JP4997544B2 - ヒトチトクロームp450遺伝子(クラスター)を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物 - Google Patents
ヒトチトクロームp450遺伝子(クラスター)を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物 Download PDFInfo
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Description
本発明はまた、上記ベクターを保持する非ヒト哺乳動物、例えばマウス、その細胞、器官又は組織に関する。
本発明はさらに、上記非ヒト哺乳動物、その細胞、器官又は組織を用いて、ヒトチトクロームP450を製造する方法、或いは薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝を試験する方法に関する。
又、ヒトでの薬物代謝を検討するのであれば、ヒト肝ミクロソームを用いるのが一つの手段であるが、ヒトの肝ミクロソームは入手が困難である。一方、遺伝子工学的な手法でヒトの酵素を比較的容易に作ることが可能になってきており、これによると安定して同一の規格のものを供給できることから、その利用が考えられる(非特許文献3)。他方、P450により代謝されて活性化された薬物の生体への影響を調べるために、in vitroの系が構築されている。これは、肝ミクロソームと薬物を細胞の培養液中に添加することにより、細胞外で代謝された代謝産物の前記細胞への影響をみるものである。この場合、活性化された物質は細胞膜と吸着し、一部分しか細胞内に到達しない。したがって、細胞に対する代謝産物の影響を正確に把握することができないと考えられる。細胞そのものがP450を発現する場合、細胞膜に吸着することなく侵入した薬物が細胞内で活性化すると考えられ、毒性をはじめとする代謝産物による影響を適切に再現できると考えられる。このような観点から、ヒトP450遺伝子を導入した細胞を代謝産物の毒性評価に用いることが望ましいとされている(非特許文献4)。
しかし、上記のin vitroでの発現系を用いた方法は、いずれも何らかの問題点を抱えているのが現状である。ヒトP450を導入した酵母を用いた発現系(例えば、非特許文献5)では、P450の発現量はある程度得られ、P450cDNAを改変せずに発現できることなどの利点はあるものの、系に酵母自身のP450が含まれる問題がある。大腸菌を用いる発現系(例えば、非特許文献6)は取扱いが容易で大量に酵素を得ることができるものの、安定して発現させるためには発現させるP450のN−末端アミノ酸を改変する必要がある。また、この改変が酵素活性に影響を与える可能性が示唆されたり、大腸菌がP450活性を発揮するのに必要な還元酵素を持っていないため還元酵素を別に添加したりする必要があるなどの問題もある。また、昆虫細胞とバキュロウイルスを用いる系(例えば、非特許文献7)では発現量も多くN−末端アミノ酸の改変も必要ないが、発現のための操作に若干の熟練を要する。ヒト肝癌由来のHepG2細胞とワクシニアウイルスを用いる系(例えば、非特許文献8)やヒトBリンパ球を用いる系はヒトの細胞を用いることもあり、P450がよりin vivoの環境に近い状態で発現していると考えられるが、ワクシニアウイルスの使用を伴なう場合やHepG2細胞ミクロソームを用いる場合は、安全性に対する配慮が必要である(非特許文献2)。
薬物代謝酵素の生物学的役割と制御については、未だに完全には解明されていない。これらの動物細胞、酵母、昆虫、細菌を用いる実験系は、in vitroでの薬物代謝と化学発癌におけるP450の役割を検討するモデルとなりうるが、薬物動態のパラメーターなど他の要素のために、in vivoにおける状態を充分には反映していないことを踏まえて使用しなくてはならない(非特許文献9)。しかし、ヒトのP450遺伝子が導入され、体内でヒトと同じ代謝産物を生成する実験動物ができれば、ヒトで特異的に生成する代謝産物であっても、その薬理作用はもとより毒性に関して動物を用いて検証できるなどの大きな利点があげられる(非特許文献10)。そのため、P450遺伝子を導入したトランスジェニックマウスについての研究も行われている。例えばRamsdenら(非特許文献11)は、ラットCyp2B2遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製した。ラットCyp2B2遺伝子の発現は、組織特異的、発生特異的に制御されると共に、フェノバルビタールによって発現が誘導されることが知られている。トランスジェニックマウスにおける、フェノバルビタールによるトランスジーンの発現誘導には800bpのプロモーター配列だけでは不充分であり、さらに上流の遺伝子配列が必要であることが示された。また、トランスジーンの発現のコントロールには、転写開始点の数十キロベース上流の配列が必要であり、これによって発現量や組織特異性も再現できる可能性が示された(非特許文献11)。
また、LoefgrenらはCYP2C18およびCYP2C19を含む細菌人工染色体(BAC)をもつトランスジェニックマウスを作製し、発現に性差があることが報告された。この系では導入された遺伝子の導入部位はマウス2番染色体C1であり、コピー数は11−13であった。通常ヒトの遺伝子コピー数は2であることからヒトのCYP2Cを生理的に発現させるモデルとしては不十分であることが示唆された(非特許文献12)。
また、Yuら(非特許文献13)はヒト成体に特異的に発現するCYP3A4を含む細菌人工染色体(BAC)をもつトランスジェニックマウスを作製した。この例では導入したCYP3A4の遺伝子の発現は2週齢および4週齢でのみであったが、発現誘導剤を投与すると、8週齢においても発現が観察された。このトランスジェニックマウスでは乳腺の発達が悪く、子孫の生存が悪かった。この系では導入された遺伝子の導入部位やコピー数は検定されていない。従って、CYP3A4遺伝子によるものかどうかは、いくつかのコピー数、挿入部位の異なる系統での再現性を取る必要があると考えられた。
さらにまた、Liら(非特許文献14)は、ヒト胎児に特異的に発現するCYP3A7をもつトランスジェニックマウスを作製した。この例ではメタロチオネインプロモーターが使用され、P450遺伝子の組織特異的な誘導発現は観察されなかった。すなわち、作製された6系統のトランスジェニックマウスのうち1系統のみで、導入したCYP3A7遺伝子の肝臓での発現が認められたが、他の系統ではさまざまな臓器において発現が認められ、本来の組織特異性が認められなかった。したがって、肝臓特異的にP450遺伝子を発現させるためにはメタロチオネインプロモーターでは不充分であると考えられる。
CYP3Aに関しては、胎児期の毒性研究のためのツールとしての応用についての研究も行われている(非特許文献4)。また、Campbellら(非特許文献15)は、ラットCyp1A1遺伝子のプロモーターとその上流配列をlacZ遺伝子と結合した遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製し、それによりCyp1A1プロモーターによる遺伝子発現の制御について解析を進めた。
トランスジェニックマウスに限らず、P450遺伝子のノックアウトマウスも開発されてきており、発生や細胞レベルのホメオスタシスへの影響やin vivoでの薬物あるいは化学物質を介した毒性に関するP450の役割について解明する重要なツールとして期待されている(非特許文献16)。例えば、内因性Cyp1a2のノックアウトマウスは2つの研究グループによって作製された。Pineauら(非特許文献17)によって作製されたCyp1a2ノックアウトマウスは、ヘテロでは正常であるが、ホモであると生後すぐに死亡した。一方、Liangら(非特許文献18)によって作製されたCyp1a2ノックアウトマウスは、ホモ個体の表現型に異常はなかった。この違いは、欠損させる遺伝子の配列が異なることに起因しているものと考えられる。また、Cyp1a2ノックアウトマウスを用いたP450遺伝子の欠損の影響や代謝の異常についても報告(例えば、非特許文献19)されており、このようなノックアウトマウスを用いたCyp1a2の代謝系での役割が解明されてきている。エタノールを代謝する主要な酵素として知られるCyp2e1についてもノックアウトマウスが作製された(非特許文献20)。Cyp2e1はエタノール以外にも、アセトアミノフェンやアセトン、アラキドン酸の代謝に関与していることが知られているが、Cyp2e1が完全に欠損したホモ個体であっても外見上はワイルドタイプのマウスと変わらなかったが、アセトアミノフェンに対する耐性が上がり、また、病理所見の結果などからアセトアミノフェンによる肝毒性にCyp2e1による代謝が大きく関与していることが示唆された。これらのP450遺伝子ノックアウトマウスのいずれも、遺伝子ノックアウトによる当該遺伝子の機能解明を目的として作製されたものであり、導入される外来のP450遺伝子の発現レベルの上昇を目的としたものではない。
他方、HerwaardenらはCyp3a遺伝子ノックアウトマウスを作製し、さらにヒトのCYP3A4遺伝子を肝臓または小腸に発現させたマウスを作製し、ドセタキセルの代謝に関する研究が報告されている。しかしながら、これらのマウスでは肝臓または小腸特異的なプロモーター下流にヒトCYP3A4遺伝子を繋いで強制的に発現させており、ヒトの発現量を生理的に再現するものではない(非特許文献21)。
このような事情に鑑み、例えば、特許文献1では、ヒト正常線維芽細胞由来7番染色体の部分断片をミクロセル法によりマウスES細胞(胚性幹細胞)に導入し、このES細胞を用いて正常組織においてヒト染色体断片を保持し、薬剤の誘導によって肝臓、小腸においてヒトCYP3A4遺伝子を発現するキメラマウスが得られたことが記載されている。これに関連して、特許文献1は、CYP3A遺伝子群(以下、「CYP3A遺伝子クラスター」ともいう。)を含むヒト7番染色体断片(約5Mb)をSC20−HACベクター(FERM BP−7583;特許文献2)に転座して得られた#7−HACベクターを開示しているが、このベクターは子孫伝達能を欠くものであった。さらに、特許文献1には、ヒトP450遺伝子(CYP3Aファミリー)を有し、さらにマウス内在性のP450遺伝子(Cyp3aファミリー)が破壊されたマウスの作製が記載されている。
特許文献1に記載のごとく、ヒトCYP3A遺伝子群を含む7番染色体の部分断片を保持するマウスまたは、ヒトCYP3A遺伝子群を含む7番染色体の約5Mbの領域をマウス個体内で安定であることがわかっているヒト人工染色体ベクター(SC20)に搭載し、そのヒト人工染色体ベクターを保持するマウスが作製されたが、キメラマウスからの安定的な子孫伝達が不可能であった。子孫伝達個体が得られない場合、キメラマウスによるマウスの生産となり、その都度胚操作を必要とすることや均一な遺伝的背景を持つマウスが得られないこと、さらには、目的とする複数のヒトP450遺伝子群が導入され、かつ内在性の薬物代謝酵素が破壊された子孫マウスが得られないことを意味する。特許文献1記載のヒトCYP3A遺伝子群を保持するキメラマウスから子孫伝達しない原因の1つとしてこれまでにゲノムインプリンティングに関与する遺伝子や発生・生殖細胞分化に重要とされる遺伝子の過剰発現は胎生致死になることが報告されている(非特許文献22−24)。
しかし一方で、ヒト人工染色体ベクター(以下、「HACベクター」ともいう。)の利点は、1)宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、宿主遺伝子を破壊しない、2)一定のコピー数で安定に保持され、宿主細胞の生理的発現制御を受けることから、挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、3)導入可能なDNAサイズに制約がないことから、発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子/アイソフォームの導入が可能となることが挙げられる。このように、ヒト人工染色体ベクターは、従来のベクター系(ウイルス、YAC、BAC、PAC、コスミド、プラスミド)にはない利点を有していることから、新たな遺伝子の機能解析のためのベクターやヒト型モデル動物の作製系として期待されている(例えば、非特許文献25−26)。
本発明の別の目的は、上記の非ヒト哺乳動物、或いはその組織、器官又は細胞を用いて、薬物や食品の薬理作用又は代謝を試験する方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト7番染色体において、ヒトCYP3A遺伝子クラスターのテロメア側AC073842において削除し、ヒトCYP3A遺伝子クラスターのセントロメア側AC004922においてloxP配列を挿入することにより、発生段階・生殖細胞分化に重要であると思われる遺伝子を除いたヒトP450(CYP3A)遺伝子群を含む特定のヒト7番染色体の遺伝子領域(約1Mb±0.5Kb)をヒト人工染色体ベクター上にクローニングし、そのヒト人工染色体ベクターを、非ヒト哺乳動物であるマウスに導入することによって、子孫伝達可能なトランスクロモソミックマウスが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
発明の概要
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
(1)ヒトチトクロームP450遺伝子を含むヒト7番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト7番染色体断片が、染色体マーカーAC004922とAC073842との間に存在する少なくともヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む約1Mb±500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター。
(2)ヒト人工染色体ベクターである、上記(1)に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
(3)前記ヒト人工染色体ベクターが、前記ヒト7番染色体断片を、ヒト14番染色体由来のSC20ベクター(FERM BP−7583)に転座して得られたベクターである、上記(2)に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
(4)前記ヒト人工染色体ベクターが、受託番号 FERM BP−10928のニワトリDT40細胞株DT40(CYP3A−HACΔ)214に保持されたCYP3A−HACΔである、上記(2)に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
(5)上記(1)〜(4)のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
(6)マウスES細胞である、上記(5)に記載の分化多能性細胞。
(7)上記(1)〜(4)のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
(8)キメラ動物又はその子孫動物である、上記(7)に記載の非ヒト哺乳動物。
(9)前記子孫動物が、前記キメラ動物と、それと同種の野生型動物との交配により得られる動物である、上記(8)に記載の非ヒト哺乳動物。
(10)前記非ヒト哺乳動物において、前記ヒトCYP3A遺伝子クラスターのホモログである前記非ヒト哺乳動物固有のチトクロームP450遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している、上記(7)〜(9)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
(11)マウスである、上記(7)〜(10)のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
(12)マウスが子孫マウスである、上記(11)に記載の非ヒト哺乳動物。
(13)上記(11)又は(12)に記載のマウス又はその子孫マウスを、マウスCyp3a遺伝子クラスターを欠損したマウスと交配させることにより作製されたマウス又はその子孫であって、上記(1)〜(4)のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持すること、マウスCyp3a遺伝子クラスターを欠損していること、及びヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、上記マウス又はその子孫。
(14)上記(7)〜(12)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物或いは上記(13)に記載のマウス又はその子孫に由来する、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現が可能であることを特徴とする、細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織。
(15)上記(7)〜(12)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物、上記(13)に記載のマウス又はその子孫、或いは上記(14)に記載の細胞、器官又は組織において、これらが保持するヒトチトクロームP450遺伝子を発現させて生物学的活性を有するヒトチトクロームP450を産生させ、該ヒトチトクロームP450を回収することを含む、生物学的活性を有するヒトチトクロームP450の製造方法。
(16)上記(7)〜(12)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物、上記(13)に記載のマウス又はその子孫、或いは上記(14)に記載の細胞、器官又は組織に薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝の試験方法。
(17)上記(1)〜(4)のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持する非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、ヒトCYP3A遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームP450遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
(18)ntES細胞である、上記(17)に記載の分化多能性細胞。
(19)マウス由来ntES細胞である、上記(17)又は(18)に記載の分化多能性細胞。
定義
本明細書中で使用する用語の定義は以下の意味を含む。
本明細書中の「哺乳動物人工染色体ベクター」という用語は、哺乳動物染色体に基づいて作製された人工染色体を意味する。例えば、ヒト染色体に基づいて作製された人工染色体は、ヒト人工染色体と称される。
本明細書中の「ヒトCYP3A遺伝子クラスター」という用語は、ヒト7番染色体上に位置するCYP3A遺伝子群を意味する。CYP3A遺伝子群は、例えば、CYP3A4,CYP3A7,CYP3A5,CYP3A43を含む。
本明細書中の「ヒトチトクロームP450遺伝子」という用語は、ヒトCYP遺伝子群の総称を意味し、例えば、CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6を含む。
本明細書中の「マウスCyp3a遺伝子クラスター」という用語は、マウス5番染色体上に位置するCyp3a遺伝子群を意味する。Cyp3a遺伝子群は、例えば、Cyp3a11,Cyp3a25,Cyp3a13を含む。
本明細書中の「ホモログ」という用語は、任意の遺伝子に対応する他の動物種の相同遺伝子を意味する。例えばヒトCYP3A4遺伝子のマウスホモログはCyp3a11である。なお、CYP遺伝子群においては、アルファベットのあとの数字は各動物種によって一致しないことが多い。
本明細書中の「ntES細胞」という用語は、ドナー細胞核からあらかじめ除核したレシピエント卵へ核移植を行うことにより作製されたES(nuclear transfer ES)細胞を意味する。
本明細書中の「非ヒト哺乳動物」という用語は、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などを含むが、これらに限定されない。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007−295993号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、#7−HACおよびCYP3A−HACおよびCYP3A−HACΔの保持領域とキメラ率、保持率および子孫伝達率のまとめを示した図である。
図3は、各ステップでの組換えや細胞融合や染色体導入が行われたことを示すFISH解析の結果を示す写真である。図3aはDT40(#7)クローン、図3bはDT40(DF141)クローン、図3cはDT40(NP25)クローン、図3dはRクローン、図3eはRP13クローン、図3fはRPC13F2クローン、図3gはCHOクローン、及び図3hはTT2Fクローンである。
図4は、ヒト7番染色体上のAC004922へloxPを導入する概略図(a)と、導入の結果を示すサザン解析の結果を示した図(b)である。
図5は、ヒト7番染色体上のAC073842において部位特異的切断を行う概略図である。cenはセントロメア側、telはテロメア側を表す。
図6は、TC(CYP3A−HACΔ)マウスにおけるCYP3A遺伝子クラスターのゲノム解析の結果を示した図である。
図7は、TC(CYP3A−HACΔ)マウスにおけるFISH解析を示す図である。左のグラフはFISH解析による各組織(横軸)におけるCYP3A−HACΔの保持率(縦軸)を示す。右のグラフはTC(CYP3A−HACΔ)マウスの尻尾繊維芽細胞のFISHの結果を示す写真である。
図8は、TC(CYP3A−HACΔ)マウスにおけるCYP3A遺伝子クラスターの発現解析の結果を示した図である。GAPDHはグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を表す。
図9は、TC(CYP3A−HACΔ)マウス肝臓におけるCYP3A遺伝子クラスターの時期特異的遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図10は、薬物誘導によるTC(CYP3A−HACΔ)マウス肝臓における遺伝子発現解析の結果を示した図である。Rifはリファンピシン(Rifampicin)を表す。
図11は、pBlueLAB(2975bp)マルチクローニング部位の構造を示した図である。
図12は、pBACcyp3a13(#39)の構造を示した図である。
図13は、pBlueLAB(SAAX)マルチクローニング部位の構造を示した図である。
図14は、pBlueLAB(NAPF)マルチクローニング部位の構造を示した図である。
