WO2023090372A1 - プロモーター活性化配列、そのプロモーター活性化配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む哺乳動物細胞 - Google Patents

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WO2023090372A1
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vector
cells
promoter
human
sequence
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PCT/JP2022/042594
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一磨 冨塚
愛海 宇野
康宏 香月
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学校法人東京薬科大学
国立大学法人鳥取大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a nucleotide sequence capable of activating a promoter, an expression vector containing the promoter activation sequence, and a mammalian cell containing the expression vector. Furthermore, the present invention relates to efficient methods for producing proteins intended for expression using said mammalian cells.
  • the target gene is stably and highly expressed.
  • promoter sequences of housekeeping genes which are commonly expressed in many tissues and cells at a certain level and participate in maintaining cell functions, are used as promoters for expressing target genes. It is however, there are cases where sufficient expression of the target gene cannot be obtained even when the promoter sequence of the housekeeping gene is used. Therefore, it is desired to identify a nucleotide sequence (hereinafter referred to as a promoter activation sequence) that has the function of activating a promoter and enables stable high expression of a target gene introduced into mammalian cells.
  • a promoter activation sequence a nucleotide sequence
  • the human ubiquitin C (hereinafter abbreviated as UbC) gene is one of the housekeeping genes, and the UbC gene is widely expressed in somatic cells including fibroblasts.
  • the promoter sequence of the UbC gene is known to exist in a region of about 1.3 kb on the 5'-end side from the UbC gene initiation codon, and is widely used for the purpose of expressing target genes in animal cells.
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 disclose a DNA fragment of about 15 kb located upstream of the human UbC gene promoter. Furthermore, these documents indicate that the addition of this approximately 15 kb DNA fragment during vector construction enhances the activity of the UbC gene promoter.
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 are as long as about 15 kb, they are often accompanied by technical difficulties when performing genetic manipulations, and there is a problem that the scope of their use is limited. .
  • this approximately 15-kb DNA fragment is derived from the genome upstream of the UbC gene, it was thought to have no effect on commonly used promoters other than the UbC gene.
  • Non-Patent Document 2 discloses that a 1.5 kbp sequence (A2UCOE) with anti-silencing activity was identified. Furthermore, Non-Patent Document 2 discloses that A2UCOE and fragments thereof exhibited anti-silencing effects on the activity of the splenic focal-forming virus (SFFV) promoter.
  • A2UCOE 1.5 kbp sequence
  • SFFV splenic focal-forming virus
  • Non-Patent Document 3 and Patent Document 2 disclose that SURF-UCOE, an approximately 1-kb anti-silencing sequence derived from the human SURF1-SURF2 gene region, was identified. Furthermore, Non-Patent Document 3 and Patent Document 2 disclose that SURF-UCOE and its partial sequences showed anti-silencing against the activity of EF1 ⁇ , PGK, CMV, and RSV promoters.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 3, and Patent Document 2 are related to suppression of silencing in promoters linked to UCOE within human gene regions.
  • UCOE contains an endogenous promoter sequence, protein-encoding exons and introns, when a target gene is expressed under the control of a given promoter, transcription from the endogenous promoter contained in UCOE and , there is concern that the presence of exons/introns may have unintended consequences.
  • Non-Patent Document 4 discloses that D424, a 3.3-kb microsatellite sequence present in the telomeric region of human chromosome 4, and its partial sequence suppress silencing of human EF1 ⁇ promoter activity.
  • the above D424 and its partial sequence contain the open reading frame (ORF) of the DUX gene. Therefore, when a gene is expressed by adding D424 and its partial sequence, there is a concern that the protein encoded by the ORF will also be expressed.
  • the object of the present invention is to provide a new means that enables stable high expression of the target gene. More specifically, it is to obtain a promoter activating sequence that is an upstream genomic sequence of the human UbC gene promoter and has a smaller size than the promoter activating sequences of Patent Document 1 and Non-Patent Document 1.
  • the present inventors found that a DNA fragment containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 activates the promoter. Furthermore, an expression vector containing the promoter activating sequence, promoter and target gene was constructed and constructed into mammalian cells into which the expression vector was introduced. The present inventors have also found that silencing is suppressed in the mammalian cells and that the target gene can be stably expressed at a high level, thus completing the present invention.
  • the present invention has the following features (1) to (17).
  • a promoter activation sequence comprising 850 or more base sequences in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 85% or more sequence identity with it.
  • An expression vector comprising the promoter activation sequence of (1), a promoter, and a DNA of interest.
  • the expression vector according to (3), wherein the constitutive expression promoter is selected from the group consisting of EF1 ⁇ promoter, PGK promoter, and UBC promoter.
  • the cells according to (10), wherein the human pluripotent stem cells are human iPS cells or human ES cells, and the human somatic stem cells are human MSC cells.
  • the mammalian cell according to any one of (8) to (13) is cultured in a medium for animal cell culture, and the protein encoded by the DNA of interest is collected from the culture obtained by the culture.
  • a method for producing a protein encoded by said DNA of interest comprising: (16) A method of suppressing silencing of the DNA of interest in a cell by introducing the expression vector according to any one of (2) to (7) into the cell. (17) A method of enhancing expression of the DNA of interest in a cell by introducing the expression vector according to any one of (2) to (7) into the cell.
  • This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2021-186122, which is the basis of priority of this application.
  • a promoter activation sequence includes a nucleotide sequence consisting of 850 or more nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1. Furthermore, the present invention provides an expression vector comprising the promoter activation sequence, promoter and target gene.
  • the target gene can be stably and efficiently expressed in mammalian cells into which the expression vector has been introduced.
  • FIG. 1 is a genetic map around the sequence of the present application (SEQ ID NO: 1: about 2.5 kb). This genetic map shows the region from 124,910,000 to 124,955,000 of human chromosome 12 obtained from the USCC genome browser.
  • the bar line shown in the description "sequence of the present application (approximately 2.5 bp)" indicates the region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2549 bp).
  • the bar indicated by the description "about 0.8 bp)” is the region corresponding to the nucleotide sequence indicated by about 0.8 bp in SEQ ID NO: 1 (2549 bp) used in the examples below.
  • FIG. 2 shows a scheme for producing HAT-resistant clones in which one copy of the expression unit is inserted into 21HAC2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a scheme for constructing X3.1-UbCP-mCherry-SV40pA (pUms vector), which is a red fluorescent protein (mCherry) expression vector for human artificial chromosome (HAC) introduction.
  • pUms vector a red fluorescent protein (mCherry) expression vector for human artificial chromosome (HAC) introduction.
  • FIG. 4 is a diagram showing a scheme for constructing pUL0.8ms vector and pUL2.5ms vector by adding UbC gene upstream genome to pUms vector.
  • Figure 5 shows a scheme for constructing the pSUL4ms vector.
  • Figure 6 shows a scheme for constructing the pSUL15ms vector.
  • FIG. 7 shows that CHO cells (HAT-resistant clones) introduced with 21HAC vector into which pUms vector or pUL2.5ms vector was inserted were cultured for 7 weeks after gene introduction, and FACS analysis was performed using the expression of red fluorescent protein as an index. It is the figure which compared the result. A thick box indicates the positive fraction.
  • FIG. 8 is a set of photographs showing the results of observing the expression of red fluorescent protein in MSC cells transfected with pUms vector, pUL0.8ms vector, or pUL2.5ms vector two weeks after transfection.
  • the upper part of FIG. 8 is a bright field image, and the lower part is a red fluorescence image.
  • the left side of FIG. 8 is a bright field image, and the lower part is a red fluorescence image.
  • FIG. 8 is a photograph of pUms vector-introduced cells, the center is a photograph of MSC cells into which pUL0.8ms vector was introduced, and the right side is a photograph of pUL2.5ms vector-introduced cells.
  • Figure 9 shows a pUbC-hKO + MCS vector (pUL vector), which is an orange expression vector for introducing human artificial chromosomes, and a pUL2.5 vector with the addition of about 2.5 kb of the human UbC gene 5' upstream genomic sequence to the pUL vector. It is a figure which shows the scheme to construct.
  • FIG. 10 is a diagram showing a scheme for constructing a pSUL15 vector in which about 15 kb of genomic sequence upstream of the UbC gene 5' is added to the pSUkb vector, which is an orange expression vector for introducing a human artificial chromosome.
  • FIG. 11-1 shows CHO cells (HAT-resistant clones: 6 clones each) introduced with a Basal-HAC vector into which a pUL vector, a pUL2.5 vector or a pSUL15 vector is inserted, using the expression of an orange fluorescent protein as an index. , and compare the results of FACS analysis. A thick box indicates the positive fraction.
  • Top panel is FACS analysis data for CHO cells with pUL vector, median positive peak is 1300.
  • the middle panel shows data from FACS analysis for CHO cells with the pUL2.5 vector, with a median positive peak of 14,400.
  • the bottom figure is data from FACS analysis for CHO cells with the pSUL15 vector, with a median positive peak of 14,000.
  • FIG. 11-2 shows CHO cells (HAT-resistant clones: 6 clones each) introduced with Basal-HAC vector into which pUL vector, pUL2.5 vector or pSUL15 vector is inserted, using the expression of orange fluorescent protein as an index. , and compare the results of FACS analysis. A thick box indicates the positive fraction.
  • Top panel is FACS analysis data for CHO cells with pUL vector, median positive peak is 1300.
  • the middle panel shows data from FACS analysis for CHO cells with the pUL2.5 vector, with a median positive peak of 14,400.
  • the bottom figure is data from FACS analysis for CHO cells with the pSUL15 vector, with a median positive peak of 14,000.
