マウス１０番染色体及び１６番染色体の各々のマウス染色体由来の齧歯類組織内で安定な新規マウス人工染色体ベクターが提供され、これらのベクターを利用したヒト抗体を産生可能なマウス、ラットなどの齧歯類動物の作製、並びに該動物によるヒト抗体の製造を可能にする。
この図は、薬剤耐性遺伝子でマークされたマウス１０番染色体又は１６番染色体を保持するマウス胎仔線維芽細胞とマウスＡ９細胞とを細胞融合することによって各マウス染色体を保持したＡ９様細胞を作製することを示した図である。 この図は、薬剤耐性遺伝子でマークされたマウス１０番染色体又は１６番染色体を含有するＡ９様細胞から微小核細胞融合法によって各マウス染色体をニワトリＤＴ４０細胞へ移すことを示した図である。 この図は、天然マウス１０番及び１６番染色体の各々からテロメアトランケーションによってマウス人工染色体（ＭＡＣ）を構築するステップ、並びに該ＭＡＣにｌｏｘＰ、ＥＧＦＰ遺伝子などを含むカセットを挿入するステップの概略図である。図中、Ｃｅｎ．はセントロメアを表し、Ｔｅｌ．はテロメアを表す。また、ＨＳ４はインスレーター、ＣＡＧ及びＰＧＫはそれぞれプロモーター、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ＮｅｏＲ、Ｐｕｒｏ、Ｎｅｏはそれぞれ薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表す。 この図は、マウス１０番染色体のテロメアトランケーションの概略図である。 この図は、長腕部分が削除される前のマウス１０番染色体と長腕部分が削除されたマウス１０番染色体（１０ＭＡＣ；Ｔ５−２６、Ｔ６−３７、Ｔ７−３４）を示すＦＩＳＨ解析画像である。 この図は、マウス１０番染色体（１０ＭＡＣ）へｌｏｘＰ及びＥＧＦＰ発現ユニットを搭載する概略図である。 この図は、マウス１０番染色体（１０ＭＡＣ）にｌｏｘＰ及びＥＧＦＰ発現ユニットを搭載する前と後（１０ＭＡＣ１）のＦＩＳＨ解析画像である。図中、搭載前が、Ｔ５−２６とＴ６−３７であり、搭載後が、Ｔ５−２６Ｌ１−２、Ｔ５−２６Ｌ２−３、Ｔ６−３７Ｌ１−５である。矢印は１０ＭＡＣ、１０ＭＡＣ１を示す。 この図は、１０ＭＡＣ１を保持するＣＨＯ細胞のＦＩＳＨ解析画像である。図中、矢印は１０ＭＡＣ１を示す。 この図は、マウス１６番染色体のテロメアトランケーションの概略図である。 この図は、マウス１６番染色体のテロメアトランケーションで得られた長腕の大部分が削除された２パターンのアレルの図である。図中、一方のパターンがＴ１−１４であり、他方のパターンがＴ２−６４、Ｔ２−６５である。 この図は、長腕部分が削除される前のマウス１６番染色体と長腕部分が削除されたマウス１６番染色体（１６ＭＡＣ；Ｔ１−１４、Ｔ２−６４、Ｔ２−６５）を示すＦＩＳＨ解析画像である。矢印は、マウス１６番染色体、それぞれの１６ＭＡＣを示す。 この図は、長腕部分の削除を行ったマウス１６番染色体へｌｏｘＰ及びＥＧＦＰ発現ユニットを搭載する概略図（パターン１）である。 この図は、長腕部分の削除を行ったマウス１６番染色体へｌｏｘＰ及びＥＧＦＰ発現ユニットを搭載する概略図（パターン２）である。 この図は、マウス１６番染色体（１６ＭＡＣ）にｌｏｘＰ及びＥＧＦＰ発現ユニットを搭載する前（１６ＭＡＣ；Ｔ１−１４、Ｔ２−６４、Ｔ２−６５）と後（１６ＭＡＣ１ＨＡ；Ｔ１−１４ Ｌ１−４、１６ＭＡＣ１Ｇｍ；Ｔ２−６４ Ｌ１−４、Ｔ２−６５ Ｌ１−４）の各ＦＩＳＨ解析画像である。矢印は１６ＭＡＣ、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍを示す。 この図は、１０ＭＡＣ１を保持するマウスＥＳ細胞ＴＴ２ＦのＦＩＳＨ解析画像である。矢印は、１０ＭＡＣ１を示す。 この図は、１０ＭＡＣ１が子孫伝達したマウスの明視野（上）とＧＦＰ蛍光（下）を示す図である。１０ＭＡＣ１にＧＦＰ発現カセットが搭載されているので、１０ＭＡＣ１を保持する細胞はＧＦＰ蛍光陽性となる。 この図は、ＩＧＨＫ−ＮＡＣ構築とＩＧＨＫ−ＮＡＣを含むヒト抗体産生マウス又はラットの作製の概略図である。 この図は、改変ヒト２番染色体とＮＡＣ（本発明の新規人工染色体ベクター）を保持するＣＨＯ細胞のＦＩＳＨ解析画像である。左の矢印がＮＡＣを示し、右の矢印が改変ヒト２番染色体を示す。 この図は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによって生じる相互転座によるＩＧＫ−ＮＡＣ構築の概略図である。図中、ＨＡＴ耐性について、ｌｏｘＰ配列で組換えを起こしたものは５’ＨＰＲＴと３’ ＨＰＲＴが連結し、ＨＰＲＴ遺伝子の再構築が起こり、ＨＡＴ耐性になるので薬剤ＨＡＴで選択できる。図中、Ｉｇκはイムノグロブリン軽鎖κ遺伝子（座）を表す。図中、Ｃｅｎ．はセントロメアを表し、Ｔｅｌ．はテロメアを表す。また、ＨＳ４はインスレーター、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＰＧＫはそれぞれプロモーター、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードする遺伝子、Ｂｓｄ、ｈｙｇ、Ｐｕｒｏ、Ｎｅｏはそれぞれ薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表す。 この図は、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステムによって生じる相互転座によるＩＧＨＫ−ＮＡＣ構築の概略図である。図中、ＨＡＴ耐性について、ＦＲＴ配列で組換えを起こしたものは５’ＨＰＲＴと３’ＨＰＲＴが連結し、ＨＰＲＴ遺伝子の再構築が起こり、ＨＡＴ耐性になるので薬剤ＨＡＴで選択できる。図中、Ｉｇκはイムノグロブリン軽鎖κ遺伝子（座）を表す。図中、ＩｇＨはイムノグロブリン重鎖遺伝子（座）を表す。図中、Ｃｅｎ．はセントロメアを表し、Ｔｅｌ．はテロメアを表す。また、ＨＳ４はインスレーター、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＰＧＫはそれぞれプロモーター、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードする遺伝子、Ｂｓｄ、ｈｙｇ、Ｎｅｏはそれぞれ薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表す。 この図は、ＩＧＨＬ−ＮＡＣ構築とＩＧＨＬ−ＮＡＣを含むヒト抗体産生マウス又はラットの作製の概略図である。 この図は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによって生じる相互転座によるＩＧＬ−ＮＡＣ構築の概略図である。図中、ＨＡＴ耐性について、ｌｏｘＰ配列で組換えを起こしたものは５’ＨＰＲＴと３’ＨＰＲＴが連結し、ＨＰＲＴ遺伝子の再構築が起こり、ＨＡＴ耐性になるので薬剤ＨＡＴで選択できる。図中、Ｉｇλはイムノグロブリン軽鎖λ遺伝子（座）を表す。図中、Ｃｅｎ．はセントロメアを表し、Ｔｅｌ．はテロメアを表す。また、ＨＳ４はインスレーター、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＰＧＫはそれぞれプロモーター、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードする遺伝子、Ｂｓｄ、ｈｙｇ、Ｐｕｒｏ、Ｎｅｏはそれぞれ薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表す。 この図は、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステムによって生じる相互転座によるＩＧＨＬ−ＮＡＣ構築の概略図である。図中、ＨＡＴ耐性について、ＦＲＴ配列で組換えを起こしたものは５’ＨＰＲＴと３’ＨＰＲＴが連結し、ＨＰＲＴ遺伝子の再構築が起こり、ＨＡＴ耐性になるので薬剤ＨＡＴで選択できる。図中、Ｃｅｎ．はセントロメアを表し、Ｔｅｌ．はテロメアを表す。また、ＨＳ４はインスレーター、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＰＧＫはそれぞれプロモーター、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードする遺伝子、Ｂｓｄ、ｈｙｇ、Ｎｅｏはそれぞれ薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表す。 この図は、マウス１０番染色体（１０ＭＡＣ）へ環状ＤＮＡ挿入用のｌｏｘＰ配列及びネオマイシン耐性遺伝子を搭載した１０ＭＡＣ２構築の概略図である。 この図は、マウス１０番染色体（１０ＭＡＣ）へＧＦＰ蛍光発現ユニット及び環状ＤＮＡ挿入用のｌｏｘＰ配列及びネオマイシン耐性遺伝子を搭載した１０ＭＡＣ３構築の概略図である。 この図は、１０ＭＡＣ２を保持するＤＴ４０細胞のＦＩＳＨ解析画像である。矢印は構築された１０ＭＡＣ２を示す。 この図は、１０ＭＡＣ３を保持するＤＴ４０細胞のＦＩＳＨ解析画像である。矢印は構築された１０ＭＡＣ３を示す。 この図は、１０ＭＡＣ２を保持するＣＨＯ細胞のＦＩＳＨ解析画像である。矢印は１０ＭＡＣ２を示す。 この図は、１０ＭＡＣ３を保持するＣＨＯ細胞のＦＩＳＨ解析画像である。矢印は１０ＭＡＣ３を示す。
本発明をさらに詳細に説明する。
上記のとおり、本発明は、マウス１０番染色体及びマウス１６番染色体からなる群から選択されるマウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス１０番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ８１５５（ＮＣＢＩ；ＮＣ＿００００７６．６）から長腕遠位を削除したマウス１０番染色体由来の長腕断片、又セントロメア近傍のマウス１６番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ３５９７４（ＮＣＢＩ；ＮＣ＿００００８２．６）から長腕遠位を削除したマウス１６番染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、並びに、齧歯類の細胞、組織又は個体において安定に保持される、かつ子孫伝達可能であることを特徴とする、マウス人工染色体ベクターを提供する。
本明細書中で使用する「マウス染色体由来の天然型セントロメア」という用語は、マウス１０番染色体又はマウス１６番染色体のセントロメア全体（完全なセントロメア）を指す。したがって、このようなセントロメアには、マウス染色体のセントロメア配列の一部を用いて偶発的又は人工的に得られたセントロメア機能を有する構造体、及び、他の動物種の染色体のセントロメアは含まれない。
本明細書中で使用する「マウス人工染色体」又は「マウス人工染色体ベクター」はトップダウンアプローチで構築された人工染色体であり、ボトムアップアプローチで構築された人工染色体ではない。トップダウンアプローチとは、自然染色体から遺伝子領域を染色体改変により削除し天然セントロメアを人工染色体ベクターの一部として構築する方法である。一方、ボトムアップアプローチとは、セントロメア配列の一部をクローン化ＤＮＡとして取得し、哺乳類細胞にトランスフェクションすることによりセントロメア機能を有する人工染色体を構築する方法であり、本発明では、この方法は使用されていない。
本明細書中で使用する「セントロメア近傍のマウス１０番（もしくは、１６番）染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ８１５５（もしくは、遺伝子Ｇｍ３５９７４）から長腕遠位を削除したマウス１０番（もしくは、１６番）染色体由来の長腕断片」は、本発明のベクターがマウス、ラットなどの齧歯類の細胞又は個体組織において安定に保持されるように、かつ齧歯類の個体発生と子孫伝達の妨げにならないように、可能な限り内在遺伝子の影響を排除することが望ましく、そのために、上記マウス染色体の長腕中の内在遺伝子を実質的に除去するようにセントロメアに近い長腕部位の遺伝子Ｇｍ８１５５（もしくは、遺伝子Ｇｍ３５９７４）の上流領域で長腕遠位を削除して得られるセントロメア側の長腕断片を指す。ここで「実質的に除去する」とは、マウス１０番染色体又はマウス１６番染色体の全内在遺伝子（数）の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９〜１００％が除去されることを意味する。また、「上流領域」とは、上記遺伝子の５'末端領域であり、好ましくは転写開始部位から５'非翻訳領域末端までの領域である。
本明細書中で使用する、マウス人工染色体がマウス、ラットなどの齧歯類の細胞、組織又は個体において安定に保持されるときの「保持率」とは、培養細胞、又は齧歯類の組織や細胞の中で人工染色体が存在している細胞の割合を指す。
本発明の染色体ベクターが「安定に保持される」とは、細胞分裂の際に該染色体ベクターの脱落を起こし難く、すなわち、分裂後であっても細胞内で安定に保持されること、それゆえに、該染色体ベクターが娘細胞や子孫マウスに効率よく子孫伝達されることを意味する。
マウス１０番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、前記長腕断片は、非限定的に例えば、該１０番染色体の長腕のマーカー遺伝子Ｇｍ８１５５よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。またマウス１６番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、前記長腕断片は、非限定的に例えば、該１６番染色体の長腕のマーカー遺伝子Ｇｍ３５９７４よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、前記長腕断片は、寄託細胞株ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５６）又は寄託細胞株ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５７）に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む。これらの基本構造には、外来ＤＮＡ又は遺伝子もしくは遺伝子座を挿入するためのｌｏｘＰ、ＦＲＴなどのＤＮＡ配列挿入部位をさらに含むことができる。
本発明のベクターは、外来ＤＮＡ又は遺伝子配列を挿入するための部位を含むことができるため、この部位に、目的の外来ＤＮＡ又は遺伝子もしくは遺伝子座を組み込むことによって、該ベクターが任意の細胞に導入されたときに該目的の外来ＤＮＡ又は遺伝子もしくは遺伝子座を発現することが可能となり、したがって、タンパク質生産、治療用薬剤のスクリーニング、薬物代謝試験、ＤＮＡの機能解析、遺伝子治療、有用な非ヒト動物の作製などへの応用に使用することが可能である。
本明細書中の「ＤＮＡ」は、特に断らない限り、遺伝子もしくは遺伝子座、ｃＤＮＡ、化学修飾ＤＮＡを含むすべての種類のＤＮＡ核酸に対し使用するものとする。
また、本明細書中の「外来遺伝子」又は「外来ＤＮＡ」とは、ベクターの遺伝子挿入部位に挿入する、ベクターに搭載する目的の遺伝子又はＤＮＡであり、対象とする細胞内に本来的には存在しない、対象とする細胞内で発現させるべき遺伝子又はＤＮＡ、或いはそれらの配列、を意味する。
本明細書中の「ＤＮＡ配列挿入部位」とは、人工染色体における、目的ＤＮＡ（例えば遺伝子、遺伝子座など）配列を挿入できる部位、例えば、部位特異的組換え酵素の認識部位等を意味する。このような認識部位には、非限定的に、例えばｌｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位）、ＦＲＴ（Ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位）、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ（φＣ３１リコンビナーゼ認識部位）、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ（Ｒ４リコンビナーゼ認識部位）、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ（ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ認識部位）、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位）などが含まれる。
本明細書中の「部位特異的組換え酵素」とは、これら酵素の認識部位で特異的に目的のＤＮＡ配列と組換えを起こすための酵素である。その例は、Ｃｒｅインテグレース（Ｃｒｅリコンビナーゼとも称する。）、Ｆｌｐリコンビナーゼ、φＣ３１インテグレース、Ｒ４インテグレース、ＴＰ９０１−１インテグレース、Ｂｘｂ１インテグレースなどである。
本発明のベクターはまた、マウス染色体を改変し、マウス由来の天然型セントロメアをそのままベクターの作製のために利用する。
本発明のベクターの有用な特性として、マウス、ラット、ハムスターなどの齧歯類の細胞又は個体組織において保持率が向上し、これによって細胞内で安定に保持され、したがって目的遺伝子（群）を長期間安定に含むことができ、齧歯類の個体間又は組織間において導入遺伝子量にバラつきがなく長期間発現させることができ、また、分化多能性細胞（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、等）を介した齧歯類の個体発生及び子孫伝達の効率を向上させることができる。保持率は、試験した組織（例えば、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳又は骨髄由来の組織）で約９０％以上であるし、また、本発明のマウス人工染色体は、効率よく増殖可能であり、細胞内での複数（多）コピーの保持を可能にする。
マウスの１０番及び１６番染色体の配列情報は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．などのＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓから入手可能である。
本明細書中の染色体の「長腕」とは、マウス染色体のセントロメア側から遺伝子領域を含む染色体領域を指す。一方、マウス染色体には、短腕がほとんど存在しない。
本明細書中の「遠位」とは、セントロメアから遠い領域（すなわち、テロメア側）を意味する。反対に、セントロメアに近い領域（すなわち、セントロメア側）は「近位」と称する。長腕遠位は、長腕の特定切断部位よりもテロメア側に位置する領域を意味し、長腕近位は、長腕の特定切断部位よりもセントロメア側に位置する領域を意味する。この特定切断部位は、マウス１０番染色体又はマウス１６番染色体の長腕に存在する全内在遺伝子（数）の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９〜１００％が削除される部位（位置）である。
本明細書中の「テロメア配列」は、同種又は異種の天然テロメア配列、或いは、人工テロメア配列である。ここで、同種とは、人工染色体ベクターの染色体断片が由来するマウスと同種の動物を意味し、一方、異種とは、該マウス以外の哺乳動物（これには、ヒトを含む）を意味する。また、人工テロメア配列は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列（ｎは、繰り返しを意味する。）などの人工的に作製されたテロメア機能を有する配列を指す。人工染色体へのテロメア配列の導入は、例えば国際公開ＷＯ００／１０３８３号に記載されるようなテロメアトランケーション（テロメア配列の置換）によって行うことができる。テロメアトランケーションは、本発明の人工染色体の作製において染色体の短縮のために使用することができる。
本明細書中の「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除く、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などの哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
本明細書中の「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」は、哺乳動物由来の受精卵の胚盤胞の内部細胞塊から樹立された分化多能性と半永久的増殖能とを備えた幹細胞である（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４−２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３−１６５）。この細胞と同等の性質をもつ、体細胞の再プログラミングによって人工的に誘導された細胞が「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ １２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０）。
＜マウス人工染色体ベクターの作製及び用途＞
以下に、本発明のマウス人工染色体ベクターの作製及びその用途について説明する。具体的には、後述の実施例及び図面にその手順が記載されている。
（１）マウス人工染色体ベクターの作製
本発明の人工染色体ベクターは、以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）マウス染色体を含む細胞を得る工程、
（ｂ）内在遺伝子（数）の大部分（９９．５％以上１００％以下）を含まないようにマウス染色体の長腕遠位を削除する工程、及び
（ｃ）長腕近位に１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を挿入する工程
を含む方法によって作製することができる。ここで、工程（ｂ）及び（ｃ）の順序は逆であってもよい。
工程（ａ）：
本発明の人工染色体ベクターを作製するには、まず、マウス染色体を含む細胞を作製する。例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子）で標識されたマウス染色体を含むマウス線維芽細胞であるｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１１−ｎｅｏ）とｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ耐性遺伝子であるＢＳｒ遺伝子を導入したマウスＡ９細胞（ＡＴＣＣ ＶＡ２０１１０−２２０９）であるｍｏｕｓｅ Ａ９（ＢＳｒ）と細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を含むマウスＡ９雑種細胞であるｍｏｕｓｅ Ａ９ｘ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＢＳｒ；ｍＣｈｒ−ｎｅｏ）から、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウス繊維芽細胞は、文献記載の方法に基づいて入手することが可能であり、例えば、マウス繊維芽細胞は日本クレアより入手可能なICR系統やＣ５７Ｂ６系統のマウスより樹立可能である。相同組換え率の高い細胞としては、例えば、ニワトリＤＴ４０細胞（Ｄｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１７４−１８２，１９９６）を利用できる。さらにまた、上記移入は、公知の染色体移入法、例えば、微小核細胞融合法（Ｋｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，８０：４１３−４１８，１９７３）によって行うことができる。
工程（ｂ）：
マウス由来の単一の染色体を含む細胞において、該マウス染色体の長腕遠位を削除する。このとき、重要なことは、長腕上に存在する内在遺伝子の大部分を削除（又は、除去もしくは欠失）しマウスセントロメアを含む人工染色体を構築することである。これは長腕上に存在する全内在遺伝子の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９〜１００％を削除（又は、除去もしくは欠失）するように切断位置を決定することである。そうすることによって、人工染色体が導入された、齧歯類由来の、好ましくはマウスもしくはラット由来の、細胞、組織又は個体において安定かつ高保持率で保持され、目的遺伝子（群）の正確な解析、物質生産などに用いることができる。上記内在遺伝子の削除は、例えば、ＷＯ００／１０３８３号に記載のテロメアトランケーションにより行うことができる。具体的には、マウス染色体を含む細胞において、人工テロメア配列を含むターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に（人工）テロメア配列が挿入されたクローンを取得し、これによってテロメアトランケーションにより欠失変異体が得られる。すなわち、所望の位置（又は、部位）が削除すべき長腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換、挿入されて長腕遠位が削除される。この位置は、ターゲティングベクターを構築する際の標的配列の設計により、適宜設定できる。例えば、後述の実施例では、マウス１０番染色体長腕のＮＣ＿００００７６．６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のＤＮＡ配列、及びマウス１６番染色体長腕のＮＣ＿００００８２．６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のＤＮＡ配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側でテロメトランケーションが起こるように設定されている。これにより、内在遺伝子の大部分が削除されたマウス１０番染色体断片又はマウス１６番染色体断片が得られる。
工程（ｃ）：
ＤＮＡ配列挿入部位として、好ましくは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入することができる。すなわち、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象が知られており、本発明のマウス人工染色体ベクターでは、このような酵素とその酵素の認識部位からなる系を利用して、目的とする遺伝子又はＤＮＡ配列を挿入、搭載できる。このような系として、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ酵素と、その認識部位であるｌｏｘＰ配列の系（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系；Ｂ．Ｓａｕｅｒ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；１９９３，２２５：８９０−９００）や、出芽酵母由来のＦｌｐ酵素と、その認識部位であるＦＲＴ（Ｆｌｐ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）配列の系（Ｆｌｐ／ＦＲＴ系）や、ストレプトミセスファージ由来のφＣ３１インテグレースと、その認識部位であるφＣ３１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｒ４インテグレースと、その認識部位であるＲ４ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、ＴＰ９０１−１インテグレースと、その認識部位であるＴＰ９０１−１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｂｘｂ１インテグレースと、その認識部位であるＢｘｂ１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、などを挙げることができるが、ＤＮＡ配列挿入部位として機能しうるのであれば、上記の系に限定されないものとする。
このような部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入のためには、公知の方法、例えば、相同組換え法が利用でき、挿入位置及び数は、長腕近位及び短腕近位内に適宜設定することができる。
本発明においては、１つの種類の認識部位又は異なる種類の認識部位を１つ挿入することも可能である。認識部位の設定により、外来遺伝子又は外来ＤＮＡの挿入位置を特定することができるので、挿入位置が一定となり、想定外の位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）を受けることもなくなる。後述の実施例に例示されるマウス人工染色体の場合には、マウス染色体上の部位特異的組換え酵素の認識部位ｌｏｘＰ配列において挿入された遺伝子を組織特異的に発現させることを可能にする。
本発明の、ＤＮＡ配列挿入部位を有するマウス人工染色体ベクターには、好ましくは、目的とする遺伝子又はＤＮＡ配列の挿入部位を残して、レポーター遺伝子をあらかじめ挿入しておいてもよい。レポーター遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、等）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、等）、タグタンパク質コードＤＮＡ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、発光遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、等）などが挙げられるが、ＧＦＰ又はＥＧＦＰが好ましい。
本発明のマウス人工染色体ベクターにはさらに、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカーは、該ベクターで形質転換された細胞を選別する際に有効である。選択マーカー遺伝子としては、ポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子のいずれか、又はその両方が例示される。ポジティブ選択マーカー遺伝子には、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏもしくはＮｅｏＲ）、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ（ＢＳ）耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）、ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）などが含まれる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子には、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡ断片（ＤＴ−Ａ）遺伝子などが包含される。一般に、ＨＳＶ−ＴＫは、ガンシクロビル又はシクロビルと組み合わせて使用される。