図15は、pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A(R)の構造(7602塩基対)を示した図である。
図16は、pcyp3a13−KOの構造(約15.8kb)を示した図である。
図17は、cyp3a13−KOベクターによる相同組換え体(HR体)ES細胞株のゲノムサザン解析の概略を示した図である。
図18は、cyp3a13−KOマウス個体の遺伝子型解析の概略を示した図である。
図19は、cyp3a44/11/25−KOマウス個体の遺伝子型解析の概略を示した図である。
図20は、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス肝臓における遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図21は、発現誘導後のTC(CYP3A−HACΔ)/ΔcypマウスにおけるウェスタンブロッティングによるCYP3A遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図22は、発現誘導後のTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスにおける代謝解析の結果を示した図である。
図23は、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスにおけるヒト特異的代謝物をLC−MS/MSにて測定した結果を示した図である。図23Aはヒト、図23Bはマウス(野生型)、図23CはΔcypマウス、図23DはTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスにおける測定結果を示す。
本発明は、その一の態様において、ヒトチトクロームP450遺伝子を含むヒト7番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト7番染色体断片が、染色体マーカーAC004922とAC073842との間に存在する少なくともヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む約1Mb±500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクターを提供する。
本明細書中において「チトクロームP450」は、水酸化酵素ファミリーの総称であり、種々の基質を水酸化する作用(生物学的活性)をもつ酵素である。動物では、主に肝臓に存在し、物質の解毒、脂肪酸の代謝、ステロイドホルモンの生合成などに関与している。本明細書中では、チトクロームP450を単に「P450」ということがある。
ヒトチトクロームP450遺伝子のCYP3A分子種の遺伝子群は、ヒト7番染色体長腕7q21〜q22のCYP3A遺伝子クラスターに存在する(例えばB.A.Brooksら,Am.J.Hum.Genet.,43:280,1988)。本発明の子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターの作製において、上記CYP3A遺伝子クラスターを含む特に有用な領域は、ヒト7番染色体長腕の染色体マーカーAC004922とAC073842との間に存在する少なくともヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む、約1Mb±500Kb、好ましくは約1Mb±300Kb、より好ましくは約1Mb±200Kbサイズの領域からなるヒト7番染色体断片である。特に、AC004922からAC073842までの領域(例えば、J.E.Sulstonら,Genome Res.,8:1097,1998)は、約1Mbのサイズであり、この領域を含む近傍の領域は、胎生致死、発生異常、奇形などをもたらすと考えられるゲノムインプリンティング遺伝子クラスターを含まないし、また、不妊の原因となる生殖細胞分化に重要とされる遺伝子も含まない。
本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、これを非ヒト哺乳動物に導入したとき、該動物本来の染色体とは独立して存在し得る。このとき得られたトランスクロモソミック動物は、ヒトP450遺伝子を保有するため、この異種遺伝子を発現することを可能にするし、また、交配によって子孫への上記ベクターの伝達を可能にする。この点で、本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、国際公開第WO01/011951号に記載されたヒト人工染色体ベクター(#7−HAC)と比べて、キメラ率及び染色体保持率のいずれも優れているし、さらに優れた特徴として子孫伝達可能であることが挙げられる。一方、公知の#7−HACベクターは子孫伝達不能であった。
本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、ヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む特定の領域の他に、哺乳動物の任意の染色体由来のセントロメアおよびテロメア・サブテロメア領域を含むことができる。ここで、哺乳動物の例は、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などを含むが、これらに限定されない。該セントロメアは哺乳動物染色体由来、好ましくはヒトの任意の染色体由来、より好ましくはヒト14番染色体由来のセントロメアである。該テロメア・サブテロメア領域は哺乳動物染色体由来、好ましくはヒト染色体由来、より好ましくはヒト7番又は14番染色体由来、より好ましくは人工的に合成されたTTAGGG配列の繰り返し配列由来である。本発明のベクターはさらに、哺乳動物染色体由来、好ましくはヒト染色体由来、より好ましくはヒト7番染色体由来のMDR1遺伝子クラスターを含むことも可能である。本発明の哺乳動物人工染色体ベクターの好ましい例は、ヒト人工染色体ベクターである。
本発明の一実施形態によれば、ヒト人工染色体ベクターは、上記ヒト7番染色体断片を、ヒト14番染色体由来のSC20ベクター(国際寄託の受託番号 FERM BP−7583;特開2005−230020号公報)に転座して得られたベクターである。転座とは、ある染色体の一部が別の染色体に移動することをいう。
本発明の別の実施形態によれば、ヒト人工染色体ベクターは、受託番号 FERM BP−10928のニワトリDT40細胞株DT40(CYP3A−HACΔ)214内に保持されたCYP3A−HACΔである。この細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に平成19年(2007年)10月30日付で国際寄託され、受託番号 FERM BP−10928が付与された。
以下では、本発明の哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物の作製例、並びにそれらの使用例を説明する。
具体的には、ヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子群をマウスなどの非ヒト哺乳動物中で安定かつ効率良く発現させるために、ヒト7番染色体断片を保持するヒト人工染色体(以下、「CYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔ」と呼ぶ)の構築を開示する。このCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔの構築及び構造は、後述の実施例、図1及び図2に記載されている。
(i)ヒト7番染色体の改変
ヒトCYP3A遺伝子クラスターは、7番染色体上の7q21.3−q22.1に存在する(B.A.Brooksら、上記)。ヒトCYP3Aファミリーには、少なくともCYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43が含まれ、CYP3Aのゲノム配列は、GenBank Accession No.NG_000004として登録されている。本発明のヒトP450は、CYP3Aファミリーに属するP450酵素、例えばCYP3A4、CYP3A5及びCYP3A7、CYP3A43の酵素の全てを対象とする。
ヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子クラスターを含む断片は、ヒト14番染色体に由来する染色体断片(SC20−HACベクター)に転座、クローニングした新規ヒト人工染色体の構築、該ヒト人工染色体のマウスでの子孫伝達、並びに、該ヒト人工染色体を保持するトランスクロモソミック非ヒト哺乳動物(例えば、げっ歯類、有蹄類などの哺乳動物)の作製に使用することができる。
本明細書中において、哺乳動物人工染色体とは、哺乳動物染色体上の所望の領域を、同種又は異種の哺乳動物由来の安定な染色体断片(染色体ベクター)に転座させて作製された、人工染色体をいう。また、トランスクロモソミック非ヒト哺乳動物とは、異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、ヒト以外の哺乳動物をいう。
本発明者らは、哺乳動物人工染色体の作製において、マウスなどの被染色体導入動物の発生に悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を染色体インサート上から可能な限り除去することが望ましいと考えてきた。しかし、従来は、ヒト染色体の詳細な配列等の構造に関する情報がないか、または不足していたため、目的遺伝子の近傍に、例えば、loxP配列およびヒトテロメア配列を挿入することが困難な場合があった。この場合、両配列に挟まれた領域には目的遺伝子以外にも、その他多くの遺伝子が含まれるので、これら余剰遺伝子がマウスなどの非ヒト哺乳動物に導入された場合に、個体発生または生殖細胞分化に悪影響を及ぼすことが危惧された。さらにまた、目的遺伝子を含む染色体インサートのサイズと、被染色体導入動物のキメラ率および導入染色体保持率および子孫伝達効率との関係が不明であった。
本発明者らは、CYP3A遺伝子クラスターが存在するヒト7番染色体の構造に関する情報に基づき、ある特定サイズ範囲の、CYP3A遺伝子クラスター含有染色体インサートについて、被染色体導入動物のキメラ率および導入染色体保持率および子孫伝達効率がいずれも有意に上昇することを今回見出した。このように余剰遺伝子をヒト人工染色体から取り除くことによって、特定されたCYP3A遺伝子クラスター領域周辺をインサートとして保持する新規ヒト人工染色体を作製することが可能となった。本明細書中、余剰遺伝子とは、被染色体導入動物の発生や生殖細胞分化に悪影響を与える有害遺伝子を指し、例えば、インプリンティング遺伝子や遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域、生殖細胞で発現する遺伝子群などである。
ゲノムインプリンティングに関与する遺伝子の過剰発現は胎生致死、発生異常、奇形などに導くことが知られているが、CYP3A遺伝子クラスターの存在するヒト7番染色体上の7q22(CYP3A遺伝子クラスターよりセントロメア側)にはゲノムインプリンティング遺伝子クラスターが存在するため、これを削除することが望ましいと考えられる。また、精巣や卵巣の生殖細胞で発現する遺伝子群の過剰発現は生殖細胞分化に悪影響を及ぼすことが知られているが、CYP3A遺伝子クラスターの存在するヒト7番染色体上の7q22(CYP3A遺伝子クラスターよりテロメア側)には生殖細胞で発現する遺伝子が複数存在するため、これを削除することが望ましいと考えられる。その結果、CYP3A遺伝子クラスター領域全体の大きさを縮小し、これによって高い子孫伝達効率を達成しうる。
下記の(ii)で、CYP3A遺伝子クラスターを含むヒト7番染色体断片をSC20−HACベクター上へ転座させる場合、転座させる染色体インサート(ヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子クラスター領域を含む)の大きさは、#7−HAC(国際公開第WO01/011951号)の場合の5Mbよりも小さいサイズ、通常約4Mb〜約0.5Mb、好ましくは約3Mb〜約0.5Mb、さらに好ましくは約2Mb〜約0.5Mb、最も好ましくは約1Mb〜約0.5Mbとしうる。また、余剰遺伝子を削除する実験の結果、転座させる染色体インサートのセントロメア側の端は、好ましくはAC004922座であり、一方テロメア側の端は、好ましくはAC073842座であるのが好ましいことが判明した。すなわち、7q22ゲノムインプリンティング遺伝子クラスターを除き、かつCYP3A遺伝子クラスターのセントロメア側に位置する染色体部位(例えば、AC004922;NCBIデータベース)に組換え酵素Creの認識配列であるloxP配列を相同組換えにより挿入し、さらに7q22に存在する生殖細胞で発現する遺伝子を除き、かつCYP3A遺伝子クラスターの極テロメア側に位置する染色体部位(例えば、AC073842;NCBIデータベース)にヒトテロメア配列を相同組換えにより挿入し、その位置により部位特異的に切断(テロメアトランケーション)(例えば、Kuroiwaら、Nucleic Acid Research 26:3447,1998)することで、AC004922−CYP3A遺伝子クラスター−AC073842断片を作製し、これを本発明の人工染色体ベクターの作製に用いることができる。
(ii)Cre−loxPシステムによるCYP3A遺伝子クラスターを含むヒト7番染色体断片のSC20−HACベクター上への転座
ヒト人工染色体(HAC)は、例えば、loxP配列及びヒトテロメア配列をヒト染色体上の目的遺伝子領域の近傍に相同組換えにより挿入し、両配列に挟まれた目的遺伝子領域周辺のみを別の染色体断片(安定でかつ子孫伝達可能な染色体断片であることが望ましい;例えばヒト14番染色体由来SC20染色体ベクター:SC20−HACベクター)上の対応loxP配列挿入部位に特異的に転座させることによって、目的遺伝子領域周辺のみをインサート(染色体インサート)として保持するヒト人工染色体として作製されうる(Kuroiwaら,Nature Biotech.,18:1086,2000)。
この場合、転座させる染色体インサート(ヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子クラスター領域を含む)の大きさは、上記のとおり、#7−HACの場合の5Mbよりも小さいサイズ、通常約4Mb〜約0.5Mb、好ましくは約3Mb〜約0.5Mb、さらに好ましくは約2Mb〜約0.5Mb、最も好ましくは約1Mb〜約0.5Mbとしうる。前記転座させる染色体インサートのセントロメア側の端は、好ましくはAC004922座であり、一方テロメア側の端は、好ましくはAC073842座である(J.E.Sulstonら、上記)。
本発明のヒト人工染色体の作製をさらに具体的に説明する。
ヒトCYP3A遺伝子クラスターを含むヒト7番染色体あるいはその断片は、周知の方法で取得しうる。すなわち、ミクロセル法によりヒト染色体あるいはその断片をマウスA9細胞にライブラリ化することができる(Koiら,Jpn.J.cancer Res.,80:413−418,1989)。得られたライブラリから、PCR等によりヒトCYP3A遺伝子クラスター特異的な配列を検出することにより、ヒト7番染色体あるいはその断片を保持するクローンを選抜することができる。ヒト7番染色体あるいはその断片は、その後の改変の便宜のため、さらにミクロセル法により好ましくはニワトリDT−40細胞(理研セルバンク(日本国):RCB1464;ATCC CRL−2111)に移入することができる。
ヒトCYP3A遺伝子クラスターは7番染色体上の7q22に存在する(B.A.Brooksら,上記)。前述の#7−HACにおいては、AC004082座からAF006752座までの5Mb領域が染色体インサートとして転座クローニングされていた。この5Mbインサートにおいて、CYP3A遺伝子クラスター領域よりもテロメア側には2Mbの、セントロメア側には2Mbの余分な染色体領域が含まれている。さらにはセントロメア側の2Mbにはインプリンティング遺伝子クラスターが含まれている。さらには、テロメア側の2Mbには生殖細胞で発現する遺伝子が複数存在する。そこで、まずセントロメア側2Mb領域を取り除くために、7番染色体断片(AF006752座でテロメアトランケーションされている断片)をCYP3A遺伝子クラスター領域の極く近傍かつセントロメア側(約300Kbセントロメア側)に存在するAC004922座(J.E.Sulstonら、上記)でloxP配列を相同組換えにより挿入する。これらの改変により、AC004922−CYP3A遺伝子クラスター−AF006752断片(約3Mb)のみを染色体インサートとしてSC20−HACベクターへ転座クローニングできる。その結果得られた人工染色体ベクターは、CYP3A−HACである(図1及び図2)。
次に、この染色体ベクターをCYP3A遺伝子クラスター領域の極く近傍かつテロメア側(約200Kbテロメア側)に位置するAC073842領域(J.E.Sulstonら、上記)においてテロメアトランケーション(例えば、Kuroiwaら、上記(1998))することで切断すれば、AC004922−CYP3A遺伝子クラスター−AC073842断片(約1Mb)のみを染色体インサートとしてSC20−HACベクターへ転座クローニングできる。その結果得られたヒト染色体ベクターがCYP3A−HACΔである(図1及び図2)。もっと具体的に言えば、CYP3A−HACΔでは、AC073842中の位置124455で切断されるため、存在するゲノム領域はAC073842の位置124456〜132764であり、位置1〜124455は存在していないし、また、AC004922の中の位置32340で転座されるため、存在するゲノム領域はAC004922の位置1〜32340であり、位置32341〜82359は存在していない。
本発明では、しかしながら、ゲノムインプリンティング遺伝子クラスター、生殖細胞分化に重要とされる遺伝子などの有害な領域を含まないで、かつ、ヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む限り、上記の特定の領域からなるヒト7番染色体断片に限定される必要はない。
これらCYP3A−HAC及びCYP3A−HACΔの作製において、ニワトリDT40細胞中でのテロメアトランケーションとCre−loxPシステムによる染色体間転座を利用することができる。
先ず、上記のようにして得られた改変ヒト7番染色体断片と改変SC20−HACベクター(Kuroiwaら,上記(2000))のそれぞれを保持するDT40細胞を作製する。次に、Cre−loxPシステムを用いてCYP3A遺伝子クラスターを含むヒト7番染色体断片をSC20−HACベクター上へ転座させるために、それぞれの改変ヒト染色体断片を保持するDT40細胞を融合させることによって、2本の改変ヒト染色体断片を保持するDT40細胞ハイブリッドを作製する。次に、Cre組換え酵素をこのDT40細胞ハイブリッド中で発現させて転座させるが、2本の非相同染色体間での組換え(転座)頻度は非常に低いことが報告されており(例えば、A.J.Smithら、Nature Genet.,9:376,1995)、さらに本発明の場合は、内在性染色体間ではなく、外来性のヒト染色体間での転座であるため、さらに組換え効率が低くなる可能性も考えられる。そこで、期待通りloxP間で組換えが起こった細胞を選択できるポジティブセレクション系を考えることが好ましい。そこで、loxP間で染色体の転座が起こった細胞において、GFP遺伝子が発現し、FACSでソーティングすることによって目的の細胞をクローニングするシステムを用いる。さらに、組換え頻度を上げるために、Cre組換え酵素を一過性ではなく、安定発現させる。2本の染色体間での転座は相互的に起こるので、Cre組換え酵素を安定発現させると、せっかく転座を起こした染色体が、頻度こそは低いが、再び組換え(転座)を起こして元に戻ってしまう可能性があるので、通常このような実験においては、Cre組換え酵素を一過性に発現させたり、Cre組換え酵素の発現を厳密にコントロールしたりする。しかし、本発明においては、DT40ハイブリッド中で転座させた直後に目的の転座したヒト人工染色体をミクロセル融合法によりチャイニーズハムスターCHO細胞へ移入させるため、CHO細胞においては、Cre組換え酵素の影響は受けずに済む。そのため、単純にCre組換え酵素を安定発現させることが可能となる。
上記の手法を用いることによって、如何なるサイズのヒト染色体断片(YACベクターのクローニングサイズを超える)をも安定なSC20−HACベクター上のloxP部位にクローニングすることができる。
上記のヒト人工染色体構築システムにより作製されたCYP3A−HAC又はCYP3A−HACΔは、マウスES細胞に導入される前に、チャイニーズハムスターCHO細胞に導入されるべきである。Diekenら(Nature Genet.,12:174,1996)は、改変ヒト染色体をニワトリDT40細胞からマウスMEL細胞(癌細胞の一種)へ移入したが、大部分が断片化された状態で移入された。これを回避するために、チャイニーズハムスターCHO細胞へ移入することによって、無傷の状態でヒト染色体を移入することができる。CHO細胞はマウスA9細胞と同様に効率良くミクロセルを形成することが知られており(Kuroiwaら、上記(2000))、これにより改変ヒト染色体をCHO細胞から非ヒト哺乳動物の分化多能性細胞(例えば、ES細胞)へ移入し、CYP3A−HACまはCYP3A−HACΔ保持キメラ動物を作製することができる。
(iii)分化多能性細胞へのヒトP450遺伝子(CYP3A遺伝子クラスター)を含む人工染色体の移入
本発明はさらに、上記の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞を提供する。
本明細書において、分化多能性細胞には、例えば胚性癌腫細胞(EC細胞、Hanaokaら,Differentiation,48:83,1991)、胚性幹細胞(ES細胞、Evansら,Nature,292:154,1981)、胚性生殖細胞(EG細胞、Matsuiら,Cell,70:841,1992)、核移植由来胚性幹細胞(ntES細胞、Wakayamaら,Science,292:740,2001)、精巣由来多能性幹細胞(mGS細胞、Kanatsu−Shinoharaら,Cell,119:1001,2004)、誘導多能性幹細胞(iPS細胞、Takahashiら,Cell,126:663,2006)などの、非ヒト哺乳動物の初期胚に注入するか或いは該初期胚と共培養することにより、未分化な状態の細胞が分化して様々な形態あるいは機能を有する体細胞に変化(分化)する上記細胞が含まれる。とりわけ、ES細胞、ntES細胞、iPS細胞などはその能力が特に高く、多くの場合生殖細胞にも寄与し、その細胞由来の子孫を作ることができる。EC細胞は主に生殖細胞癌から、ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、EG細胞は発生初期に出現する原始生殖細胞から、ntES細胞は除核した未受精卵にドナー核を核移植して、その胚盤胞の内部細胞塊から、mGS細胞は精巣由来幹細胞から、iPS細胞はマウスなどの哺乳動物由来の、繊維芽細胞などの体細胞に特定の2、3又は4因子(klf4,oct4;klf−4,oct4,sox2;klf−4,oct4,c−myc,sox2など)をコードするDNAを導入することで、得られる。