  • Figure 12 shows a pEFms vector, which is an mCherry expression vector using the EF1 ⁇ gene promoter, a pEF2.5ms vector obtained by adding 2.5 kb of the UbC gene upstream genomic sequence to the pEFms vector, and a pPGKms vector, which is an mCherry expression vector using the PGK gene promoter.
  • FIG. 3 shows the structure of the pPGK2.5ms vector obtained by adding 2.5 kb of the UbC gene upstream genomic sequence to the pPGKms vector.
  • FIG. 13 shows CHO cells (HAT-resistant cell population) introduced with a HAC vector into which a pEFms vector or a pEF2.5ms vector was inserted, after culturing for 4 weeks and 7 weeks after introduction, using the expression of red fluorescent protein as an index. It is the figure which compared the result of having performed FACS analysis. A thick box indicates the positive fraction. Left panel shows data for CHO cells with pEFms vector and right panel shows data for CHO cells with pEF2.5ms vector.
  • FIG. 14 shows the CHO cells (HAT-resistant cell population) into which the HAC vector into which the pPGKms vector or the pPGK2.5ms vector was inserted were cultured for 4 weeks and 7 weeks after the introduction, using the expression of red fluorescent protein as an index. It is the figure which compared the result of having performed FACS analysis. A thick box indicates the positive fraction. Left panel is data for CHO cells with pPGKms vector and right panel is for CHO cells with pPGK2.5ms vector. The upper figure shows data after 4 weeks of culture after gene introduction, and the lower figure shows data after 7 weeks of culture after gene introduction.
  • FIG. 14 shows the CHO cells (HAT-resistant cell population) into which the HAC vector into which the pPGKms vector or the pPGK2.5ms vector was inserted were cultured for 4 weeks and 7 weeks after the introduction, using the expression of red fluorescent protein as an index. It is the figure which compared the result of having performed FACS analysis. A thick box indicates the positive fraction. Left panel is
  • FIG. 15 shows that human mesenchymal stem cells (HAT-resistant cell population) introduced with a HAC vector into which a pPGKms vector or a pPGK2.5ms vector was inserted were cultured for 4 weeks after introduction by electric pulse, followed by FACS analysis.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the results of FACS analysis using the expression of .
  • the upper panel shows data for human mesenchymal stem cells with the pPGKms vector
  • the lower panel shows data for human mesenchymal stem cells with the pPGK2.5ms vector.
  • FIG. 16 is a diagram showing the structure of pUL2.5mNs vector, in which the mCherry-NeoR amplified fragment digested with SpeI and FseI was inserted into the pUL2.5ms vector digested with SpeI and FseI.
  • FIG. 17 shows the structure of the pUmNs vector obtained by deleting the 2.5 kb region from the pUL2.5mNs vector.
  • FIG. 18 shows that neomycin-resistant CHO cells (G418-resistant cells) into which a pUmNs vector or a pUmL2.5ms vector-inserted HAC vector was introduced were cultured for 2 weeks after introduction by electric pulse, followed by FACS analysis, and expression of red fluorescent protein.
  • the upper panel shows data for G418-resistant cells with the pUmNs vector
  • the lower panel shows data for human mesenchymal stem cells with the pUL2.5mNs vector.
  • the number of mCherry-positive (P7 fraction) cells was 1136 out of 20826 (5.5%) relative to the total number of cells.
  • the number of mCherry-positive (P7 fraction) cells was 1481 out of 12595 (11.8%) relative to the total number of cells.
  • FIG. 20-1 shows the results of FACS analysis of human iPS clones into which a Basal-HAC vector containing a pUL vector or pUL2.5 vector was introduced, using the expression of orange fluorescent protein as an index. .
  • FIG. 20-1 shows data of FACS analysis of representative clones, and the part surrounded by a thick square indicates the Kusabira Orange (KO)-positive fraction.
  • FIG. 20-2 shows human iPS clones (HAT-resistant clones: 12 clones each) into which a Basal-HAC vector inserted with a pUL vector or pUL2.5 vector was introduced, using the expression of orange fluorescent protein as an index, FACS It is the figure which compared the result of having analyzed.
  • FIG. 20-2 shows the average fluorescence intensity of KO-introduced iPS clones. The bar on the left side of FIG.
  • FIG. 20-2 shows the average fluorescence intensity of human iPS clones into which the pUL vector was introduced, and the value on the right side shows the average fluorescence intensity of the human iPS clones into which the pUL2.5 vector was inserted. *P ⁇ 0.01 indicates that there is a significant difference at the significance level of 1% as a result of the t-test.
  • a population of neomycin-resistant CHO cells (G418-resistant cells) into which a pUmNs vector or a pUmL2.5ms vector-inserted HAC vector was introduced was subjected to FACS analysis 2 weeks, 4 weeks, or 7 weeks after introduction by electric pulse. , the ratio of strongly positive mCherry to the total number of cells was evaluated.
  • the portion surrounded by a thick box in FIG. 21-1 indicates the mCherry-Neo positive fraction (P6).
  • the horizontal axis indicates mCherry fluorescence intensity, and the vertical axis indicates Count.
  • a population of neomycin-resistant CHO cells (G418-resistant cells) into which a pUmNs vector or a pUmL2.5ms vector-inserted HAC vector was introduced was subjected to FACS analysis 2 weeks, 4 weeks, or 7 weeks after introduction by electric pulse. , the ratio of strongly positive mCherry to the total number of cells was evaluated.
  • Figure 21-2 shows the number of cells in the mCherry strongly positive fraction (P6 in Figure 21-1) relative to the total number of cells at 2 weeks (2 weeks), 4 weeks (4 weeks), and 7 weeks (7 weeks) after introduction.
  • FIG. 23 shows the results of examining the anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence elements for the EF1A-mCherry-NeoR expression unit in random insertion gene transfer into CHO cells.
  • a neomycin-resistant CHO cell population into which a pEFmNs vector or a HAC vector into which a pEFmNsms vector was inserted was cultured for 4 weeks after introduction by electric pulse, and FACS analysis was performed using the expression of red fluorescent protein as an indicator, and the results were compared.
  • the first to second figures from the top are FACS analysis data of CHO cells carrying the pEF2.5mNs vector, and the third to fifth figures from the top are FACS analysis data of CHO cells carrying the pEFmNs vector.
  • the median mCherry fluorescence intensity in the total number of cells and the percentage of mCherry-positive cells are also shown.
  • the promoter activating sequence of the present invention includes a sequence of 850 or more nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having mutations in the nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a sequence located upstream of the expression promoter of the UbC gene on human chromosomal DNA. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a 2549 bp nucleotide sequence corresponding to positions 124,927,045 to 124,929,593 of human chromosome 12.
  • the base sequence of human chromosome 12 is disclosed as NC_000012.12 in GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Table 1 shows the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • the promoter activation sequence of the present invention most preferably consists of the entire nucleotide sequence of SEQ ID NO:1, ie, the 2549 bp nucleotide sequence of SEQ ID NO:1.
  • the promoter activation sequence of the present invention may also be a shorter partial sequence of SEQ ID NO:1. For example, it may consist of 1500 bp or more, 1000 bp or more, or 850 bp or more of the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • the promoter activation sequence of the present invention also includes a nucleotide sequence in which one to several nucleotides are deleted, substituted, added or inserted in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • "several” means 10 or less, preferably 8 or less, more preferably 6 or less, and most preferably 4 or less.
  • the promoter activation sequence of the present invention also includes a nucleotide sequence that hybridizes to the complementary strand of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
  • stringent conditions are, for example, the conditions described in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999, for example, 6 ⁇ SSC (sodium chloride /sodium citrate)/hybridization at 45°C, followed by one or more washes in 0.2 x SSC/0.1% SDS/50-65°C.
  • Hybridization conditions that give equivalent stringency can be selected as appropriate.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 disclose that an approximately 15 kb DNA sequence located upstream of the promoter of the UbC gene on human chromosomal DNA enhances gene expression.
  • a genetic map of the region from 124,910,000 to 124,955,000 of human chromosome 12 obtained from the USCC genome browser is shown in FIG.
  • the left-pointing arrow indicates the region where the UbC gene (left) and DHX37 gene (right) exist on chromosome 12.
  • the bar line indicated by the description "this application sequence (about 2.5 bp)" is the region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2549 bp) indicates
  • the bar line on the left side of the description "15 kb region” further below shows the region corresponding to the 15 kb base sequence disclosed in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1.
  • This 15 kb base sequence corresponds to the region from 124914981 to 124929646 of human chromosome 12 (NC_000012.12 Homo sapiens chromosome 12, GRCh38.p13 Primary Assembly).
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 disclose that the activity-enhancing effect decreased as the promoter activation sequence became shorter to 15 kb, 4 kb, and 1.3 kb.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 describe the production of erythropoietin from the erythropoietin gene, which is the target gene, in CHO cells into which a vector in which a 15-kb, 4-kb, or 1.3-kb promoter-activating sequence was linked to the promoter was introduced. It is disclosed that 4.5-fold, 2.5-fold, and 1.2-fold activity-enhancing effects were obtained, respectively, using the amount as an index.
  • a long sequence (15 kb) has a high activity-enhancing effect, and a shorter partial sequence alone cannot achieve an activity-enhancing effect equivalent to that of a 15 kb sequence. .
  • the promoter activating sequence of the present invention of about 2.5 kb sequence (SEQ ID NO: 1) of the present invention, which is the above 15 kb partial sequence, has a promoter activating effect equivalent to that of the 15 kb sequence of the prior art. was not predicted.
  • nucleotide sequence (2549 bp) of SEQ ID NO: 1 of the present invention which is located about 13 kb away from the human UbC gene promoter and located near the middle of the adjacent DEAH-box helicase 37 (DHX37) gene, is about 15 kb region. It was not expected to have an equivalent activity-enhancing effect.