本発明のマウス人工染色体ベクターに、レポーター遺伝子又は目的の外来遺伝子もしくはＤＮＡを挿入する手法としては、相同組換え法を好ましく使用できる。相同組換えは、マウス染色体上の挿入位置の５’側領域及び３’側領域の塩基配列（各々約１〜６ｋｂ、好ましくは約２〜４ｋｂ）と相同な両配列（５’ａｒｍ及び３’ａｒｍ）の間に、挿入すべきＤＮＡカセットを連結して得られたターゲティングベクターを用いて行うことができる。この目的で使用されるベクターとしては、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスなどが挙げられ、好ましくはプラスミドである。ターゲティングベクター構築のための基本プラスミドの例は、Ｖ９０７又はＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）などであるが、これらに限定されない。基本ベクターには、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー遺伝子、複製開始点などの、ベクター構築において一般的に挿入される１つ又は２つ以上の配列又はエレメントが含まれていてもよい。プロモーターの例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）プロモーターなどを含むことができる。
上記の手法で作製されたマウス人工染色体ベクターは、マウス由来の染色体断片（これには、天然型セントロメア、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、の内在遺伝子が削除された長腕断片、及び（存在する場合の）短腕が含まれる。）と、人工テロメア配列とを含む。また、上記セントロメアは、人工染色体の作製のために利用されたマウスの染色体のセントロメア構造の全体である。
本発明のマウス人工染色体ベクターの例は、後述の実施例で作製されたマウス人工染色体ベクターであり、この人工染色体は、マウス１０番染色体において長腕遠位を遺伝子Ｇｍ８１５５の上流領域において削除して得られたベクター、及びマウス１６番染色体において長腕遠位を遺伝子Ｇｍ３５９７４の上流領域において削除して得られたベクターである。これらのベクターは、寄託細胞株ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５６）又は寄託細胞株ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５７）に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む。基本構造であることから、このＤＮＡ構造中に以下のようなＤＮＡ配列挿入部位、選択マーカー遺伝子、外来遺伝子（又は、ＤＮＡ）などを挿入することができる。
上記マウス人工染色体ベクターは、好ましくは、１つ又は複数のＤＮＡ配列挿入部位、例えば部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばＣｒｅ酵素認識部位であるｌｏｘＰ配列）を含むことができる。ここで、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列であるか、或いは、５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇタイプであるか、或いはＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列或いはＧＦＰ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＰＧＫｈｙｇタイプのｌｏｘＰ配列であるが、これらに限定されない。ここで、ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質遺伝子であり、ＰＧＫｎｅｏは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン耐性遺伝子カセットであり、ＨＰＲＴは、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であり、ｈｙｇはハイグロマイシン耐性遺伝子である。
上記マウス人工染色体ベクターにはさらに、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子（ポジティブ選択マーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子など）を含むことができる。
上記マウス人工染色体ベクターにはさらに、外来遺伝子又はＤＮＡ配列を含んでもよい。
外来遺伝子又はＤＮＡは、限定されないが、ヒト遺伝子又はＤＮＡなどを含み、このなかには例えばヒト染色体長腕又は短腕の遺伝子もしくは遺伝子座のＤＮＡなどが含まれる（下記（２）参照）。
本発明のマウス人工染色体ベクターの利点としては従来の人工染色体ベクターの利点である、１）宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、宿主遺伝子を破壊しない、２）一定のコピー数（複数（多）コピー可能）で安定に保持され、宿主細胞の生理的発現制御を受けることから、挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、３）導入可能なＤＮＡサイズに制約がないことから、発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子／アイソフォームの導入が可能となることに加え、齧歯類細胞或いは齧歯類個体中における保持率が向上すること、導入遺伝子の長期間における安定発現を実現し、かつ子孫伝達率が向上することで遺伝子導入マウスの作製効率が向上する、４）ベクター導入後の組織間のばらつきが少なく、すなわち保持率は約９０％以上である、などの利点が挙げられる。
（２）外来遺伝子又はＤＮＡの導入
本発明のマウス人工染色体ベクターには、外来遺伝子又はＤＮＡを導入することができる。
外来遺伝子又はＤＮＡ配列のサイズは、特に制限されず、２０ｋｂ以下であってもよいし、或いは２０ｋｂを超えてもよく、例えば５０ｋｂ以上、１００ｋｂ以上、２００ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、７００ｋｂ以上、１Ｍｂ以上、１０Ｍｂ以上、２０Ｍｂ以上、３０Ｍｂ以上、４０Ｍｂ以上、又は５０Ｍｂ以上である。本発明のベクターは、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣなどの人工染色体ベクターでは困難なサイズ、すなわち１Ｍｂ以上の外来ＤＮＡ（染色体断片）を搭載可能である。そのうえ、本発明のベクターは、そのように２００ｋｂ以上、例えば１Ｍｂ以上、の大サイズの外来遺伝子又はＤＮＡを安定にかつ高い保持率で齧歯類の細胞内、組織内又は個体内、に含むことを可能にする。
本発明の実施形態の一つとして、本発明は、２００ｋｂ以上の巨大なサイズの外来遺伝子又はＤＮＡを齧歯類の細胞、組織又は個体で９０％以上の保持率で安定に維持させることが可能なベクター、並びに、該ベクターを作製する方法を提供する。
外来遺伝子又はＤＮＡは、マウス、ラットなどの齧歯類以外の生物種由来の核酸であり、特に限定されるものではなく、任意の生物種由来の或いは任意の組織又は細胞由来の遺伝子又はＤＮＡであり、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子又はＤＮＡ、より好ましくはヒト由来の遺伝子又はＤＮＡである。そのような遺伝子又はＤＮＡには、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、免疫グロブリン類、Ｇ蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はＤＮＡ、その他、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、等）、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患、感染症、閉塞性動脈硬化症、膿疱性線維症、ＡＤＡ（アデノシン・デアミナーゼ）欠損症などを含む種々の疾患に関連する治療用遺伝子又はＤＮＡ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの免疫系遺伝子又はＤＮＡ、（ヒト）薬物代謝酵素の遺伝子（群）又はＤＮＡや（ヒト）薬物代謝関連遺伝子又はＤＮＡ、ヒト染色体の長腕又は短腕のＤＮＡ、（ヒト）ゲノムライブラリーなどが含まれるが、これらに限定されない。
サイトカイン類には、例えば、インターフェロン類（例えばＩＦ−α，ＩＦ−β，ＩＦ−γ等）、インターロイキン類（例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２等）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−α，ＴＮＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリータンパク質（例えば骨形成促進タンパク質（ＢＭＰ）、等）などが含まれる。
ホルモン類には、例えば、成長ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）、ヒト下垂体性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン放出因子、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、プロラクチンなどが含まれる。
成長因子類又は栄養因子類には、例えば、インスリン様増殖因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アルブミン融合絨毛様神経栄養因子、血小板由来神経栄養因子（ＰＤＮＦ）、形質転換成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＴＮＦ成長因子などが含まれる。
血液凝固・溶解因子類には、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、ｔ−ＰＡなどが含まれる。
造血因子類には、例えば、エリスロポエチン、（顆粒球）コロニー形成刺激因子、トロンボポエチンなどが含まれる。
Ｇ蛋白質共役型受容体類には、アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、ＧＡＢＡ受容体（Ｂ型）、アンギオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、ガストリンの受容体、Ｐ２Ｙ受容体などが含まれる。
酵素類には、例えば、アスパラギナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ウリカーゼ、ストレプトキナーゼ、ドーパミン合成酵素、アデノシン・デアミナーゼなどが含まれる。
腫瘍、筋ジストロフィー、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、等）、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などを含む種々の疾患に関連する治療用遺伝子には、例えばジストロフィン遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ドーパミン合成系酵素遺伝子、遺伝性欠損酵素の遺伝子類（例えば副腎酵素（例えばチトクロム酵素（Ｐ４５０）、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２１ヒドロキシラーゼ（Ｐ４５０ ｃ２１）、等）の遺伝子、等）などが含まれる。
免疫系遺伝子には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、Ｆｃγ受容体（ＦＣＧＲ）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ））、白血球Ｉｇ様受容体（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＩＬＲ））などの免疫系に関与するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡなどが含まれる。
薬物代謝酵素は、薬や毒物などの異物を分解・排出するための代謝反応に関わる酵素であり、第一相反応（酸化、還元、加水分解）に関わる酵素及び第二相反応（抱合）に関わる酵素を含む。第一相反応に関わる酵素には、例えばチトクロムＰ４５０（「ＣＹＰ」）などの公知の酵素、具体的にはＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ２Ｊ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ、ＣＹＰ４Ｂ及びそれらのサブファミリー、並びにＣＥＳ、などが含まれる。ＣＹＰサブファミリーとしては、例えばＣＹＰ３ＡのサブファミリーにはＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ４３，ＣＹＰ３Ａ５，ＣＹＰ３Ａ７などが含まれるし、また、ＣＹＰ２ＣのサブファミリーにはＣＹＰ２Ｃ８，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１８，ＣＹＰ２Ｃ１９などが含まれる。一方、第二相反応（抱合）に関わる酵素には、例えばＵＧＴ１及びＵＧＴ２などが含まれる。
薬物代謝関連遺伝子には、例えばトランスポーターをコードする遺伝子、核内受容体をコードする遺伝子などが含まれる。トランスポーターをコードする遺伝子の例は、ＭＤＲ１，ＭＤＲ２，ＭＲＰ２，ＯＡＴ，ＯＡＴＰ，ＯＣＴ，ＢＣＲＰなどであり、核内受容体をコードする遺伝子の例は、ＰＸＲ，ＡｈＲ，ＣＡＲ，ＰＰＡＲαなどである。
このように、本発明のベクターに導入可能な、薬物代謝に関係する外来ＤＮＡ配列は、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の配列、或いは、少なくとも２つの遺伝子の配列を含むことができる。
免疫グロブリン類をコードする遺伝子又はＤＮＡは、好ましくはヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座であり、具体的にはヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座、又はその重鎖及び軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座の両方のＤＮＡである。該軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座は、λ軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座及び／又はκ軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座である。
本明細書中で使用する「ヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座」は、特に断らない限り、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及び／又はヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を指す。具体的には、ヒト抗体遺伝子もしくは遺伝子座は、例えばヒト１４番染色体のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｌｏｃｕｓ（ｈｕｍａｎ）ＮＣ＿００００１４．９（（塩基番号１０５５８６４３７．．１０６８７９８４４）あるいは（塩基番号１０５２６４２２１．．１０７０４３７１８））、ヒト２番染色体のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ（ｈｕｍａｎ）ＮＣ＿０００００２．１２（（塩基番号８８８５７３６１．．９０２３５３６８）あるいは（塩基番号８８５６００８６．．９０２６５６６６））、及びヒト２２番染色体のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ ｌｏｃｕｓ（ｈｕｍａｎ）ＮＣ＿００００２２．１１（（塩基番号２２０２６０７６．．２２９２２９１３）あるいは（塩基番号２１６２０３６２．．２３８２３６５４））に記載される塩基配列によって表される。ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座は、約１．３Ｍｂの塩基長であり、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座は、約１．４Ｍｂの塩基長であり、ヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座は、約０．９Ｍｂの塩基長である。
因みに、マウスの抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座は、マウス第１２番染色体上にあり、マウスの抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座は、マウス第６番染色体上にあり、マウス抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座は、マウス第１６番染色体上にある。具体的には、マウス抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座は、例えばＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １２，ＮＣ＿００００７８．６（１１３２５８７６８．．１１６００９９５４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、マウス抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座は、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ６，ＮＣ＿００００７２．６（６７５５５６３６．．７０７２６７５４）、マウス抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座は、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １６，ＮＣ＿００００８２．６（１９０２６８５８．．１９２６０８４４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に記載される塩基配列によって表される。
また、ラットの抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座は、ラット第６番染色体上にあり、ラットの抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座は、ラット第４番染色体上にあり、ラット抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座は、ラット第１１番染色体上にある。同様に、これらの遺伝子もしくは遺伝子座の塩基配列は、米国ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ等）、公知文献などから入手可能である。
本発明において上記のヒト抗体遺伝子を含む上記のマウス人工染色体ベクターは、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター、あるいは、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター、あるいは、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座のすべてを含むマウス人工染色体ベクターである。これらのベクターは、本明細書に記載の染色体工学技術を用いることによって作製可能である。
本発明の非ヒト動物は、上記のヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター及びヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む動物、あるいは、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む動物である。これによって上記の非ヒト動物は、抗原物質を投与されたとき、その物質に対するヒト抗体を産生することが可能になる。
本明細書におけるヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のいずれのクラス及びサブクラスでもよい。そのようなクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥが含まれ、サブクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれる。これらのクラス及びサブクラスは、重鎖の違いによって分けることが可能であり、ＩｇＧ鎖は、γ鎖と称し、ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４に対応してγ１、γ２、γ３及びγ４鎖と称し、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥはそれぞれα鎖（α１及びα２）、μ鎖、δ鎖、ε鎖と称する。いずれの抗体の軽鎖にもκ鎖とλ鎖があり、免疫グロブリン遺伝子の再配列の過程でκ鎖遺伝子の再構成が不成功に終わるとλ鎖遺伝子の再構成が起こることが知られている。また、ヒト抗体重鎖遺伝子座は、５'から３'に向けて、ＶＨ１，ＶＨ２，....,ＶＨｍ（ここで、ｍは、例えば３８〜４６である。）を含むＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ）領域遺伝子、ＤＨ１，ＤＨ２．．ＤＨｎ（ここで、ｎは、例えば２３である。）を含むＤ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）領域遺伝子、ＪＨ１，ＪＨ２．．ＪＨｒ（ここで、ｒは６である。）を含むＪ（ｊｏｉｎｉｎｇ）領域遺伝子、Ｃμ，Ｃδ，Ｃγ３，Ｃγ１，Ｃα１，Ｃγ２，Ｃγ４，Ｃε，Ｃα２を含むＣ（ｃｏｎｓｔａｎｔ）領域遺伝子を含む。免疫システムにおいて上記のヒト免疫グロブリン遺伝子の再配列を介して産生される抗体が、ヒト抗体である。
ヒト抗体分子は、２本のヒト抗体重鎖と２本のヒト抗体軽鎖からなり、各重鎖と各軽鎖は２つのジスルフィド結合によって結合されており、並びに、２本の重鎖は定常（Ｃ）領域で２つのジスルフィド結合によって結合された構造を有する。また、抗体分子の可変（Ｖ）領域には、とりわけ変異の大きい部分が３か所あり、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ））と呼ばれており、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。このＣＤＲ領域の配列の違いにより抗体の抗原に対する結合特性が変化する。免疫グロブリン遺伝子の再構成によって抗体の多様性が生じることが知られている。
本発明のマウス人工染色体ベクターにおける外来遺伝子又は外来ＤＮＡの挿入部位の近傍又は挿入部位の両側には、少なくとも１つのインスレーター配列を存在させることができる。インスレーター配列は、エンハンサーブロッキング効果（すなわち、隣り合う遺伝子が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を有する。このような配列には、例えばヒトβグロビンＨＳ１〜ＨＳ５、ニワトリβグロビンＨＳ４などが包含される。
外来遺伝子又はＤＮＡの導入は、上記のＤＮＡ配列挿入部位として挿入されている、上で例示されるような部位特異的組換え酵素の系を利用して行うことができる。例えば、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列と外来遺伝子又はＤＮＡを含むターゲティングベクター或いは、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列を挿入した外来遺伝子又はＤＮＡを含む染色体断片を構築し、本発明のマウス人工染色体ベクターを含む細胞内でＣｒｅ酵素を発現させることにより、ｌｏｘＰ配列において該ターゲティングベクター或いは該染色体断片との部位特異的組換えにより、外来遺伝子又はＤＮＡを導入できる。
本発明のマウス人工染色体ベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列など）を含む環状ＤＮＡを挿入することもでき、大腸菌を宿主としたプラスミドや、酵母を宿主とした環状ＹＡＣ等の既存のベクターによりクローン化されたＤＮＡも挿入できる。好適なｌｏｘＰ配列はＰ１ファージに由来する野生の配列であり、Ｃｒｅ酵素による人工染色体ベクター上のｌｏｘＰ配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。一旦環状インサートが挿入されると、人工染色体ベクター上に２つのｌｏｘＰ配列が残る。このため再度Ｃｒｅ酵素を発現させると環状インサートを切り出す逆反応が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するようなさらなる人工染色体ベクターの改変が困難となる。しかし、塩基置換を行った変異ｌｏｘＰ配列やφＣ３１インテグレースの認識部位であるａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の組み合わせ等によっては、逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築できる。
（３）マウス人工染色体ベクターの細胞への移入及び非ヒト動物の作出
本発明のマウス人工染色体ベクター、或いは、外来遺伝子若しくはＤＮＡを含む本発明のマウス人工染色体ベクターは、任意の細胞に移入又は導入することができる。そのための手法には、例えば、微小核細胞融合法、リポフェクション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれるが、好ましい手法は微小核細胞融合法である。
微小核細胞融合法は、本発明のマウス人工染色体ベクターを含有する微小核形成能を有する細胞（例えばマウスＡ９細胞）と、他の所望の細胞との微小核融合によって該ベクターを該他の細胞に移入する方法である。微小核形成能を有する細胞は、倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理して微小核多核細胞を形成し、サイトカラシン処理により微小核体を形成する処理を行ったのちに、所望の細胞との細胞融合を行う。
上記のベクター導入可能な細胞は、動物細胞、好ましくはヒト細胞を含む哺乳動物細胞、例えば卵母細胞、精子細胞などの生殖系列細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、精子幹（ＧＳ）細胞、体性幹細胞などの幹細胞、体細胞、胎児細胞、成体細胞、正常細胞、疾患細胞、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞など、を包含する。幹細胞には、例えばＥＳ細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞、ｍＧＳ細胞、ヒト間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、核移植クローン胚由来胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞などが含まれる。好ましい細胞は、哺乳動物（好ましくは、マウスを含む齧歯類）由来の体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される。細胞が齧歯類などの哺乳類由来の細胞である場合、本発明のベクターが導入された哺乳類（例えばマウスなどの齧歯類）の細胞又は組織において、ベクターがより安定に保持される、すなわち細胞からのベクターの脱落が有意に低下する、又は脱落が起こらない。
細胞は、例えば、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子、卵子などである。
組織は、例えば肝臓、腸、腎臓、胸腺、脾臓、肺、心臓、筋肉（例えば骨格筋）、脳、骨髄、精巣、卵巣などの組織である。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マイトマイシンＣ処理マウス胎仔線維芽細胞をフィーダーにして樹立し維持することができる（Ｍ．Ｊ．ＥｖａｎｓとＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６）。
ｉＰＳ細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む）に、ある特定の再プログラム化因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３〜５週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；或いは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３−６７６（２００６）；ＷＯ ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７−１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８，６００−６０３（２００８））。培養例は、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（約１０４〜１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地、それらの混合培地などであり、ＥＳ細胞用培地は、マウスＥＳ細胞用培地、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）などを使用することができる。
ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、生殖系列に寄与することが知られているので、目的の遺伝子又はＤＮＡを含む本発明のマウス人工染色体ベクターを導入したこれらの細胞を、該細胞が由来する同種の哺乳動物の胚の胚盤胞に注入し、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させることを含む手法によって、非ヒト動物（又は、トランスジェニック動物（ヒトを除く））を作出することができる。さらにまた、得られた雌雄のトランスジェニック動物を交配することによって、ホモ接合性動物、さらにその子孫動物を作出することができる。
本発明のマウス人工染色体ベクターを介してＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの分化多能性細胞、その他の上記細胞類に、ヒト抗体遺伝子、疾患治療用遺伝子、薬物代謝関連遺伝子などの外来の遺伝子若しくはＤＮＡを導入することによって、ヒト抗体を産生可能にする細胞や非ヒト動物を作製することができるし、また、治療用タンパク質を産生可能にする細胞を作製することができるし、さらにまた、薬物代謝関連疾患などの疾患モデル非ヒト動物を作製することができる。
そのような非ヒト動物では、マウス人工染色体ベクターに含まれる外来遺伝子に対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下していることが好ましい場合もある。破壊の方法には、ジーンターゲティング法を使用することができる。内在遺伝子の発現の低下法には、ＲＮＡｉ法やｍｉＲＮＡ法などを用いることができる。例えば、そのような外来遺伝子の例には、薬物代謝関連遺伝子、ヒト抗体遺伝子などが挙げられる。内在遺伝子が破壊された非ヒト動物は、外来遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを含むキメラ非ヒト動物若しくはその子孫と、対応する内在遺伝子をクラスターごと欠失させたキメラ動物若しくは子孫とを交配させて得られた該内在遺伝子がヘテロに欠失した動物同士をさらに交配させることによって作出することができる。