分化多能性細胞の中でも特にES細胞はマウスES細胞がよく知られているため、本発明では、マウスES細胞を好ましく使用することができる。また、マウス以外の動物種におけるES細胞又は分化多能性細胞の樹立は、ラット(Iannacconeら,Dev.Biol.,163:288,1994)、ブタ(Wheelerら,Reprod.Fertil.Dev.,6:563,1994)において報告されている。あるいは、ES様細胞として知られるiPS細胞の使用も好ましい。したがって、これらのES細胞、iPS細胞あるいは他の分化多能性細胞を受容細胞として、ヒト人工染色体を移入すれば、マウスの場合と同様に、ヒト人工染色体あるいはその断片を保持し、該ヒト人工染色体上の遺伝子を発現する非ヒト動物が作製可能である。さらに、これらの非ヒト哺乳動物を利用して、ヒトCYP3A遺伝子クラスターを発現することも可能である。上記非ヒト動物において該ヒト人工染色体が子孫伝達不可能な場合でも、非ヒト動物由来の分化多能性細胞においてヒトP450遺伝子の相同遺伝子に対応する遺伝子を破壊し、該ヒト人工染色体を導入すれば、非ヒト動物由来の内在のP450遺伝子が欠損し、かつヒトCYP3A遺伝子クラスターを発現することができる分化多能性細胞が得られる。
本発明におけるヒトP450遺伝子を含む染色体断片を移入するための受容細胞としては、上記のような分化多能性細胞株を用いることができる。
また、標識されたヒトP450遺伝子を含む染色体断片を保持する染色体供与細胞としては、1)受容細胞で選択可能なマーカーで標識されたヒト染色体を保持し、2)それ以外のヒト染色体を含まない、3)ミクロセル形成能が高い細胞が望ましい。ヒト染色体提供の材料としては、ヒト由来のあらゆる細胞株、癌細胞、初代培養細胞を用いることができるが、染色体の欠失、増幅等の異常の可能性が低く、また培養が容易な点を考慮すると正常線維芽細胞が適している。まず、1)については、ヒト細胞は、薬剤(例えばG418、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジンなど)耐性等のマーカー遺伝子を発現するベクターにより形質転換することができる。ここで用いるマーカー発現制御のためのプロモーターとしては、ヒト細胞においてのみならず、マウスES細胞のような受容細胞で効率よく働くものが望ましい。この目的には、SV40エンハンサーと単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターを連結したもの(Katohら,Cell Struct.Funct.,12:575,1987)、マウスPGK−1プロモーター(Sorianoら,Cell,64:693,1991)等を用いることができる。上記マーカー遺伝子、必要に応じてプロモーターを連結したマーカー遺伝子を含むDNA断片で、エレクトロポーレーション(石田ら,細胞工学実験操作入門、講談社、1992)等によりヒト細胞を形質転換し、マーカー遺伝子が発現する細胞を選択することにより、導入されたマーカー遺伝子が、23種46本あるヒト染色体上にランダムに挿入されたようなヒト細胞形質転換体のライブラリを得ることができる。3)については、多くのヒト正常細胞はミクロセル形成能が非常に低いので、上記の形質転換体をミクロセル形成能の高い細胞、例えば、マウスA9細胞(Koiら,Jpn.J.Cancer Res.,80:413−418,1989)と全細胞融合することにより、ミクロセル形成能を付与することができる。
受容細胞へのヒト染色体断片移入の材料としては、ヒトP450遺伝子を含むヒト7番染色体供与細胞から調製されるミクロセル、或いは、ガンマ線照射したミクロセルを用いることができる。受容細胞への移入は、(清水素行,細胞工学ハンドブック,羊土社,1992)等に記載された方法で受容細胞とミクロセルを融合することにより行う。ミクロセル供与細胞においては、ヒトP450遺伝子を含む染色体またはその断片が受容細胞において選別可能なマーカーを保持している。この中から、特異的な遺伝子マーカーや多型マーカーに基づくプライマー又は蛍光標識プローブを使用した、PCR、サザンブロット解析、FISH解析等により、ヒトP450遺伝子あるいはヒトP450遺伝子を含む染色体断片を保持する株を選択すれば、ヒトP450遺伝子を含む染色体断片を導入することが可能である。また、異なる選択マーカーを保持する複数のヒトP450遺伝子を含む染色体断片を逐次導入することにより、これらを同時に保持する受容細胞を得ることもできる。ヒトP450遺伝子を含む染色体上のマーカー(G418耐性等)により選抜された受容細胞が、供与細胞の保持していたヒトP450遺伝子を含む染色体断片を保持していることは、例えば、選抜された受容細胞から抽出したゲノムDNAを用い、プローブとしてヒト特異的繰り返し配列(L1、Alu等、Korenbergら,Cell,53:391,1988)、ヒト染色体特異的プローブ(Lichterら,Human Genetics,80:224,1988)を用いたフルオレッセンス・インサイチュ・ハイブリダイゼーション(FISH)等の染色体解析、ヒトP450遺伝子特異的プライマーによるPCR法、ヒトP450遺伝子特異的配列プローブを用いたサザン解析により検出される。
また、これに関連して、動物細胞への遺伝子導入におけるレポーター遺伝子としてオワンクラゲ由来のGFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子が知られている(例えば、Prasher,D.Cら,Gene,111:229,1992)。GFPの発光には基質は必要でなく、蛍光で検出することが可能であるので、生細胞のまま、しかも短時間でモニターすることができる。loxP組換え体のポジティブセレクションマーカーとして、GFP遺伝子を用いることができる。具体的には、プロモーターを含まないGFP遺伝子をSC20−HACベクターの一端に挿入し、7番染色体上のCYP3A遺伝子クラスターのセントロメア側の一端にはGFPの発現に必要なプロモーターを挿入する。CreによるloxP配列間での組換えが起こると、プロモーターとGFP遺伝子とが連結され、GFPが発現するようになる。この組換えDT40細胞は蛍光を発光するので、SC20−HACベクターにCYP3A遺伝子クラスターをクローニングするためのセレクションおよび該HACベクターの受容細胞でのセレクションが可能になる。
(iv)ヒトP450遺伝子(CYP3A遺伝子クラスター)を含む人工染色体を導入した非ヒト哺乳動物由来ES細胞又は分化多能性細胞からのキメラ動物の作製
本発明はさらに、上記のヒト人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒト哺乳動物を提供する。
非ヒト哺乳動物ES細胞株又は分化多能性細胞、例えばマウス細胞ES株やntES細胞株からのキメラ動物の作製は、相澤慎一,バイオマニュアルシリーズ8ジ−ンターゲティング,羊土社,1995、等に記載された方法で行うことができる。効率的なキメラ動物の作製を行うための宿主胚の発生時期、系統等の選択については、それぞれのES細胞株についてすでに検討された条件を用いることが望ましい。例えば、マウスES細胞株であるCBA×C57BL/6 F1由来のTT2細胞(野生色、Yagiら,Analytical Biochemistry,214:70,1993)については、Balb/c(白色、日本クレア社)又はICR(日本クレア社)由来の8細胞期胚を宿主胚として用いることが望ましい。
具体的には、上記の方法で作製した本発明の人工染色体ベクターを保持するCHO細胞からミクロセルを精製し、DMEM培地中、ポリエチレングリコール(例えばPEG1000)の存在下で、ミクロセルとES細胞またはntES細胞との融合を行う。得られたES細胞またはntES細胞クローンを、雌雄交配により得られた8細胞期胚(上記)に注入し、注入胚を仮親に移植し、キメラ動物を誕生させる。好ましい分化多能性細胞は非ヒト哺乳動物由来のES細胞またはntES細胞である。さらに好ましいES細胞またはntES細胞は、マウスES細胞またはマウスntES細胞である。
好ましい実施形態においては、ヒトP450遺伝子を効率良く発現させるために、かつヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子群による薬物代謝をよりヒト型にするために、非ヒト哺乳動物内在性のCYP3A遺伝子群を破壊することができる。すなわち、ヒト遺伝子の導入を行った動物に対して、内在性CYP3A遺伝子の破壊を行うか、或いはこの逆に、内在性のCYP3A遺伝子群を破壊した動物にヒト遺伝子の導入を行うことも可能である。
本発明においては、このようにして得られる非ヒト哺乳動物は、本発明の人工染色体ベクターを保持し、ヒトP450遺伝子の発現を可能にする、キメラ動物或いはその子孫動物である。また、子孫動物は、上記キメラ動物と、それと同種の野生型動物との交配により得られる動物であってもよいし、或いは上記キメラ動物と、それと同種の動物の対応遺伝子の破壊された動物との交配により得られる動物であってもよい。
好ましい実施形態によれば、本発明の非ヒト哺乳動物においては、上記ヒトCYP3A遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームP450遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している。
さらに、好ましい実施形態によれば、本発明の非ヒト哺乳動物は、マウスであり、キメラマウス及びその子孫マウスの両方を含む。このようなマウス又はその子孫は、本発明の人工染色体ベクターを保持すること、マウスCyp3a遺伝子クラスターを欠損していること、及びヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする。
本発明によれば、ES細胞(Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失)からキメラ非ヒト哺乳動物を作製し、野生型動物と交配させ、Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失したF1動物を得る。このF1動物どうしを交配させ、Cyp3a遺伝子クラスターがホモに欠失したF2動物を得る。一方、ヒトCYP3A遺伝子クラスターを含むヒト人工染色体を保持するキメラ非ヒト動物と野生型動物を交配させ、該ヒト人工染色体を保持するF1動物を得る。このF1動物とCyp3a遺伝子クラスターがホモに欠失した上記F2動物とを交配させ、Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持するF2動物を得る。このF2動物とCyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失したF2動物とを交配させることによって、最終的に目的の非ヒト哺乳動物(マウスCyp3a遺伝子クラスターがホモに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持)が得られる。
(v)キメラ非ヒト哺乳動物又はその子孫におけるヒトP450遺伝子(CYP3A遺伝子クラスター)を含む人工染色体の保持およびヒト遺伝子発現の確認
ES細胞を注入した胚から誕生した非ヒト哺乳動物におけるES細胞の貢献率は、その毛色によりおおまかな判定ができる。しかし、毛色に貢献がみられないからといって他の組織で貢献がないと判断はできない。より詳細なキメラ動物各組織におけるヒト染色体の保持は、各組織より抽出されたゲノムDNAを用いたサザン解析、PCR、FISH等によって確認することができる。導入された染色体上のヒトP450遺伝子の発現は以下のようにして確認される。ヒトP450遺伝子を含む染色体由来のmRNAの発現は、各組織由来のRNAを用いたRT−PCR法(Kawasakiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5698,1988)、ノーザンブロット法(Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,Johen Willy & Sons,1994)により検出される。タンパク質レベルの発現はウェスタンブロット法(Ausubelら,前記)あるいは、キメラ動物肝ミクロソームを用いたテストステロン6β水酸化活性測定等により検出される。さらに、キメラ動物細胞中でのヒトP450遺伝子群を含む染色体の保持および該染色体上の遺伝子の発現が、キメラ動物由来初代培養細胞での薬剤耐性マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子発現による耐性細胞の出現により確認できる。
本発明の非ヒト哺乳動物において、ヒトP450遺伝子群を含む人工染色体を保持するES細胞が、そのキメラ動物の生殖細胞に分化した場合、その子孫にも導入したヒトP450遺伝子群を含む染色体断片が認められ、その染色体断片上の遺伝子を発現する。
さらにまた、上記キメラ動物と正常動物の交配により、ヒトP450遺伝子群を含むヒト染色体が子孫伝達したかどうかは、子孫動物の組織、器官又は細胞より抽出されたゲノムDNAを用いたサザン解析、PCR、FISH等によって同様に確認することができる。また、子孫伝達動物における個体発生段階などの時期特異的、組織特異的遺伝子発現の確認もまた上記と同様に行うことができる。
(vi)子孫伝達非ヒト哺乳動物における遺伝子発現誘導の確認
遺伝子発現の確認については、上記(v)の方法と同様である。例えば遺伝子発現の誘導はRifampicinやPCNで誘導される(後述の実施例6参照)。
(vii)非ヒト哺乳動物内在性P450遺伝子群のノックアウト動物の作製
ノックアウトベクターおよびノックアウトES細胞は、後述の実施例7、或いはP.Hastyら,Nature,1991,350:243−246、M.Zijlstraら,Nature,1989,342:435−438などに記載の方法により作製可能であり、また、ノックアウト動物の作製については上記(iv)の方法と同様である。
簡単に説明すると、内在性の目的遺伝子の機能を不活性化するために通常使用される方法の1つが、ジーンターゲッティング法である。該遺伝子の複数のエクソンを含む約数kbのゲノムDNAの1つのエクソンの内部に例えばneor遺伝子などの外来遺伝子を挿入した組換えDNAを作製し、これを適当なベクターに挿入することによってノックアウトベクターを作ることができる。ベクターDNAをES細胞に導入し、G418耐性細胞を選別し、相同組換えを起こした細胞を例えばサザンブロット解析によって選抜したのち、胚盤胞に注入し、得られた胚を、同種の仮親非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、キメラ動物を誕生させる。キメラ動物同士、又はキメラ動物と野生型動物間、の交配によってホモ接合体であるノックアウト動物を得ることができる。
なお、マウスの場合、内在性(又は「固有の」)P450遺伝子を含むCyp3a遺伝子クラスターは、Cyp3a11、Cyp3a13、Cyp3a25、Cyp3a41などのP450遺伝子を含み、該クラスターはマウス5番染色体上に存在する(例えば、Cyp3a11は、マウスChr5. 78.0cM、Cyp3a13は、マウスChr5. 73.7cMにそれぞれ存在する)。
(viii)ノックアウト非ヒト哺乳動物における内在性P450遺伝子群の欠損の確認
作製されたノックアウト動物におけるES細胞の貢献率は、ヒト染色体導入キメラ動物と同様にその毛色によっておおよその判断ができる。さらに、ノックアウト動物より抽出したゲノムDNAを用いたサザン解析、PCR等により内在性遺伝子の欠損を確認することが望ましい。また、ターゲティング部分にGFPを挿入した場合は、動物個体においても発現が認められるため、ES細胞におけるセレクションと同様に、蛍光によって、容易にノックアウト動物の選別が可能となる。
(ix)内在性P450遺伝子群が欠損されたかつヒトP450遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物の作製
ヒトP450遺伝子群を含むヒト染色体を保持し、非ヒト哺乳動物内在性P450遺伝子群を欠くヒトP450保持動物は、上記の方法によって作製された、ヒトP450遺伝子群を含むヒト染色体を保持するキメラ動物あるいはその子孫と、内在性P450遺伝子をクラスターごと欠損させたキメラ動物あるいはその子孫を交配することにより得られる。「ヒト染色体の保持」、「内在性P450遺伝子の欠損」は共に、基本的にメンデルの法則に従って両者の遺伝的要素が伝達すると考えられる。
動物の交配方法には種々のパターンが考えられるが、具体的には以下のように実施可能である。まず、Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失したキメラ動物を野生型動物と交配させ、Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失したF1動物を得る(F1動物A)。このF1動物Aどうしを交配させ、Cyp3a遺伝子クラスターがホモに欠失したF2動物を得る(F2動物B)。一方、ヒトCYP3A遺伝子クラスターを含むヒト人工染色体を保持するキメラ動物と野生型動物を交配させ、該ヒト人工染色体を保持するF1動物を得る(F1動物C)。F2動物BとF1動物Cを交配させ、Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持するF2動物を得る(F2動物D)。このF2動物DとF2動物Bとを交配させることによって、最終的な動物(動物Cyp3a遺伝子クラスターがホモに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持)が得られる。
さらに、本発明によって、内在性P450遺伝子群が欠損されたかつヒトP450遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物から、上記のヒト人工染色体ベクターを保持する非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、ヒトCYP3A遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームP450遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞を作製することも可能である。分化多能性細胞の例は、上記のように、胚性癌腫細胞(EC細胞、Hanaokaら,Differentiation,48:83,1991)、胚性幹細胞(ES細胞、Evansら,Nature,292:154,1981)、胚性生殖細胞(EG細胞、Matsuiら,Cell,70:841,1992)、誘導多能性幹細胞(iPS細胞、Takahashiら,Cell,126:663,2006)など、とりわけ核移植由来胚性幹細胞(ntES細胞、Wakayamaら,Science,292:740,2001)、例えばマウス由来ntES細胞である。具体的には、後述の実施例13〜16に説明されている。
(x)ヒトP450タンパク質の製造方法
本発明はさらに、上記の非ヒト哺乳動物或いは上記のマウス又はその子孫に由来する、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現が可能であることを特徴とする、細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織を提供する。
本発明はまた、上記の非ヒト哺乳動物、上記のマウス又はその子孫、或いは上記の細胞、器官又は組織において、これらが保持するヒトチトクロームP450遺伝子を発現させて生物学的に活性を有するヒトチトクロームP450を産生させ、該ヒトチトクロームP450を回収することを含む、生物学的活性を有するヒトチトクロームP450の製造方法を提供する。
なお、ヒトP450のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、GenBank Accession Nos.NM_017460(CYP3A4遺伝子)、NM_000777(CYP3A5遺伝子)、NM_000765(CYP3A7遺伝子)、NM_0022820(CYP3A43遺伝子)として登録されている。
上記のようにして得られるキメラ動物を利用して生物学的に活性のあるヒトP450タンパクをその器官、組織、細胞から得ることができる。例えば、キメラ動物あるいはその子孫の肝ミクロソームからヒトP450を含む分画を抽出し、精製することでヒトのP450タンパクを抽出できる。あるいは、ヒトP450遺伝子を含む染色体を保持するキメラ動物あるいはその子孫の組織から細胞株を樹立し、培養することでその培養物からヒトP450タンパクを回収することが可能である。
タンパク質の精製は、公知の技術を組み合わせて行うことができる。そのような精製法には、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、HPLC、FPLCなどのクロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動、限外ろ過、硫安分画、透析などが含まれる。
ヒトP450の同定は、市販のアッセイキットを用いて行うことができる。そのようなアッセイキットの例は、P450−GloTMCYP3A4 Assay、P450−GloTMCYP3A7 Assay(いずれもPromega)である。このアッセイ法は、P450の基質であるルシフェリン誘導体をP450酵素によりルシフェリンに変換したのち、ルシフェラーゼ反応により生じた発光量に基づいてP450酵素活性を測定する方法からなる。
(xi)薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝の試験方法
本発明は更に、上記の非ヒト哺乳動物、上記のマウス又はその子孫、或いは上記の細胞、器官又は組織に薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝の試験方法を提供する。
本発明のキメラ動物あるいはその子孫、或いは、それらと動物内在性P450遺伝子群を欠損させたノックアウト動物とを交配させてできたヒトP450導入動物は、その体内で本来ヒトの生体内で発現しているのと同じパターンでヒトP450を発現していると考えられるため、特定の薬物を投与することで個体レベルでの薬理効果、毒性、がん原性、催奇形性、薬物動態を研究するための実験動物としての利用価値が高い。さらに、ヒトにおける薬物の代謝メカニズムや組織ごとの毒性について、薬物をヒトに投与することなく知ることができる。動物における代謝解析では、肝ミクロソームを用いたトリアゾラム(triazolam)水酸化活性測定やテストステロン6β水酸化活性測定等によりヒトCYP3Aで代謝される薬物の代謝活性が検出されうる。この試験方法の具体例は、後述の実施例12、図22及び図23に記載されている。