  • the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof (that is, the promoter activation sequence of the present invention) has a function as a promoter activation sequence, and the effect is surprising. It was something.
  • the expression vector of the present invention comprises 1. A promoter activating sequence, a promoter, and DNA of interest as described in .
  • the DNA of interest in the present invention is a DNA for the purpose of obtaining the protein encoded by it by expression, or a DNA for achieving the desired effect of gene therapy by introducing it. It includes nucleic acids such as locus, cDNA, recombinant DNA, modified DNA.
  • the target DNA includes, without limitation, for example, disease-causing genes, therapeutic genes, chromosome fragments containing these genes, genes necessary for cell differentiation, etc.
  • examples include cytokines, interferons, interleukins, , chemokines (factors with cell migration activity), granulocyte colony stimulating factor, tumor necrosis factor, growth factors (e.g., platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor, keratinocyte growth factor, nerve growth factor, epithelial stem cell growth factors, hematopoietic stem cell growth factors, etc.), nutritional factors (e.g., neurotrophic factors, brain-derived neurotrophic factors, etc.), erythropoietin, blood coagulation proteins, platelet production promoting factors, hormones, antibodies (e.g., monoclonal antibodies, recombinant antibodies such as scFv, etc.), genes or DNA encoding proteins such as enzymes.
  • cytokines e
  • the DNA of interest further includes therapeutic genes or DNA associated with diseases such as muscular dystrophy, hemophilia, neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, allergic diseases, genetic diseases, tumors, chimeric antigen receptors (CAR), T cells It can include immune system genes or DNA such as receptors (TCR), human leukocyte antigens (HLA).
  • diseases such as muscular dystrophy, hemophilia, neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, allergic diseases, genetic diseases, tumors, chimeric antigen receptors (CAR), T cells
  • CAR chimeric antigen receptors
  • TCR receptors
  • HLA human leukocyte antigens
  • protein encoded by the DNA of interest in the present invention is expressed.
  • protein as used herein includes proteins, polypeptides and peptides, and may be any protein as long as it is industrially useful, preferably a human-derived protein. Examples of such proteins include any protein for use in the treatment or prevention of, or diagnosis of, the diseases mentioned above.
  • the expression vector of the present invention may contain the promoter activation sequence of the present invention on the 5' side upstream or 3' side downstream of the above promoter. More preferably, the expression vector of the present invention contains the promoter activating sequence of the present invention 5' upstream of the promoter.
  • any promoter can be used as the promoter contained in the vector of the present invention, as long as it can function as a promoter in mammalian cells, and is not particularly limited. Constitutive promoters are advantageous for the purposes of the present invention because they always allow a constant amount of target DNA to be expressed.
  • the promoter used in the present invention is a constitutive expression promoter known in the art to activate constitutive expression of expression vectors, preferably the promoter of a housekeeping gene. .
  • constitutive promoters examples include non-viral promoters such as the human polypeptide elongation factor 1 ⁇ gene promoter (EF1 ⁇ promoter), the phosphoglycerate kinase promoter (PGK promoter) and the human ubiquitin C (UBC) promoter, as well as the CMV promoter, Viral promoters such as SV40 promoter and CAG can be mentioned.
  • the promoter used in the present invention is particularly preferably the EF1 ⁇ promoter, PGK promoter, or UBC promoter used in the examples below.
  • the expression vector of the present invention can be constructed by inserting a DNA cassette containing the promoter activation sequence of the present invention, the promoter and the DNA of interest into the expression vector.
  • the expression vector into which the promoter activating sequence, the promoter and the target DNA are introduced has a promoter at an appropriate position for expressing the target DNA inserted into the vector, and the target DNA is expressed in mammalian cells.
  • DNA cassette examples include, but are not limited to, ampicillin resistance gene, HS4 (insulator sequence described below), poly A sequence, red fluorescent protein (mCherry) gene coding region sequence, UBCP Mention may be made of pUL2.5ms with the promoter sequence, the promoter activating sequence of the invention (2.5 kb) and additionally HS4 (see Figure 4 described in the Examples).
  • the present invention is not limited thereto, it is preferable to use mammalian artificial chromosome vectors and plasmid vectors. However, it is not limited to this, and conventional vector systems such as viruses, YACs, BACs, PACs, cosmids, etc. can also be used in the present invention.
  • mammalian artificial chromosome vectors are not particularly limited, for example, humans, monkeys, chimpanzees, primates such as gorillas, mice, rats, hamsters, rodents such as guinea pigs, cattle, sheep, Examples include ungulates such as goats, artificial chromosome vectors such as dogs and cats.
  • Particularly preferred mammalian artificial chromosome vectors are Human Artificial Chromosome (HAC) vectors, Mouse Artificial Chromosome (MAC) vectors, and Rat Artificial Chromosome (RAC) vectors.
  • Human artificial chromosome vector is the most suitable vector, as a specific human artificial chromosome vector, 21HAC using human chromosome 21, 14HAC using human chromosome 14, 2HAC using human chromosome 2, etc. can be mentioned.
  • the "artificial chromosome vector” herein refers to the centromere of the mammal-derived chromosome, the long arm, and, if any, a fragment near the centromere of the short arm (genes are removed as much as possible.), and artificially engineered chromosomal vectors containing natural or artificial telomeres.
  • Mouse artificial chromosome vectors are described, for example, in Japanese Patent No. 5557217 and Japanese Patent No. 4997544, and human artificial chromosome vectors are described, for example, in Japanese Patent No. 4895100.
  • Human chromosomes for use in the production of human artificial chromosome vectors may be any of human chromosomes 1 to 22, X and Y, but preferably any of chromosomes 1 to 22.
  • human iPS cell-derived chromosomes can be used as human chromosome vectors.
  • Production of human artificial chromosomes for example, JP 2010-004887, methods described in WO2008 / 013067, etc., can refer to the method described in the above literature on the production of mouse artificial chromosome vector.
  • Mouse chromosomes for use in the production of mouse artificial chromosome vectors may be any of mouse chromosomes 1 to 19, X and Y, but preferably any of chromosomes 1 to 19.
  • the long arm fragment is, without limitation, for example, AL671968 of the long arm of chromosome 11, or BX572640 (located on the centromere side from AL671968.) , CR954170 (located on the centromere side of AL671968 and BX572640) or AL713875 (located on the centromere side of AL671968).
  • the long arm fragment in the case of a mouse artificial chromosome vector derived from a mouse chromosome 15 fragment, the long arm fragment consists of a long arm fragment in which regions distal to positions such as AC121307 and AC161799 are deleted, for example.
  • the long arm fragment in the case of a mouse artificial chromosome vector derived from a mouse chromosome 16 fragment, the long arm fragment consists of a long arm fragment in which regions distal to positions such as AC127687 and AC140982 are deleted, for example.
  • the above artificial chromosome vector further includes loxP (Cre recombinase recognition site), FRT (Flp recombinase recognition site), ⁇ C31attB and ⁇ C31attP ( ⁇ C31 recombinase recognition site), R4attB and R4attP (R4 recombinase recognition site), TP901-1attB and TP901-1attP (TP901-1 recombinase recognition site), or Bxb1attB and Bxb1attP (Bxb1 recombinase recognition site).
  • loxP Cross recombinase recognition site
  • FRT Frp recombinase recognition site
  • ⁇ C31attB and ⁇ C31attP ⁇ C31 recombinase recognition site
  • R4attB and R4attP R4 recombinase recognition site
  • the artificial chromosome vector can contain a site for inserting a desired nucleic acid sequence
  • the artificial chromosome vector is introduced into any cell by incorporating the desired nucleic acid into this site Sometimes it is possible to express the desired nucleic acid.
  • the object of the present invention can be achieved.
  • Examples 13 and 14 are examples of not using a site-specific recombination enzyme / enzyme recognition site when inserting a DNA cassette into an artificial chromosome vector, in which case the centromere and A DNA cassette is randomly inserted into any site other than the telomere or into the genome of the cell.
  • a vector such as a plasmid vector or a viral vector into which the DNA cassette is inserted
  • the DNA cassette specifically or randomly into the genome of the cell.
  • a technique for inserting a DNA cassette into a genome it is also possible to insert a DNA cassette at a desired target site or randomly using, for example, a gene targeting method or a genome editing technique.
  • Genome editing is a technology that edits and modifies genomic DNA using artificial cutting enzymes such as TALEN (Transcription Activator-Like Effector nuclease), ZFN (Zinc Finger nuclease), CRISPR-Cas system, etc.
  • TALEN Transcription Activator-Like Effector nuclease
  • ZFN Zinc Finger nuclease
  • CRISPR-Cas system etc.
  • the CRISPR / Cas9 system was discovered from the adaptive immune mechanism against viruses and plasmids of bacteria and archaea, but the construction of the vector is relatively simple, and multiple genes can be modified at the same time.
  • This system consists of a Cas9 nuclease that cleaves double-stranded DNA on the genome and a guide RNA (sgRNA or crRNA (CRISPR RNA) + tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)).
  • DSB double-strand break
  • a reporter gene may preferably be inserted into the mammalian artificial chromosome vector, in addition to the sequence of the above gene or locus of interest.
  • reporter genes include, but are not limited to, fluorescent protein (e.g., green fluorescent protein (GFP or EGFP), yellow fluorescent protein (YFP), etc.) gene, tag protein-encoding DNA, ⁇ -galactosidase gene, luciferase gene and the like.
  • the mammalian artificial chromosome vector may further contain a selectable marker gene.
  • Selectable markers are useful in selecting cells transformed with the vector.
  • selectable marker genes include positive selectable marker genes and negative selectable marker genes, or both.
  • Positive selectable marker genes include drug resistance genes such as neomycin resistance gene, ampicillin resistance gene, blasticidin S (BS) resistance gene, puromycin resistance gene, geneticin (G418) resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.