上記の手法によって、マウス人工染色体ベクターを含む細胞又はトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。具体的な非ヒト動物の例は、マウス人工染色体ベクターを含む、マウスやラットなどの齧歯類である。
すなわち、本発明は、マウス人工染色体ベクターを含むことを特徴とする、細胞又は非ヒト動物を提供する。
さらにまた、本発明の非ヒト動物から得られる細胞、組織又は器官は、それらから、外来遺伝子によって発現されたタンパク質を産生する細胞株を作製するために使用することも可能である。
（４）ヒト抗体産生非ヒト動物
本発明の非ヒト動物は、上記のとおり、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクター、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む動物、あるいは、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む動物である。
具体的には、例えば図１７、図２１に示された手順によって、ヒト抗体を産生可能な本発明の非ヒト動物（マウス及びラット）を作製することができる。
以下において、マウス人工染色体を利用する非ヒト動物の作製例について説明する。
部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰ及びＦＲＴ）を導入して改変された、ヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含む動物細胞（例えばＤＴ４０）、及びヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含む動物細胞（例えばＤＴ４０）のそれぞれを、細胞融合法によりマウス人工染色体（ＭＡＣ）を含む齧歯類細胞（例えばＣＨＯ）に移入したのち、部位特異的組換え酵素（例えばＣｒｅ）発現を誘導することにより、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞、並びにヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞を作製する。
動物細胞（例えばＤＴ４０）に保持されるヒト１４番染色体上のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座の近傍に部位特異的組換え酵素の認識部位（例えばＦＲＴ）を導入したのち、改変されたヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座を含む動物細胞を、細胞融合法によりＭＡＣを含む齧歯類細胞（例えばＣＨＯ）に移入して、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞を作製する。
上記のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞のそれぞれと、上記のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座を含む齧歯類細胞とを融合することによって、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座を含む齧歯類細胞内に、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣ、又はヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを移入したのち、部位特異的組換え酵素（例えばＦＬＰ）発現を誘導することにより、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞、並びにヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞のそれぞれを作製する。
上記のヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞、並びにヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む齧歯類細胞のそれぞれを、微小核細胞融合法により、非ヒト動物（例えばマウス又はラット）分化多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞）と融合して、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物分化多能性幹細胞、並びにヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物分化多能性幹細胞を作製する。
上記のヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物分化多能性幹細胞、並びにヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物分化多能性幹細胞のそれぞれを、非ヒト動物の初期胚（例えば８細胞期胚又は胚盤胞期胚）に移植して、上記ＭＡＣのそれぞれを含むキメラ動物を作製し、さらに子孫動物を作製する。さらに子孫動物同士の交配により上記ＭＡＣのそれぞれを含む子孫動物を作製する。
同様の手法を用いることによって、上記のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む非ヒト動物を作製することができる。
上記のヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物、又は、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物との間での交配を行い、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む、かつヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた非ヒト動物、あるいは、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む、かつヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた非ヒト動物を作製する。
或いは、上記のヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物、並びに、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物との間での交配を行い、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む、並びに、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むＭＡＣを含む、かつ対応するヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた非ヒト動物を作製する。
或いは、上記のヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト抗体軽鎖κ遺伝子もしくは遺伝子座、及びヒト抗体軽鎖λ遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む非ヒト動物と、ヒト抗体重鎖遺伝子もしくは遺伝子座及びヒト抗体軽鎖κ及びλ遺伝子もしくは遺伝子座に対応する内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた同種の非ヒト動物を交配し、ＭＡＣを含み、かつ該動物の該内在抗体遺伝子もしくは遺伝子座がノックアウトされた、非ヒト動物を作製する。
（５）有用なタンパク質の生産法
本発明はさらに、外来ＤＮＡ配列を発現可能に含むマウス人工染色体ベクターを含む細胞を培養し、産生された該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法を提供する。
タンパク質として、例えば上記の医療上、診断上、農業上などの産業上有用なタンパク質又はポリペプチド類が挙げられる。これらのタンパク質又はポリペプチド類をコードするＤＮＡを、プロモーター（及び必要であれば、エンハンサー）の存在下で発現可能となるようにマウス人工染色体ベクターに挿入し、適当な細胞を形質転換若しくはトランスフェクションする。得られた細胞を培養し、該ＤＮＡを発現させて該タンパク質又はポリペプチドを産生させ、これを、細胞又は培地から回収する。
細胞は、哺乳動物細胞の他に、Ｓｆ細胞などの昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、植物細胞などの真核細胞の使用も可能である。
培地を含む培養条件は、細胞の種類に応じて選択され、培養条件として公知の条件を使用しうる。例えば、動物細胞の培地としては、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、イスコフＥＭＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、これらの混合培地などが含まれる。
タンパク質又はポリペプチド類の回収（又は、単離）は、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどのクロマトグラフィー法、塩析法、硫安沈殿法、有機溶媒沈殿法、限外ろ過法、結晶化などの公知の手段を単独で又は組み合わせて実施しうる。
（６）ヒト抗体の製造法
本発明はさらに、ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを含む上記（４）の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法を提供する。
ヒト抗体遺伝子は、ヒトＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥのいずれかのクラス、或いは、ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２のいずれかのサブクラスをコードする遺伝子である。好ましいヒト抗体遺伝子は、ＩｇＧクラス及びそのサブクラスである。
ヒト抗体は、２本の同一配列の重鎖（Ｈ）と２本の同一配列の軽鎖（Ｌ）から構成されており、Ｈ鎖もＬ鎖もともに、可変領域と定常領域から構成されている。ヒトＨ鎖及びＬ鎖の可変領域はともに、３つの超可変領域（Ｎ末端側からＣ末端側にＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３の順番）と４つのフレームワーク領域（Ｎ末端側からＣ末端側にＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３，ＦＲ４の順番）からなり、ヒトＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれ３つずつのＣＤＲ配列によって抗体の特異性が決まる。
ヒトＩｇＧ抗体の場合、重鎖であるμ鎖と、軽鎖であるλ鎖若しくはκ鎖とによって構成されており、これらの抗体鎖遺伝子はそれぞれ、ヒト１４番染色体、２２番染色体、２番染色体上に存在する。本発明で使用するヒト抗体遺伝子としては、各抗体遺伝子座を含むヒト染色体断片を使用し、これらを異なる又は同一のマウス人工染色体に組み込む。抗体遺伝子配列は、ＮＣＢＩ（米国）のデータベースなどから入手可能である。この一連の手法は、例えば特開２００５−２３００２０号公報に記載される技術の改良である。
完全ヒト抗体を生産可能な非ヒト動物は、ヒトμ鎖遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む非ヒト動物と、ヒトλ鎖遺伝子座及び／又はヒトκ鎖遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む同種の非ヒト動物とを交配することによって、両方のＨ鎖及びＬ鎖遺伝子座を保有するキメラ非ヒト動物及びその子孫動物を得ることが可能である。
このようにして作製された完全ヒト抗体産生可能な非ヒト動物（例えばマウス、ラットなどの齧歯類）に、ある特定の抗原ペプチド若しくは抗原ポリペプチドを免疫し、該動物の血液からヒト抗体を分離することを含む方法により、ヒト抗体を生産することができる。
或いは、ある特定の抗原で免疫した非ヒト動物の脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることも可能である。
（７）治療物質のスクリーニング法
本発明はさらに、疾患モデル動物である上記非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法を提供する。
疾患モデル非ヒト動物は、ある種のタンパク質の欠損、変異などによる生物機能異常、薬物代謝異常、染色体異常などの異常を原因とする疾患を持つ人工的に作製された動物である。染色体異常をもつモデル非ヒト動物の例は、以下に限定されないが、ヒト１８番又は２１番染色体トリソミーをもつ動物である。
このような非ヒト動物は、遺伝子又は染色体に上記のような異常を含む遺伝子又は染色体断片を作製し、これを本発明のマウス人工染色体ベクターに組み込み、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に導入し、受精卵の胚盤胞に注入し、この細胞を非ヒト動物の仮親の子宮に移植し、出産させることを含む方法によって作出することができる。
上記のようにして作製された非ヒト動物に、候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することによって、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングすることができる。
候補薬剤は、非限定的に、例えば、低分子化合物、高分子化合物、（糖）タンパク質、ペプチド、（リン又は糖）脂質、糖類、核酸類などである。
（８）薬物又は食品の薬理作用、代謝又は毒性の試験方法
本発明の実施形態によれば、本発明はまた、ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを含む上記非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び／又は代謝及び／又は毒性の試験方法を提供する。
本発明はまた、ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを含む上記非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分Ｓ９を、培養細胞若しくは細菌及び薬物若しくは／及び食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす（悪）影響（例えば変異、等）を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法を提供する。
ヒト薬物代謝関連遺伝子は、上に例示したものである。また、非ヒト動物の作出方法も上に記載したものと同様である。
ヒト薬物代謝関連遺伝子を有するマウス人工染色体ベクターを含む上記の非ヒト動物を用いる上記方法では、例えば、該動物の状態の観察、臓器や染色体に及ぼす影響の試験などによって、薬物又は食品の薬理作用、代謝又は毒性を判定することができる。
本発明のもうひとつの方法では、該非ヒト動物から得られたミクロソーム若しくはミクロソーム画分Ｓ９（９０００ｇ画分であって加水分解、還元、酸化、結合などを触媒する多数の酵素を含む画分）を、培養細胞（特に、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞）又は細菌（好ましくは、サルモネラ菌）と一緒に、薬物及び／又は食品の存在下で培養する。薬物又は食品の、細胞に対する毒性の検出は、エイムス試験又は小核試験によって行うことができる。エイムス試験では、サルモネラ菌の変異に基づいて毒性を判定する。小核試験では、細胞核の染色体の異常に基づいて毒性を判定する。これらの試験法はよく知られており、本発明の方法で使用しうる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例に限定されるものではない。
［実施例１］マウス人工染色体ベクター構築を目的とした染色体改変のためのマウス染色体保持ＤＴ４０細胞の作製
マウス人工染色体ベクター構築のため、微小核形成率の高いマウスＡ９細胞を介して、相同組換え頻度の高いニワトリＤＴ４０細胞へマウス染色体を移入する。
［Ａ］Ａ９細胞とマウス繊維芽細胞（Ｂｓｄ；ｍＣｈｒ−Ｎｅｏ）のハイブリッド細胞樹立
薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ耐性遺伝子）で標識されたマウス１０番染色体及び１６番染色体を含有するマウス繊維芽細胞であるｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１０−Ｎｅｏ、ｍＣｈｒ１６−Ｎｅｏ）と公知のマウスＡ９細胞にブラストサイジンＳ耐性遺伝子であるＢｓｄ遺伝子を挿入したｍｏｕｓｅ Ａ９（Ｂｓｄ）とを細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞であるｍｏｕｓｅ Ａ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（Ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１０−Ｎｅｏ及びＢｓｄ；ｍＣｈｒ１６−Ｎｅｏ）を樹立する（図１）。薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を微小核細胞融合法により相同組換頻度の高いニワトリＤＴ４０細胞へ導入するために、微小核形成率が高いことが知られているマウスＡ９細胞に薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を細胞融合によって導入する。
［Ａ．１］細胞融合及び二重薬剤耐性クローンの単離
Ｇ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子をマウス染色体上に挿入したマウス繊維芽細胞であるｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ｍＣｈｒ１０−Ｎｅｏ及びｍＣｈｒ１６−Ｎｅｏ）と、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子であるＢｓｄ遺伝子が挿入されているマウスＡ９細胞であるｍｏｕｓｅ Ａ９（ｂｓｄ）をそれぞれＰＢＳ（−）で細胞表面を洗浄後、トリプシン添加によって細胞を分散し、培養液（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に懸濁し、それぞれの細胞１ｘ１０６個を培養用フラスコ（２５ｃｍ２）に同時に植え込み、一日間培養する。ＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄した後に３ｍｌのＰＥＧ（１：１．４）溶液［５ｇ，ＰＥＧ１０００，ｃａｔ：１６５−０９０８５，ｗａｋｏを無血清ＤＭＥＭ６ｍｌに溶解させ、ジメチルスルホキシド１ｍｌを加えて濾過滅菌する］で１分間処理し、さらに３ｍｌのＰＥＧ（１：３）溶液［５ｇ，ＰＥＧ１０００，ｃａｔ：１６５−０９０８５，ｗａｋｏを無血清ＤＭＥＭ１５ｍｌに溶解させて濾過滅菌する］に換えて１分間処理した。ＰＥＧ溶液を吸引後、無血清ＤＭＥＭで３回洗浄し、通常の培養液（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）で一日間培養した。ＰＢＳ（−）で細胞表面を洗浄後、トリプシン添加によって細胞を分散し、Ｇ４１８及びブラストサイジンＳを含む二重選択培養液（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞をプラスチック培養皿に植え込み、２〜３週間選択培養した。ｍＣｈｒ１０−Ｎｅｏでは４回の細胞融合で得た各合計９個の耐性コロニーを単離し増殖させ、ｍＣｈｒ１６−Ｎｅｏでは４回の細胞融合で得た各合計１０個の耐性コロニーを単離し増殖させ、ランダムに選択したクローンを以降に用いた（クローン名：ｍｏｕｓｅ Ａ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ及びｂｓｄ；ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ））。
［Ｂ］薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体のＤＴ４０細胞への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を含有するマウスＡ９雑種細胞であるｍｏｕｓｅ Ａ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ及びｂｓｄ；ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）から薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体をニワトリ由来であるＤＴ４０細胞へ導入する（図２）。人工テロメア（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列（サイズ：約１ｋｂ）の挿入による染色体部位特異的切断であるテロメアトランケーション、及び相同組換によりマウス染色体にＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰ配列の挿入を効率的に行うために、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を微小核細胞融合法により相同組換頻度の高いＤＴ４０細胞へ導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
染色体改変を効率的に行うために、マウス染色体をＡ９雑種細胞クローンであるＡ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ及びｂｓｄ；ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）から相同組換え頻度の高いニワトリ由来細胞であるＤＴ４０へ移入した。フラスコ×２４で培養していたドナー細胞であるＡ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ及びｂｓｄ；ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）がそれぞれのフラスコにおいて７０％コンフルエントになった時点で、コルセミド処理（コルセミド０．０５μｇ／ｍｌ、２０％ＦＣＳ、ＤＭＥＭ）を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間行った。コルセミド処理が終了したら、フラスコ内のｍｅｄｉｕｍをアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを大型高速遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１ｈ、３４℃）をした。遠心終了後、サイトカラシンＢを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収した。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心（２０００ｒｐｍ、５分、Ｒ．Ｔ）し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収、懸濁し、遠心（２０００ｒｐｍ、５分）をした。
レシピエント細胞であるＤＴ４０細胞は浮遊細胞であるため、一度付着状態にする必要がある。ＤＴ４０を６穴プレート（Ｎｕｎｃ）のうちの１穴に付着させるために５０μｇ／ｍｌに調整したポリ−Ｌ−リジン（ＳＩＧＭＡ）１．５ｍｌで１穴を３７℃、オーバーナイトでインキュベートすることでコーティングした。ポリ−Ｌ−リジンを回収し、プレートをＰＢＳ（−）で洗浄し、約１ｘ１０７個のＤＴ４０細胞を２ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）でプレートに静かに播種した。プレートごと遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）にセットし、３７℃、１２００ｒｐｍ、３分間遠心して付着ＤＴ４０にした。
精製した微小核細胞をＰＨＡ−Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去した付着ＤＴ４０上に静かに播種した。プレートを３７℃、１２００ｒｐｍ、３分間遠心した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］溶液を１ｍｌで正確に１分間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を４ｍｌで４回洗浄し、通常のＤＴ４０の培養液３ｍｌでピペッティングして、付着ＤＴ４０を浮遊状態に戻し、３７℃、２４穴プレート２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。Ｇ４１８を１５００μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養した。Ａ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ）＃４、Ａ９ｘｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄ（ｂｓｄ；ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）＃２の微小核細胞融合で得た各合計１０及び２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ）及びＤＴ４０（ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＤＴ４０（ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ）及びＤＴ４０（ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）のクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところＤＴ４０（ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ）１及びＤＴ４０（ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）３において、それぞれ９０％、９３％で正常核型（２ｎ）あたりのマウス染色体数が１コピーであったため、以降のステップに用いた。
［実施例２］マウス１０番染色体改変によるマウス人工染色体（１０ＭＡＣ）の構築
マウス人工染色体ベクターを構築するにあたり、内在の遺伝子を可能な限り削除することが必要である。相同組換え効率の高いニワトリＤＴ４０細胞内においてテロメアトランケーションという方法で内在遺伝子を含むマウス１０番染色体長腕の大部分を削除する。
［Ａ］ニワトリＤＴ４０細胞内におけるマウス１０番染色体領域セントロメア近傍から遠位のテロメアトランケーションによる部位特異的切断
マウス人工染色体ベクターとして導入目的遺伝子以外の内在遺伝子は少ない方が実験系に及ぼす影響が軽減され、かつ内在遺伝子のうちインプリント遺伝子のようにマウス個体発生に遺伝子発現量の変化による影響を及ぼす遺伝子を極力残さないことが必要であるので、マウス長腕の大部分を削除する（図３）。
［Ａ．１］テロメアトランケーションベクター作製
短腕近位部位特異的切断用の基本ベクターにはｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏコンストラクト（Ｋｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２）を用いた。
ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏのＥｃｏＲＩサイトにセルフアニーリングした合成オリゴ（Ｓｉｇｍａ）を挿入した。合成オリゴの配列を以下に示す。
EcoRI-AscI-EcoRI：5’-AATTCGGCGCGCCG-3’(配列番号1)
ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＮＣ＿００００７６．６）マウス１０番染色体長腕近位の塩基配列から相同組換え標的配列を設計した。ＤＴ４０（ｍＣｈｒ１０−ｎｅｏ）１からゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換え標的配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーの配列を以下に示す。
AscI_m10T F2：5'-TCGAGGCGCGCCAGCCTTCTAGGGAACAGGAGATGTTCAA-3' (配列番号2)
BamHI_m10T R3：5'-TCGAGGATCCGCCTTGAGTGGGGTTCTAGTCATCTTTC-3' (配列番号3)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃６分を３５サイクル行ったＰＣＲ産物をＡｓｃＩとＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、ＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩ消化したｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏにクローニングした（ベクター名：ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿１０ＭＡＣ）。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図４に示した。
［Ａ．２］相同組換え体の選別
マウス１０番染色体領域近位から遠位において部位特異的切断を行うベクターは上述のｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿１０ＭＡＣを用いてトランスフェクションを行い、ピューロマイシン耐性クローンの単離及び相同組換え体の選別を行った。
得られたクローンからＤＮＡを抽出しそれを鋳型にＰＣＲを行い、部位特異的切断の確認を行った。プライマー配列を以下に示す。
m10 F6：5'-AACTACCCAGTTCTGCATTTGGTGTGAG-3' (配列番号4)
m10 R6： 5'- ATCAGTCATCAGTACCCCCAACCTCTCT-3' (配列番号5)
m10 F6 (前出)
PuroI：5'-GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACG-3' (配列番号6)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ （ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃８分を３５サイクル行った。