(xii)キメラ率及び保持率
上述したように、本発明により、ヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子クラスター領域を含む約3Mb及び約1Mb領域をSC20−HACベクターに転座、クローニングして得られたヒト人工染色体(それぞれCYP3A−HAC及びCYP3A−HACΔ)を作製し、次いでCYP3A−HACおよびCYP3A−HACΔの各々をマウス個体へ導入し、キメラマウスにおけるキメラ率について#7−HAC(Kuroiwaら,Gene Ther.,9:708,2002)と比較し、キメラ率および染色体保持率の向上とヒト人工染色体の効率的な子孫伝達の達成を確認した。
キメラ率はキメラ動物におけるES細胞の組織(体毛)への寄与率を示し、通常キメラ動物の体表面におけるES細胞に由来する体毛色の占める割合を視覚的に評価することにより決定されうる。一方で保持率は導入染色体の組織への寄与率を示す。ヒト染色体としての安定性があり、かつ発生に悪影響を及ぼす因子がその染色体上に存在する場合、高いキメラ率のマウスは発生障害を引き起こし致死につながることから、生まれてこない。しかし、ヒト染色体上に発生に悪影響を及ぼす因子があっても安定性がなければ、高キメラマウスが生まれてくる可能性があり、その場合ヒト染色体は高頻度で維持されない。
ここで言う安定性は、個々の染色体のセントロメア機能や個々の染色体上に存在する遺伝子(例えば細胞増殖を抑制する因子)に影響されうる。
したがって、安定的な子孫伝達個体を得るためには高キメラマウス(体細胞におけるES細胞の寄与率の高いキメラマウス個体)に高い保持率で外来染色体が維持されている必要がある。
ヒト7番染色体断片又は#7−HACを保持する高いキメラ率のキメラマウスはこれまでに作製されているが、安定的にヒト7番染色体断片もしくは#7−HACが子孫に伝達することはなかった(国際公開第WO01/011951号;Kuroiwaら,Gene Ther.,9:708,2002)。ヒト7番染色体断片もしくは#7−HACを保持する高いキメラ率のキメラマウスにおいて、外来染色体の子孫伝達が観察されなかったことは導入染色体の組織への寄与率が低かった可能性が示唆される。
本発明により、CYP3A−HACあるいはCYP3A−HACΔによるCYP3A遺伝子クラスターを保持するトランスクロモソミック非ヒト動物(例えば、マウスなどの哺乳動物)の効率のよい作出が可能になる。これは、医薬品の候補となった薬剤の毒性スクリーニングや食品の機能性や安全性のための非ヒト動物として有用であると考えられる。CYP3A−HACあるいはCYP3A−HACΔトランスクロモソミックマウスは異種染色体断片の子孫伝達が可能であるので、交配により均一な形質を持ったトランスクロモソミックマウスの大量生産が可能になるだろう。Yuらの報告(Endocology 146:2911−2919)では、ヒトCYP3A遺伝子クラスターの一部(CYP3A4)を含む細菌人工染色体(BAC)を導入したトランスジェニックマウスが構築された。しかし、当該マウス系統にて発現するCYP3A4遺伝子は成体期に発現する遺伝子であり、胎児期に発現するCYP3A7や他のCYP3A遺伝子クラスターであるCYP3A5やCYP3A43などを含まない。従って、該マウス系統で発現するCYP3AはCYP3A4に限定的であると想像される。さらに導入されているBACコピー数や導入部位は同定されておらず、ヒトと同じ生理的発現制御を受けているとは言い難い。また、Herwaardenらの報告(Herwaardenら,J.Clin.Invest.,117:3583−3592,2007)ではCyp3a遺伝子ノックアウトマウスを作製し、さらにヒトのCYP3A4遺伝子を肝臓または小腸に発現させたマウスを作製した。しかし、これらのマウスでは肝臓または小腸特異的なプロモーター下流にヒトCYP3A4遺伝子を繋いで強制的に発現させており、ヒトと同じ生理的発現制御を受けているとは言い難い。
本明細書で開示されるヒトCYP3A遺伝子クラスターを発現するマウス系統においては、ヒトと同様にCYP3A遺伝子クラスターの時期特異性発現や組織特異性発現、発現誘導能等がより忠実に再現される。例えば、CYP3A4やCYP3A7が含まれるため成体期および胎児期のCYP3A発現をヒトと同様に検出することができる。誘導剤の例は、RifampicinやPCN(Pregnenolone 16α−carbonitrile)である。
これらのヒトCYP3A遺伝子クラスター発現トランスクロモソミックマウスを適当な誘導剤により発現誘導することにより、その肝臓より活性の高いミクロゾーム・S9が得られる。これらのS9は薬品や化学品や食品の代謝研究に利用できる。
さらにまた、上記のようにして得られるトランスクロモソミック非ヒト動物細胞や動物を利用して、外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することにより、生物学的に活性な物質を製造することができる。具体的には、トランスクロモソミック非ヒト動物個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後、発現産物を動物の肝臓、小腸などから回収することができる。
また、トランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの(例えば、肝臓由来幹細胞)などを、外来染色体またはその断片上の遺伝子が発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物を培養物から回収することができる。
あるいはまた、これらトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものから抽出した外来染色体もしくはその断片、この外来染色体もしくはその断片を構成するDNA、またはトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものに保持された外来染色体もしくはその断片に由来するcDNAを、動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞(例えば、CHO細胞、BHK細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、パン酵母細胞、SF9細胞、HEPG2細胞等)に導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物を培養物から回収することができる。生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、P450、特にヒトCYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43などを挙げることができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1
ヒトCYP3A遺伝子クラスター領域周辺(AC004922−ヒトCYP3A遺伝子クラスター−AF006752)3MbをSC20−HACベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体CYP3A−HACの構築
(A)ヒト7番染色体のAC004922へのloxP配列の部位特異的挿入
(A.1)ターゲティングベクターpNPloxPHygの作製
ヒト7染色体上のCYP3A遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側(約300Kbセントロメア側)に位置するAC004922領域にCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターpNPloxPHygを以下のようにして作製した。まず、AC004922ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。
loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV901(Lexicon genetics)を用いた。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGene Amp 9600を、TaqポリメラーゼはLATaq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃1分の熱変性後、98℃20秒、68℃7分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースK(ギブコ)処理した後、CHROMASPIN−TE400(クローンテック)でゲル濾過した。その後、制限酵素BamHI(ベーリンガー)およびEcoRI(ニッポンジーン)およびBglII(ニッポンジーン)で切断しCHROMASPIN−TE1000(クローンテック)でゲル濾過した。このPCR断片(3.7kbおよび3.0kb)をV901プラスミドのEcoRIとBamHI又はBglIIサイトにクローニングした(V901−NP21)。次に、V901−NP21を制限酵素AscI(NEB)で切断し脱リン酸化後、カセットベクターploxPhyg(Kuroiwaら,Nature Biotech.18:1086,2000)から制限酵素AscIでloxPを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションした。loxP配列の方向がクローニングしたAC004922ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターpNPloxPHygとした。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは14.1kbである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図4aに示す。
(A.2)トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
WO01/011951に記載された方法で作製されたヒト7番染色体断片(AF006752座で部位特異的に切断されている)を保持するニワトリDT−40細胞(クローンDF141)に上記(A.1)で作製したターゲティングベクターpNPloxPHygをトランスフェクションし、AC004922ゲノム領域へのloxP配列の挿入を試みた。
ニワトリDT−40細胞の培養は10%ウシ胎児血清(ギブコ、以下FBSで記す)、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10−4M 2−メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で行った。約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotII(宝酒造)で線状化したターゲティングベクターpNPloxPHygを25〜30μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット(バイオラッド)に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー(バイオラッド)にセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、24時間培養した。24時間後、ハイグロマイシンB(1.5mg/ml)を含む培地に交換し、96穴培養プレート3枚に分注して約2週間の選択培養を行った。5回のトランスフェクションで得た合計96個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:DT40(NP))。
(A.3)相同組換え体の選別
(A.3.1)PCR解析
ハイグロマイシンB耐性クローンからPuregene DNA Isolation Kit(Gentra System社)を用いてゲノムDNAを抽出して、以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。
以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGene Amp 9600を、TaqポリメラーゼはLATaq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃ 1分の熱変性後、98℃ 10秒、68℃ 4分を35サイクル行った。96クローンをスクリーニングした結果、36クローンが相同組換え体として同定された(組換え頻度37.5%)。
(A.3.2)サザンブロット解析
上記PCR解析にて組換えを確認した6クローンについて以下のようにサザンブロット解析を行った。このゲノムDNAを制限酵素EcoRI(宝酒造)で処理し、0.8%アガロースゲル中で電気泳動し、GeneScreen PlusTMハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン(NENTM Life Science Products,Inc.)へアルカリブロッティングした。このフィルターに対してAC004922中の遺伝子配列をPCRにより増幅したNPpプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の同定を行った(図4)。NPpプローブの作製は以下のプライマーを用いDF141のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、そのPCR産物を鋳型としてランダムプライミングによる32P標識DNAプローブを作製した(アマシャム、添付のプロトコールに従った)。
NPpプローブ作製用プライマー:
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEX Taq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、93℃5分の熱変性後、93℃1分、54℃1分、72℃1分を1サイクルとして35サイクルで行った。サザンハイブリダイゼーションにより、非相同組換え体では約10.9kb、相同組換え体では約8.1kbのバンドが検出されると予測された(図4b)。サザンハイブリダイゼーションの結果、6クローン中すべてのクローンが目的の相同組換え体であった(NPクローンと呼ぶ)。
(A.3.3)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。上記A.3.2で組換えを確認したクローンのうち6クローンをヒトcot−1 DNAおよびハイグロマイシンをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト7番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、7q22付近にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。結果を図3a−c示す。図3aはDT40(#7)、図3bはDT40(DF141)、図3cはDT40(NP25)クローンを示す。
(B)ヒト7番染色体断片とSC20−HACベクターの両者を保持するDT−40ハイブリッドの作製
まず、最初に上記A.3.2で得られたクローンNP25をSC20−HACベクターを保持するDT−40細胞Rクローン(Kuroiwaら,Nature Biotech.18:1086,2000)と細胞融合することによって、ヒト7番染色体断片と14番染色体断片SC20断片の両者を保持するDT−40ハイブリッドを作製した。
(B.1)細胞融合およびダブル薬剤耐性クローンの単離
RクローンはブラストサイジンS(10μg/ml)含有RPMI1640培地で、NP25クローンはハイグロマイシンB(1.5mg/ml)含有RPMI1640培地で培養した。1〜2×107個の両クローンを混合し遠心後、無血清RPMI1640培地で2回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め37℃で保温しておいた50%PEG1500(ベーリンガー)0.5mlを静かに加え、約2分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清RPMI1640培地1mlを1分間かけてゆっくり加え、続いて無血清RPMI1640培地9mlを約3分間かけて加え、37℃で10分間静置した。その後、1,200rpmで5分間遠心し、血清を含むRPMI1640培地で24〜48時間培養した。その後、ブラストサイジンS(10μg/ml)・ハイグロマイシンB(1.5mg/ml)含有RPMI1640培地に交換し、24穴培養プレート5枚に分注し、3〜4週間培養した。5回の細胞融合で得た合計8個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:DT40(RP))。
(B.2)相同組換え体の選別
(B.2.1)PCR解析
ダブル薬剤耐性クローンからゲノムDNAを抽出して、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト14番染色体断片(SC20−HACベクター)、7番染色体断片の2本が保持されていることを確認した。
ヒト14番染色体(SC20染色体ベクター)検出用プライマー:
ヒト7番染色体(CYP3A遺伝子クラスター)検出用プライマー:
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEX Taq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTPs(dATP,dCTP,DGTP,dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃1分の熱変性後、98℃10秒、56℃30秒、72℃30秒を35サイクル行った。PCRの結果、8クローン中6クローンが全てのプライマーで陽性であった。
(B.2.2)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析方法はKuroiwaら(Nature Biotech.18:1086,2000)に従った。上記B.2.1で組換えを確認したクローンのうち6クローンをヒト14番染色体特異的プローブ(ローダミン標識)とヒト7番染色体特異的プローブ(FITC標識)を用いたFISH解析を行ったところ、SC20−HACベクターとヒト7番染色体断片は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、独立に1本ずつシグナルが検出されたことから細胞融合が起こったことが確かめられた。結果を図3d−eに示す。図3dはRクローン、図3eはRP13クローンを示す。
以上の結果から、これらの6ハイブリッドクローンはヒト14番染色体断片(SC20−HACベクター)、7番染色体断片の2本を保持していると判断できた。
(C)DT−40ハイブリッドクローン(RP13)におけるヒト7番染色体領域(AC004922−CYP3A遺伝子クラスター−AF006752)3MbのSC20−HACベクターへの部位特異的転座
Kuroiwaら(上記,2000)の方法に従って、ヒト染色体間の部位特異的転座はCre−loxPシステムを用いることによって行った。
上記と同様にして、制限酵素KpnI(ベーリンガー)で線状化したCre組換え酵素安定発現ベクターpBS185hisD(Kuroiwaら,Nature Biotech.18:1086,2000)をRP13ハイブリッドクローンにトランスフェクションし、24穴プレートへ分注し、ヒスチヂノール(1mg/ml)存在下で約2週間選択培養した。それぞれのウェルからゲノムを抽出し、以下の2組のプライマーを用いたネステッド(nested)PCRを行い、SC20−HACベクターとヒト7番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEX Taq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。まず、第一のPCRは、94℃1分の熱変性後、98℃10秒、61℃30秒、72℃1分をPGK−1とGFP−1をプライマーとして35サイクル行った。この反応液の一部を鋳型として、98℃ 10秒、59℃ 30秒、72℃ 0秒をPGK−2とGFP−2をプライマーとして35サイクル行った。PCR陽性で転座が確認できたウェル中の細胞プールを107細胞数になるまで増やし、プールを5% FBSと1μ/mlのプロピディアムアイオダイド(PI)を添加したPBS(リン酸緩衝溶液)4mlに懸濁し、FACSVantage(ベクトン・ディッキンソン)により解析した。Kuroiwaら(前出)の報告にあるように、loxP間での組換え転座が起こるとGFP遺伝子が再構築され発現するので転座を起こした細胞をFACSで検出できる。GFP陽性と思われる細胞画分のソーティングを2回繰り返した。毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシンB(1.5mg/ml)含有RPMI1640培地で行った。その結果、GFP陽性細胞を98〜99%の純度で濃縮することができた。
次に、FACSでクローニングされたGFP陽性クローン(RPC13F2)において、期待通りloxP間で組換えが起こっていることを前記PGK−2とGFP−2をプライマーとして用いたPCRによって確認した。さらに、クローンRPC13F2に対して、ヒト14番染色体特異的プローブ(ローダミン標識)とヒト7番染色体特異的プローブ(FITC標識)を用いたFISH解析(黒岩ら、上記)を行った結果、確かにヒト7番染色体領域がSC20−HACベクター(ヒト14番染色体断片)に転座した人工染色体の存在が確認された(図3f)。
以上の結果から、クローンRPC13F2において、CYP3A遺伝子クラスター領域周辺(AC004922−CYP3A遺伝子クラスター−AF006752)3MbがSC20−HACベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体CYP3A−HACが構築できたと結論付けた。
(D)CYP3A−HAC含有DT−40ハイブリッド細胞のCHO細胞へのCYP3A−HACの導入
Kuroiwaら(上記)の報告にあるように、構築されたHACをマウスES細胞へ導入するために、まずCHO細胞への導入を試みた。