  • Negative selectable marker genes include, for example, herpes simplex thymidine kinase (HSV-TK) gene, diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene and the like. HSV-TK is commonly used in combination with ganciclovir or acyclovir.
  • the artificial chromosome vector which is the expression vector in the present invention, also contains a nucleic acid insertion site into which a nucleic acid containing the promoter activation sequence, promoter, and target DNA of the present invention can be inserted, and the nucleic acid is inserted into this site. be done.
  • At least one insulator sequence can be present near the nucleic acid insertion site or on both sides of the insertion site in the artificial chromosome of the present invention.
  • Insulator sequences have an enhancer-blocking effect (ie, adjacent genes are not affected by each other) or a chromosomal boundary effect (separate regions that ensure gene expression from those that are repressed).
  • Such sequences may include, for example, human beta globin HS1-HS5, chicken beta globin HS4, and the like.
  • the promoter activation sequence of the present invention a promoter , and a nucleic acid containing the DNA of interest can be introduced. After introduction of the nucleic acid, donor cells containing the DNA of interest can be detected and recovered, for example, by HAT selection methods.
  • Mammalian cells of the present invention Mammalian cells containing the expression vector of the present invention (hereinafter simply referred to as mammalian cells of the present invention) by introducing the foreign gene expression vector into mammalian cells that are host cells ) can be made.
  • Mammalian cells used as host cells in the present invention are not particularly limited as long as they can cause nucleic acid amplification of the target DNA.
  • cells rodent cells (hamster cells, mouse cells, rat cells, etc.).
  • rodent cells hamster cells, mouse cells, rat cells, etc.
  • particularly human cells and hamster cells are preferably used.
  • human-derived stem cells such as human pluripotent stem cells or human somatic stem cells can be used.
  • human mesenchymal stem cells MSC cells
  • human induced pluripotent stem cells iPS cells
  • Mouse cells or rat cells can also be mouse- or rat-derived stem cells, such as mouse- or rat-derived pluripotent stem cells or somatic stem cells.
  • mouse or rat somatic stem cells it is particularly preferred to use mouse or rat MSC cells.
  • mouse or rat pluripotent stem cells it is particularly preferable to use mouse or rat induced pluripotent stem cells (iPS cells), and mouse or rat embryonic stem cells (ES cells) are used. is also particularly preferred.
  • Rat ES cells, as well as mouse ES cells can be obtained from rat blastocyst stage embryos or 8-cell stage embryos. It is a cell line with pluripotency and self-renewal ability, which is established from the inner cell mass of the embryo.
  • hamster cells it is preferable to use Chinese hamster ovary cells (CHO cells), and more specifically, for example, CHO-K1, CHO-S, DG44, etc. are particularly preferable. be.
  • CHO cells Chinese hamster ovary cells
  • somatic cells include, but are not limited to, hepatocytes, enterocytes, kidney cells, splenocytes, lung cells, heart cells, skeletal muscle cells, brain cells, skin cells, bone marrow cells, fibroblasts, hematopoietic stem cells, Examples include T cells, B cells, and the like.
  • embryonic stem cells or "ES cells” used herein refers to pluripotent differentiation and semi-permanent proliferative ability established from the inner cell mass of the blastocyst of a fertilized egg derived from a mammal.
  • stem cells MJ Evans and MH Kaufman (1981) Nature 292: 154-156; JA Thomson et al. (1999) Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848; JA Thomson et al.(1996) Biol. Marshall (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 38:133-165).
  • iPS cells are "induced pluripotent stem cells” or "iPS cells” (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell 126 : 663-676; K. Takahashi et al. (2007) Cell 131: 861-872; J. Yu et al. (2007) Science 318: 1917-1920).
  • iPS cells are produced by introducing a specific reprogramming factor (DNA or protein) into somatic cells (including somatic stem cells), culturing them in an appropriate medium, and subculturing them in about 3 to 5 weeks. Can generate colonies.
  • Reprogramming factors are, for example, the combination consisting of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc; the combination consisting of Oct3/4, Sox2 and Klf4; the combination consisting of Oct4, Sox2, Nanog and Lin28; A combination of Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog and Lin28 is known (K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell 126: 663-676 (2006); WO2007/069666; M.
  • the mammalian artificial chromosome vector of the present invention can be transferred or introduced into any mammalian cell.
  • Techniques therefor include, for example, the micronucleus cell fusion method, lipofection, calcium phosphate method, microinjection, electroporation, etc., and the preferred method is the micronucleus cell fusion method disclosed in WO2020/075823.
  • the micronucleus cell fusion method is a method of transferring the vector into another cell by micronucleus fusion between a cell that contains a mammalian artificial chromosome vector and has the ability to form micronuclei with another desired cell.
  • Cells having the ability to form micronuclei are treated with a polyploid-inducing agent (e.g., colcemid, colchicine, etc.) to form micronucleated multinucleated cells, and treated with cytochalasin to form micronuclei.
  • a polyploid-inducing agent e.g., colcemid, colchicine, etc.
  • Mammalian cells containing the expression vector of the present invention can achieve stable and high expression of the DNA to be expressed due to the presence of the promoter activation sequence of the present invention contained in the expression vector. It is demonstrated in the examples described below that such stable high expression of the target DNA is brought about by the expression-enhancing activity and/or anti-silencing activity of the target DNA.
  • Protein production method of the present invention 3 . by culturing the mammalian cells described in 1. in a medium for culturing animal cells, and collecting a protein encoded by the DNA of interest (hereinafter referred to as the desired protein) from the culture obtained by the culturing, A desired protein can be produced. This is because, as described above, the presence of the promoter activation sequence of the present invention brings about stable high expression of the target DNA.
  • Cultivation of the animal cells of the present invention can be carried out according to ordinary methods used for culturing mammalian cells.
  • Methods for producing the protein of the present invention include a method of producing it within the host cell, a method of secreting it outside the host cell, and a method of producing it on the extracellular membrane of the host cell. By changing , an appropriate method can be selected.
  • a medium suitable for the type of cells used is selected.
  • Commonly used basal media include MEM medium, DMEM medium, RPMI medium, F12 medium, Macy's 5A medium, or mixed medium thereof (eg, DMEM/F12).
  • the basal medium can further be supplemented with at least one component such as serum, serum replacement, antibiotics, supplements such as glutamate, pyruvate and the like.
  • the pH of the medium is, for example, 7.2-7.4.
  • mitomycin C-treated mouse fetal fibroblast cell lines eg, STO
  • vector-introduced somatic cells eg, about 10 4 to 10 5 cells/cm 2
  • the basal medium is, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham's F-12 medium, mixed medium thereof, or the like
  • the ES cell medium is mouse ES cell medium, primate ES cell medium (Reprocell), or the like.
  • human iPS cells and human ES cells can be cultured under feeder-free conditions using StemFit AK02N medium (TAKARA) that does not contain animal-derived components.
  • TAKARA StemFit AK02N medium
  • Rat ES cells are obtained by, for example, culturing rat blastocysts with lysed zona pellucida on mouse embryonic fibroblast (MEFF) feeders using medium containing leukemia inhibitory factor (LIF). After 10 days, the outgrowth formed from the blastocyst is dispersed, transferred onto MEF feeders and cultured, and after about 7 days, ES cells emerge.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • Cultivation is carried out in an atmosphere of air containing about 2-10% (usually about 5%) CO 2 at a temperature of about 35-40° C. (usually about 37° C.).
  • the culture method may be batch culture, flask culture, fed-batch culture, continuous culture, suspension culture, shaking culture, stirring culture, circulation culture, or the like.
  • a method such as passing the culture medium during culture through a hollow fiber filter to break up aggregates.
  • the culture equipment equipment used for animal cell culture can be used.
  • the apparatus should be equipped with ventilation, temperature control, agitation, pH and DO control functions.
  • Examples of equipment include fermenter tank culture equipment, air lift culture equipment, fluidized bed culture equipment, hollow fiber culture equipment, roller bottle culture equipment, filled tank culture equipment, bag culture equipment, etc. Can be cultured.
  • reporter genes that monitor the behavior and biological functions of target proteins in mammalian cells.
  • a reporter gene eg, DNA encoding a fluorescent or luminescent protein
  • genetic regulatory sequences eg, promoter, enhancer, etc.
  • High expression of the reporter gene can increase the detection sensitivity of the reporter assay.
  • the behavior of the target DNA expressed by a certain stimulus in the cell can be observed using fluorescence or luminescence as an indicator. Since such observations can usually be performed in a laboratory, cells can be cultured using a solid medium suitable for the cell type. Observation can generally be performed using a fluorescence microscope with a camera or the like.
  • JP-A-2-227075 a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like
  • the supernatant or cells after centrifugation or filtration are subjected to column chromatography such as affinity chromatography, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, etc. It can be subjected to graphics, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, combinations thereof, and the like.
  • the recovery method shall not be limited to the methods described above, and generally includes any method that can be used for protein purification.
  • the desired protein is a glycoprotein such as an antibody
  • it can be recovered using a protein A column, protein G column, protein L column, or IgG-binding peptide column.
  • the cells are recovered by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and treated with an ultrasonicator, French press, Mantongaurin homogenizer, Dynomill, or the like. to disrupt the cells using to obtain a cell-free extract.
  • the usual protein isolation and purification methods such as solvent extraction, salting out with ammonium sulfate, desalting, precipitation with an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography method using resins such as ethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using resins such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) method, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing. can be used alone or in combination to obtain purified preparations.
  • solvent extraction salting out with ammonium sulfate
  • desalting precipitation with an organic solvent
  • diethylamino Anion exchange chromatography method using resins such as ethyl (DEAE)-S
  • the cells are collected and crushed in the same manner as described above, and centrifuged to collect the insoluble form of the protein as a precipitate fraction.