Plekhg1 F：5'- TGGATGGGTTTCAATGCCACT-3' (配列番号7)
Plekhg1 R：5'- GGCATTCTCCCCTGTTGTGG-3' (配列番号8)
Gm8155 F：5'- ACCCCTCGAACCCCTATTGC-3' (配列番号9)
Gm8155 R：5'- CACGCCATCGGTGATGGATA-3' (配列番号10)
Iyd F：5'- TGGGATGACCCCCACTTCTTT-3' (配列番号11)
Iyd R：5'- TTTTGGCCTCTTGCCCCATA-3' (配列番号12)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。
その結果、マウス１０番染色体領域を切断できた３クローンを確認した（クローン名：ＤＴ４０（１０ＭＡＣ））。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図４に示した。
［Ａ．３］Ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンの選別
上記で得られたＤＴ４０（１０ＭＡＣ）の３クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＰＧＫＰｕｒｏ ｐｌａｓｍｉｄをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ３クローンすべてにおいてマウス１０番染色体の長腕部分がセントロメア近傍で切断されていることを確認した（図５）。以降のステップではクローンＴ５−２６，Ｔ６−３７を用いた。
［実施例３］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１の構築
マウス人工染色体１０ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列を挿入することでマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１を構築し、遺伝子搭載を行うためのｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞株へ導入する。
［Ａ］マウス人工染色体１０ＭＡＣへのＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列の挿入によるマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１構築
マウス人工染色体１０ＭＡＣへ遺伝子搭載サイトｌｏｘＰ及び、その存在をモニター可能なＧＦＰ発現ユニットを搭載する。
［Ａ．１］ＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰターゲティングベクター作製
ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるマウス１０番染色体のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＮＣ＿００００７６．６）。薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換えの二つの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。
KpnI_m10 LA F：5'- TCGAGGTACCTCTAAGTCAGGGAAAGATCCCCTTCTTG-3' (配列番号13)
XhoI_m10 LA R：5'- TCGACTCGAGGACCATGAAGATGGTCCAACTAAAGCAA-3' (配列番号14)
SalI_m10 RA F：5'- TCGAGTCGACCACTGCTCTTTCTTTAGTTACATGCAGCCC-3' （配列番号15）
NotI_m10 RA R：5'- TCGAGCGGCCGCATTCTTGCCAAGCTACTCTTCCGAGCTA-3' (配列番号16)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃３分及び５分を３５サイクル行った。
それぞれのＰＣＲ産物をＫｐｎＩ（ＮＥＢ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ）及びＳａｌＩ（ＮＥＢ）とＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９１３のＫｐｎＩ／ＸｈｏＩあるいはＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９１３−ｍ１０ＬＡＲＡ）。３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列をクローニングした。ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目のエクソンである３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰをＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＥｃｏＲＩとＡｓｃＩにクローニングした（ベクター名：Ｘ３．１）。さらにＸ３．１のＫｐｎＩサイトとＥｃｏＲＩサイトにＫｐｎＩとＮｏｔＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ配列をクローニングした（ベクター名：Ｘ４．１）。Ｘ４．１からＫｐｎＩとＡｓｃＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴをＶ９１３のＫｐｎＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＶＮＬＨ）。ｐＶＮＬＨのＥｃｏＲＶサイトにＮｏｔＩとＳａｌＩ消化後に平滑化を行ったＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（大阪大学、岡部博士及びＮＩＨ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士より分与）をクローニングした（ベクター名：ｐＶＧＮＬＨ）。ｐＶＧＮＬＨからＳａｌＩとＡｓｃＩにより切り出したＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをＶ９１３−ｍ１０ＬＡＲＡのＸｈｏＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ１０ＭＡＣ１）。ターゲティングベクター、標的配列及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図６に示す。
［Ａ．２］トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
ニワトリＤＴ４０細胞の培養は１０％ウシ胎仔血清（ギブコ、以下「ＦＢＳ」で記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６、Ｔ６−３７の約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化したターゲティングベクターｐ１０ＭＡＣ１を２５μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。Ｇ４１８（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。Ｔ５−２６，Ｔ６−３７各２回のトランスフェクションで得た各２４、２０個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（１０ＭＡＣ１））。
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１０番染色体上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
m10 F1：5'- TGAGAAATACCGAATGGCAGAGAAACAC-3' (配列番号17)
EGFP-F(L)：5'- CCTGAAGTTCATCTGCACCA-3' (配列番号18)
kj neo：5'- CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3' （配列番号19）
m10 R2：5'- GAGAGGAGGGAAGCTTGATGAGAAAATG-3' (配列番号20)
KpnI m10 LA F (前出)
XhoI m10 LA R (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分、８分、２．５分を３５サイクル行った。
その結果ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６、Ｔ６−３７について、各８、３クローンについて目的の組換えが行われていることが示唆された。
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記から得られたＤＴ４０（１０ＭＡＣ１）において、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴ（ｐＶＧＮＬＨ）カセットをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ｌｏｘＰ配列がターゲティングされたマウス１０番染色体断片のセントロメア付近にプローブ由来のＦＩＴＣシグナルが検出され、かつネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス１０番染色体断片（ＤＴ４０（１０ＭＡＣ））では現れなかったシグナルが検出されたことから、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた（図７）。これらの結果から、マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１を保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論できた。以降のステップでは、ＤＴ４０（１０ＭＡＣ１）Ｔ５−２６ Ｌ１−２、Ｔ５−２６ Ｌ２−３、Ｔ６−３７ Ｌ１−５の３クローンを用いることとした。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１含有ＤＴ４０細胞から１０ＭＡＣ１のＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ細胞を介してマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１をマウスＥＳ細胞に導入するため、或いはＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１のＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰを介して安定に目的遺伝子（群）等、例えばＣＹＰ３Ａクラスター、ヒト抗体遺伝子などを挿入するため、ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＤＴ４０（１０ＭＡＣ１）を用いて、上記と同様にＣＨＯ ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）に微小核細胞融合法を行う。微小核細胞融合で得たＧ４１８耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行う（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工番染色体ベクター１０ＭＡＣ１がＣＨＯ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
m10 F6 (前出)
PuroI (前出)
m10 F1 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kj neo (前出)
m10 R2 (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃８分、２．５分を３５サイクル行う。その結果、ＰＣＲ陽性のクローンについて以降の解析を行った。
［Ｂ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１）クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行い、マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１がＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。結果、１クローンについてＣＨＯ内で１０ＭＡＣ１が独立して安定に保持されていることを確認した（図8）。
［Ｃ］１０ＭＡＣ１への組換え挿入確認
１０ＭＡＣ１の組換え配列であるＬｏｘＰ−３’ＨＰＲＴが機能するか動作確認を行う。
［Ｃ．１］ＭＡＣ１へのＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる環状DNAの挿入
ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１）を６ｃｍ dishでコンフルエントになるように培養を行った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてメーカーのプロトコールに従い、Ｃｒｅ発現プラスミド（ベクター名：ｐＢＳ１８５）および５’ＨＰＲＴ−ＬｏｘＰのプラスミドを共導入した。遺伝子導入２４時間後細胞を１０ｃｍｄｉｓｈ１０枚に継代培養し、さらに２４時間後からＨＡＴで薬剤選択を行った。得られた薬剤耐性クローン２４クローンについて以降の解析を行った。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの解析
期待された部位特異的組換えが起こり、５’ＨＰＲＴ−ＬｏｘＰを保持した環状ＤＮＡが挿入されると１０ＭＡＣ１でＨＰＲＴ遺伝子の再構成が起こり、ＨＡＴ耐性になる。薬剤耐性クローンからＤＮＡを抽出し、この組換えのつなぎ目を検出するＰＣＲを行った。使用したプライマーを以下に示す。
TRANS L1：5'-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3' (配列番号21)
TRANS R1：5'-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA-3' (配列番号22)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行った。その結果、すべての薬剤耐性２４クローンについてＰＣＲ陽性であったころから、得られた薬剤耐性クローンについて高効率で部位特異的組換えによる環状ＤＮＡの挿入が起こっていることが示された。
［実施例４］マウス１６番染色体改変によるマウス人工染色体（１６ＭＡＣ）の構築
マウス人工染色体ベクターを構築するにあたり、内在の遺伝子を可能な限り削除することが必要である。相同組換え効率の高いニワトリＤＴ４０細胞内においてテロメアトランケーションという方法で内在遺伝子を含むマウス１６番染色体長腕部を削除する。
［Ａ］ニワトリＤＴ４０細胞内におけるマウス１６番染色体領域セントロメア近傍から遠位のテロメアトランケーションによる部位特異的切断
マウス人工染色体ベクターとして導入目的遺伝子以外の内在遺伝子は少ない方が実験系に及ぼす影響が軽減され、かつ内在遺伝子のうちインプリント遺伝子のようにマウス個体発生に遺伝子発現量の変化による影響を及ぼす遺伝子を極力残さないことが必要であるので、マウス長腕の大部分を削除する（図３）。
［Ａ．１］テロメアトランケーションベクター作製
短腕近位部位特異的切断用の基本ベクターにはｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏコンストラクト（Ｋｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２）を用いた。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たマウス１６番染色体長腕近位の塩基配列から相同組換え標的配列を設計した。ＤＴ４０（ｍＣｈｒ１６−ｎｅｏ）３からゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換え標的配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーの配列を以下に示す。
BamHI_m16T F2：5'-TCGAGGATCCGGGAGTAATTTTCAATCCTTGAGGCAGA-3' (配列番号23)
BglII_m16T R2：5'-TCGAAGATCTCATCAGTGTACACCACAATCCCATCTGT-3' (配列番号24)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃７分を３５サイクル行ったＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、ＢａｍＨＩ消化したｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏにクローニングした（ベクター名：ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿１６ＭＡＣ）。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図９に示した。
［Ａ．２］相同組換え体の選別
マウス１６番染色体領域近位から遠位において部位特異的切断を行うベクターは上述のｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏ＿１６ＭＡＣを用いてトランスフェクションを行い、ピューロマイシン耐性クローンの単離及び相同組換え体の選別を行った。
得られたクローンからＤＮＡを抽出しそれを鋳型にＰＣＲを行い、部位特異的切断の確認を行った。プライマー配列を以下に示す。
m16 F5: 5'-cctcttcttgacggttaccacattttgc-3' (配列番号25)
PuroI (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃９分を３５サイクル行った。
Vmn1r-ps137 F：5'- TGAATTGGTCCCTCCTGCTCA-3'(配列番号26)
Vmn1r-ps137 R：5'- CAGGCCATGAGACCCAGACA-3'(配列番号27)
Mefv F：5'- TCCTCGGAGAATGGCTCCTG-3'(配列番号28)
Mefv R：5'- GGCAGGTTGATGGGAACTGG-3'(配列番号29)
Slx4 F：5'- AACCAGGGTCCCCATCCTGT-3'(配列番号30)
Slx4 R：5'- TGGGCTGGTTTCAATGCTGA-3'(配列番号31)
Gm4106 F：5'- GTGTGGCCATGGCTGGAGTA-3'(配列番号32)
Gm4106 R：5'- TGTTCCTCTGCTGCCACTCG-3'(配列番号33)
Gm35974 F：5'- ACCCAGCCACTCCCACCATA-3'(配列番号34)
Gm35974 R：5'- AAGGGCATGGCTATCCCACA-3'(配列番号35)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル行った。
その結果、マウス１０番染色体領域切断を示唆する３クローンを確認した（クローン名：ＤＴ４０（１６ＭＡＣ））。これらのクローンについて切断箇所が異なることが確認され、２パターン存在することが示唆された。想定される切断後のアレル２パターンを図１０に示した。
［Ａ．３］Ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンの選別
上記で得られたＤＴ４０（１６ＭＡＣ）の３クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ３クローンすべてにおいてマウス１６番染色体の長腕部分がセントロメア近傍で切断されていることを確認した（図１１）。
［実施例５］マウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１の構築
マウス人工染色体１６ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列を挿入することでマウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１を構築し、遺伝子搭載を行うためのｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞株へ導入する。
［Ａ］マウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣへのＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴタイプのｌｏｘＰ配列の挿入
［Ａ．１］ＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴ タイプのｌｏｘＰターゲティングベクター作製
切断部位が異なる２種の１６ＭＡＣに対して異なる配列を標的としたターゲティングベクターを構築した。
タイプ１として、テロメアトランケーションに用いた相同配列を標的としたターゲティングベクターを構築した。
ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるマウス１６番染色体のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＮＣ＿００００８２．６）。薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換えの二つの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。
KpnI_m16 HAtLA F：5'- TCGAGGTACCGGGAGTAATTTTCAATCCTTGAGGCAGA-3' (配列番号36)
XhoI_m16 HAtLA R：5'- TCGACTCGAGTGGCACTGACCCCTTAATTACGTACAGA-3' (配列番号37)
SalI_m16 HAtRA F：5'- TCGAGTCGACAAAGATTTGCATCCTTGGCCATGACTC-3' （配列番号38）
NotI_m16 HAtRA R：5'- TCGAGCGGCCGCCATCAGTGTACACCACAATCCCATCTGT-3' (配列番号39)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃４分を３５サイクル行った。
それぞれのＰＣＲ産物をＫｐｎＩ（ＮＥＢ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ）及びＳａｌＩ（ＮＥＢ）とＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９１３のＫｐｎＩ／ＸｈｏＩあるいはＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９１３−ｍ１６ＨＡ）。３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列をクローニングした。ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目のエクソンである３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰをＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＥｃｏＲＩとＡｓｃＩにクローニングした（ベクター名：Ｘ３．１）。さらにＸ３．１のＫｐｎＩサイトとＥｃｏＲＩサイトにＫｐｎＩとＮｏｔＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ配列をクローニングした（ベクター名：Ｘ４．１）。Ｘ４．１からＫｐｎＩとＡｓｃＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴをＶ９１３のＫｐｎＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＶＮＬＨ）。ｐＶＮＬＨのＥｃｏＲＶサイトにＮｏｔＩとＳａｌＩ消化後に平滑化をおこなったＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（大阪大学、岡部博士及びＮＩＨ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士より分与）をクローニングした（ベクター名：ｐＶＧＮＬＨ）。ｐＶＧＮＬＨからＳａｌＩとＡｓｃＩにより切り出したＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをＶ９１３−ｍ１０ＬＡＲＡのＸｈｏＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ１６ＨＡＭＡＣ１）。ターゲティングベクター、標的配列及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図１２に示す。
タイプ２として、残存するマウス１６番染色体近位配列を標的としたターゲティングベクターを構築した。
ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９１３（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるマウス１６番染色体のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＮＣ＿００００８２．６）。薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換えの二つの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。
KpnI_m16 GmLA F：5'- TCGAGGTACCAAGAACAAGCTTCAGAACACAGCCAGAC-3' (配列番号40)
XhoI_m16 GmLA R：5'- TCGACTCGAGAACTTGTCACACAGATCCTACTGGAGGTG-3' (配列番号41)
SalI_m16 GmRA F：5'- TCGAGTCGACCCACAGACTGAAGCAATTGACCTCAAAAG-3' （配列番号42）
NotI_m16 GmRA R：5'- TCGAGCGGCCGCAAAGCAGTTATCCGCTATTTGGGACCTT-3' (配列番号43)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃４分を３５サイクル行った。
それぞれのＰＣＲ産物をＫｐｎＩ（ＮＥＢ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ）及びＳａｌＩ（ＮＥＢ）とＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９１３のＫｐｎＩ／ＸｈｏＩあるいはＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９１３−ｍ１６Ｇｍ）。３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰはＶ８２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列をクローニングした。ＨＰＲＴ遺伝子の３番目から９番目のエクソンである３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰをＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＥｃｏＲＩとＡｓｃＩにクローニングした（ベクター名：Ｘ３．１）。さらにＸ３．１のＫｐｎＩサイトとＥｃｏＲＩサイトにＫｐｎＩとＮｏｔＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ配列をクローニングした（ベクター名：Ｘ４．１）。Ｘ４．１からＫｐｎＩとＡｓｃＩにより切り出したＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴをＶ９１３のＫｐｎＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐＶＮＬＨ）。ｐＶＮＬＨのＥｃｏＲＶサイトにＮｏｔＩとＳａｌＩ消化後に平滑化を行ったＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（大阪大学、岡部博士及びＮＩＨ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ博士より分与）をクローニングした（ベクター名：ｐＶＧＮＬＨ）。ｐＶＧＮＬＨからＳａｌＩとＡｓｃＩにより切り出したＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴカセットをＶ９１３−ｍ１０ＬＡＲＡのＸｈｏＩサイトとＡｓｃＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ１６ＧｍＭＡＣ１）。ターゲティングベクター、標的配列及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図１３に示す。
［Ａ．２］トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
ニワトリＤＴ４０細胞の培養は１０％ウシ胎仔血清（ギブコ、以下「ＦＢＳ」で記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４、Ｔ２−６４、Ｔ２−６５の約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化したターゲティングベクターｐ１０ＭＡＣ１を２５μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。Ｇ４１８（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。ｐ１６ＨＡＭＡＣ１、ｐ１６ＧｍＭＡＣ１ベクターそれぞれ１回のトランスフェクションで得た各１２個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１Ｇｍ））。
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１６番染色体上で部位特異的に組換えが起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
パターン１（ｐ１６ＭＡＣ１ＨＡ）：
m16 F5 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kjneo (前出)