DT−40ハイブリッドクローンRPC13F2をT225フラスコ(スミロン)8本で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、1% ニワトリ血清、10−4M 2−メルカプトエタノール、0.05μg/mlコルセミドを添加したRPMI1640培地に交換し、さらに24時間培養してミクロセルを形成させた。細胞を24mlの血清RPMI1640培地に懸濁し、予め100μg/mlのポリ L−リジンでコートした遠心用25cm2フラスコ12本(コーニング)に2mlずつ分注し、37℃で1時間培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、1700rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。一方、約107個のCHO細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清DMEM培地で2回洗浄し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。再度、ミクロセルを1700rpm、10分間遠心し、上清を除かずに先のCHO懸濁液5mlを静かに重層した。遠心後、培養液を除去し、PEG1500溶液(ベーリンガー)0.5mlを加え、約2分間ピペットで激しく攪拌した。その後、無血清DMEM培地10mlを約3分間かけてゆっくり加え、37℃で10分間静置した。遠心後、10%FBS添加F12培地(ギブコ)に細胞を懸濁し、24穴培養プレート5〜6枚に分注し、37℃で24時間培養した。その後、G418 800μg/ml含有F12培地に交換し、3〜4週間選択培養した。
G418耐性クローンからゲノムDNAを抽出してCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーおよびPGK−2、GFP−2プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、CYP3A−HACを保持するCHOクローンを同定した(例えば、CHO/CYP3A−HAC4,25)。さらに、上記PCRで陽性だったクローンに対して、ヒトCOT1DNAをプローブに用いてFISH解析を行った結果、視覚的にCYP3A−HACの存在を確認した。これらの結果から、CYP3A−HACを保持するCHO細胞クローンが得られたと結論付けた(図3g)。
(E)CHO細胞からのCYP3A−HACのマウスES細胞への移入
CYP3A−HACを保持するキメラマウスを作製するために、上記(D)で得られたCYP3A−HACを保持するCHO細胞からマウスES細胞(野性型TT2F)へミクロセル法により導入した。
Tomizukaら(Nature Genet.16:133,1997)の方法に従い、約108個のCYP3A−HACを保持するCHO細胞(CHO/CYP3A−HAC4,25,32,33など)からミクロセルを精製し、DMEM 5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM 5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5g PEG1000(和光純薬)、1ml DMSO(シグマ)をDMEM 6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM 10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレ(コーニング)3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、CHO/CYP3A−HAC4からは25クローン、CHO/CYP3A−HAC25からは13クローン、CHO/CYP3A−HAC32からは28クローンがCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、ヒトCOT1DNAプローブを用いてFISH解析(Tomizukaら,Nature Genet.16:133,1997)を行った結果、COT1プローブにより特異的に検出されるCYP3A−HACの存在が66クローン中、52クローンで確認された。このうちマウスの核型が正常なクローンは28クローンであった。以上のことから、CYP3A−HAC保持TT2F細胞が28クローン得られたと結論付けた(図3h)。
(F)ヒト人工染色体CYP3A−HACを保持するキメラマウスの作製
上記(E)で得られたES細胞クローンを用いてTomizukaらの方法(Nature Genet.16:133,1997)でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCH(ICR)(白色、日本クレア社より購入)の雌雄交配により得られる8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野性型TT2F/CYP3A−HACクローン(例えばF8/CYP3A−HAC−1および18、上記(E)で取得)を注入した9410個の胚を仮親に移植した結果、484匹のキメラマウス(毛色に濃茶色の部分の認められる)が誕生した。うち29匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100%の個体であった。すなわち、ヒト人工染色体CYP3A−HACを保持するES細胞株(TT2F)はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
(G)ヒト人工染色体CYP3A−HACを保持するES細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
上記(F)でTT2F/CYP3Aクローン(F8/CYP3A−HAC−1および18)より作製されたキメラマウス(キメラ率約80%)の尻尾からTomizukaらの報告(Nature Genet.16:133,1997)に記された方法でゲノムDNAを調製し、CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A−HACの保持を検討した。その結果、2種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるCYP3A−HACの保持が確認された。また、キメラ率約80%のキメラマウス2匹の肝臓組織を用いてShinoharaらの報告Human Molecular Genetics,:10,1163−1175,2001)に記された方法でヒトCOT1DNAをプローブに用いてFISH解析を行った結果、視覚的にCYP3A−HACの存在を確認し、そのCYP3A−HACの保持率は両個体とも70%であり、キメラ率とほぼ一致した。キメラ率はES細胞の組織(体毛)への寄与率を示し、保持率は導入染色体の組織への寄与率を示す。キメラ率が高く、保持率も高いキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持ES細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。すなわちCYP3A−HACの使用により、CYP3A遺伝子を含むヒト染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
上記(F)で作製された雌キメラマウス(キメラ率約100%)4匹をMCH(ICR)(白色、日本クレア社より購入)雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した40匹の仔マウスのうち、29匹がES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちCYP3A−HACを保持するES細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス29匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製した。得られたDNAについてCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A−HACの保持を検討した結果、全てにおいて2種のプライマー共に陰性であり、キメラマウス子孫におけるCYP3A−HACの保持は確認されなかった。すなわち、キメラ率、保持率が高いキメラ個体において子孫伝達が観察されなかったことはCYP3A−HAC上に発生あるいは生殖細胞分化に悪影響を及ぼすヒト遺伝子が存在することが示唆された。
実施例2
ヒトCYP3A遺伝子クラスター領域周辺(AC004922−ヒトCYP3A遺伝子クラスター−AC073842)1MbをSC20−HACベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体CYP3A−HACΔの構築
上記CYP3A−HACにおいては、CYP3A遺伝子クラスター−AF006752間に約2Mbの余分な領域がまだ残存している。そこで、厳密に余分な染色体領域を取り除き、CYP3A遺伝子クラスター領域周辺のみを転座クローニングする目的で、AC00492−ヒトCYP3A遺伝子クラスター−AC073842領域約1MbをSC20−HACベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体CYP3A−HACΔを構築することを試みた。
(A)CYP3A−HACのDT40細胞への移入
染色体改変を効率的に行うために、CYP3A−HACをCHO細胞から相同組換え頻度の高いDT40細胞へ移入した。Tomizukaら(Nature Genet.,16:133−143,1997)の方法に従い、約108個のCYP3A−HACを保持するCHO細胞(CHO/CYP3A−HAC32、実施例1記載)からミクロセルを精製し、DMEM 5mlに懸濁した。1〜2×107個のニワトリDT40細胞をDMEMで2回洗浄後、DMEM 5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1500rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、PEG1500溶液(ベーリンガー)0.5mlを加え、約2分間、十分攪拌した。その後、DMEM 10mlをゆっくり加え、1500rpmで10分間遠心し、10%ウシ胎児血清(ギブコ、以下F BSで記す)、1%ニワトリ血清(ギブコ)、10−4M 2−メルカプトエタノール(シグマ)を添加したRPMI1640培地(ギブコ)中で培養した。24時間後、培地を1mg/mlのG418を含む培地に交換し、約3週間選択培養した。薬剤耐性コロニーからゲノムDNAを抽出してCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いてPCRを行った。
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃1分の熱変性後、98℃10秒、56℃30秒、72℃30秒を1サイクルとして35サイクル行った。その結果、約5クローン中、2クローンがCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマー陽性であった。さらに、ヒトCOT1DNAプローブを用いてFISHを行った結果、CYP3A−HACが独立して存在していることが分かった。以上の結果から、CYP3A−HACを保持するニワトリDT40細胞(以下、DT40(CYP3A−HAC)と略記)がクローニングできた。
(B)CYP3A−HAC上のヒト7番染色体領域AC073842での部位特異的切断
(B.1)ターゲティングベクターpTELhisD−PTの作製
ヒト7染色体上のCYP3A遺伝子座のごく近傍かつテロメア側(約150Kbテロメア側)に位置するAC073842領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターpTELhisD−PTを以下のようにして作製した。まず、AC073842ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGene Amp9600を、TaqポリメラーゼはLATaq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃1分の熱変性後、98℃20秒、68℃8分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースK(ギブコ)処理した後、CHROMASPIN−TE400(クローンテック)でゲル濾過した。その後、制限酵素BamHI(ベーリンガー)およびBglII(ニッポンジーン)で切断し、CHROMASPIN−TE 1000(クローンテック)でゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpTELhisD(Kuroiwaら,Nature Biotech.,20:88,2002)のBamHI部位にクローニングした。AC073842ゲノムシークエンスの方向はテロメア→セントロメアなので、クローニングされたAC073842ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターpTELhisD−PTとした(図5)。
最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは14.4kbである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図5に示した。
(B.2)トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
上記と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpTELhisD−PTを制限酵素SrfI(東洋紡)で線状化後、上記で作製したクローンDT40(CYP3A−HAC)−4にトランスフェクションし、ヒスチジノール(0.5mg/ml)を含む培地に交換し、96穴培養プレート10枚に分注して約2週間の選択培養を行った。5回のトランスフェクションで得た合計433個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:DT40(CYP3A−HACΔ))。
(B.3)相同組換え体の選別
(B.3.1)PCR解析
ヒスチジノール耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEX Taq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、93℃5分の熱変性後、93℃1分、56℃1分、72℃1分を1サイクルとして35サイクルで行った。次に上記プライマーで検出されなかった433クローンのうちの11クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをPCRにて確認した。そのプライマーの位置を図5に示す。配列は以下のとおりである。
上記プライマー及び上記B.1のプライマーの組み合わせ(PT2R−hisD2、PT2R−hisD3)によりPCRはLATaq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTPS(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃1分の熱変性後、98℃20秒、68℃8分を35サイクル行った。11クローンのうち部位特異的に組換えが起こった9クローンでのみ約8kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40、DT40(CYP3A−HAC)ではバンドは検出されなかった。
(B.3.2)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。上記B.3.1で組換えを確認したクローンのうち7クローンをヒトcot−1 DNAおよびヒスチジノールをプローブにしてFISH解析を行ったところ、CYP3A−HACΔは全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、CYP3A−HACΔ末端にヒスチジノール由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の結果から、クローンDT40(CYP3A−HACΔ)214において、CYP3A遺伝子クラスター領域周辺AC004922−ヒトCYP3A遺伝子クラスター−AC073842)1MbがSC20−HACベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体CYP3A−HACΔが構築できたと結論付けた。
CYP3A−HACΔを保持するニワトリDT40(CYP3A−HACΔ)214は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に平成19年(2007年)10月30日付けで国際寄託され、受託番号 FERM BP−10928が与えられた。
(C)CYP3A−HACΔ含有DT−40ハイブリッド細胞のCHO細胞へのCYP3A−HACΔの導入
Kuroiwaら(前出)の報告にあるように、構築されたHACをマウスES細胞へ導入するために、まずCHO細胞への導入を試みた。
DT−40ハイブリッドクローンDT40(CYP3A−HACΔ)214をT225フラスコ(スミロン)8本で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、1% ニワトリ血清、10−4M 2−メルカプトエタノール、0.05μg/mlコルセミドを添加したRPMI1640培地に交換し、さらに24時間培養してミクロセルを形成させた。細胞を24mlの血清RPMI1640培地に懸濁し、予め100μ/mlのポリ L−リジンでコートした遠心用25cm2フラスコ12本(コーニング)に2mlずつ分注し、37℃で1時間培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、1700rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。一方、約107個のCHO細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清DMEM培地で2回洗浄し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。再度、ミクロセルを1700rpm、10分間遠心し、上清を除かずに先のCHO懸濁液5mlを静かに重層した。遠心後、培養液を除去し、PEG1500溶液(ベーリンガー)0.5mlを加え、約2分間ピペットで激しく攪拌した。その後、無血清DMEM培地10mlを約3分間かけてゆっくり加え、37℃で10分間静置した。遠心後、10% FBS添加F12培地(ギブコ)に細胞を懸濁し、24穴培養プレート5〜6枚に分注し、37℃で24時間培養した。その後、G418 800μg/ml含有F12培地に交換し、3〜4週間選択培養した。
G418耐性クローンからゲノムDNAを抽出してCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーおよびPGK−2、GFP−2プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、CYP3A−HACΔを保持するCHOクローンを同定した(例えば、CHO/CYP3A−HACΔ4,6)。さらに、上記PCRで陽性だったクローンに対して、ヒトCOT1DNAをプローブに用いてFISH解析を行った結果、視覚的にCYP3A−HACΔの存在を確認した。これらの結果から、CYP3A−HACΔを保持するCHO細胞クローンが得られたと結論できた。
(D)CHO細胞からのCYP3A−HACΔのマウスES細胞への移入
CYP3A−HACΔを保持するキメラマウスを作製するために、上記(C)で得られたCYP3A−HACΔを保持するCHO細胞からマウスES細胞(野性型TT2F)へミクロセル法により導入した。Tomizukaら(Nature Genet.16:133,1997)の方法に従い、約108個のCYP3A−HACΔを保持するCHO細胞(CHO/CYP3A−HACΔ4,6,7,10など)からミクロセルを精製し、DMEM 5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM 5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5g PEG1000(和光純薬)、1ml DMSO(シグマ)をDMEM 6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM 10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレ(コーニング)3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、CHO/CYP3A−HACΔ4からは4クローン、CHO/CYP3A−HACΔ6からは4クローン、CHO/CYP3A−HACΔ7からは3クローン、CHO/CYP3A−HACΔ10からは4クローンがCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、ヒトCOT1DNAプローブを用いてFISH解析(Tomizukaら,Nature Genet.16:133,1997)を行った結果、COT1プローブにより特異的に検出されるCYP3A−HACΔの存在が15クローン中、15クローンで確認された。このうちマウスの核型が正常なクローンは3クローンであった。以上のことから、CYP3A−HACΔ保持TT2F細胞が3クローン得られたと結論付けた。
(E)ヒト人工染色体CYP3A−HACΔを保持するキメラマウスの作製
上記(D)で得られたES細胞クローンを用いてTomizukaらの方法(Nature Genet.,16:133,1997)でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCH(ICR)(白色、日本クレア社より購入)の雌雄交配により得られる8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野性型TT2F/CYP3A−HACΔクローン(例えばF8/CYP3A−HACΔ−7および11、上記(D)で取得)を注入した800個の胚を仮親に移植した結果、92匹のキメラマウス(毛色に濃茶色の部分の認められる)が誕生した。うち10匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100%の個体であった。すなわち、ヒト人工染色体CYP3A−HACΔを保持するES細胞株(TT2F)はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