  • the collected insoluble form of the protein is solubilized with a protein denaturant.
  • a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein or a derivative such as a sugar modification thereof can be recovered from the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation in the same manner as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. can.
  • Non-Human Animals Carrying Expression Vectors of the Present Invention The present invention further provides non-human animals carrying the expression vectors of the present invention.
  • non-human animals refers to animals other than humans, including primates such as monkeys and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, cattle, pigs, sheep, goats, horses and camels. It includes, but is not limited to, mammals such as ungulates such as hoofed animals.
  • Non-human animals can be produced, for example, by introducing the expression vector into ES cells or iPS cells, introducing these cells into early embryos, then transplanting them into the uterus of foster mothers, and giving birth to non-human animals. .
  • a method for producing the same will be described below.
  • ES cells can be established and maintained by removing the inner cell mass from the blastocyst of the fertilized egg of the target animal and using mitomycin C-treated mouse fetal fibroblasts as a feeder (MJ Evans and MH. Kaufman, Nature 292:154-156 (1981)).
  • iPS cells are produced by introducing a specific reprogramming factor (DNA or protein) into somatic cells (including somatic stem cells), culturing them in an appropriate medium, and subculturing them for about 3 to 5 years. Form colonies in a week.
  • Reprogramming factors are, for example, the combination consisting of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc; the combination consisting of Oct3/4, Sox2 and Klf4; the combination consisting of Oct4, Sox2, Nanog and Lin28; A combination of Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog and Lin28 is known (K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell 126: 663-676 (2006); WO2007/069666; M.
  • the basal medium is, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham's F-12 medium, mixed medium thereof, etc.
  • the ES cell medium is mouse ES cell medium, primate ES cell medium (Reprocell, Japan). ) can be used.
  • ES cells and iPS cells are known to contribute to the germ line
  • these cells into which the expression vector of the present invention containing the DNA of interest has been introduced are introduced into early embryonic embryos of the same species of mammals from which the cells are derived.
  • a non-human animal (or transgenic non-human animal) can be produced by a procedure that involves injecting an embryo, implanting the embryo into the uterus of a foster mother, and bringing it to term.
  • homozygous animals and their progeny animals can be produced by mating the resulting male and female transgenic animals.
  • the non-human animal when used to produce a heterologous (e.g., human) protein encoded by the DNA of interest, the endogenous gene corresponding to the DNA of interest is deleted or completely inactivated. Animals can be used.
  • Gene therapy can be performed by administering the expression vector of the present invention to mammals, particularly humans, and expressing the protein encoded by the target DNA in the body of the mammal.
  • Gene and cell therapy can be performed by expressing the protein encoded by the DNA of interest in the body of an animal.
  • the effect of gene cell therapy can be obtained by administering or transplanting the expression vector of the present invention containing a disease-causing gene, a therapeutic gene, etc. as a target DNA, or a cell or tissue into which the expression vector has been introduced, to a patient.
  • a disease-causing gene e.g., a therapeutic gene, etc.
  • a target DNA e.g., a cell or tissue into which the expression vector has been introduced
  • causative genes or therapeutic genes for those diseases such as chimeric antigen receptor (CAR)
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the promoter (UBCP promoter, EF1 ⁇ promoter and PGK promoter) has the promoter activation sequence of the present invention (2549 bp: SEQ ID NO: 1) on the 5' side upstream of the promoter, and 3' of the promoter.
  • a HAC vector was constructed with a downstream indicator gene (gene for red fluorescent protein or orange fluorescent protein). Then, the HAC vector was introduced into CHO cells or human mesenchymal cells, and the anti-silencing effect and activity enhancement effect of the promoter activation sequence of the present invention were evaluated using the expression of the indicator protein as an index. As a result, it was demonstrated that the promoter activation sequence of the present invention actually has anti-silencing effect and activity enhancement effect.
  • Example 1 Construction of red fluorescent protein (mCherry) expression vector for introduction of human artificial chromosome (HAC) CHO hprt-deficient (hprt-) cell line (21HAC2 / CHOhprt-) harboring HAC vector (21HAC2); Kazuki Y et al Gene Ther 18(4):384-93 2011) investigated the anti-silencing and activity-enhancing effects of additional sequence elements on universal promoters.
  • the CAG promoter-EGFP-polyA portion of the I-EGFP-I-loxP-3'HPRT vector ( Figure 2; Kazuki Y et al. Gene Ther 18(4):384-93 2011) was combined with various other expression units.
  • HS4-F2 5'-ATCCATGGATCGACTCTAGAGGGACAGCC-3' (SEQ ID NO: 3)
  • HS4-R1 5'-ATAACTAGTCGACGCGGCCGCCTCACTGACTCCGTCCTGGA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • mCherry expression vector by adding UbC gene upstream genomic sequence to pUms vector About 2.5 kb region (Fig. 1) within about 15 kb of human UbC gene 5' upstream genomic sequence (hereinafter referred to as UL15) or a partial fragment thereof (0. 8 kb; FIG. 1) were added, respectively, HAC introduction vectors having an expression unit consisting of UbCP / mCherry gene / SV40 poly A sequence were prepared by the following procedure (respectively, pUL0.8ms vector, pUL2.5ms vector and called).
  • Two types of human UbC gene 5' upstream genomic sequences were prepared by PCR amplification using the following primers and human chromosomal BAC clone RP11-592O2 as a template. Using the following primers and Primestar GXL premix (Takara), 98°C 10 seconds ⁇ 72°C 10 minutes, 5 cycles, 98°C 10 seconds ⁇ 70°C 10 minutes, 5 cycles, 98°C 10 seconds ⁇ 68°C 10 minutes, 30 Cycle PCR reactions were performed. The amplified fragment was further digested with SalI and KpnI and the resulting fragment was cloned into the pUms vector digested with SalI and KpnI. An outline of vector construction is shown in FIG.
  • pUL0.8ms-F 5'-CATGTCGACCCAGAGACAACCACAGAACC-3' (SEQ ID NO: 5)
  • pUL0.8ms-R 5'-AGTGGTACCCGCACGCAGTCCCTGCTGAA-3' (SEQ ID NO: 6)
  • pUL2.5ms-F 5'-CATGTCGACACCCGGAAGGCGGAGGTTAC-3' (SEQ ID NO: 7)
  • pUL2.5ms-R 5'-AGTGGTACCAGGAAGTTCAGGAAATTGGC-3' (SEQ ID NO: 8)
  • pSUL15ms vector A vector for introducing HAC having an expression unit consisting of UbCP/mCherry gene/SV40 polyA sequence with UL15 added was constructed by the following procedure.
  • pSTV28 vector (Takara) was digested with EcoRI and XbaI, and a DNA fragment containing AscI site and SmaI site prepared by annealing the following synthetic DNA sequences was inserted to prepare pSTV28+MCS vector (Fig. 5).
  • pSTV28-MCS_1 5'-CTAGACCCGGGATTGGCGCGCCG-3' (SEQ ID NO: 9)
  • pSTV28-MCS_2 5'-AATTCGGCGCGCCAATCCCCGGGT-3' (SEQ ID NO: 10)
  • UbCP / mCherry gene / SV40 poly to which about 4 kb region proximal to the UBC gene coding region and about 11 kb distal to the UBC gene coding region in the human UbC gene 5' upstream genomic sequence about 15 kb (hereinafter referred to as UL15) are added 2.
  • a HAC introduction vector having an expression unit consisting of the A sequence; (referred to as pUL4ms vector and pUL11ms vector, respectively).
  • Two types of human UbC gene 5' upstream genomic sequences were prepared by PCR amplification using the following primers, respectively, and human chromosomal BAC clone RP11-592O2 as a template.
  • pUL4ms-F 5'-ACTGGTACCATCGATTCAGCCAGGCACATTAGCTC-3' (SEQ ID NO: 11)
  • pUL4ms-R 5'-GAGGTCGACCGGGAGCGGGTGGGCGGCCC-3' (SEQ ID NO: 12)
  • pUL11ms-F 5'-TATGTCGACATCGATATACAGACATGAGCTAATGT-3' (SEQ ID NO: 13)
  • pUL11ms-F 5'-AGTGGTACCAGGAAGTTCAGGAAATTGGC-3' (SEQ ID NO: 14)
  • the DNA fragment between the AscI site and the SmaI site of the pSTV28+MCS vector was replaced with the DNA fragment between the ScaI and AscI sites containing UL4-UbCP-mCherry-SV40pA of the pUL4ms vector to generate pSTV-UL4-UbCP-mCherry-SV40pA.
  • Fig. 5 hereinafter referred to as pSUL4ms vector.
  • the pSUL4ms vector was digested with KpnI and ClaI, and a DNA fragment between the KpnI and ClaI sites containing the UL11 sequence of the pUL11ms vector was inserted to create pSTV-UL15-UbCP-mCherry-SV40pA (Fig. 6; hereinafter, pSUL15ms vector called).
  • Example 2 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on UBCP-mcherry expression unit in CHO cells 21HAC2 vector.
  • the above expression vector was added to 21HAC2/CHOhprt- cells harboring the 21HAC2 vector together with the recombinase (Cre) expression vector pBS185 (Kazuki Y et al. Gene Ther 18(4):384-93 2011) to transfer NEPA21 (Nepagene, 150V, 5. 0 msec) was used to introduce by the electric pulse method.
  • Re recombinase
  • the cells were seeded on one 10 cm dish and cultured in Ham's F12 medium containing 2% HAT (Sigma) and 10% FBS (Nichirei) after 48 hours to obtain HAT-resistant colonies. bottom.