PuroI (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃７．５分を３５サイクル行った。
その結果ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４由来、５クローンについて目的の組換えが行われていることが示唆された。（クローン名：ＤＴ４０（１６ＭＡＣ１ＨＡ））
パターン２（ｐ１６ＧｍＭＡＣ１）：
m16 F6：5'- CATGCACATTTGCTTACACACAGAGGTT-3' (配列番号44)
EGFP-F(L) (前出)
kjneo (前出)
m16 R7：5'- ATCTGGGCACTGGGGTACAACTGTTAAT-3' (配列番号45)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃７．５分を３５サイクル行った。
その結果ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ２−６４、Ｔ２−６５由来、各１１、９クローンについて目的の組換えが行われていることが示唆された（クローン名：ＤＴ４０（１６ＭＡＣ１Ｇｍ））。
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記から得られたＤＴ４０（１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１Ｇｍ）において、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴ（ｐＶＧＮＬＨ）カセットをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ｌｏｘＰ配列がターゲティングされたマウス１０番染色体断片のセントロメア付近にプローブ由来のＦＩＴＣシグナルが検出され、かつネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス１６番染色体断片（ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４、Ｔ２−６４、Ｔ２−６５）では現れなかったシグナルが検出されたことから、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた（図１４）。これらの結果から、マウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１Ｇｍを保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論できた。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１Ｇｍ含有ＤＴ４０細胞から１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１ＧｍのＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ細胞を介してマウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１ＧｍをマウスＥＳ細胞に導入するため、或いはＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１ＧｍのＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰを介して安定に目的遺伝子（群）等、例えばＣＹＰ３Ａクラスター、ヒト抗体遺伝子などを挿入するため、ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＤＴ４０（１６ＭＡＣ１ＨＡ）及びＤＴ４０（１６ＭＡＣ１Ｇｍ）を用いて、上記と同様にＣＨＯ ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）に微小核細胞融合法を行う。微小核細胞融合で得たＧ４１８耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行う（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１Ｇｍ））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工番染色体１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１ＧｍがＣＨＯ細胞に導入できているかを確認する。そのプライマー配列を以下に示す。１６ＭＡＣ１ＨＡの確認：
m16 F5 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kjneo (前出)
PuroI (前出)
16MAC1Gmの確認
m16 F6 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kjneo (前出)
m16 R7 (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃７．５分を３５サイクル行う。ＰＣＲ陽性のクローンについて以降の解析を行う。
［Ｂ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１Ｇｍ）クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０： １１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行い、マウス人工染色体ベクター１６ＭＡＣ１ＨＡ及び１６ＭＡＣ１ＧｍがＣＨＯ細胞に導入されていることを確認する。
［実施例６］マウス人工染色体ベクターのマウス個体における安定性評価
１０ＭＡＣ１、１０ＭＡＣ１ＨＡ、１０ＭＡＣ１ＧｍのマウスＥＳ細胞での安定性を検証し、さらに各マウス人工染色体ベクターを導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。
［Ａ］各マウス人工染色体ベクター含有ＣＨＯ細胞からマウスＥＳ細胞へマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍの導入
マウスＥＳ細胞及びマウス個体内でのマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍの安定性を検証するために、各マウス人工染色体１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１ＧｍをマウスＥＳ細胞に導入し、各マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ含有キメラマウスならびに子孫伝達マウスを作製する。
［Ａ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１）、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１６ＭＡＣ１ＨＡ）、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１６ＭＡＣ１Ｇｍ）を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心する。
ドナー細胞にはＣ５７Ｂ６系統マウスのＥＳ細胞であるＢ６−ＥＳ、及びＢ６−ＥＳ細胞に６ＴＧ処理を行ったＨＰＲＴ欠損株であるＢ６（ＨＰＲＴ−）、及びＣ５７Ｂ６ｘＣＢＡ系統Ｆ１マウスのＥＳ細胞であるＴＴ２Ｆ、及びＴＴ２Ｆ細胞に６ＴＧ処理を行ったＨＰＲＴ欠損株であるＫＯ５６（ＨＰＲＴ−）を用いる。培養には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＩＧＭＡ）に、１０％ＦＣＳ、ＬＩＦ（Ｍｕｅｒｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）、１×１０‐５Ｍ ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール：ＳＩＧＭＡ）、Ｌ−グルタミン（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（０．１２５ｍＭ：ＧＩＢＣＯ）を添加し、５％ ＣＯ２、３７℃にて培養を行う。マウスＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加した培養液で回収し、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、無血清培養液５ｍｌに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに１２００ｒｐｍで遠心する。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を０．５ｍｌで正確に１分３０秒間融合した。１３ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）を静かに添加し、１２００ｒｐｍで遠心する。上清を除去し、通常のマウスＥＳ細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したＧ４１８耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径１０ｃｍ細胞培養皿２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートする。Ｇ４１８を２５０μｇ／ｍｌになるように加え、３〜４週間選択培養する（クローン名：Ｂ６−ＥＳ（１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）及びＢ６（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）及びＴＴ２Ｆ（１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）及びＫＯ５６（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ））。その結果、得られたＴＴ２Ｆ（１０ＭＡＣ１）の薬剤耐性コロニー１３クローンを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
［Ａ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ａ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、各マウス人工番染色体ベクターがマウスＥＳ細胞に導入できているかを確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
１０ＭＡＣ１の確認：
m10 F6 (前出)
PuroI (前出)
m10 F1 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kj neo (前出)
m10 R2 (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃８分、２．５分を３５サイクル行った。その結果得られたＰＣＲ陽性９クローンについて以降の解析を行う。
１６ＭＡＣ１ＨＡの確認：
m16 F5 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kjneo (前出)
PuroI (前出)
１６ＭＡＣ１Ｇｍの確認：
m16 F6 (前出)
EGFP-F(L) (前出)
kjneo (前出)
m16 R7 (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃７．５分を３５サイクル行う。ＰＣＲ陽性のクローンについて以降の解析を行う。
［Ａ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＢ６−ＥＳ（ＭＡＣ１）及びＢ６（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）及びＴＴ２Ｆ（１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）及びＫＯ５６（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）のクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウス ｍｉｎｏｒ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行う。各マウス人工染色体ベクターが保持されていることを確認する。また、正常核型である内在マウス染色体の本数がＢ６−ＥＳの場合４０本、またはＫＯ５６の場合３９本であることを確認する。結果を受けて、マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１ＧｍがマウスＥＳ細胞に導入できたと結論付ける。ＴＴ２Ｆ−ＥＳ（１０ＭＡＣ１）ＰＣＲ陽性９クローンについてＦＩＳＨ解析を行った結果、２クローンについてＭＡＣ１を高保持で正常核型のクローンであることが確認できた(図１５)。
［Ｂ］各マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍの安定性
［Ｂ．１］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１ＧｍのＣＨＯ細胞における安定性
上記で得られたＣＨＯクローン（例えばＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ１）上記実施例３で取得）について０〜２５ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析により１０ＭＡＣ１保持細胞の割合を計測する。
［Ｂ．２］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１ＧｍのマウスＥＳ細胞における安定性
上記で得られたマウスＥＳクローン（例えばＫＯ５６（１０ＭＡＣ１）及びＴＴ２Ｆ（１０ＭＡＣ１）上記実施例６［Ａ］で取得できる）について０〜１００ＰＤＬの非選択培養下での長期培養後におけるＦＩＳＨ解析により１０ＭＡＣ１保持細胞の割合を計測する。
［Ｂ．３］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍを保持するキメラマウスの作製
上記実施例６［Ａ］で得られたＥＳ細胞クローンを用いてＴｏｍｉｚｕｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１６：１３３，１９９７）でキメラマウスを作製した。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いる。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。１０ＭＡＣ１保持ＥＳクローンＴＴ２Ｆ（１０ＭＡＣ１）（例えば他にＫＯ５６ １０ＭＡＣ１、上記実施例６［Ａ］で取得できる）を注入した胚を仮親に移植した。出生したキメラマウスについて毛色により（毛色に濃茶色の部分の認められる）キメラ率を判定した。これにより、マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１を保持するＥＳ細胞株（ＫＯ５６及びＴＴ２Ｆ）がキメラ形成能を保持しているか、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることを確認した。
［Ｂ．４］各種マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍを保持するキメラマウスからの１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍの子孫伝達
上記［Ｂ．３］で作製された雌キメラマウス（キメラ率約１００％）をＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配する。キメラマウスより誕生した仔マウスについてＧＦＰ蛍光により各種マウス人工染色体ベクターの保持を検討した。各マウス人工染色体が子孫伝達されたマウス系統をＴＣ（１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）と呼ぶ。ＴＴ２Ｆ（ＭＡＣ１）由来キメラから得られた子孫伝達個体について全身でＧＦＰ蛍光タンパクが発現が確認できる個体を得た（図１６）。
［Ｂ．５］ＴＣ（１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）マウス系統の体細胞における１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍの安定性
［Ｂ．５．１］実体蛍光顕微鏡観察
上記で得られたＴＣ（１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ）マウスのうち雄及び雌について脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣（または卵巣）を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察し、全ての組織にてＧＦＰ陽性を観察する。
［Ｂ．５．２］血液系細胞のＦＡＣＳ解析
Ｂ細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ４，ＣＤ８）、巨核球（ＣＤ４１）に対する特異的抗体（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、骨髄ならびに脾臓細胞におけるＧＦＰ陽性率を検討する。
［Ｂ．５．３］蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
また上記と同様の個体から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスマイナーサテライト（ｍｉｎｏｒ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行い、視覚的にＭＡＣの存在を確認し、宿主染色体とは独立して維持されていることを確認する。
［実施例７］新規マウス人工染色体ベクターを用いたヒト抗体産生（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）マウス及びラットの作製
１０ＭＡＣ１、１６ＭＡＣ１ＨＡ、１６ＭＡＣ１Ｇｍ各マウス人工染色体ベクターの機能性評価から、使用するベクターを絞り（選抜したマウス人工染色体を「ＮＡＣ」と呼ぶ）、ヒト抗体遺伝子（ＩＧＨ、ＩＧＫ）を搭載し、ヒト抗体産生マウス及びラットの作製を行う（図１７）。１０ＭＡＣ1を選択し、ＮＡＣとして以降の実験を行った。
［Ａ］ＮＡＣを保持するＣＨＯ細胞への改変ヒト２番染色体の移入
改変ヒト２番染色体保持ＣＨＯ細胞より改変ヒト２番染色体をＮＡＣ保持ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ａ．１］微小核細胞融合法による改変ヒト２番染色体のＮＡＣ保持Ｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞への移入
ドナー細胞である改変ヒト２番染色体ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ ｈＣｈｒ２ＬＦ）を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをＤＭＥＭで調製した０．０５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（シグマ）溶液２ｍＬに懸濁し、６ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるＮＡＣ保持Ｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞株に、培養液を除いた後添加する。１５分インキュベートして微小核をＣＨＯ細胞に張り付ける。その後、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地６ｍＬに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分融合する。５ｍＬの無血清ＤＭＥＭでＰＥＧを除去するために４回ウオッシュ操作を行った後、ＣＨＯ培養液を添加する。２４時間後、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に細胞を播種し、８μｇ／ｍＬブラストサイジンＳを添加し、１０日選択培養を行った。得られた薬剤耐性株ついて以降の解析を行った。
［Ａ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ブラストサイジンＳ耐性株のゲノムを抽出し、鋳型としてＰＣＲ解析を行い、改変ヒト２番染色体の保持を確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
改変ヒト２番染色体ｌｏｘＰ配列確認プライマー：
cos138 sp L：5’-CTGAGAAGAGTCATTGTTTATGGTAGACT-3’ (配列番号46)
cos138 sp R：5’- ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGT-3’ (配列番号47)
x6.1cosRa L：5’-GGGGAATAAACACCCTTTCCAAATCCTC-3’(配列番号48)
x6.1cosRa R：5’- ACCAAGTAACCGATCAAACCAACCCTTG-3’ (配列番号49)
ｃｏｓ１３８ ｓｐ Ｌ， ｃｏｓ１３８ ｓｐ Ｒのプライマーについては、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９４℃２分の熱変性後、９４℃１５秒、６０℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。
ｘ６．１ｃｏｓＲａ Ｌ，ｘ６．１ｃｏｓＲａ Ｒのプライマーについては、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃１２分を３０サイクル行う。
改変ヒト２番染色体ＦＲＴ配列確認プライマー：
kD9 tcLa L：5’-TGAGAACACAGGGGTCTCCATTCTGACT-3’ (配列番号50)
kD9 tcLa R：5’-ACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAG-3’ (配列番号51)
kD9 tcRa L：5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’ (配列番号52)
kD9 tcRa R：5’-TGGTCACTGAAGCTTTCCATCTGCTCTT-3’ (配列番号53)
これらプライマーについては、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。
加えて、ヒト２番染色体上のプライマーを用い領域が保持されているかを確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
D2S177 F：5’-AGCTCAGAGACACCTCTCCA-3’ (配列番号54)
D2S177 R：5’-CTGTATTAGGATACTTGGCTATTGA-3’ (配列番号55)
FABP1-F：5’-TATCAAGGGGGTGTCGGAAATCGTG-3’ (配列番号56)
FABP1-R：5’-ACTGGGCCTGGGAGAACCTGAGACT-3’ (配列番号57)
EIF2AK3-F：5’-AGGTGCTGCTGGGTGGTCAAGT-3’ (配列番号58)
EIF2AK3-R：5’-GCTCCTGCAAATGTCTCCTGTCA-3’ (配列番号59)
RPIA-F：5’-CTTACCCAGGCTCCAGGCTCTATT-3’ (配列番号60)
RPIA-R：5’-CTCTACCTCCCTACCCCATCATCAC-3’ (配列番号61)
IGKC-F：5’-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3’ (配列番号62)
IGKC-R：5’-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3’ (配列番号63)
IGKV-F：5’-AGTCAGGGCATTAGCAGTGC-3’ (配列番号64)
IGKV-R：5’-GCTGCTGATGGTGAGAGTGA-3’ (配列番号65)
Vk3-2 F：5’-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA-3’ (配列番号66)
Vk3-2 R：5’-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC-3’ (配列番号67)
D2S159_1 F：5’-CTCTAACTGAATCAAGGGAATGAAC-3’ (配列番号68)
D2S159_1 R：5’-AGCAGTTTGAGTTTAGGATGAAGG-3’ (配列番号69)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ＰＣＲ陽性であったクローンについて以降の解析を行った。その結果、改変ヒト２番染色体とＮＡＣ(新規人工染色体ベクター)が維持されているクローンを取得した。
［Ａ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記の結果よりＰＣＲ陽性クローンについて、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行う。Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、改変ヒト２番染色体及びＮＡＣが宿主染色体と独立して安定に維持されていることを確認した（図１８）。
［Ｂ］転座クローニングによるヒト２番染色体ＩＧＫ領域のマウス人工染色体ベクター（ＮＡＣ）への搭載
ＮＡＣを保持するＣＨＯ細胞において、ヒト２番染色体上ＩＧＫ領域をＮＡＣへ転座クローニングする。転座クローニングにはＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用い、ヒト２番染色体とＮＡＣを相互転座させることで、ＩＧＫ領域をＮＡＣに搭載する（図１９）。
［Ｂ．１］Ｃｒｅ発現によるＨＡＴ耐性染色体組換え体の取得
ＮＡＣにはｌｏｘＰサイトが搭載されており、Ｃｒｅ組換え酵素存在下で改変ヒト２番染色体のｌｏｘＰサイトと組換えが起こるようになっている。また、組換えが起こると副産物となるＮＡＣに載らないヒト２番染色体領域の５’ＨＰＲＴと副産物となるＮＡＣ末端の３’ＨＰＲＴが連結して、ＨＰＲＴ遺伝子の再構成が起こり、ＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）はＨＡＴ耐性を獲得する。
改変ヒト２番染色体とＮＡＣを保持するＨｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞について、１０ｃｍ細胞培養皿においてコンフルエントになった時に、１８μｇのＣｒｅ発現プラスミド（ベクター名：ｐＢＳ１８５）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメーカーの手順を参照して加える。添加後６時間経過したら、培養液を交換し、２４時間後に、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に播種し、１×ＨＡＴ（シグマ）、４μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎで薬剤選択を行う。得られた薬剤耐性株を以降の解析に用いる。
［Ｂ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト２番染色体断片とＮＡＣ上で染色体相互転座が起こっているかを確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo：5'-CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3’（配列番号70）
PGKr-2：5'-ATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTA-3’（配列番号71）
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
加えて、ヒト２番染色体領域とＦＲＴ配列が維持されているかどうかＰＣＲを行う。プライマーを以下に示す。
ヒト２番染色体領域確認プライマー：
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
FABP1-F (前出)
FABP1-R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
D2S159_1 F (前出)
D2S159_1 R (前出)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト２番染色体上ＦＲＴ配列確認プライマー：
kD9 tcLa L (前出)
kD9 tcLa R (前出)
kD9 tcRa L (前出)
kD9 tcRa R (前出)
これらプライマーについては、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。ＰＣＲ陽性クローンについて以降の解析を行う。
［Ｂ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
ＰＣＲ陽性クローンについてＨｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行う。ＮＡＣと改変ヒト２番染色体が相互転座をおこしかつ、ＩＧＫ領域がＮＡＣに搭載されたＩＧＫ−ＮＡＣ、副産物が独立して保持されていることを確認する。このクローンをＣＨＯ ＩＧＫ−ＮＡＣと呼ぶ。
［Ｃ］ＩＧＫ−ＮＡＣの改変ヒト１４番染色体保持ＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）細胞株への移入
作製したＩＧＫ−ＮＡＣを、改変ヒト１４番染色体を保持するＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）細胞株へ移入し、ＦＲＴ／Ｆｌｐシステムによる組換えを起こさせＩＧＨ領域をＩＧＫ−ＮＡＣに搭載し、ＩＧＨＫ−ＮＡＣを作製する（図２０）。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＣＨＯ ＩＧＫ−ＮＡＣを細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをＤＭＥＭで調製した０．０５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（シグマ）溶液２ｍＬに懸濁し、６ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるＣＨＯ ｈｐｒｔ−／− １４ＦＲＴを、培養液を除いた後添加する。１５分インキュベートして微小核をＣＨＯ細胞に張り付ける。その後、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地６ｍＬに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分融合する。５ｍＬの無血清ＤＭＥＭでＰＥＧを除去するために４回ウオッシュ操作を行った後、ＣＨＯ培養液を添加する。２４時間後、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に細胞を播種し、６００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８と６μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを添加し、１０日選択培養を行う。得られた薬剤耐性株ついて以降の解析を行う。