(F)ヒト人工染色体CYP3A−HACΔを保持するES細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
(F.1)ゲノムPCR解析
上記(E)でTT2F/CYP3A−HACΔクローン(F8/CYP3A−HACΔ−7および11)より作製されたキメラマウス(キメラ率約80%)の尻尾からTomizukaらの報告(Nature Genet.,16:133,1997)に記された方法でゲノムDNAを調製し、CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A−HACΔの保持を検討した。その結果、2種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるCYP3A−HACΔの保持が確認された。
(F.2)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
また、キメラ率約80%のキメラマウス2匹の肝臓組織を用いてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163−1175,2001)に記された方法でヒトCOT1DNAをプローブに用いてFISH解析を行った結果、視覚的にCYP3A−HACΔの存在を確認し、そのCYP3A−HACΔの保持率は両個体とも70%であり、キメラ率とほぼ一致した。キメラ率はES細胞の組織(体毛)への寄与率を示し、保持率は導入染色体の組織への寄与率を示す。キメラ率が高く、保持率も高いのキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持ES細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。すなわちCYP3A−HACΔの使用により、CYP3A遺伝子を含むヒト染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
(G)ヒト人工染色体CYP3A−HACΔを保持するキメラマウスからの人工染色体子孫伝達
上記(E)で作製された雌キメラマウス(キメラ率約100%)4匹をMCH(ICR)(白色、日本クレア社より購入)雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した80匹の仔マウスのうち、75匹がES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちCYP3A−HACΔを保持するES細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス75匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製した。得られたDNAについてCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A−HACΔの保持を検討した結果、24匹において2種のプライマーで共に陽性であり、キメラマウス子孫におけるCYP3A−HACΔの保持が確認された。CYP3A−HACΔが子孫伝達されたマウス系統をTC(CYP3A−HACΔ)と呼ぶ。
実施例3
TC(CYP3A−HACΔ)マウス系統の体細胞におけるCYP3A−HACΔの保持
(3.1)ゲノムPCR解析
上記で得られたTC(CYP3A−HACΔ)マウスのうち雄(165)および雌(155)1匹ずつについて脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣(または子宮)からのゲノムを鋳型として、CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、全ての臓器でCYP3A−HACΔを検出した。その雌(155)の代表的な結果を図6に示す。
(3.2)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
また上記と同様の個体や組織において、Shinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163−1175,2001)に記された方法でヒトcot−1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、55〜95%でCYP3A−HACΔを保持することが確かめられた(図7)。特にCYP3Aが主に発現する肝臓および小腸では85%以上の高い染色体保持率であることが確かめられた。TC(CYP3A−HACΔ)から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて同様にFISH解析を行った結果、視覚的にCYP3A−HACΔの存在を確認し、マウス染色体とは独立にCYP3A−HACΔが存在していることが確かめられた(図7)。
実施例4
TC(CYP3A−HACΔ)マウス系統における組織特異的CYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現
上記でTC(CYP3A−HACΔ)マウスのうち雄(165)および雌(155)1匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣(または子宮)において、トータルRNAを市販のプロトコール(QIAGEN)に従い抽出後、市販のプロトコール(invitrogen)に従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、ヒトCYP3A遺伝子クラスターおよびマウスCyp3a遺伝子クラスターの発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。
ヒトCYP3A遺伝子クラスター発現検出用プライマー:
マウスCyp3a遺伝子クラスター発現検出用プライマー:
コントロール遺伝子発現検出用プライマー:
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin−Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEX Taq(宝酒造)を用い、バッファーやdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、93℃5分の熱変性後、93℃1分、56℃1分、72℃1分を1サイクルとして35サイクルで行った。
その結果TC(CYP3A−HACΔ)を保持するマウスにおいて、CYP3A4は肝臓と小腸でのみ、CYP3A5は肝臓と小腸と肺でのみ、CYP3A7は肝臓と小腸と腎臓と肺でのみ、CYP3A43は肝臓と小腸と腎臓でのみ、Cyp3a11は肝臓と小腸でのみ、Cyp3a13は肝臓と小腸でのみ、Cyp3a25は肝臓と小腸でのみ、Cyp3a44は肝臓と小腸でのみ発現を検出できた。また、コントロールのGAPDHは全ての組織で検出された。その雌(155)の代表的な結果を図8に示す。このようにヒトでみられるよう組織特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。
実施例5
TC(CYP3A−HACΔ)マウス系統における時期特異的CYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現
(5.1)ゲノムPCR解析
TC(CYP3A−HACΔ)マウスの雄および雌の胎齢14.5日、胎齢16.5日、胎齢18.5日、生後0日、2週齢、4週齢、6週齢、8週齢、24週齢における肝臓からのゲノムを鋳型として、CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、全ての胎齢、週齡でCYP3A−HACΔを検出した。
(5.2)RT−PCR解析
また上記と同じ個体の肝臓のトータルRNAを市販のプロトコール(QIAGEN)に従い抽出後、市販のプロトコール(invitrogen)に従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、上述のヒトCYP3A遺伝子クラスター発現およびマウスCyp3a遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。
その結果、成体型発現のヒトCYP3A4、ヒトCYP3A5、マウスcyp3a11、マウスCyp3a13は成体期において、胎児型のCYP3A7は胎児において強く発現していることが確かめられた。また、コントロールのGAPDHは全ての胎齢、週齡で同程度の発現量が検出された。その代表的な結果を図9に示す。このようにヒトでみられるような時期特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。
実施例6
TC(CYP3A−HACΔ)マウス系統におけるCYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現誘導
ヒトCYP3A4の発現を誘導する物質として知られるRifampicin(シグマ)がTC(CYP3A−HACΔ)マウスにおけるCYP3A4遺伝子の発現に及ぼす影響について検討するため、一回の投与量は100mg/kgとし、4日間腹腔内投与した。なお、投与液はRifampicin(「Rif」)をコーンオイル(シグマ)に懸濁して調製した。5日目に各マウス肝臓を摘出し、トータルRNAを市販のプロトコール(QIAGEN)に従い抽出後、市販のプロトコール(invitrogen)に従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、上述のヒトCYP3A遺伝子の発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。その結果、TC(CYP3A−HACΔ)において溶媒(corn oil)投与群に比べてRifampicin投与群においてヒトCYP3A4遺伝子の発現が強く発現していることが確かめられた。また、コントロールのGAPDHは両群ともに同程度の発現量が検出された。その雄3匹ずつ(Rif投与およびoil投与)の代表的な結果を図10に示す。
以上のことからTC(CYP3A−HACΔ)におけるヒトCYP3A遺伝子の発現誘導がヒト型化されていることが確かめられた。
実施例7
内因性Cyp3a13遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
(7.1)Cyp3a13遺伝子エクソン1領域を含むDNA断片のクローニング
pBluescript II SK(−)(日本国東洋紡)に新たな制限酵素サイトを付加するため以下のDNAを合成した。
pBluescript II SK(−)を制限酵素SalIおよびXhoIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。一方プラスミドに新たな制限酵素サイトNruI、SgrAIおよびAscIを付加するため、20μl反応液中に2種のオリゴDNA(LinkA1およびLinkA2)各100μmolを添加し、70℃15分→37℃15分→室温15分の順序で計45分インキュベーションして得られたDNA断片を、前記制限酵素処理したpBluescript II SK(−)プラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAを取得した。
続いて、pBlueLAを制限酵素NotIおよびEcoRIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。プラスミドに新たな制限酵素サイトPacI、FseIおよびSalIを付加するため、20μl反応液中に2種のオリゴDNA(LinkB1およびLinkB2)各100μmolを添加し、70℃15分→37℃15分→室温15分の順序で計45分インキュベーションして得られたDNA断片を、前記制限酵素処理したpBlueLAプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(図11)を取得した。
BACクローン、RP23−425N17(ジェノテックス社より購入)をHindIIIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、マウスCyp3a13遺伝子周辺領域を含むDNA断片(10319bp)を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって同DNA断片を精製した。この断片をpBlueLABのHindIII部位に挿入しpBACcyp3a13(#39)(図12)を取得した。
(7.2)pBlueLAB(SAAX)の構築
上記7.1で作製されたpBlueLABの制限酵素サイトを改変するために以下のオリゴDNAを合成した。
pBlueLABを制限酵素SacIおよびXhoIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。一方20μl反応液中に上記2種のオリゴDNA各100μmolを添加し、70℃15分→37℃15分→室温15分の順序で計45分インキュベーションして得られたDNA断片を、上記SacI/XhoI処理したベクターに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(SAAX)(図13)を取得した。
(7.3)pBlueLAB(NAPF)の構築
上記7.1で作製されたpBlueLABの制限酵素サイトを改変するために以下のオリゴDNAを合成した。
5’NotIAscI linker36 S(5’リン酸付加):
5’NotIAscI linker36 A(5’リン酸付加):
pBlueLABを制限酵素PvuIIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。精製されたベクターDNAをアリカリフォスファターゼ(Calf intestine由来、タカラ)処理後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。一方20μl反応液中に上記2種のオリゴDNA各100μmolを添加し、70℃15分→37℃15分→室温15分の順序で計45分インキュベーションして得られたDNA断片を、上記PvuII制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(NAPF)(図14)を取得した。
(7.4)Cyp3a13(エクソン1〜イントロン1)領域DNA断片の調製及びpBlueLAB(SAAX)への挿入
Cyp3a13(エクソン1〜イントロン1)領域の一部を含むDNA調製するために以下のオリゴDNAを合成した。
KOD−plus−(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に上記2種のプライマー(10μmol)を各1.5μl、鋳型として上記7.1で作製されたpBACcyp3a13(#39)を添加し、94℃2分保温した後、94℃15秒→60℃1分→68℃1分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた209bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をAscIおよびAccIで酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってDNA断片を回収した。
pBlueLAB(SAAX)を制限酵素AscIおよびAccIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。精製されたベクターに上記で調製したDNA断片(Cyp3a13エクソン1〜イントロン1領域の一部を含む)を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(SAAX)cyp3a13(209bp)を取得した。
(7.5)Cyp3a13−5’ゲノム領域を含むDNA断片(110bp)のpBlueLAB(NAPF)への挿入
Cyp3a13−5’ゲノム領域を含むDNA断片(110bp)を得るために下記のオリゴDNAを作製した。
3a13 PvuII−ex1 S:
3a13 PvuII−ex1 A:
pBlueLAB(NAPF)を制限酵素PvuIIおよびFseIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。一方20μl反応液中に上記2種のオリゴDNA各100μmolを添加し、70℃15分→37℃15分→室温15分の順序で計45分インキュベーションして得られた110bpDNA断片を、上記PvuII/FseI処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(NAPF)cyp3a13(110bp)を取得した。
(7.6)pBACcyp3a13(#39)由来3’ゲノム断片(約2.8kb)のpBlueLAB(SAAX)Cyp3a13(209bp)への挿入
上記7.4にて作製したpBlueLAB(SAAX)cyp3a13(209bp)を制限酵素AccIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。精製されたベクターDNAをアリカリフォスファターゼ(Calf intestine由来、タカラ)処理後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。一方pBACcyp3a13(#39)を制限酵素AccIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、Cyp3a13遺伝子エクソン1の一部及び、エクソン2を含む約2.8kbのDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってDNA断片(2.8kb)を精製した。得られたDNA断片(2.8kb)を、上記AccI処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(SAAX)cyp3a13(2.8kb)を取得した。
(7.7)pBACcyp3a13(#39)由来5’ゲノム断片(約5.1kb)のpBlueLAB(NAPF)cyp3a13(110bp)への挿入
上記7.5にて作製したpBlueLAB(NAPF)cyp3a13(110bp)を制限酵素AatII及びPvuIIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。一方pBACcyp3a13(#39)を制限酵素AatII及びPvuIIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、Cyp3a13遺伝子5’領域及びエクソン1の一部を含む約5.1kbのDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってDNA断片(約5.1kb)を精製した。得られたDNA断片(約5.1kb)を、上記AatII/PvuII処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB(NAPF)Cyp3a13(5.1kb)を取得した。
(7.8)KO基本ベクターの構築
WO 00/10383号パンフレットに記載されたpLoxP−STneoプラスミドをXhoI消化し、両端にLoxP配列を持つNeo耐性遺伝子(LoxP−Neo)を取得した。LoxP−Neoの両末端をT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、LoxP−Neo−B断片を取得した。
pBlueLABをEcoRV消化後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、LoxP−Neo−B断片を挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体のうち、ベクター上ClaI部位側にNeo耐性遺伝子をドライブするプロモーターが配置されているようクローンについてDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB−LoxP−Neo(R)を取得した。
pMC1DT−A(ライフテックオリエンタル株式会社)をXhoIおよびSalI消化後、0.8%アガロースゲルにアプライし、約1kbのバンドを分離回収し、QIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってDT−Aフラグメントを回収した。pBlueLAB−LoxP−Neo(R)をXhoI消化後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、DT−Aフラグメントを挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、KO基本ベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A(R)(図15)を取得した。
(7.9)pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A(R)へのCyp3a13−3’ゲノム断片(約3.0kb:AscI−XhoI)及びCyp3a13−3’ゲノム断片(約5.2kb:NotI−FseI)の挿入
pBlueLAB(SAAX)cyp3a13(2.8kb)を制限酵素AscI、XhoIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、Cyp3a13遺伝子エクソン1の一部及び「エクソン2を含む約3.0kbのDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってAscI−XhoI DNA断片(3.0kb)を精製した。さらにpBlueLAB(NAPF)cyp3a13(5.1kb)を制限酵素NotI、FseIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、Cyp3a13遺伝子5’領域及びエクソン1の一部を含む約5.2kbのDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってNotI−FseI DNA断片(5.2kb)を精製した。
KO基本ベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A(R)プラスミドを制限酵素AscI及びXhoIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。上記で得られたAscI−XhoI DNA断片(3.0kb)を、上記AscI/XhoI処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A(R)+3’genomeを取得した。