  • the resulting HAT-resistant cell population was subjected to FACS analysis 7 weeks after introduction to evaluate the expression of red fluorescent protein.
  • the results are shown in FIG.
  • the mean median positive peaks of the HAT-resistant cell population transfected with the pUL2.5ms vector (4302) were higher than the mean median positive peaks of the cell population transfected with the pUms vector (1662). That is, it was shown that the addition of the 2.5 kb fragment to UBCP brought about the effect of enhancing the promoter activity.
  • Example 3 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on UBCP-mcherry expression unit in human mesenchymal stem cells pUms vector, pUL0.8ms vector, pUL2.5ms vector prepared in Example 1 was inserted into the 21HAC2 vector in the 21HAC2/human immortalized mesenchymal stem cells (Okamoto T et al. BBRC 295:354-361 2002) hprt- strain. The above expression vector was transferred together with the recombinase (Cre) expression vector pBS185 (Kazuki Y et al.
  • Re recombinase
  • the red fluorescence intensity in the pUL2.5ms vector-introduced cells was clearly stronger than the red fluorescence intensity in the pUms vector and pUL0.8ms vector-introduced cells. That is, it was shown that addition of about 2.5 kb fragment to UBCP brings about promoter activity enhancing effect, and addition of about 0.8 kb fragment has no such effect.
  • the ⁇ C31 attB-NeoR-pUbc-KO1 vector was digested with KpnI, blunt-ended and self-ligated to prepare the ⁇ C31 attB-NeoR-pUbc-KO1(KpnI-) vector (Fig. 9).
  • a DNA fragment containing a SalI site and a KpnI site (multicloning site) prepared by annealing the following sequences was inserted into the SalI site upstream of the UbC promoter to construct a pUbC-hKO+MCS vector (hereinafter referred to as pUL vector.
  • pUL vector pUbC-hKO+MCS vector
  • a vector was constructed in the same manner as in Example 1, in which about 2.5 kb of the genomic sequence 5' upstream of the human UbC gene was added to the UBCP of the pUL vector (Fig. 9; referred to as pUL2.5 vector).
  • the DNA fragment between the PvuI site and the SacI site of the pSTV28+MCS vector prepared in Example 1 was replaced with the DNA fragment between the PvuI site and the SacI site containing UbC-KO-BGHpA of the pUL vector, resulting in pSTV-UbC-hKO- A BGHpA vector was constructed (hereinafter referred to as pSUkb vector; FIG. 10).
  • the pSUkb vector was digested with SalI and KpnI, and a DNA fragment containing about 15 kb of the UbC gene 5' upstream genomic sequence between the SalI site and the KpnI site of the pSUL15ms vector was inserted to prepare the pSUL15 vector (FIG. 10).
  • Example 5 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on UBCP-KO expression unit in CHO cells / into the Basal-HAC vector in CHO cells.
  • the above expression vector was transferred to Basal-HAC/CHO cells together with a recombinant enzyme ( ⁇ C31 integrase) expression vector (Kazuki Y et al. Molecular Therapy: Nucleic Acids 23: 629-639 2021) and NEPA21 (Nepagene, 150 V, 5.0 msec).
  • ⁇ C31 integrase recombinant enzyme
  • Example 6 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on UBCP-KO expression unit in human iPS cells It was inserted into the Basal-HAC vector in iPS cells (Kazuki Y et al. Molecular Therapy: Nucleic Acids 23:629-639 2021). The above expression vector was introduced into Basal-HAC/human iPS cells together with a recombinant enzyme ( ⁇ C31 integrase) expression vector (Kazuki Y et al. Molecular Therapy: Nucleic Acids 23:629-639 2021) by an electric pulse method.
  • ⁇ C31 integrase recombinant enzyme
  • FIG. 20 shows the results of evaluating the fluorescence intensity of KO in clones into which each vector was introduced. As a result, the proportion of the KO positive population when the pUL2.5 vector was introduced was higher than when the pUL vector was introduced. , showed an increased proportion of KO-expressing cells in human iPS cells.
  • Example 7 Construction of mCherry expression vector using EF1A promoter added with UbC gene upstream genomic sequence Human elongation factor 1 ⁇ 1 (EF1 ⁇ ) gene promoter (EF1AP; about 1.2 kb, Qin JY et al. PLoS One.5 (5 ): e10611 2010), the red fluorescent protein mCherry gene coding region, and the SV40polyA sequence were designed to have NotI sites at both ends, and the sequence was synthesized by Vector Builder.
  • EF1 ⁇ Human elongation factor 1 ⁇ 1 gene promoter
  • the EF1A-mCherry-SV40pA sequence (NotI fragment) derived from the synthetic DNA was inserted into the X3.1-MCS vector digested with NotI in the same manner as in Example 1 to prepare X3.1-EF1A-mCherry-SV40pA. (hereinafter referred to as pEFms vector; FIG. 12).
  • pEFms vector a HAC introduction vector having an expression unit consisting of EF1AP/mCherry gene/SV40 poly A sequence to which about 2.5 kb of the human UbC gene 5′ upstream genome sequence was added was prepared (hereinafter referred to as pEF2 .5 ms vector; FIG. 12).
  • Example 8 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on EF1AP-mcherry expression unit in CHO cells 21HAC2 vector.
  • the above expression vector was transferred together with the recombinase (Cre) expression vector pBS185 (Kazuki Y et al. Gene Ther 18(4):384-93 2011) into 21HAC2/CHOhprt- cells harboring the 21HAC2 vector by NEPA21 (Nepagene, 150V, 5 .0 msec) were introduced by the electrical pulse method.
  • Re recombinase
  • the cells were seeded on one 10 cm dish and cultured in Ham's F12 medium containing 2% HAT (Sigma) and 10% FBS (Nichirei) after 48 hours to obtain HAT-resistant colonies. bottom.
  • the obtained HAT-resistant cell population was subjected to FACS analysis 4 weeks and 7 weeks after introduction to evaluate the expression of red fluorescent protein.
  • the results are shown in FIG.
  • the ratio of the mcherry-negative population was higher than in the positive population, but in the pUL2.5 vector-introduced cell population, almost no negative population was observed. That is, it was shown that addition of a 2.5 kb fragment to EF1AP resulted in an anti-silencing effect.
  • Example 9 Construction of mCherry expression vector using PGK promoter to which UbC gene upstream genomic sequence was added Human phosphoglycerate kinase 1 (PGK) gene promoter (PGKP; about 0.5 kb, Kita-Matsuo H et al. PLoS One. 4(4): e5046. 2009), the red fluorescent protein mCherry gene coding region, and the expression unit consisting of the SV40polyA sequence was designed so that NotI sites were arranged at both ends, and the sequence was prepared by Vector Builder. Synthesized.
  • PGK Human phosphoglycerate kinase 1
  • the PGKP-mCherry-SV40pA sequence (NotI fragment) derived from the synthetic DNA was inserted into the X3.1-MCS vector digested with NotI in the same manner as in Example 1 to prepare X3.1-PGKP-mCherry-SV40pA ( Hereafter referred to as the pPGKms vector; FIG. 12).
  • a HAC introduction vector having an expression unit consisting of PGKP/mCherry gene/SV40 poly A sequence to which about 2.5 kb of the human UbC gene 5′ upstream genomic sequence was added was prepared (hereinafter referred to as pPGK2. Called 5 ms vector; FIG. 12).
  • Example 10 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on PGKP-mcherry expression unit in CHO cells - inserted into the 21HAC2 vector in cells.
  • the above expression vector was transferred together with the recombinase (Cre) expression vector pBS185 (Kazuki Y et al. Gene Ther 18(4):384-93 2011) into 21HAC2/CHOhprt- cells harboring the 21HAC2 vector by NEPA21 (Nepagene, 150V, 5 .0 msec) were introduced by the electric pulse method.
  • Re recombinase
  • the cells were seeded on one 10 cm dish and cultured in Ham's F12 medium containing 2% HAT (Sigma) and 10% FBS (Nichirei) after 48 hours to obtain HAT-resistant colonies. bottom.
  • the obtained HAT-resistant cell population was subjected to FACS analysis 4 weeks and 7 weeks after introduction to evaluate the expression of red fluorescent protein.
  • the results are shown in FIG.
  • the ratio of the mcherry-negative population was higher than that of the mcherry-positive population.
  • almost no negative population was observed in the cell population into which the pPGK2.5ms vector was introduced. That is, it was shown that the addition of the 2.5 kb fragment to EF1AP confers an anti-silencing effect.
  • Example 11 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on PGKP-mcherry expression unit in human mesenchymal stem cells - inserted into the 21HAC2 vector in cells.
  • the above expression vector was transferred together with the recombinase (Cre) expression vector pBS185 (Kazuki Y et al. Gene Ther 18(4): 384-93 2011) into 21HAC2/hiMSChprt- cells harboring the 21HAC2 vector with NEPA21 (Nepagene, 150V, 5 .0 msec) were introduced by the electrical pulse method.
  • Re recombinase
  • the cells were seeded on a 10 cm dish and cultured in DMEM medium containing 2% HAT (Sigma) and 10% FBS (Nichirei) after 48 hours to obtain HAT-resistant colonies.
  • the resulting HAT-resistant cell population was subjected to FACS analysis 4 weeks after introduction to evaluate the expression of red fluorescent protein.
  • the results are shown in FIG.
  • the ratio of the mcherry-negative population was higher than that of the mcherry-positive population.
  • almost no negative population was observed in the cell population into which the pPGK2.5ms vector was introduced. That is, it was shown that the addition of the 2.5 kb fragment to PGKP confers an anti-silencing effect.
  • Example 12 Construction of mCherry expression vector for random insertion with addition of UbC gene upstream genomic sequence
  • a random insertion vector having an expression unit consisting of a neoR (neomycin resistance) fusion gene/SV40 polyA sequence was constructed by the following procedure (referred to as pUL2.5mNs vector).