［Ｃ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＫ−ＮＡＣが改変ヒト１４番染色体を保持するＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）株に移入されているか、改変ヒト１４番染色体は維持されているかを確認するためにＰＣＲ解析を行う。以下に用いるプライマーを示す。
ＩＧＫ−ＮＡＣの確認プライマー：
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ＩＧＫ−ＮＡＣ上のＦＲＴ挿入部位確認プライマー：
kD9 tcLa L (前出)
kD9 tcLa R (前出)
kD9 tcRa L (前出)
kD9 tcRa R (前出)
これらプライマーについては、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。
ヒト２番染色体領域確認プライマー：
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
改変ヒト１４番染色体上ＦＲＴ配列確認プライマー：
14TarC_La F：5’-AGCAATTAGGGCCTGTGCATCTCACTTT-3’（配列番号72）
14TarC_La R：5’-CCAGCTCATTCCTCCCACTCATGATCTA-3’（配列番号73）
14TarC_Ra F：5’-CATCTGGAGTCCTATTGACATCGCCAGT-3’（配列番号74）
14TarC_Ra R：5’-CTTATTCCTCCTTCTGCCCACCCTTCAT-3’（配列番号75）
これらプライマーについては、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃６分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域確認プライマー：
MTA1-F3：5’-AGCACTTTACGCATCCCAGCATGT-3’（配列番号76）
MTA1-R3：5’-CCAAGAGAGTAGTCGTGCCCCTCA-3’（配列番号77）
ELK2P2-F：5’-CCCACTTTACCGTGCTCATT-3’（配列番号78）
ELK2P2-R：5’-ATGAAGGTCCGTGACTTTGG-3’（配列番号79）
g1(g2)-F：5’-ACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTC-3’（配列番号80）
g1(g2)-R：5’-CACTTGTACTCCTTGCCATTCAGC-3’（配列番号81）
VH3-F：5’-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3’（配列番号82）
VH3-R：5’-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3’（配列番号83）
CH3F3：5’-AGGCCAGCATCTGCGAGGAT-3’（配列番号84）
CH4R2：5’-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3’（配列番号85）
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲ陽性のクローンを以降の解析に用いた。
［Ｃ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
選別したクローンについて、Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＫ−ＮＡＣと改変ヒト１４番染色体が独立して、１コピーずつ維持されていることを確認し、以降のステップに用いる。
［Ｄ］ＦＲＴ／Ｆｌｐ組換えシステムを用いたＩＧＨＫ−ＮＡＣの構築
ＩＧＫ−ＮＡＣと改変ヒト１４番染色体をＦＲＴ／Ｆｌｐシステムで相互転座させることで、ＩＧＫ−ＮＡＣ上にヒト１４番染色体由来ＩＧＨ領域を転座クローニングし、ＩＧＨＫ−ＮＡＣを構築する。
［Ｄ．１］ＦＬＰ発現によるＨＡＴ耐性染色体組換え体の取得
ＩＧＫ−ＮＡＣ上のＦＲＴサイトと改変ヒト１４番染色体上のＦＲＴサイトを用いて、ＦＬＰ組換え酵素存在下で相互転座を起こさせる。また、組換えが起こるとＩＧＨＫ−ＮＡＣ上では、５’ＨＰＲＴと３’ＨＰＲＴが連結して、ＨＰＲＴ遺伝子の再構成が起こり、ＨＡＴ耐性を獲得する。ＩＧＫ−ＮＡＣと改変ヒト１４番染色体を保持するＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）株が、１０ｃｍ細胞培養皿においてコンフルエントになった時に１８μｇのＦＬＰ発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメーカーの手順を参照して加える。添加後６時間経過したら、培養液を交換し、２４時間後に、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に播種し、１×ＨＡＴ、６μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎで薬剤選択を行う。得られたＨＡＴ耐性クローンについて以降の解析を行う。
［Ｄ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＦＲＴ／ＦＬＰシステムを用いて期待した相互転座が起こり、ＩＧＨＫ−ＮＡＣが構築されているか確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位の確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1：5’- CCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACG-3’(配列番号 86)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２番染色体領域確認プライマー：
D2S177 F (前出)
D2S177 R (前出)
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲ陽性のクローンについて以降の解析を行う。
［Ｄ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
選別したクローンについて、Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行う。副産物であるＮＡＣに載らないヒト１４番染色体に、余分なヒト２番染色体領域が転座して染色体が長くなっていれば、相互転座が起こったことが示唆される。さらに、プローブとしてＢＡＣクローンＣＨ１７−４０５Ｈ５（ＩＧＫ領域：ＣＨＯＲＩ）とＣＨ１７−２６２Ｈ１１（ＩＧＨ領域：ＣＨＯＲＩ）及びＣＨ１７−２１６Ｋ２（ＩＧＫ領域：ＣＨＯＲＩ）とＣＨ１７−２１２Ｐ１１（ＩＧＨ領域：ＣＨＯＲＩ）の組み合わせを用いてｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を行い、実際ＩＧＨＫ−ＮＡＣが構築されているか詳細に解析する。ＩＧＨＫ−ＮＡＣと考えられる染色体が１コピーで独立して存在していることが確認できたクローンを以降用いる。
［Ｅ］ＩＧＨＫ−ＮＡＣのＣＨＯ Ｋ１細胞株への移入
ＩＧＨＫ−ＮＡＣ及びＩＧＨＫ−ＮＡＣ構築のための相互転座の際に形成された副産物の両方にＮｅｏ耐性遺伝子がのっており、微小核細胞融合法で目的の細胞に移入した際、Ｇ４１８で薬剤選択するとＩＧＨＫ−ＮＡＣもしくは副産物がそれぞれあるいは両方移入された細胞を取得することになる。ＮＡＣ上にはＥＧＦＰが搭載されているので、目的の細胞にＩＧＨＫ−ＮＡＣが移入されているか確認することが可能であるが、染色体導入が効率的に行えるドナー細胞でかつＩＧＨＫ−ＮＡＣのみを保持する細胞を作製するため、ＩＧＨＫ−ＮＡＣをＣＨＯ Ｋ１細胞株に移入する。
［Ｅ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離：染色体移入による、ＩＧＨＫ−ＮＡＣのみを保持する細胞株を作製する。
ドナー細胞であるＣＨＯ ＩＧＨＫ−ＮＡＣを細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをＤＭＥＭで調製した０．０５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（シグマ）溶液２ｍＬに懸濁し、６ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるＣＨＯ Ｋ１細胞株に、培養液を除いた後添加する。１５分インキュベートして微小核をＣＨＯ細胞に張り付ける。その後、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地６ｍＬに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分融合する。５ｍＬの無血清ＤＭＥＭでＰＥＧを除去するために４回ウオッシュ操作を行った後、ＣＨＯ培養液を添加する。２４時間後、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に細胞を播種し、８００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を添加し、１０日選択培養を行った。得られた薬剤耐性株については、ＩＧＨＫ−ＮＡＣ上ＧＦＰ遺伝子の蛍光タンパク発現を確認し、以降の解析に用いる。
［Ｅ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＨＫ−ＮＡＣがＣＨＯ Ｋ１細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２番染色体領域確認プライマー：
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲの結果からＩＧＨＫ−ＮＡＣのみ保持していることを示唆したクローンについて以降の解析を行う。
［Ｅ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
選別したクローンについて、Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、期待通りＩＧＨＫ−ＮＡＣのみを保持していることを確認する。加えて、プローブとしてＢＡＣクローンＣＨ１７−４０５Ｈ５（ＩＧＫ領域：ＣＨＯＲＩ）とＣＨ１７−２６２Ｈ１１（ＩＧＨ領域：ＣＨＯＲＩ）及びＣＨ１７−２１６Ｋ２（ＩＧＫ領域：ＣＨＯＲＩ）とＣＨ１７−２１２Ｐ１１（ＩＧＨ領域：ＣＨＯＲＩ）の組み合わせを用いてｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を行い、実際ＩＧＨＫ−ＮＡＣが構築されているか詳細に解析する。
［Ｆ］マウスＥＳ細胞へのＩＧＨＫ−ＮＡＣの移入
ヒト抗体産生マウスを作製するためにはＩＧＨＫ−ＮＡＣをマウスＥＳ細胞に移入し、受精卵８細胞期にインジェクションし、キメラマウスを作製し、ＩＧＨＫ−ＮＡＣを子孫伝達させることが必要である。ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持したマウスＥＳ細胞の作製を行う。
［Ｆ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞は、ＣＨＯ Ｋ１ ＩＧＨＫ−ＮＡＣを用いる。ドナー細胞を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。２０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁する。さらに２０００ｒｐｍ，１０分間遠心した。レシピエント細胞には、マウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１ ６ＴＧ−９（マウスのＩｇｈ及びＩｇｋ遺伝子が破壊されている。国際公開ＷＯ９８／３７７５７号に記載）及びＸＯ ＥＳ９（抗体遺伝子は破壊されていない。）を用いる。培養には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＩＧＭＡ）に、１０％ＦＣＳ、ＬＩＦ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）、１×１０‐５Ｍ ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール：ＳＩＧＭＡ）、Ｌ−グルタミン（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ溶液（３．５ｇ／ｍｌ：ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（０．１２５ｍＭ：ＧＩＢＣＯ）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃にて培養をおこなう。１０ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったマウスＥＳ細胞をＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加した培養液で回収し、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、無血清培養液５ｍｌに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに１２００ｒｐｍで遠心する。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を０．５ｍｌで正確に１分３０秒間融合する。１３ｍｌの無血清培養液（ＤＭＥＭ）を静かに添加し、１２００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、通常のマウスＥＳ細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したＧ４１８耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径１０ｃｍ細胞培養皿２枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートする。Ｇ４１８を２５０μｇ／ｍＬになるように加え、３〜４週間選択培養する。薬剤耐性かつＥＧＦＰ陽性株について以降の解析を行う。
［Ｆ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＨＫ−ＮＡＣが各種マウスＥＳ細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２番染色体領域確認プライマー：
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲの結果からＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持していることを示唆したクローンについて以降の解析を行う。
［Ｆ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＨＫ−ＮＡＣの独立保持と宿主の核型が正常であることを確認する。期待した結果が得られたクローンについてキメラマウス作製に用いる。
［Ｇ］ラットＥＳ細胞へのＩＧＨＫ−ＮＡＣの移入
ヒト抗体産生ラットを作製するためにはＩＧＨＫ−ＮＡＣをラットＥＳ細胞に移入し、８細胞期胚にインジェクションし、キメララットを作製し、ＩＧＨＫ−ＮＡＣを子孫伝達させることが必要である。
［Ｇ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ＣＨＯ Ｋ１ ＩＧＨＫ−ＮＡＣをドナーとして、上記Ｆ．１記載のようにマウスＥＳ細胞への微小核細胞融合法と同様の手法を用いてラットＥＳ細胞へのＩＧＨＫ−ＮＡＣの導入を行う。融合後、オーバーナイトでインキュベーションし、Ｇ４１８を１５０μｇ／ｍＬになるように加え、３〜４週間選択培養する。薬剤耐性及びＧＦＰ陽性を示す株を選別し、以降の解析を行う。
［Ｇ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＨＫ−ＮＡＣがラットＥＳ細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２番染色体領域確認プライマー：
EIF2AK3-F (前出)
EIF2AK3-R (前出)
RPIA-F (前出)
RPIA-R (前出)
IGKC-F (前出)
IGKC-R (前出)
IGKV-F (前出)
IGKV-R (前出)
Vk3-2 F (前出)
Vk3-2 R (前出)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲの結果からＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持していることを示唆したクローンについて以降の解析を行う。
［Ｇ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、期待通りＩＧＨＫ−ＮＡＣを独立保持しており、ラットＥＳの正常核型（４２本）を維持していることが確認できた株についてキメララット作製に用いる。
［Ｈ］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持したマウスの作製
ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持したマウスの作製及び、解析を行う。過程で得られたキメラについても解析を行う。
［Ｈ．１］キメラマウスの作製
得られたＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を用いて（ジーンターゲティング、実験医学、１９９５）の手法に従い、キメラマウスを作製する。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）の雌雄交配により得られる桑実胚及び８細胞期胚を用いる。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。
［Ｈ．２］キメラマウスのＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持解析
誕生後３週以上を経たキメラマウスから（勝木元也，発生工学実験マニュアル，講談社サイエンティフィク，１９８７）に記された方法に従い尻尾を取得し、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。上記Ｇ．２記載のプライマー及びＰＣＲ条件により、ＰＣＲ解析を行い、ＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持を確認する。
さらに、キメラマウスから採血を行った後、細胞固定を行い標本作製し、Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１及びＭｏｕｓｅ ｍｉｎｏｒ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡをプローブとしてＦＩＳＨ解析を行うことで、ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持した細胞を染色体レベルで確認する。
［Ｈ．３］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおけるヒトＩＧＭ発現評価
ＨＫＤ３１マウスＥＳ細胞はマウスＩｇｈ，Ｉｇｋ遺伝子が破壊されている。Ｂリンパ球の発生に必須な抗体μ鎖遺伝子ノックアウトマウスは体液性免疫を担う成熟Ｂリンパ球が欠損していることにより抗体を産生することができない。したがって、ＨＫＤ３１マウスＥＳ細胞は、キメラマウスにおいて成熟Ｂ細胞になれない。キメラマウス作製に用いるＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持ＨＫＤ３１マウス細胞について、ＩＧＨＫ−ＮＡＣからヒトＩＧＭが発現すれば、この欠損を救済可能で、ＧＦＰ陽性のＢ細胞を検出することができる。これにより、ＩＧＨＫ−ＮＡＣ上のＩＧＭ遺伝子の機能的発現が間接的に検証できる。キメラマウスより血液を採取し、マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）に対する抗体染色を用い、マウスＢ細胞をフローサイトメーターにより検出する。ＣＤ４５ＲとＧＦＰ共陽性の細胞が存在するか解析を行うことで、ＩＧＨＫ−ＮＡＣ由来ＩＧＭの機能的発現を確認することができる。ヒトＩＧＭとマウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）に対する抗体を用いて、血液細胞を染色し、ヒトＩＧＭ、ＣＤ４５Ｒ、ＧＦＰ陽性の細胞を確認する。末梢血を採血し、ヘパリンＰＢＳの入ったチューブに血液を移し、転倒混和して氷冷する。遠心（２０００ｒｐｍ、３分、４℃）の後、上清除去後、各種抗体を添加し、４℃で３０分反応させ、５％牛胎仔血清を添加したＰＢＳ（５％ＦＢＳ／ＰＢＳ）により洗浄する。最後の遠心後、ペレットに１．２％Ｄｅｘｔｒａｎ／生理食塩水を加え、タッピング後、室温で４５分静置し、赤血球を自然沈降させる。上清を新しいチューブに移し、２０００ｒｐｍ、３分、４℃で遠心後上清除去し、ペレットに室温の溶血剤（０．１７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ）を加え、５分静置する。２０００ｒｐｍ、３分、４℃で遠心し、５％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した後５００μｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳで懸濁したものを解析サンプルとし、フローサイトメーターにより解析する。
［Ｈ．４］キメラマウス血清中のヒト抗体検出
キメラマウスにおいて、ヒト抗体遺伝子軽鎖、重鎖、各種アイソタイプ発現確認を目的として、血清中のヒト抗体濃度をエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定する。ＥＬＩＳＡは以下に記載されている方法に従う。富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、１９８７；安東・千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社、１９９１；石川、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、１９９３：Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ａ．Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，１９９６。これらの文献に記載の方法を参考にして、測定系によっては反応時間や温度を４℃で終夜行うなどの改良を行う。特定の抗体検出については、ｋｉｔを用いて実施する。ヒト抗体（ｈγ、ｈμ、ｈκ、ｈγ１、ｈγ２、ｈγ３、ｈγ４、ｈα、ｈε、ｈδ）の発現及び血清中の濃度を測定する。基本的な操作を以下に示す。
測定しようとするヒト免疫グロブリンに対する抗体を希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングする。血清試料の測定では、ブロッキング、試料及び標識抗体の希釈に５％牛胎仔血清を添加したＰＢＳを用いる。コーティングしたプレートを洗浄した後、ブロッキングを１時間以上行う。プレートを洗浄後、試料を加えて３０分以上インキュベートするプレート洗浄後、希釈した酵素標識抗ヒト及びマウス免疫グロブリン抗体を加えて、１時間以上インキュベートした後、プレートを洗浄し基質液を加えて発色させる。また測定系によって、基本的には同じ操作で、ビオチン標識した抗体を用い、プレート洗浄後これにアビジン−酵素複合体を加えてインキュベートした後洗浄し基質液を加える。マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。血清中の濃度の測定には濃度既知の標準を段階希釈してＥＬＩＳＡをサンプルと同時に行い、検量線を引いて解析することで濃度を特定できる。
［Ｈ．５］ヒト抗体の発現解析及び配列同定
キメララット脾臓由来ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。方法は国際公開ＷＯ９８／３７７５７号に記されている方法同様実施することで解析、評価できる。
［Ｈ．６］抗原特異的ヒト抗体産生応答の評価
キメラマウスについて、抗原特異的ヒト抗体価の増加が見られるかを評価する。方法は特許（国際公開ＷＯ９８／３７７５７号）に記されている方法同様にヒト血清アルブミンで免疫し、抗体力価の上昇を解析する。
［Ｉ］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するキメラマウスからのＩＧＨＫ−ＮＡＣの子孫伝達
［Ｉ．１］ＩＧＨＫ−ＮＡＣ子孫伝達
上記［Ｈ］で作製される雌キメラマウス（キメラ率約１００％）をＩＣＲ雄マウスと交配し、誕生した仔マウスについて、ＥＳ細胞由来のＩＧＨＫ−ＮＡＣの優性遺伝形質である、ＧＦＰの蛍光を観察する。ＧＦＰの蛍光が観察されれば、マウス個体においてＩＧＨＫ−ＮＡＣが子孫伝達し、安定に保持されていることが確認できる。ＩＧＨＫ−ＮＡＣが子孫伝達されたマウス系統をｍＴＣ（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）と呼ぶ。
［Ｉ．２］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するマウスのＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持確認
ｍＴＣ（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）について（実施例７）［Ｈ．２］同様解析を行うことでＩＧＨＫ−ＮＡＣの子孫伝達を詳細に確認できる。
［Ｉ．３］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するマウスのヒト抗体産生能評価
ｍＴＣ（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）について（実施例７）［Ｈ．４］［Ｈ．５］［Ｈ．６］同様に評価する。
［Ｊ］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するラットの作製
ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持したラットの作製及び、解析を行う。過程で得られたキメラについても解析を行う。
［Ｊ．１］キメララットの作製
上記実施例７［Ｇ］で得られたＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持ラットＥＳ細胞クローンを用いてＨｉｒａｂａｙａｓｈｉらの方法（Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ． ２０１０ Ｆｅｂ；７７（２）：９４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｒｄ．２１１２３．）でキメララットを作製した。宿主としてはＣｒｌｊ：ＷＩラット（白色、日本チャールスリバー社より購入）の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔ラットは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。ＥＳ細胞由来のＩＧＨＫ−ＮＡＣの優性遺伝形質である、ＧＦＰの蛍光も産まれて間もない時期に観察し、ＥＳ細胞の寄与を確認する。
［Ｊ．２］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するＥＳ細胞由来キメララットのＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持確認
上記［Ｈ．２］同様に解析を行い、ＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持をより詳細に確認する。血液細胞についてＨｕｍａｎ ｃｏｔ−１及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブとして用い、ＦＩＳＨ解析を実施する。
［Ｊ．３］キメララットのヒト抗体産生能評価
キメララットについて（実施例７） ［Ａ．４］［Ａ．５］［Ａ．６］同様に評価する。
［Ｋ］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するキメララットからのＩＧＨＫ−ＮＡＣの子孫伝達
［Ｋ．１］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するキメララットからのＩＧＨＫ−ＮＡＣの子孫伝達
上記［Ｊ］で作製されたキメララット（キメラ率約１００％）とＣｒｌｊ：ＷＩラットを交配し、誕生した仔ラットについてＥＳ細胞由来のＩＧＨＫ−ＮＡＣの優性遺伝形質である、ＧＦＰの蛍光を観察する。ＧＦＰの蛍光が観察され、ラット個体においてＩＧＨＫ−ＮＡＣが子孫伝達し、安定に保持されていることを確認する。ＩＧＨＫ−ＮＡＣが子孫伝達されたラット系統をｒＴＣ（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）と呼ぶ。
［Ｋ．２］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するラットのＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持確認
ｒＴＣ（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）について［Ｊ．２］同様解析を行うことでＩＧＨＫ−ＮＡＣの子孫伝達を詳細に確認できる。
［Ｋ．３］ＩＧＨＫ−ＮＡＣを保持するラットのヒト抗体産生能評価
ｒＴＣ（ＩＧＨＫ−ＮＡＣ）について（実施例７）［Ｈ．４］［Ｈ．５］［Ｈ．６］同様に評価する。
［実施例８］新規マウス人工染色体ベクターを用いたヒト抗体産生（ＩＧＨＬ−ＮＡＣ）マウス及びラットの作製
ヒト抗体遺伝子（ＩＧＨ、ＩＧＬ）をＮＡＣへ搭載することでＩＧＨＬ−ＮＡＣを構築し、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持したヒト抗体産生マウス及びラットの作製を行う（図２１）。