上記pBlueLAB−LoxP−Neo−DT−A(R)+3’genomeプラスミドを制限酵素NotI及びFseIで処理した反応液を0.8%ゲルで分離し、ベクターDNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQTAGEN)を用い添付文書にしたがってベクターDNA断片を精製した。上記で得られたNotI−FseI DNA断片(5.2kb)を、上記NotI/FseI処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpcyp3a13−KO(図16)を取得した。
(7.10)ゲノムサザン解析用プローブの調製
BACクローン、RP23−425N17(Genbankアクセッション番号:AC125063)の塩基配列情報を基に、Cyp3a13−5’ゲノム領域を含むDNA断片(約1.2kb)を取得するため以下のDNAを合成した。
KOD−plus−(東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に上記2種のプライマー(10μmol)を各1.5μl、鋳型として上記7.1で作製されたpBACcyp3a13(#39)を添加し、94℃2分保温した後、94℃15秒→60℃30秒→68℃2分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた約1.2kbの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって増幅断片(5’側ゲノムサザン用プローブ、5’KO−prob、図17)を回収した。
BACクローン、RP23−425N17(Genbankアクセッション番号:AC125063)の塩基配列情報を基に、Cyp3a13−3’ゲノム領域を含むDNA断片(約1.2kb)を取得するため以下のDNAを合成した。
KOD−plus−(東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に上記2種のプライマー(10μmol)を各1.5μl、鋳型として上記7.1で作製されたpBACcyp3a13(#39)を添加し、94℃2分保温した後、94℃15秒→60℃30秒→68℃2分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた約1.2kbの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(ドイツQIAGEN)を用い添付文書にしたがって増幅断片(3’側ゲノムサザン用プローブ、3’KO−prob、図17)を回収した。
(7.11)Cyp3a13−KOベクターを用いたジーンターゲティング
マウスES細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウスを交配することにより得られる受精後2.5日の胚を採取し、ES細胞用培地中でインビトロ培養し、該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そして該胚を、フィーダー細胞培地中に播種して培養し、該培養胚からES様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有するES細胞用培地を用いて分散処理、及び、フィーダー細胞培地を用いて培養し、更にはES細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。
相同組換えによるpcyp3a13遺伝子ノックアウト・マウスES細胞の取得のため、pcyp3a13−KOを制限酵素NotI(宝酒造)で線状化し、確立されている方法(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)に従ってマウスES細胞TT2(Yagiら、Analytical Biochem.,214:70,1993)へ導入した。TT2細胞の培養法は、記載の方法(相沢慎一、前記)に従い、栄養細胞はマイトマイシンC(米国シグマ)処理したG418耐性初代培養細胞(インビトロジェン社より購入)を用いた。まず、増殖させたTT2細胞をトリプシン処理し、3x107個/mlとなるようにHBSに懸濁した。その後、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット(電極距離:0.4cm、米国バイオラッド)にてエレクトロポレーションを行った(容量:960μF、電圧:240V、室温)。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン、米国ベクトン.ディッキンソン)1枚に播種した。24時間後に200μg/mlのネオマイシン(米国シグマ)を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地(FBS+10%DMSO、米国シグマ)に懸濁し、−80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits(米国Gentra System社)により調製した。
得られたネオマイシン耐性TT2細胞ゲノムDNAを制限酵素SacI(宝酒造)で消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター3’相同領域の下流に位置するDNA断片(3’KO−prob、図17)をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではSacI消化により、1本のバンド(約8.3kb)が検出された。相同組換え体においては、2本のバンド(約8.3kbと約11.9kb)が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約11.9kbの新たなバンドが確認された(図17)。更に、5’KO−probによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノムDNAを制限酵素SphI(宝酒造)で消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター5’相同領域の上流に位置するDNA断片(5’KO−prob)をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2細胞ではSphI消化により、1本のバンド(約11.6kb)が検出された。相同組換え体においては、2本のバンド(約11.6kbと約13.3kb)が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約13.3kbの新たなバンドが確認された(図17)。すなわち、これらのクローンはマウスCyp3a13遺伝子エクソン1の開始コドン周辺領域を領域を欠失し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子(両端にはターゲティングベクター由来の制限酵素サイト部位を含む)が挿入されたものである。3’および5’KO−probによるサザン解析の結果、pcyp3a13−KOを制限酵素NotIで線状化したベクターを用いた場合には60株中5株が相同組換え体であるという結果を得た。
(7.12)pcyp3a13−KO ES細胞株を用いたキメラマウスの作製
上記7.11で得られたG418耐性マウスES細胞株(#4、#16、#25、#36、#42)を凍結ストックより立ち上げ、それらを、MCH(ICR)マウス(日本クレア社)の雌雄交配により得られた8細胞期胚に、それぞれ胚1つあたり8〜10個注入した。ES培地(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後2.5日の仮親MCH(ICR)マウス(日本国日本クレア社)の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約10個のインジェクション胚を移植した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にES細胞由来の野生色(濃茶)が認められるかどうかによって判定される。移植実験の結果、5種のES細胞株から計37匹のキメラマウスが誕生した。
(7.13)cyp3a13−KO ES細胞株由来キメラマウスからのpcyp3a13−KOアレルの子孫伝達
上記7.12で作製されたpcyp3a13−KO ES細胞株(#4、#42)由来キメラマウスのうち、100%のキメラ率を示しかつ雄である個体(#4:9匹、#42:1匹)について、C57BL/6N系統雌マウス(日本クレア社)と交配し、ES細胞由来のpcyp3a13−KOアレルを有する子孫が誕生するかを検討した。この交配によって得られた仔マウスの尻尾より調製したゲノムDNAについて、以下のプライマーを用いてPCR解析を実施した。
LA−Taq(タカラバイオ)を用い添付文書にしたがって反応液(30μl)を調製し、プライマーとして上記3’genome2と5’down(図18、(1)×(2))、あるいは3’genome2とneo3−1(図18、(1)×(3))の組み合わせ、鋳型として前記仔マウスゲノムDNAを添加し、94℃5分保温した後、94℃30秒→60℃30秒→72℃3分を1サイクルとして35サイクル増幅した。反応液を0.8%ゲルにて電気泳動し増幅産物の検出を行った。野生型Cyp3a13アレルについては(1)×(2)のプライマーの組み合わせによって3.5kbの特異的産物が、KO型Cyp3a13アレルについては(1)×(3)のプライマーの組み合わせによって3.2kbの特異的産物が検出される(図18)。#4、#42、それぞれのES細胞株に由来するキメラマウスより誕生した仔マウスの尻尾DNAについて解析を行った結果、(1)×(2)、および(1)×(3)のプライマーの組み合わせの両方で陽性となるcyp3a13−KOヘテロ接合体(図18)が存在することが確認された。
(7.14)cyp3a13−KOマウスとcyp3a44/11/25−KOマウスの交配によるcyp3a13/44/11/25−KOマウスの作製
マウスCyp3aファミリー遺伝子のうち、Cyp3a44とCyp3a11とCyp3a25を同時に欠失するcyp3a44/11/25−KOマウスの作製法はWO01/011951に開示されている。Cyp3a44とCyp3a11とCyp3a25遺伝子は他の2種のCyp3aファミリー遺伝子(3a16、3a41)と共にマウス5番染色体上でクラスターを形成しているが、このCyp3aファミリー遺伝子クラスターとCyp3a13遺伝子の距離は約10Mbである。
上記7.12にて作製されたcyp3a13−KOヘテロ接合体マウス個体と上記cyp3a44/11/25−KOマウスヘテロ接合体マウス個体の交配によって得られた仔マウスの尻尾より調製したゲノムDNAについて、まずCyp3a13遺伝子座の遺伝子型を決定するため上記7.13(図18)に記載されたPCR解析を実施した。その結果より(1)×(2)、および(1)×(3)のプライマーの組み合わせの両方で陽性となるcyp3a13−KOヘテロ接合体(図18)を選抜し、さらにCyp3a44/11/25遺伝子座の遺伝子型を決定するため以下のPCR解析を実施した。
Ex−Taq(タカラバイオ)を用い添付文書にしたがって反応液(30μl)を調製し、プライマーとして上記3a25Fwと3a25Rv(図19、(4)×(5))、あるいは前記PGK2とGFP2(図19、(6)×(7))の組み合わせ、鋳型として前記仔マウスゲノムDNAを添加し、85℃3分、94℃1分保温した後、94℃10秒→59℃30秒→72℃30秒を1サイクルとして35サイクル増幅した。反応液を2%ゲルにて電気泳動し増幅産物の検出を行った。野生型Cyp3a44/11/25アレルについては(4)×(5)のプライマーの組み合わせによって0.3kbの特異的産物が、KO型Cyp3a44/11/25アレルについては(6)×(7)のプライマーの組み合わせによって0.4kbの特異的産物が検出される(図19)。以上の解析を実施した結果、Cyp3a13遺伝子ノックアウトについてヘテロ接合体かつ、(4)×(5)、および(6)×(7)のプライマーの組み合わせの両方で陽性となるcyp3a44/11/25−KOヘテロ接合体(図19)を得た。
ここで得られたcyp3a44/11/25−KO、cyp3a13−KOの両者についてヘテロ接合体であるダブルヘテロ個体の体細胞においては、2種のKOアレルは同一染色体上には存在しない。しかし精子あるいは卵子を形成する減数分裂過程においては相同染色体間の組換えが起こり、2種のKOアレルを同一染色体上に有する配偶子がある確率で生じる。この現象を利用して、cyp3a44/11/25−KOアレルとcyp3a13−KOアレルを同一の染色体上に有するマウス個体の取得を試みた。上記で得られたcyp3a13−KO/cyp3a44/11/25−KOついてヘテロ接合体であるダブルヘテロ個体のうち雄について、野生型C57BL/6N系統雌マウス(日本クレア社)と交配を実施し、得られた仔マウスの尻尾よりゲノムDNAを調製し、上記7.12及び上記に示したcyp3a44/11/25−KO、cyp3a13−KO遺伝子型解析を実施した。両KOアレルについてヘテロ接合体である個体の体細胞においては2種の遺伝子KOアレルが同一染色体上にあると考えられるが、本解析の結果、両KOアレルについてヘテロ接合体である個体を得た。
さらに上記で取得された両KOアレルについてヘテロ接合体であるダブルヘテロ(同一染色体)個体の雌雄交配により、cyp3a44/11/25−KO、cyp3a13−KOの両KOアレルについてホモ接合体であり、これら3種のCyp3aファミリー遺伝子を欠損するダブルホモ個体の取得を試みた。上記で得られたダブルヘテロ(同一染色体)個体のうち雄について、野生型C57BL/6N系統雌マウス(日本クレア社)と交配を実施し、得られた仔マウスの尻尾よりゲノムDNAを調製し、上記7.12及び上記に示したcyp3a44/11/25−KO、cyp3a13−KO遺伝子型解析を実施した(図18、19)。その結果、cyp3a13−KOについて(1)×(2)のプライマーセットで陰性、(1)×(3)のプライマーセットで陽性、かつcyp3a44/11/25−KOについて(4)×(5)のプライマーセットで陰性、(6)×(7)のプライマーセットで陽性となる両KOアレルについてホモ接合体である個体を得た(図18、19)(以下、Δcypと記す)。Cyp3aクラスターの遺伝子型は上記プライマーに対応して以下の表1のようになる。
得られたダブルホモマウス雌雄個体の生殖機能は正常であり、以後、ダブルホモマウス雌雄個体同士の交配により本系統を維持した。
実施例8
CYP3A−HACΔを保持し、かつ内因性Cyp3a遺伝子群の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
実施例2で作製されたTC(CYP3A−HACΔ)を、実施例7で作製されたΔcyp系統に戻し交配し、得られたマウス個体について、PCR法を用いて遺伝子型の解析を行った(実施例4および7参照)。交配して得られた仔マウス109匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製した。得られたDNAについてCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーおよび上記表1記載のプライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A−HACΔの保持およびCyp3a遺伝子クラスターのKOを検討した結果、24匹においてCYP3A−HACΔを保持し、かつ内因性Cyp3a遺伝子群の片方のアレルが破壊された(ヘテロKO)マウス系統であることが確認された。さらにこのヘテロにCyp3a遺伝子群が破壊され、かつCYP3A−HACΔを保持するマウスと実施例7で作製されたΔcyp系統に戻し交配し、得られた仔マウス178匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製し、上記と同様のPCR法を用いて遺伝子型の解析を行った。その結果28匹においてCYP3A−HACΔを保持し、かつ内因性Cyp3a遺伝子群の両方のアレルが破壊された(ホモKO)マウス系統であることが確認された。(以下、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypと記す)。
実施例9
TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統の体細胞におけるCYP3A−HACΔの保持
(9.1)ゲノムPCR解析
上記で得られたTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスのうち雄(301)および雌(298)1匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣(または子宮)からのゲノムを鋳型として、CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、全ての臓器でCYP3A−HACΔを検出した。
(9.2)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
得られたTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスのうち雄(301)および雌(298)1匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣(または子宮)において、Shinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163−1175,2001)に記された方法でヒトcot−1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、49〜95%でCYP3A−HACΔを保持することが確かめられた。特にCYP3Aが主に発現する肝臓および小腸では84%以上の高い染色体保持率であることが確かめられた。
実施例10
TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統におけるCYP3A/Cyp3a遺伝子クラスターの遺伝子発現
B6雄マウスの3週齢(B6−6)および10週齢(B6−1)の肝臓、B6雌マウスの3週齢(B6−8)および10週齢(B6−4)の肝臓、Δcyp雄マウスの3週齢(PT482)および10週齢(PT449)の肝臓、Δcyp雌マウスの3週齢(PT485)および10週齢(PT300)の肝臓、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスの10週齢における雄(301)および雌(298)の肝臓、のトータルRNAを市販のプロトコール(QIAGEN)に従い抽出後、市販のプロトコール(invitrogen)に従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、上述のヒトCYP3A遺伝子クラスター発現およびマウスCyp3a遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。
その結果、TC(CYP3A−HACΔ)/ΔcypマウスではマウスCyp3a遺伝子クラスターは発現せず、ヒトCYP3A遺伝子クラスターは発現し、ΔcypマウスではマウスCyp3a遺伝子クラスター、ヒトCYP3A遺伝子クラスターともに発現せず、B6正常マウスではヒトCYP3A遺伝子クラスターは発現せず、マウスCyp3a遺伝子クラスターは発現していることが確かめられた(図20)。
実施例11
TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統におけるCYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現誘導
CYP3A/Cyp3aの発現を誘導する物質として知られるPCN(Pregnenolone 16α−carbonitrile)(シグマ)がTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス、Δcypマウス、B6正常マウスにおけるCYP3A/Cyp3a遺伝子の発現に及ぼす影響について検討するため、一回の投与量は100mg/kgとし、4日間腹腔内投与した。なお、投与液はPCNをコーンオイル(シグマ)に懸濁して調製した。5日目に各マウス肝臓を摘出し、肝臓ミクロソーム画分よりタンパク質を抽出し、岡田雅人・宮崎香(タンパク質実験ノート、羊土社、1996)に従い、anti−CYP3A抗体(第一化学薬品;カタログ番号242496)およびanti−β−actin抗体(Sigma Aldrich;カタログ番号A5441)によるウェスタンブロッティング解析を行った。
その結果、PCNを投与したTC(CYP3A−HACΔ)/ΔcypマウスおよびB6正常マウスでの発現はコーンオイルのみ投与した同系統のマウスよりもCYP3A発現は上昇しており、その発現量はヒトミクロソーム画分より抽出したタンパク質の発現と同程度であった。また、ΔcypマウスにおいてはPCNを投与した個体においても発現は観察されなかった。一方で、コントロールとして用いたβ−actinの発現は全ての個体で同程度であった。以上のことから、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統においてCYP3A−HACΔ上のヒトCYP3A遺伝子がCYP3A/Cyp3a誘導剤によって発現誘導されることが確かめられた(図21)。
実施例12
TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統における代謝解析
上記でPCNまたはコーンオイルを投与したTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス、Δcypマウス個体の肝臓ミクロソームをOmuraら(J.Biol.Chem.,239,2370,1964)に従い、CYP3A4で代謝されることがわかっているトリアゾラム(Triazolam)(200μM)と混合し、その代謝物であるα−OH−triazolamおよび4−OH−triazolamを測定した。その結果、PCNを投与したTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスにおいて、コーンオイルのみ投与した同系統のマウスの10倍の代謝活性が得られ、それはヒト(HLM:human liver microsome)の約半分の活性であることが確かめられた。一方で、PCN投与したΔcypマウスでは活性がほとんど認められなかった。ヒトでは相同遺伝子が2本あり、このTC(CYP3A−HACΔ)/ΔcypマウスではCYP3A遺伝子クラスターが染色体1本分であると考えられる。ヒトの約半分の活性をTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスで示したことは、ヒトと同様の代謝能を示していることが示された。一方で、PCN投与したΔcypマウスでは活性がほとんど認められなかった。以上のことから、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統においてCYP3A−HACΔ上のヒトCYP3A遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられた(図22)。