  • PCR was performed using the mCherry_NeoR-CMV_Luciferase vector synthesized by Vector Builder as a template to amplify a fragment with SpeI and FseI sites added to both ends of mCherry-NeoR.
  • primers and KOD One PCR Master Mix TOYOBO
  • the pUL2.5mNs vector was prepared by inserting the above mCherry-NeoR amplified fragment digested with SpeI and FseI into the pUL2.5ms vector prepared in (Example 1) digested with SpeI and FseI.
  • An outline of the construction of the pUL2.5mNs vector is shown in FIG.
  • the pUmNs vector obtained by deleting the above-mentioned approximately 2.5 kb region from the pUL2.5mNs vector was prepared by digesting the pUL2.5mNs vector with SalI and KpnI and blunt-ending it with a Blunting Kit (TAKARA). An outline of the structure of the pUmNs vector is shown in FIG.
  • Example 13 Examination of the anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence elements on the UbCP-mCherry-NeoR expression unit in random insertion gene transfer with CHO 21HAC2/CHOhprt- cells.
  • a recombinant enzyme (Cre) expression vector was not introduced at the same time. It renders neomycin (G418) resistant when the introduced vector is randomly inserted into the CHO cell genome.
  • ScaI restriction enzyme
  • the cells were seeded on two 10 cm dishes, and after 48 hours, cultured in Ham's F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418 (Wako) and 10% FBS (Nichirei) to form drug-resistant colonies. obtained. Two weeks after the introduction, FACS analysis was performed on the resulting cell population in which drug-resistant colonies were mixed, and red fluorescence intensity was compared. The results are shown in FIG. In the G418-resistant cells carrying the pUmNs vector, the number of mCherry-positive (P7 fraction) cells was 1136 out of 20826 (5.5%) relative to the total number of cells.
  • 21-2 shows FACS analysis of G418-resistant cells 2 weeks, 4 weeks, or 7 weeks after introduction by electric pulse, and measuring the ratio of mCherry strongly positive fraction (P6) to the total number of cells. .
  • the percentage of cells in the mCherry strongly positive fraction (P6) exhibiting a fluorescence intensity of 1000 or more was 10 in all G418-resistant cells at week 4 and week 7 harboring the pUL2.5mNs vector. % or more (average of week 4: 15.87%, average of week 7: 13.10%), whereas in G418-resistant cells with pUmNs vectors, all were 0.1% or less. there were.
  • the proportion of the mcherry-positive population when the pUL2.5mNs vector was introduced was higher than when the pUmNs vector was introduced. It was shown that the proportion of mcherry-expressing cells was increased.
  • Example 14 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element for UbCP-mCherry-NeoR expression unit in random insertion gene transfer in human iPS cells pUmNs vector and pUL2.5mNs prepared in Example 12
  • the vector was introduced into human iPS cells (201B7: RIKEN CELL BANK No. HPS0063).
  • a recombinant enzyme (Cre) expression vector is not introduced at the same time. It renders neomycin (G418) resistant when the introduced vector is randomly inserted into the CHO cell genome.
  • the vector was digested with restriction enzyme ScaI, it was recovered by ethanol precipitation and introduced into 201B7 by electric pulse method using NEPA21 (Nepagene, 175 V, 2.5 msec). After induction by electric pulse, the cells were seeded on two 10-cm dishes and cultured in StemFit medium (TAKARA) containing 70 ⁇ g/mL G418 (Wako) after 48 hours to obtain drug-resistant colonies. Seven days after the introduction, one 10 cm dish was treated with methanol for 15 minutes and then stained with a CBB staining solution (0.25% CBB/10% ethanol/40% methanol) for 15 minutes. The stained 10 cm dish was photographed, and the number of colonies was counted and compared.
  • TAKARA StemFit medium
  • the drug-resistant colony appearance rate increased due to the anti-silencing effect and activity-enhancing effect of the 2.5-kb fragment on UBCP (Fig. 19).
  • one 10 cm dish is cultured with the G418 concentration changed to 50 ⁇ g/ml from 8 days after the introduction, and FACS analysis is performed 2 weeks after the introduction to compare the intensity of red fluorescence.
  • the results show that the anti-silencing and activity-enhancing effects of the 2.5 kb fragment on UBCP increase the proportion of mcherry-expressing cells.
  • Example 15 Construction of mCherry expression vector for random insertion using EF1A promoter to which UbC gene upstream genomic sequence was added
  • Expression unit composed of EF1AP/red fluorescent protein mCherry gene coding region/and SV40polyA sequence constructed in Example 7
  • a HAC introduction vector pEFms vector; top of FIG. 12
  • an expression unit consisting of an EF1AP / mCherry gene / SV40polyA sequence added with about 2.5 kb of the human UbC gene 5' upstream genome sequence HAC introduction with Using the vector (pEF2.5ms vector; second from the top in FIG.
  • Example 16 Examination of anti-silencing effect and activity-enhancing effect of additional sequence element on EF1A-mCherry-NeoR expression unit in random insertion gene transfer in CHO cells pEFmNs vector and pEF2.5mNs vector prepared in Example 15 was introduced into 21HAC2/CHOhprt- cells in the same manner as in Example 13. Unlike Example 2 and the like, since a recombination enzyme (Cre) expression vector was not introduced simultaneously, neomycin (G418) resistance is obtained when the introduced vector is randomly inserted into the CHO cell genome.
  • Re recombination enzyme
  • the vector was digested with restriction enzyme ScaI, it was recovered by ethanol precipitation and introduced into 21HAC2/CHOhprt- by electric pulse method using NEPA21 (Nepagene, 150 V, 5.0 msec). After induction by electric pulse, the cells were seeded on two 10 cm dishes, and after 48 hours, cultured in Ham's F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418 (Wako) and 10% FBS (Nichirei) to form drug-resistant colonies. obtained. Four weeks after the introduction, FACS analysis was performed on the resulting cell population in which drug-resistant colonies were mixed, and red fluorescence intensity was compared. The results are shown in FIG.
  • a protein encoded by the DNA of interest can be stably and efficiently produced in said mammalian cell. It is useful for the purpose of producing
  • SEQ ID NOS: 3-8 Primers SEQ ID NOS: 9-10: Annealing sequences for producing DNA fragments containing AscI site and SmaI site SEQ ID NOS: 11-14: Primers SEQ ID NOS: 15-16: DNA containing SalI site and KpnI site Annealing sequences for making fragments SEQ ID NO: 17-18: primers