［Ａ］ＮＡＣを保持するＣＨＯ細胞への改変ヒト２２番染色体の移入
改変ヒト２２番染色体保持ＣＨＯ細胞より改変ヒト２２番染色体をＮＡＣ保持ＣＨＯ細胞に導入する。
［Ａ．１］微小核細胞融合法による改変ヒト２２番染色体のＮＡＣ保持Ｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞への移入
ドナー細胞である改変ヒト２２番染色体ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ ｈＣｈｒ２２ＬＦ）を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをＤＭＥＭで調製した０．０５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（シグマ）溶液２ｍＬに懸濁し、６ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるＮＡＣ保持Ｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞株に、培養液を除いた後添加する。１５分インキュベートして微小核をＣＨＯ細胞に張り付ける。その後、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地６ｍＬに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分融合する。５ｍＬの無血清ＤＭＥＭでＰＥＧを除去するために４回ウオッシュ操作を行った後、ＣＨＯ培養液を添加する。２４時間後、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に細胞を播種し、８μｇ／ｍＬブラストサイジンＳを添加し、１０日選択培養を行った。得られた薬剤耐性株ついて以降の解析を行う。
［Ａ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ブラストサイジンＳ耐性株のゲノムを抽出し、鋳型としてＰＣＲ解析を行い、改変ヒト２番染色体の保持を確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
改変ヒト２２番染色体ｌｏｘＰ配列確認プライマー：
22CeT La L：5’-CCTGCCTTCTTGTTTCAGCTCTCAACTG-3’(配列番号87)
22CeT La R：5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(配列番号88)
22CeT Ra L：5’-ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGT-3’(配列番号89)
22CeT Ra R：5’-ACACTTTAGTCCCTGTCCCCTCAACGAG-3’(配列番号90)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＴａｋａｒａ社製のＴＰ６００を、ＰＣＲ酵素はＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。
改変ヒト２２番染色体ＦＲＴ配列確認プライマー：
22TeT La L：5’-TGCAGGTATCTGTTGGTGTCCCTGTTTT-3’(配列番号91)
22TeT La R：5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(配列番号92)
22TeT Ra L：5’-AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGA-3’(配列番号93)
22TeT Ra R：5’-CTGTCCTATCCTTGCAGCTGTCTTCCAG-3’(配列番号94)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＴａｋａｒａ社製のＴＰ６００を、ＰＣＲ酵素はＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行えば組換えが確認する。
加えて、ヒト２番染色体上のプライマーを用い領域が保持されているかを確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
553P-F：5’-AGATCTCTTGAGCCCAGCAGTTTGA-3’(配列番号95)
553P-R：5’-TGAAGTTAGCCGGGGATACAGACG-3’(配列番号96)
PPM1F L：5’-AACGGCAGCCAAACCAAAGA-3’(配列番号97)
PPM1F R：5’-ACCAGGACTGGCTGGGCATA-3’(配列番号98)
IGLVI-70 L：5’-AGTCTGCGCTGACCCAGGAA-3’(配列番号99)
IGLVI-70 R：5’-TTGAGCCAGAGAAGCGGTCA-3’(配列番号100)
GNAZ L：5’-TCCACTTGGGGGTCTGCATT-3’(配列番号101)
GNAZ R：5’-TGGTGCTGAGCAGCTGTGTG-3’(配列番号102)
LIF L：5’-TGGGACTTAGGTGGGCCAGA-3’(配列番号103)
LIF R：5’-GCCTCCCCAAGAGCCTGAAT-3’(配列番号104)
hVpreB1-F：5’-TGTCCTGGGCTCCTGTCCTGCTCAT-3’(配列番号105)
hVpreB1-Rm：5’-GGCGGCGACTCCACCCTCTT-3’(配列番号106)
hVpreB3-F：5’-CACTGCCTGCCCGCTGCTGGTA-3’(配列番号107)
hVpreB3-R：5’-GGGCGGGGAAGTGGGGGAGAG-3’(配列番号108)
hL5-F：5’-AGCCCCAAGAACCCAGCCGATGTGA-3’(配列番号109)
hL5-R：5’-GGCAGAGGGAGTGTGGGGTGTTGTG-3’(配列番号110)
344-F：5’-ATCATCTGCTCGCTCTCTCC-3’(配列番号111)
344-R：5’-CACATCTGTAGTGGCTGTGG-3’(配列番号112)
350P-F：5’-ACCAGCGCGTCATCATCAAG-3’(配列番号113)
350P-R：5’-ATCGCCAGCCTCACCATTTC-3’(配列番号114)
IgL-F：5’-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3’(配列番号115)
IgL-Rm：5’-GAGAGTTGGAGAAGGGGTGACT-3’(配列番号116)
SERPIND1 L：5’-ACCTAGAGGGTCTCACCTCC-3’(配列番号117)
SERPIND1 R：5’-CCCTGGACATCAAGAATGG-3’(配列番号118)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれかで３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ＰＣＲ陽性クローンについて以降の解析を行う。
［Ａ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
ＰＣＲ解析陽性クローンについて、Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＮＡＣと改変ヒト２２番染色体が独立して保持されている陽性細胞を選別する。
［Ｂ］転座クローニングによるヒト２２番染色体ＩＧＬ領域のマウス人工染色体ベクター（ＮＡＣ）への搭載
ＮＡＣを保持するＣＨＯ細胞において、ヒト２２番染色体上ＩＧＫ領域をＮＡＣへ転座クローニングする。転座クローニングにはＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用い、ヒト２番染色体とＮＡＣを相互転座させることで、ＩＧＬ領域をＮＡＣに搭載する（図２２）。
［Ｂ．１］Ｃｒｅ発現によるＨＡＴ耐性染色体組換え体の取得
ＮＡＣにはｌｏｘＰサイトが搭載されており、Ｃｒｅ組換え酵素存在下で改変ヒト２番染色体のｌｏｘＰサイトと組換えが起こるようになっている。また、組換えが起こると副産物となるＮＡＣに載らないヒト２番染色体領域の５’ＨＰＲＴと副産物となるＮＡＣ末端の３’ＨＰＲＴが連結して、ＨＰＲＴ遺伝子の再構成が起こり、ＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）はＨＡＴ耐性を獲得する。
改変ヒト２番染色体とＮＡＣを保持するＨｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞について、１０ｃｍ細胞培養皿においてコンフルエントになった時に、１８μｇのＣｒｅ発現プラスミド（ベクター名：ｐＢＳ１８５）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメーカーの手順を参照して加える。添加後６時間経過したら、培養液を交換し、２４時間後に、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に播種し、１×ＨＡＴ（シグマ）、４μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎで薬剤選択を行う。得られた薬剤耐性株を以降の解析に用いる。
［Ｂ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト２番染色体断片とＮＡＣ上で染色体相互転座が起こっているかを確認する。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ＦＲＴ挿入部位が維持されているか確認するためのプライマーを以下に示す。
22TeT La L (前出)
22TeT La R (前出)
22TeT Ra L (前出)
22TeT Ra R (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＴａｋａｒａ社製のＴＰ６００を、ＰＣＲ酵素はＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。
また、ヒト２２番染色体領域についてＰＣＲ解析を行う。以下に配列を示す。
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
SERPIND1 L (前出)
SERPIND1 R (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれか３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
［Ｂ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＮＡＣと改変ヒト２２番染色体が相互転座をおこしかつ、ＩＧＬ領域がＮＡＣに搭載されたＩＧＬ−ＮＡＣ、副産物が独立して保持されていることを確認する。選別した陽性細胞（ＣＨＯ ＩＧＬ−ＮＡＣと命名する）について、以下の実験を行う。
［Ｃ］ＩＧＬ−ＮＡＣの改変ヒト１４番染色体保持ＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）細胞株への移入
作製したＩＧＬ−ＮＡＣを、改変ヒト１４番染色体を保持するＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）細胞株へ移入し、ＦＲＴ／Ｆｌｐシステムによる組換えを起こさせＩＧＨ領域をＩＧＬ−ＮＡＣに搭載し、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを作製する。
［Ｃ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＣＨＯ ＩＧＬ−ＮＡＣを細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをＤＭＥＭで調製した０．０５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（シグマ）溶液２ｍＬに懸濁し、６ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるＣＨＯ ｈｐｒｔ−／−１４ＦＲＴ（ＰＣＴ／ＪＰ２０１７／０３９４４１に記載）、培養液を除いた後添加する。１５分インキュベートして微小核をＣＨＯ細胞に張り付ける。その後、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地６ｍＬに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分融合する。５ｍＬの無血清ＤＭＥＭでＰＥＧを除去するために４回ウオッシュ操作を行った後、ＣＨＯ培養液を添加する。２４時間後、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に細胞を播種し、６００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８と６μｇ／ｍＬブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を添加し、１０日選択培養を行う。得られた薬剤耐性株ついて以降の解析を行う。
［Ｃ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＬ−ＮＡＣが改変ヒト１４番染色体を保持するＣＨＯ（ｈｐｒｔ−／−）株に移入されているか、改変ヒト１４番染色体は維持されているかを確認するためにＰＣＲ解析を行う。以下に用いるプライマーを示す。
ＩＧＬ−ＮＡＣの確認プライマー：
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ＦＲＴ挿入部位が維持されているか確認するためのプライマーを以下に示す。
22TeT La L (前出)
22TeT La R (前出)
22TeT Ra L (前出)
22TeT Ra R (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＴａｋａｒａ社製のＴＰ６００を、ＰＣＲ酵素はＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分を３５サイクル行う。
また、ヒト２２番染色体領域についてＰＣＲ解析を行う。以下に配列を示す。
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
SERPIND1 L (前出)
SERPIND1 R (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれかで３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域の確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
改変ヒト１４番染色体上ＦＲＴ挿入部位の確認プライマー：
14TarC_La F (前出)
14TarC_La R (前出)
14TarC_Ra F (前出)
14TarC_Ra R (前出)
これらプライマーについては、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃６分を３５サイクル行う。
この結果を受けて、クローンを選別し、以降の実験を進める。
［Ｃ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＬ−ＮＡＣと改変ヒト１４番染色体が独立して、１コピーずつ維持されているクローンを確認する。陽性細胞（ＣＨＯ ＃１４ ＩＧＬ−ＮＡＣと命名）を選択し以降の実験を行う。
［Ｄ］ＦＲＴ／Ｆｌｐ組換えシステムを用いたＩＧＨＬ−ＮＡＣの構築
ＩＧＬ−ＮＡＣと改変ヒト１４番染色体をＦＲＴ／Ｆｌｐシステムで相互転座させることで、ＩＧＬ−ＮＡＣ上にヒト１４番染色体由来ＩＧＨ領域を転座クローニングし、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを構築する（図２３）。
［Ｄ．１］ＦＬＰ発現によるＨＡＴ耐性染色体組換え体の取得
ＩＧＬ−ＮＡＣ上のＦＲＴサイトと改変ヒト１４番染色体上のＦＲＴサイトを用いて、ＦＬＰｏ組換え酵素存在下で相互転座を起こさせる。また、組換えが起こるとＩＧＨＬ−ＮＡＣ上では、５’ＨＰＲＴと３’ＨＰＲＴが連結して、ＨＰＲＴ遺伝子の再構成が起こり、ＨＡＴ耐性を獲得する。ＣＨＯ＃１４ＩＧＬ−ＮＡＣについて、１０ｃｍ細胞培養皿においてコンフルエントになった時に１８μｇのＦＬＰ発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメーカーの手順を参照して加える。添加後６時間経過したら、培養液を交換し、２４時間後に、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に播種し、１×ＨＡＴ、８μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎで薬剤選択を行う。
得られたＨＡＴ耐性クローンを以降の解析に用いる。
［Ｄ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＦＲＴ／ＦＬＰシステムを用いて期待した相互転座が起こり、ＩＧＨＫ−ＮＡＣが構築されているか確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位の確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２２番染色体領域についてＰＣＲ解析を行う。以下に配列を示す。
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
GNAZ L (前出)
GNAZ R (前出)
LIF L (前出)
LIF R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれかで３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域の確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ＰＣＲ結果によりクローンを選別し、以降の実験に用いる。
［Ｄ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
プローブとしてＢＡＣクローンＣＨ１７−４２４Ｌ４（ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２６２Ｈ１１（ＩＧＨ領域）及びＣＨ１７−９５Ｆ２（ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２１２Ｐ１１（ＩＧＨ領域）の組み合わせを用いてｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を行い、実際ＩＧＨＬ−ＮＡＣが構築されているか詳細に解析する。ＮＡＣ上にそれぞれ、ＩＧＬ領域とＩＧＨ領域の存在を示すシグナルが観察されたものを陽性とし、ＩＧＨＬ−ＮＡＣが構築されていることを確認（ＣＨＯ ＩＧＨＬ−ＮＡＣと命名）しクローンを選別し、以降の実験を行う。
［Ｅ］ＩＧＨＬ−ＮＡＣのＣＨＯ Ｋ１細胞株への移入
ＩＧＨＬ−ＮＡＣ及びＩＧＨＬ−ＮＡＣ構築のための相互転座の際に形成された副産物の両方にＮｅｏ耐性遺伝子が載っており、微小核細胞融合法で目的の細胞に移入した際、Ｇ４１８で薬剤選択するとＩＧＨＬ−ＮＡＣもしくは副産物がそれぞれあるいは両方移入された細胞を取得することになる。ＮＡＣ上にはＥＧＦＰが搭載されているので、目的の細胞にＩＧＨＬ−ＮＡＣが移入されているか確認することが可能であるが、染色体導入が効率的に行えるドナー細胞でかつＩＧＨＬ−ＮＡＣのみを保持する細胞を作製するため。ＩＧＨＬ−ＮＡＣをＣＨＯ Ｋ１細胞株に移入する。
［Ｅ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離：ＩＧＨＬ−ＮＡＣのＣＨＯ Ｋ１株への移入
ドナー細胞であるＣＨＯ ＩＧＨＬ−ＮＡＣを細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養後に２０％ＦＢＳ、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＦ１２培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。微小核（「ミクロセル」ともいう）を無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ，５μｍ，３μｍフィルターにて精製する。精製後、ミクロセルをＤＭＥＭで調製した０．０５ｍｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｐ（シグマ）溶液２ｍＬに懸濁し、６ｃｍ細胞培養皿でコンフルエントになったレシピエントであるＣＨＯ Ｋ１細胞株に、培養液を除いた後添加する。１５分インキュベートして微小核をＣＨＯ細胞に張り付ける。その後、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地６ｍＬに完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分融合する。５ｍＬの無血清ＤＭＥＭでＰＥＧを除去するために４回ウオッシュ操作を行った後、ＣＨＯ培養液を添加する。２４時間後、１０ｃｍ細胞培養皿１０枚に細胞を播種し、８００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を添加し、１０日選択培養を行う。得られた薬剤耐性株について以降の解析を行う。
［Ｅ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＨＬ−ＮＡＣがＣＨＯ Ｋ１細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ解析を行った。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
CMVr-1 (前出)
PGKr-2 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２２番染色体領域についてＰＣＲ解析を行う。以下に配列を示す。
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれかで３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域の確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲ解析陽性細胞株について以降の解析を行う。
［Ｅ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを１コピー独立して保持していることを確認する。
さらに、プローブとしてＢＡＣクローンＣＨ１７−４２４Ｌ４ （ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２６２Ｈ１１（ＩＧＨ領域）及びＣＨ１７−９５Ｆ２ （ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２１２Ｐ１１（ＩＧＨ領域）の組み合わせを用いてｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＨＬ−ＮＡＣの構造を詳細に解析する。ＮＡＣ上にそれぞれ、ＩＧＬ領域とＩＧＨ領域の存在を示すシグナルが観察されたものを陽性（ＣＨＯ Ｋ１ ＩＧＨＬ−ＮＡＣと命名）として、以降の実験に用いる。
［Ｆ］マウスＥＳ細胞へのＩＧＨＬ−ＮＡＣの移入
ヒト抗体産生マウスを作製するためにはＩＧＨＬ−ＮＡＣをマウスＥＳ細胞に移入し、受精卵８細胞期にインジェクションし、キメラマウスを作製し、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを子孫伝達させることが必要である。
［Ｆ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞は、ＣＨＯ Ｋ１ ＩＧＨＬ−ＮＡＣを用いる。実施例７［Ｆ．１］と同様の手法を用いて微小核細胞融合を行い、ＥＧＦＰ陽性かつ薬剤耐性株を取得し、以降の解析を行う。
［Ｆ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＨＬ−ＮＡＣがマウスＥＳ細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いるプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。
ヒト２２番染色体領域についてＰＣＲ解析を行う。以下に配列を示す。
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれか３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域の確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲ解析陽性細胞株について以降の解析を行う。
［Ｆ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＨＬ−ＮＡＣのみを保持しており、マウスＥＳの正常核型を維持していることを確認する。
プローブとしてＢＡＣクローンＣＨ１７−９５Ｆ２（ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２６２Ｈ１１（ＩＧＨ領域）及びＣＨ１７−４２４Ｌ４（ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２１２Ｐ１１（ＩＧＨ領域）の組み合わせを用いてｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を行い、実際ＩＧＨＬ−ＮＡＣが構築されているか詳細に解析する。ＮＡＣ上にそれぞれ、ＩＧＬ領域とＩＧＨ領域の存在を示すシグナルが期待した位置に観察されたものを陽性細胞株（ＨＫＤ３１ ＩＧＨＬ−ＮＡＣ）とし、インジェクションに用いる。
［Ｇ］ラットＥＳ細胞へのＩＧＨＬ−ＮＡＣの移入
ヒト抗体産生ラットを作製するためにはＩＧＨＬ−ＮＡＣをラットＥＳ細胞に移入し、受精卵８細胞期にインジェクションし、キメラマウスを作製し、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを子孫伝達させることが必要である。
［Ｇ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
実施例７［Ｆ．１］に記載のようにマウスＥＳ細胞への微小核細胞融合法と同様の手法を用いてラットＥＳ細胞へのＩＧＨＬ−ＮＡＣの導入を行う。ドナー細胞は、ＣＨＯ Ｋ１ ＩＧＨＬ−ＮＡＣを用いる。融合後、オーバーナイトでインキュベーションし、Ｇ４１８を１５０μｇ／ｍＬになるように加え、３〜４週間選択培養する。結果ＧＦＰ陽性かつ薬剤耐性のクローンを以降の解析に用いる。
［Ｇ．２］ＰＣＲ解析による薬剤耐性クローンの選別
ＩＧＨＬ−ＮＡＣがラットＥＳ細胞株に移入されていることを確認するため、薬剤耐性クローンのＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ解析を行う。用いたプライマーを以下に示す。
相互転座連結部位確認プライマー：
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
KJneo (前出)
PGKr-2 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行った。
ヒト２２番染色体領域についてＰＣＲ解析を行う。以下に配列を示す。
553P-F (前出)
553P-R (前出)
PPM1F L (前出)
PPM1F R (前出)
IGLVI-70 L (前出)
IGLVI-70 R (前出)
hVpreB1-F (前出)
hVpreB1-Rm (前出)
hVpreB3-F (前出)
hVpreB3-R (前出)
hL5-F (前出)
hL5-R (前出)
344-F (前出)
344-R (前出)
350P-F (前出)
350P-R (前出)
IgL-F (前出)
IgL-Rm (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６３、６２、６０、５６、５５、５０℃のいずれか３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ヒト１４番染色体領域確認プライマー：
MTA1-F3 (前出)
MTA1-R3 (前出)
ELK2P2-F (前出)
ELK2P2-R (前出)
g1(g2)-F (前出)
g1(g2)-R (前出)
VH3-F (前出)
VH3-R (前出)
CH3F3 (前出)
CH4R2 (前出)
これらプライマーを用いたＰＣＲについて、ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒もしくは５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。ＰＣＲ解析陽性細胞株について以降の解析を行う。
［Ｇ．３］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
Ｈｕｍａｎ ｃｏｔ−１ ＤＮＡ及びＭｏｕｓｅ ｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを１コピー独立して保持しており、ラットＥＳの正常核型（４２本）を維持していることを確認する。プローブとしてＢＡＣクローンＣＨ１７−９５Ｆ２（ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２６２Ｈ１１（ＩＧＨ領域）及びＣＨ１７−４２４Ｌ４（ＩＧＬ領域）とＣＨ１７−２１２Ｐ１１（ＩＧＨ領域）の組み合わせを用いてｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を行い、ＩＧＨＬ−ＮＡＣの構造をさらに詳しく解析する。ＮＡＣ上にそれぞれ、ＩＧＬ領域とＩＧＨ領域の存在を示すシグナルが期待した位置に観察されたものを陽性細胞株（ｒＥＳＩＧＨＬ−ＮＡＣと命名）とし、インジェクションに用いる。
［Ｈ］ＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持するマウス及びラットの作製と子孫伝達個体の作製
ＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持するマウス及びラットＥＳ細胞を用い、（実施例７）［Ｈ］［Ｉ］［Ｊ］［Ｋ］同様に操作を行うことで、ＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持した子孫伝達マウス及び、ラットを作製することができる。子孫伝達マウス、ラット及び過程で得られたキメラマウスについても、（実施例７）［Ｈ．４］［Ｈ．５］［Ｈ．６］同様に解析を行い、ＩＧＨＬ−ＮＡＣ保持及び抗体発現（ｈλも含む）を確認する。作製されたＩＧＨＬ−ＮＡＣ保持マウス及びラット系統をそれぞれｍＴＣ（ＩＧＨＬ−ＮＡＣ）、ｒＴＣ（ＩＧＨＬ−ＮＡＣ）と呼ぶ。
［実施例９］完全ヒト抗体産生マウスの作製