実施例13
TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統におけるヒト特異的代謝物の測定
CYP3A/Cyp3aで代謝されることが知られているmidazolamのヒト特異的代謝物がTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスにおいて、ヒトと同様にヒト特異的な代謝物が観察されるかを検討するため、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス、Δcypマウス、B6正常マウス、ヒトの各肝臓由来ミクロソームとmidazolamを反応させて、以下のようにLC−MS/MSにて質量分析した。反応混液(10μM midazolam,87.5mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.4),0.5mg/mL 肝ミクロソーム)を37℃で5分間プレインキュベーション後、NADPH生成システム(3.3mM β−NADP+,80mM グルコース−6−リン酸、10units/mL グルコース−6−リン酸脱水素酵素)を添加し37℃で30分間インキュベーションした。アセトニトリルの添加により反応を停止後、混液を遠心分離(3,000rpm,5分間)し上清を分取した。これを窒素気流下40℃で溶媒留去し、乾固した抽出物をアセトニトリルに再溶解し、LC−MS/MSにて質量分析した。
その結果、ヒトとTC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウスのミクロソームにおいて10.22に特異的な代謝物を検出することができた。一方で、主代謝物である10.62には全てのミクロソーム群で代謝物を検出することができた。以上のことから、TC(CYP3A−HACΔ)/Δcypマウス系統においてCYP3A−HACΔ上のヒトCYP3A遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられた(図23)。
実施例14
(14.1)Δcypマウス由来ntES細胞の作製
実施例7で得られたΔcypマウスの尻尾繊維芽細胞をWakayamaらの方法(Science,292:740,2001)従い培養し、あらかじめ除核した未受精卵に上記Δcypマウス由来の尻尾繊維芽細胞由来の核を注入した。雄のΔcypマウス1匹(個体No.596)および雌Δcypマウス1匹(個体No.480)からそれぞれ、3ラインずつntESを樹立した(596−1,2,3および480−1,2,4)。
(14.2)Δcypマウス由来ntES細胞のneo耐性遺伝子除去
Δcyp−ntESへCYP3A−HACおよびCYP3A−HACΔを導入するためにΔcyp−ntESに存在するneo耐性遺伝子を除去する必要があるため、以下のようにCyp3a13遺伝子のKOに用いたneo耐性遺伝子(2つのloxPで挟まれている、図17参照)の除去を行った。上記で得られたΔcyp−ntES細胞株6クローンに対して、Cre組換え酵素発現ベクターpBS185(ギブコ)をトランスフェクションした。これによって、マウス内在性Cyp3a13遺伝子領域に存在するloxP配列間で部位特異的組換えが起こり、結果的にneo遺伝子が欠失すると期待できた。Δcyp−ntES細胞をトリプシン処理し、1.0x107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから、30μgのpBS185(インビトロジェン)ベクターを加え、ジーンパルサーを用いて250V、960μFの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを行った。その後、100mmシャーレ1枚に播種した。期待通りのloxP間組換えが起こっている場合にはベクター中のneo遺伝子が発現しなくなり、G418の耐性の有無によって検出可能と考えられた。Cre発現ベクターpBS185導入から72時間培養後、トリプシン処理により細胞をディッシュから剥離し、ES用DMEMで懸濁後、15mlチューブに移して1000rpm、5分間遠心した後、上清を吸引した。チューブをタッピングした後、ES用DMEM 10mlで細胞を再懸濁し、ゼラチンコートした100mmディッシュに播種し約一時間培養した。その後培地を静かに回収し、1000rpm、5分間遠心した。遠心後、上清を吸引し、細胞塊をタッピングしてほぐし、フィーダー細胞があらかじめ播種された60mmディッシュに十分分離した数十のコロニーが出現するように播種した。一週間後、フィーダー細胞があらかじめ播種された24wellにコロニーを各クローンにつき12個ずつピックアップし、さらに数日後、フィーダー細胞があらかじめ播種された24well2枚に播種し、片方にG418を含む培地、片方にG418を含まない培地を加えた(マスタープレート)。G418を加えた培地で死滅したクローンがneo耐性遺伝子が除去されたクローンであると考えられたので、G418で死滅したクローンのマスタープレートを増殖させ、24穴プレート1穴分の細胞を4穴プレート2穴に播種した。4穴プレート1穴分を−80℃にて凍結保存した。残りの1穴分はゲノムDNA取得用として3.5cmゼラチンコートしたディッシュに播種し培養した。上記細胞からゲノムDNAを調製し、neo遺伝子が欠失した細胞株であることを、実施例7記載のPrimer1/2およびPrimer1/3のプライマーを用いてPCRにて確認した。Neo耐性遺伝子が除去されたクローンは表1の正常マウスと同じパターンになることが予測された。480−1では12クローン中5クローン、480−2では12クローン中7クローン、480−4では12クローン中8クローン、596−1では12クローン中9クローン、596−2では12クローン中8クローン、596−3では12クローン中10クローン、でneo遺伝子が欠損しているPCRパターンであり、それらのクローンではすべてG418は非耐性であったことから、上記クローンはすべてneo遺伝子が除去されたΔcyp−ntES(G−)細胞であることが確認された。
実施例15
Δcyp−ntES(G−)細胞へのCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔの導入
CYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔを保持するΔcyp−ntES(G−)細胞を保持するキメラマウスを作製するために、実施例2で得られたCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔを保持するCHO細胞から実施例14で得られたΔcyp−ntES(G−)細胞へミクロセル法により導入した。Tomizukaら(Nature Genet.16:133,1997)の方法に従い、約108個のCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔを保持するCHO細胞(CHO/CYP3A−HAC4,25,32,33など、またはCHO/CYP3A−HACΔ4,6,7,10など)からミクロセルを精製し、DMEM 5mlに懸濁した。約107個のΔcyp−ntES(G−)細胞(596−1−2、596−2−9など)をトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM 5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4 PEG溶液[5g PEG1000(和光純薬)、1ml DMSO(シグマ)をDMEM 6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM 10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレ(コーニング)3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、CYP3A−HACを保持するΔcyp−ntES(G−)細胞(Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HAC)は21クローン、CYP3A−HACΔを保持するΔcyp−ntES(G−)細胞(Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ)は57クローンがCYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記で得られたΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HAC細胞およびΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ細胞の12クローンずつについて、ヒトCOT1DNAプローブを用いてFISH解析(Tomizukaら,Nature Genet.16:133,1997)を行った結果、COT1プローブにより特異的に検出されるCYP3A−HACの存在が12クローン中、11クローンで、CYP3A−HACΔの存在が12クローン中、12クローンで確認された。このうちマウスの核型が正常なクローンはΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACでは5クローンで、Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔでは9クローンあった。以上のことから、少なくともΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HAC細胞が5クローン、Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔが9クローン、得られたと結論付けた。
実施例16
Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACまたはΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔからのキメラマウス作製
実施例15で得られたntES細胞クローンを用いてWakayamaらの方法(Science,292:740,2001)でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCH(ICR)(白色、日本クレア社より購入)の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACまたはΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ(例えばΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HAC5,6,7および11、Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ25,63,67、実施例15で取得)を注入した約500個の胚を仮親に移植した結果、Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACからは26匹のキメラマウス、Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔからは29匹のキメラマウス(毛色に黒色の部分の認められる)が誕生した。すなわち、ヒト人工染色体CYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔを保持するntES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
実施例17
CYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔを保持するΔcyp−ntES(G−)細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
(17.1)ゲノムPCR解析
実施例16でΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACクローン(Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HAC5,6,7および11)またはΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ(Δcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ25,63,67)より作製されたキメラマウス(キメラ率約50%)の尻尾から富塚らの報告(Nature Genet.16:133,1997)に記された方法でゲノムDNAを調製し、CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒト14番染色体検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔの保持を検討した。その結果、調べた10匹すべてで2種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔの保持が確認された。
(17.2)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
またΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACまたはΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔ由来のキメラマウス(キメラ率約50%)から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて、Shinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163−1175,2001)に記された方法でヒトcot−1 DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、視覚的にCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔの存在を確認し、マウス染色体とは独立にCYP3A−HACΔが存在していることが確かめられた。約50%の割合でCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔが保持されていたことから、キメラ率と一致してCYP3A−HACまたはCYP3A−HACΔが効率に保持されていることが確かめられた。
以上のことから、内在のマウスCyp3a遺伝子クラスターを欠損し、かつヒトCYP3A遺伝子クラスターを保持しているΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACまたはΔcyp−ntES(G−)/CYP3A−HACΔは各種細胞にin vitroまたはin vivoで分化誘導をさせることで、マウスCyp3a遺伝子クラスターを発現しない、かつヒトCYP3A遺伝子クラスターを発現する細胞を提供できることが示唆された。
本発明は、以下の有用性を有する。
(1)ヒトP450遺伝子領域を保持し、かつ次世代へ高効率で子孫伝達可能で個体内で安定に維持されるヒト人工染色体が提供される。
(2)また、該ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物由来ES細胞が提供される。
(3)また、本発明により、該ヒト人工染色体を個体内で安定に維持し、高効率で次世代に子孫伝達する非ヒト動物およびその子孫が提供される。
(3)これと相同遺伝子となる非ヒト哺乳動物内在性P450遺伝子が破壊されたノックアウト非ヒト哺乳動物あるいはその子孫と交配させてできた産仔では、特定のP450分子種に関して完全にヒト型化していると考えられる。よって、発現の組織特異性や薬物誘導また発現の割合だけでなく、代謝産物の機能についても特定のP450分子種に関して完全にヒト型化したヒトP450導入非ヒト哺乳動物を提供できると考えられる。
(4)この特定のP450分子種に関して完全にヒト型化したヒトP450導入非ヒト哺乳動物を用いれば、薬理効果や薬物代謝あるいは毒性といった薬物のヒトへの影響を実際にヒトに投与することなく研究あるいは予測することが可能である。
(5)さらに、この特定のP450分子種に関して完全にヒト型化したヒトP450導入非ヒト哺乳動物の全胎児培養によって、その代謝と薬物毒性や奇形などの評価も可能である。
(6)完全にヒト型化したヒトP450導入非ヒト哺乳動物の個体や、その組織、細胞から生物学的活性のあるヒトP450タンパクを得ることが可能である。このようなタンパクは、従来入手の困難なヒトP450タンパクを容易に提供できるばかりか、大腸菌に代表される細菌を用いた発現系では解決し得なかったリン酸化や糖鎖による修飾などに代表されるタンパクの修飾の面でもよりヒトの体内で生産されるP450に近いものを提供できる。
(7)また、上記非ヒト哺乳動物由来の組織や細胞を不死化して培養系で用いる場合、安定してヒトP450タンパクを供給できる。さらに、ヒトにおける薬物代謝の培養系における研究材料として利用が可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号87〜98:オリゴDNA
[配列表]
Claims (19)
- ヒトチトクロームP450遺伝子を含むヒト7番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト7番染色体断片が、染色体マーカーAC004922とAC073842との間に存在する少なくともヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む約1Mb±500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター。
- ヒト人工染色体ベクターである、請求項1に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
- 前記ヒト人工染色体ベクターが、前記ヒト7番染色体断片を、ヒト14番染色体由来のSC20ベクター(FERM BP−7583)に転座して得られたベクターである、請求項2に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
- 前記ヒト人工染色体ベクターが、受託番号FERM BP−10928のニワトリDT40細胞株DT40(CYP3A−HACΔ)214に保持されたCYP3A−HACΔである、請求項2に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
- マウスES細胞である、請求項5に記載の分化多能性細胞。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- キメラ動物又はその子孫動物である、請求項7に記載の非ヒト哺乳動物。
- 前記子孫動物が、前記キメラ動物と、それと同種の野生型動物との交配により得られる動物である、請求項8に記載の非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物において、前記ヒトCYP3A遺伝子クラスターのホモログである前記非ヒト哺乳動物固有のチトクロームP450遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している、請求項7〜9のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
- マウスである、請求項7〜10のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
- マウスが子孫マウスである、請求項11に記載の非ヒト哺乳動物。
- 請求項11又は12に記載のマウス又はその子孫マウスを、マウスCyp3a遺伝子クラスターを欠損したマウスと交配させることにより作製されたマウス又はその子孫であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持すること、マウスCyp3a遺伝子クラスターを欠損していること、及びヒトチトクロームP450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、上記マウス又はその子孫。
- 請求項7〜12のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物或いは請求項13に記載のマウス又はその子孫に由来する、かつ、ヒトチトクロームP450遺伝子の発現が可能であることを特徴とする、細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織。
- 請求項7〜12のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、請求項13に記載のマウス又はその子孫、或いは請求項14に記載の細胞、器官又は組織において、これらが保持するヒトチトクロームP450遺伝子を発現させて生物学的活性を有するヒトチトクロームP450を産生させ、該ヒトチトクロームP450を回収することを含む、生物学的活性を有するヒトチトクロームP450の製造方法。
- 請求項7〜12のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、請求項13に記載のマウス又はその子孫、或いは請求項14に記載の細胞、器官又は組織に薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝の試験方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持する非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、ヒトCYP3A遺伝子クラスターのホモログである非ヒト哺乳動物固有のチトクロームP450遺伝子が破壊され、その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、非ヒト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
- ntES細胞である、請求項17に記載の分化多能性細胞。
- マウス由来ntES細胞である、請求項17又は18に記載の分化多能性細胞。
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