ＩＧＨＫ−ＮＡＣ及びＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持するマウスと、マウスＩｇｈ，及びＩｇｋ遺伝子が破壊されており、かつＩｇｌ変異を持つ（Ｉｇｌの発現が低くなる変異を持つ）マウスを交配させ、ヒト抗体産生マウスを作製する。
［Ａ］Ｉｇｈ及びＩｇｋ遺伝子欠損、Ｉｇｌ低発現マウスの作製
ヒト抗体産生マウスを作製するため、マウス抗体遺伝子を欠損または低発現しているマウスを作製する。
［Ａ．１］Ｉｇｈ及びＩｇｋ遺伝子欠損、Ｉｇｌ低発現マウスの作製
ＨＫＤ３１（マウスＩｇｈ、Ｉｇｋの遺伝子破壊が破壊されている）マウスＥＳより得られたマウス系統と、マウスＩｇｌ低発現の変異を持つＣＤ−１（ＩＣＲ、チャールズリバーより購入）を交配して、Ｉｇｈ及びＩｇｋ遺伝子欠損、Ｉｇｌ低発現マウスを作製する。
ＣＤ−１由来のマウスＩｇｌｃ変異はＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析により確認する。
以下のプライマーを用いてＰＣＲを行う。
mIglc1VnC L：5’-CCTCAGGTTGGGCAGGAAGA-3’(配列番号119)
J3C1：5’-GACCTAGGAACAGTCAGCACGGG-3’(配列番号120)
ＴａｑポリメラーゼはＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９５℃１０分の熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル行う。
ＰＣＲプロダクトをＫｐｎＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）で処理し、電気泳動後、ＰＣＲプロダクトの切断が認められないものを変異アレル保持として判定する。Ｉｇλ変異が両アレルで認められるマウス（「ＬＤ系統」と呼ぶ。）を交配にて獲得する。
［Ａ．２］マウス抗体遺伝子の発現評価
マウス抗体が発現消失及びほぼ発現していないことをフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析及びＥＬＩＳＡによって、評価する。
実施例７［Ｈ．３］で述べたように、Ｉｇｈ遺伝子が破壊されており、Ｉｇμの発現がなくなるとＢ細胞ができず、Ｂ細胞の有無を判定することで、Ｉｇｈ遺伝子欠損が評価できる。ＦＣＭ解析は以前の報告（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００ Ｊａｎ １８；９７（２）：７２２−７．）同様行い、Ｂ細胞欠失が見られた個体について、マウスＩｇｈ欠損と判定する。マウスＩｇｈ、Ｉｇκが破壊されていると考えられるマウス（ＨＫＤ系統と呼ぶ。）とＩｇλ変異マウスとの交配を進め、Ｉｇｈ、Ｉｇκが破壊されかつＩｇλ変異を両アレルにもつマウス（ＨＫＬＤ系統と呼ぶ。）を得る。
また、得られたマウスについて、マウスＩｇｈに加え、Ｉｇｋ，Ｉｇｌの発現も以前の報告（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００ Ｊａｎ １８；９７（２）：７２２−７）と同様に、ＥＬＩＳＡを行い、発現消失及び低発現であることを確認する。
［Ａ．３］ヒト抗体産生マウスの作製
ＩＧＨＫ−ＮＡＣ保持マウスもしくはＩＧＨＬ−ＮＡＣ保持マウスとマウスＩｇｈＫＯ、ＩｇｋＫＯ、Ｉｇｌ変異マウスを交配し、完全ヒト抗体産生マウスを作製する。
［Ｂ］完全ヒト抗体産生マウスの評価
［Ｂ．１］ＦＡＣＳ解析
ＩＧＨＫ−ＮＡＣもしくはＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持するＢ細胞の存在確認を目的としてフローサイトメトリー解析を行う。ヒトＩＧＭとマウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）に対する抗体を用いて、血液細胞を染色し、ヒトＩＧＭ、ＣＤ４５Ｒ、ＧＦＰ陽性の細胞を確認する。ヘパリンコートキャピラリ―を用いて、眼窩より採血し、ヘパリンＰＢＳの入ったチューブに血液を移し、転倒混和して氷冷。遠心２０００ｒｐｍ、３分、４℃、の後、上清除去後、各種抗体を添加し、４℃で３０分反応させ、５％牛胎仔血清を添加したＰＢＳ（５％ＦＢＳ／ＰＢＳ）により洗浄する。最後の遠心後、ペレットに１．２％Ｄｅｘｔｒａｎ／生理食塩水を加え、タッピング後、室温で４５分静置し、赤血球を自然沈降させる。上清を新しいチューブに移し、２０００ｒｐｍ、３分、４℃で遠心後上清除去し、ペレットに室温の溶血剤（０．１７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ）を加え、５分静置する。２０００ｒｐｍ、３分、４℃で遠心し、５％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した後５００μｌの５％ＦＢＳ／ＰＢＳで懸濁したものを解析サンプルとし、フローサイトメーターにより解析する。
［Ｂ．２］ヒト抗体の発現解析
ヒト抗体遺伝子軽鎖、重鎖、各種アイソタイプ発現確認を目的として、ＥＬＩＳＡにより測定する。（実施例７）［Ｈ．４］に記載した方法同様、マウスの抗体発現の有無確認も含め、マウス抗体（ｍγ、ｍμ、ｍκ、ｍλ）、ヒト抗体（ｈγ、ｈμ、ｈκ、ｈλ、ｈγ１、ｈγ２、ｈγ３、ｈγ４、ｈα、ｈε、ｈδ）の発現及び血清中の濃度を測定する。
［Ｂ．３］ヒト抗体の発現解析及び配列同定
ヒト抗体産生マウス脾臓由来ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。（実施例７）［Ｈ．５］と同様に実施することで解析、評価できる。
［Ｂ．４］抗原特異的ヒト抗体産生応答の評価
ヒト抗体産生マウスについて、抗原特異的ヒト抗体産生応答が見られるかを評価する。（実施例７）［Ｈ．６］に記載した方法同様にヒト血清アルブミンで免疫し、抗体力価の上昇を解析する。
［Ｂ．５］ヒト抗体産生マウスからのヒト抗体産生ハイブリドーマの取得
特許（国際公開ＷＯ９８／３７７５７号）に記載されている方法同様にヒト抗体産生ハイブリドーマの取得ができる。
［実施例１０］完全ヒト抗体産生ラットの作製
ＩＧＨＫ−ＮＡＣ及びＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持するラットと、ラットＩｇｈ，Ｉｇｋ，Ｉｇｌが破壊されたＫＯラットを交配させ、ヒト抗体産生ラットを作製する。
［Ａ］ヒト抗体産生ラットの作製及び評価
［Ａ．１］ヒト抗体産生ラットの作製
ＩＧＨＫ−ＮＡＣもしくはＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持したラット系統とラットＩｇｈ、Ｉｇκ、Ｉｇλ遺伝子が破壊されたラット系統を交配することで、ヒト抗体産生ラットを作製できる。
［Ａ．２］ＦＡＣＳ解析
ＩＧＨＫ−ＮＡＣもしくはＩＧＨＬ−ＮＡＣを保持するＢ細胞の確認を行う。（実施例１４）［Ｂ．１］と同様の方法で実施し、抗体は抗ラットＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）抗体を用い、溶血剤は０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌを用いる。
［Ａ．３］ヒトＩｇの発現解析
ＥＬＩＳＡによるヒト抗体遺伝子軽鎖、重鎖、各種アイソタイプ発現確認を目的として、（実施例７）［Ｈ．４］］と同様に解析を行うことでヒト抗体産生を評価することができる。抗ラット免疫グロブリン抗体を用いてラット抗体（ｒγ、ｒμ、ｒκ、ｒλ）の発現も評価する。
［Ａ．４］ヒト抗体の発現解析及び遺伝子配列同定
上記の（実施例７）［Ｈ．５］と同様の方法を用いて、抗体遺伝子配列決定、解析、評価を行うことができる。
［Ａ．５］抗原特異的ヒト抗体産生応答の評価
（実施例７）［Ｈ．６］の記載と同様に実施し、評価することができる。
［Ａ．６］ヒト抗体産生ラットからのヒト抗体産生ハイブリドーマの取得
（実施例９）［Ｂ．５］の記載と同様の方法で実施し、ヒト抗体産生ハイブリドーマの取得ができる。
［実施例１１］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２、１０ＭＡＣ３の構築
マウス人工染色体１０ＭＡＣにＤＮＡ挿入配列としてＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰおよびＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰタイプのｌｏｘＰ配列を挿入することでマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２、１０ＭＡＣ３を各々構築し、環状ＤＮＡを介した遺伝子搭載を行うためのｈｐｒｔ欠損ＣＨＯ細胞株へ導入し、動作確認を行う。
［Ａ］マウス人工染色体１０ＭＡＣへのＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰおよびＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰタイプのｌｏｘＰ配列の挿入によるマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２、１０ＭＡＣ３の構築
マウス人工染色体１０ＭＡＣに遺伝子搭載サイトｌｏｘＰのみを搭載した１０ＭＡＣおよび遺伝子搭載サイトｌｏｘＰとその存在をモニター可能なＧＦＰ発現ユニットを搭載した１０ＭＡＣを構築する。
［Ａ．１］ ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰおよびＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰタイプのｌｏｘＰターゲティングベクターの作製
ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０７（Ｌｅｘｉｃｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるマウス１０番染色体のＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＮＣ＿００００７６．６）。薬剤耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出して鋳型とし、相同組換えの二つの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。
NotI_m10 LA F：5'- TCGAGCGGCCGCTCTAAGTCAGGGAAAGATCCCCTTCTTG -3' (配列番号121)
SalI_m10 LA R：5'- TCGAGTCGACGACCATGAAGATGGTCCAACTAAAGCAA -3' (配列番号122)
ClaI_m10 RA F：5'- TCGAATCGATCACTGCTCTTTCTTTAGTTACATGCAGCCC -3' （配列番号123）
ClaI_m10 RA R：5'- TCGAATCGATATTCTTGCCAAGCTACTCTTCCGAGCTA -3' (配列番号124)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃３分及び５分を３５サイクル行った。
ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰのターゲティングベクターの作製。
Ｖ９０７のＥｃｏＲＩサイトにＰＧＫｎｅｏをクローニングした。ＡｓｃＩサイトとＣｌａＩサイトに５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰを挿入した。ＣｌａＩ ｍ１０ ＲＡ ＦとＣｌａＩ ｍ１０ ＲＡ ＲのＰＣＲ産物をＣｌａＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０７のＣｌａＩサイトにクローニングした（ベクター名：Ｖ９０７−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｍ１０ＲＡ）。ＮｏｔＩ_ｍ１０ ＬＡ ＦとＳａｌＩ_ｍ１０ ＬＡ ＲのＰＣＲ産物をＮｏｔＩ（ＮＥＢ）とＳａｌＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０７−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｍ１０ＲＡのＮｏｔＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ１０ＭＡＣ２）。
ＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰのターゲティングベクターの作製。Ｖ９０７−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ―ｍ１０ＲＡのＮｏｔＩ／ＳａｌＩサイトににＣＡＧ−ＥＧＦＰをクローニングした。ＮｏｔＩ_ｍ１０ ＬＡ ＦとＳａｌＩ_ｍ１０ ＬＡ ＲのＰＣＲ産物をＮｏｔＩ（ＮＥＢ）とＰｓｐＯＭＩ（ＮＥＢ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０７−ＥＧＦＰ−ＰＧＫｎｅｏ−５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ―ｍ１０ＲＡのＮｏｔＩサイトにクローニングした（ベクター名：ｐ１０ＭＡＣ３）。
ターゲティングベクター、標的配列及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図２４、２５に示す。
［Ａ．２］トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
ニワトリＤＴ４０細胞の培養は１０％ウシ胎仔血清（ギブコ、以下「ＦＢＳ」で記す）、１％ニワトリ血清（ギブコ）、１０−４Ｍ ２−メルカプトエタノール（シグマ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）中で行った。ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６の約１０７個の細胞を無添加ＲＰＭＩ１６４０培地で一回洗浄し、０．５ｍｌの無添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、制限酵素ＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で線状化したターゲティングベクターｐ１０ＭＡＣ２もしくはｐ１０ＭＡＣ３を２５μｇ加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で１０分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、５５０Ｖ、２５μＦの条件で電圧印加した。室温で１０分間静置後、２４時間培養した。Ｇ４１８（１．５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、９６穴培養プレート２枚に分注して約２週間の選択培養を行った。Ｔ５−２６，Ｔ６−３７各２回のトランスフェクションで得た各２４、２０個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（１０ＭＡＣ２）およびＤＴ４０（１０ＭＡＣ３））。
［Ａ．３］相同組換体の選別
［Ａ．３．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス１０番染色体上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＤＴ４０（１０ＭＡＣ２）
m10 F1 (前出)
NAC R1：5'- CTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAAC -3' (配列番号125)
NAC F1：5'- TGCTTGCATTGTATGTCTGGCTATTCTG -3' (配列番号126)
m10 R2 (前出)
m10 F6 (前出)
Puro I (前出)
ＤＴ４０（１０ＭＡＣ３）
m10 F1 (前出)
EGFP-R：5'- TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG -3' (配列番号127)
NAC F1 (前出)
m10 R2 (前出)
m10 F6 (前出)
Puro I (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分もしくは６分を３５サイクル行った。
その結果ＤＴ４０（１０ＭＡＣ２）およびＤＴ４０（１０ＭＡＣ３）について各１４、１１クローンについて目的の組換えが行われていることが示唆された。
［Ａ．３．２］ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記から得られたＤＴ４０（１０ＭＡＣ２）およびＤＴ４０（１０ＭＡＣ３）において、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析を松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に従い行った。マウスｃｏｔ−１ ＤＮＡ及び５’-ＨＰＲＴ-ｌｏｘＰ（Ｘ６．１）カセットをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ｌｏｘＰ配列がターゲティングされたマウス１０番染色体断片のセントロメア付近にプローブ由来のＦＩＴＣシグナルが検出されたことから、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた（図２６、２７）。これらの結果から、マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２および１０ＭＡＣ３を保持するＤＴ４０細胞クローンが得られたと結論できた。以降のステップでは、ＤＴ４０（１０ＭＡＣ２） ＃８、ＤＴ４０（１０ＭＡＣ３）＃１２の各１クローンを用いることとした。
［Ｂ］マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２および１０ＭＡＣ３含有ＤＴ４０細胞から１０ＭＡＣ２および１０ＭＡＣ３のＣＨＯ細胞への導入
ＣＨＯ細胞内でマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２もしくは１０ＭＡＣ３のＤＮＡ配列挿入部位であるｌｏｘＰ配列を介して目的遺伝子（群）を保持した環状ＤＮＡを挿入するため、或いはＣＨＯ細胞を介して目的の遺伝子が搭載されたマウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２もしくは１０ＭＡＣ３をマウスＥＳ細胞等に導入するためにＣＨＯ細胞に導入する。
［Ｂ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＤＴ４０（１０ＭＡＣ２）およびＤＴ４０（１０ＭＡＣ３）を用いて、上記と同様にＣＨＯ ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ−）に微小核細胞融合法を行った。微小核細胞融合で得たＧ４１８耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ２）およびＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ３））。
［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウス人工番染色体ベクター１０ＭＡＣ２および１０ＭＡＣ３がＣＨＯ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ２）
m10 F1 (前出)
NAC R1 (前出)
NAC F1 (前出)
m10 R2 (前出)
m10 F6 (前出)
Puro I (前出)
ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ３）
m10 F1 (前出)
EGFP-R (前出)
NAC F1 (前出)
m10 R2 (前出)
m10 F6 (前出)
Puro I (前出)
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９８℃１５秒、６８℃５分もしくは６分を３５サイクル行った。ＰＣＲ陽性のクローン各１２、１０クローン得られたため以降の解析を行った。
［Ｂ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ２）および（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ３）に関して選抜した各６クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０： １１６３−１１７５，２００１）に記された方法でマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行い、マウス人工染色体ベクター１０ＭＡＣ２および１０ＭＡＣ３がＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。解析結果よりＭＡＣ２が安定に独立して保持されている１クローンおよびＭＡＣ３が安定かつ独立して保持されている２クローンを確認した（図２８、２９）。
［Ｃ］ＭＡＣ２およびＭＡＣ３への環状ＤＮＡの挿入確認
作製したＭＡＣ２およびＭＡＣ３への環状ＤＮＡの組換え挿入が動作するか検証を行った。
［Ｃ．１］ＭＡＣ２およびＭＡＣ３へのＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる環状DNAの挿入
ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ２）および（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ３）を６ｃｍ dishでコンフルエントになるように培養を行った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてメーカーのプロトコールに従い、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ２）にはＣｒｅ発現プラスミド（ベクター名：ｐＢＳ１８５）およびＬｏｘＰ-３’ＨＰＲＴ-ＥＧＦＰのプラスミド（ベクター名：Ｘ３．１−Ｉ−ＥＧＦＰ-Ｉ）を共導入し、ＣＨＯ（ＨＰＲＴ−；１０ＭＡＣ３）にはｐＢＳ１８５およびＬｏｘＰ-３’ＨＰＲＴ-ｔｄｔｏｍａｔｏのプラスミド（ベクター名：Ｘ３．１−Ｉ−ｔｄｔｏｍａｔｏ-Ｉ）を共導入した。遺伝子導入２４時間後細胞を１０ｃｍｄｉｓｈ１０枚に継代培養し、さらに２４時間後からＨＡＴで薬剤選択を行った。得られた薬剤耐性クローンについて以降の解析を行う。
［Ｃ．２］薬剤耐性クローンの解析
期待された部位特異的組換えが起こり、ＬｏｘＰ-３’ＨＰＲＴを保持した環状ＤＮＡが挿入されると１０ＭＡＣ２および１０ＭＡＣ３でＨＰＲＴ遺伝子の再構成が起こり、ＨＡＴ耐性になる。薬剤耐性クローンからＤＮＡを抽出し、この組換えのつなぎ目を検出するＰＣＲを行う。使用したプライマーを以下に示す。
TRANS L1 (前出)
TRANS R1 (前出)
これらプライマーについては、ＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いる。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行う。その結果で、部位特異的組換えによる環状ＤＮＡの挿入効率を評価する。
本発明のマウス人工染色体ベクターは、例えば、外来遺伝子を発現する細胞や有用な非ヒト動物の作製、ヒト抗体などのタンパク質の製造などの種々の用途や目的のために利用できる。
本明細書に記載された下記の（１）及び（２）の細胞株はそれぞれ、マウス１０番染色体由来及びマウス１６番染色体由来のマウス人工染色体をニワトリＢ前駆細胞株ＤＴ４０にエレクトロポレーションによって導入した動物細胞株であり、これら２つの動物細胞株はいずれも、２０１８年２月２８日に国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、１２２号室）にブダペスト条約の規定に基づき国際寄託された。
（１）ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６の受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５６
（２）ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４の受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５７
配列番号１〜１２７：プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (22)

  1. マウス１０番染色体及びマウス１６番染色体からなる群から選択されるマウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス１０番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ８１５５から長腕遠位を削除したマウス１０番染色体由来の長腕断片、又はセントロメア近傍のマウス１６番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ３５９７４から長腕遠位を削除したマウス１６番染色体由来の長腕断片、１つ又は複数の外来ＤＮＡ挿入部位、及びテロメアを含むこと、並びに、齧歯類の細胞、組織又は個体において安定に保持される、かつ子孫伝達可能であることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。
  2. 寄託細胞株ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５−２６（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５６）に含まれるマウス人工染色体を含む、請求項１に記載のマウス人工染色体ベクター。
  3. 寄託細胞株ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１−１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６５７）に含まれるマウス人工染色体を含む、請求項１に記載のマウス人工染色体ベクター。
  4. 齧歯類がマウス又はラットである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
  5. 外来ＤＮＡ挿入部位が、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ配列、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ配列、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ配列、並びに、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
  6. レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子又はその両方をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
  7. 外来ＤＮＡ挿入部位が外来ＤＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
  8. 外来ＤＮＡがヒトＤＮＡである、請求項７に記載のマウス人工染色体ベクター。
  9. 外来ＤＮＡが、ヒト染色体長腕又は短腕の遺伝子もしくは遺伝子座のＤＮＡである、請求項８に記載のマウス人工染色体ベクター。
  10. 外来ＤＮＡが、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子もしくは遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座、又はその重鎖及び軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座の両方のＤＮＡである、請求項８又は９に記載のマウス人工染色体ベクター。
  11. 外来ＤＮＡが、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、血液凝固・溶解因子類、Ｇ蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はＤＮＡ、或いは、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などの疾患に関連する治療用遺伝子又はＤＮＡ、並びに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの免疫系遺伝子又はＤＮＡからなる群から選択される遺伝子又はＤＮＡである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクター。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクターを含む哺乳動物由来細胞。
  13. 哺乳動物由来細胞が、体細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の細胞。
  14. 哺乳動物由来細胞が、齧歯類由来細胞である、請求項１２又は１３に記載の細胞。
  15. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマウス人工染色体ベクターを含む非ヒト動物。
  16. 非ヒト動物が、齧歯類動物である、請求項１５に記載の非ヒト動物。
  17. 齧歯類動物が、マウス又はラットである、請求項１６に記載の非ヒト動物。
  18. ヒト抗体を産生可能にする動物である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  19. マウス人工染色体ベクターに含まれる外来ＤＮＡに対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下している、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
  20. 外来ＤＮＡ配列を含むマウス人工染色体ベクターを含む請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の細胞を培養し、産生された該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の製造方法。
  21. ヒト抗体重鎖及び軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを含む請求項１８に記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法。
  22. ヒト抗体軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座が、ヒト抗体λ及びκ軽鎖遺伝子もしくは遺伝子座である、請求項２１に記載の方法。
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