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Abstract

哺乳動物細胞において、目的ＤＮＡの安定的且つ効率的な発現を可能とするプロモーター活性化配列を提供することである。　配列番号１で示される塩基配列又はそれと８５％以上の配列同一性を有する塩基配列の中の８５０以上の塩基配列を含むプロモーター活性化配列。そのプロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む発現ベクター、並びにその発現ベクター含む哺乳動物細胞又は哺乳動物。

Description

プロモーター活性化配列、そのプロモーター活性化配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む哺乳動物細胞
　本発明は、プロモーターを活性化することができる塩基配列、及び該プロモーター活性化配列を含む発現ベクター、及び該発現ベクターを含む哺乳動物細胞に関する。更に本発明は、該哺乳動物細胞を用いた発現を目的とするタンパク質の効率的な製造方法に関する。
　近年のバイオテクノロジー技術の発達に伴い、哺乳動物細胞を用いたバイオ医薬品の製造技術や、遺伝子治療の技術は大きく進展してきた。そのような技術を実用化するためには、発現を目的とする遺伝子（以下目的遺伝子と称する）が安定的に高発現することが非常に重要である。
　しかしながら、目的遺伝子を導入して発現させることによって外来性タンパク質を生産する際には、メチル化などのエピジェネテイック修飾やヘテロクロマチン化などの宿主染色体の構造変化が起こることにより、導入した目的遺伝子が不活化又は発現抑制を受ける、遺伝子サイレンシングの現象が起こることが知られている。そしてこのような現象により、導入した目的遺伝子の発現調節が困難となるという問題が生じる。
　そのような問題に対処するために、目的遺伝子を発現させる際のプロモーターとして、多くの組織や細胞中に共通して一定量発現して細胞機能の維持に関与するハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列が用いられている。しかしながら、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列を用いてもなお、目的遺伝子の十分な発現を得られない場合もある。そのために、プロモーターを活性化する機能を有し、哺乳動物細胞に導入した目的遺伝子の安定的な高発現を可能とする塩基配列（以下プロモーター活性化配列と称する）の同定が望まれている。
　ところでヒトユビキチンＣ（以下ＵｂＣと略する）遺伝子はハウスキーピング遺伝子の一つであり、ＵｂＣ遺伝子は線維芽細胞を始めとする体細胞において広く発現している。ＵｂＣ遺伝子のプロモーター配列は、ＵｂＣ遺伝子開始コドンから５’末側の約１．３ｋｂの領域にあることが知られており、動物細胞において目的遺伝子を発現させる目的で汎用されている。
　非特許文献１と特許文献１には、ヒトＵｂＣ遺伝子プロモーターの上流に位置する約１５ｋｂのＤＮＡ断片が開示されている。更にこれらの文献には、ベクターを構築する際にこの約１５ｋｂのＤＮＡ断片を付加することにより、ＵｂＣ遺伝子プロモーターの活性が増強することが示されている。
　しかし非特許文献１と特許文献１のＤＮＡ断片は約１５ｋｂと長大であるために、遺伝子操作を行う際に技術的困難を伴うことが多く、その利用範囲が限られてしまうという問題があった。加えてこの約１５ｋｂのＤＮＡ断片はＵｂＣ遺伝子の上流ゲノムに由来することから、ＵｂＣ遺伝子以外の汎用されるプロモーターに対しては効果が無いと考えられていた。
　なお抗サイレンシング効果を有する他の配列としては、最も広く用いられているヒトＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ遺伝子領域内に由来するｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＵＣＯＥ）が、抗サイレンシング活性を有するという報告がある。
　その一例として非特許文献２には、抗サイレング活性を有する１，５ｋｂｐの配列（Ａ２ＵＣＯＥ）を同定したことが開示されている。更に非特許文献２には、Ａ２ＵＣＯＥ及びその断片が、脾フォーカル形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターの活性に対して抗サイレンシング効果を示したことも開示されている。
　非特許文献３と特許文献２には、ヒトＳＵＲＦ１－ＳＵＲＦ２遺伝子領域内に由来する約１ｋｂの抗サイレンシング配列である、ＳＵＲＦ－ＵＣＯＥを同定したことが開示されている。さらに非特許文献３と特許文献２には、ＳＵＲＦ－ＵＣＯＥ及びその部分配列が、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＭＶ、及びＲＳＶプロモーターの活性に対して抗サイレンシングを示したことが開示されている。
　すなわち非特許文献２、非特許文献３及び特許文献２の開示は、ヒト遺伝子領域内のＵＣＯＥが連結されたプロモーターにおいてサイレンシングを抑制されたことに関連している。しかしながら、ＵＣＯＥには内在性プロモーター配列、タンパク質をコードするエクソン及びイントロンを含まれているため、目的遺伝子を所定のプロモーターの制御下に発現させる際に、ＵＣＯＥに含まれる内在性プロモーターからの転写や、エクソン／イントロンの存在が予期せぬ結果をもたらす懸念がある。
　非特許文献４には、ヒト4番染色体テロメア領域に存在する３．３ｋｂのマイクロサテライト配列であるＤ４２４及びその部分配列が、ヒトＥＦ１αプロモーター活性のサイレンシングを抑制することが開示されている。なお上記のＤ４２４及びその部分配列は、ＤＵＸ遺伝子の読み枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を含んでいる。そのために、Ｄ４２４及びその部分配列を付加して遺伝子を発現させた場合には、そのＯＲＦがコードするタンパク質も発現してしまう懸念がある。
国際公開番号　ＷＯ２０１１/０７１１４７ 国際公開番号　ＷＯ２０２０/２２３１６０
Ｋａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　４１５　４３９－４４４（２０１１） Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　［７－７９１９］，（２０１７） Ｒｕｄｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＢｉｏＲｘｉｖ，（２０１９），　Ｄｏｉ：１０．１１０１／６２６７１３ Ｒｉｖａｌ－Ｇｅｒｖｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　ｖｏｌ．２１，　１５３６－１５５０，（２０１３）
　本発明の課題は、目的遺伝子の安定的な高発現を可能とする新たな手段を提供することである。より具体的にはヒトＵｂＣ遺伝子プロモーターの上流ゲノム配列であって、且つ特許文献１と非特許文献１のプロモーター活性化配列よりも小さなサイズを有するプロモーター活性化配列を取得することである。
　本発明者らは鋭意検討した結果、配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡ断片がプロモーターを活性化することを見出した。更に該プロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的遺伝子を含む発現ベクターを作製し、該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞に作製した。そして本発明者らは該哺乳動物細胞おいてサイレンシングが抑制され、目的遺伝子の安定的な高発現を得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　従って、本発明は、以下の（１）～（１７）の特徴を有する。
（１）配列番号１で示される塩基配列又はそれと８５％以上の配列同一性を有する塩基配列の中の８５０以上の塩基配列を含む、プロモーター活性化配列。
（２）(１）に記載のプロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む発現ベクター。
（３）前記プロモーターが、構成的発現プロモーターである、（２）に記載の発現ベクター。
（４）前記構成的発現プロモーターが、ＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、（３）に記載の発現ベクター。
（５）（１）に記載のプロモーター活性化配列を、前記プロモーターの５’側上流に含む（２）～（４）のいずれかに記載の発現ベクター。
（６）哺乳動物の人工染色体ベクターである、（２）～（５）のいずれかに記載の発現ベクター。
（７）ヒト人工染色体ベクターである、（６）に記載の発現ベクター。
（８）（２）～（７）のいずれかに記載の発現ベクターを保持する哺乳動物細胞。
（９）前記動物細胞がヒト細胞又はＣＨＯ細胞である、（８）に記載の細胞。
（１０）前記ヒト細胞が、ヒト多能性幹細胞又はヒト体性幹細胞である、（９）に記載の細胞。
（１１）前記ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞であり、前記ヒト体性幹細胞がヒトＭＳＣ細胞である、（１０）に記載の細胞。
（１２）（１）に記載のプロモーター活性化配列の存在により、前記目的ＤＮＡの安定的な高発現を示す、（８）～（１１）のいずれかに記載の細胞。
（１３）前記目的ＤＮＡの安定的な高発現が、前記目的ＤＮＡの発現増強活性及び／又は抗サイレンシング活性によりもたらされる、（１２）に記載の細胞。
（１４）（２）～（７）のいずれかに記載の発現ベクターを保持する非ヒト哺乳動物。
（１５）（８）～（１３）のいずれかに記載の哺乳動物細胞を、動物細胞培養用の培地内で培養し、該培養により得らえた培養物から前記目的ＤＮＡがコードするタンパク質を採取することを含む、前記目的ＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造する方法。
（１６）（２）～（７）のいずれかに記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞において、前記目的ＤＮＡのサイレンシングを抑制する方法。
（１７）（２）～（７）のいずれかに記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞において、前記目的ＤＮＡの発現を増強する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-186122号の開示内容を包含する。
　本発明により、配列番号１で示される塩基配列中の８５０以上からなる塩基配列を含む、プロモーター活性化配列が提供された。更に本発明により、該プロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的遺伝子を含む発現ベクターが提供された。該発現ベクターを導入した哺乳動物細胞において、該目的遺伝子の安定的且つ効率的な発現を行うことが可能となる。
図１は、本願配列（配列番号１：約２．５ｋｂ）付近の遺伝子マップである。この遺伝子マップは、ＵＳＣＣ　ｇｅｎｏｍｅ　ｂｒｏｗｓｅｒより得た、ヒト１２番染色体の１２４，９１０，０００～１２４，９５５，０００の領域を示す。「本願配列（約２．５ｂｐ）」という記載で示されている棒線は、配列番号１（２５４９ｂｐ）で示される塩基配列に対応する領域を示す。「約０．８ｂｐ）」という記載で示されている棒線は、配列番号１（２５４９ｂｐ）の中の、下記の実施例で使用されている約０．８ｂｐで示される塩基配列に対応する領域を示す。左向きの矢印で示されているのは、１２番染色体におけるＵｂＣ遺伝子（左側）とＤＨＸ３７遺伝子（右側）が存在する領域である。「１５ｋｂ領域」いう記載の左側にある棒線は、特許文献１と非特許文献１に開示されている１５ｋｂの塩基配列に対応する領域を示す。 図２は、１コピーの発現ユニットが２１ＨＡＣ２に挿入されたＨＡＴ耐性クローンを作製するスキームを示した図である。 図３は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）導入用の赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）発現ベクターであるＸ３．１－ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡ（ｐＵｍｓベクター）を構築するスキームを示す図である。 図４は、ｐＵｍｓベクターにＵｂＣ遺伝子上流ゲノムを付加した、ｐＵＬ０．８ｍｓベクターとｐＵＬ２．５ｍｓベクターを構築するスキームを示す図である。 図５は、ｐＳＵＬ４ｍｓベクターを構築するスキームを示す図である。 図６は、ｐＳＵＬ１５ｍｓベクターを構築するスキームを示す図である。 図７は、ｐＵｍｓベクター又はｐＵＬ２．５ｍｓベクターを挿入した２１ＨＡＣベクターが導入されたＣＨＯ細胞（ＨＡＴ耐性クローン）について、遺伝子導入７週間培養後に、赤色蛍光タンパク質の発現を指標として、ＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。太い四角で囲まれた部分は陽性画分を示す。左側の図はｐＵｍｓベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１６６２である。右側の図はｐＵｍｓ２．５ｍｓベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は４３０２である。 図８は、ｐＵｍｓベクター、ｐＵＬ０．８ｍｓベクター、又はｐＵＬ２．５ｍｓベクターが導入されたＭＳＣ細胞について、導入から２週間後に赤色蛍光タンパク質の発現を観察した結果を示す写真である。図８の上段は明視野像であり、下段は赤色蛍光像である。また図８の左側はｐＵｍｓベクターを導入した細胞の写真であり、中央はｐＵＬ０．８ｍｓベクターを導入したＭＳＣ細胞の写真であり、右側はｐＵＬ２．５ｍｓベクターを導入した細胞の写真である。 図９は、ヒト人工染色体導入用のオレンジ色発現ベクターであるｐＵｂＣ－ｈＫＯ＋ＭＣＳベクター（ｐＵＬベクター）と、ｐＵＬベクターにヒトＵｂＣ遺伝子５’上流のゲノム配列約２．５ｋｂを付加したｐＵＬ２．５ベクターを構築するスキームを示す図である。 図１０は、ヒト人工染色体導入用のオレンジ色発現ベクターであるｐＳＵｋｂベクターにＵｂＣ遺伝子５’上流のゲノム配列約１５ｋｂを付加したｐＳＵＬ１５ベクターの構築のスキームを示す図である。 図１１－１は、ｐＵＬベクター、ｐＵＬ２．５ベクター又はｐＳＵＬ１５ベクターが挿入されたＢａｓａｌ－ＨＡＣベクターが導入されたＣＨＯ細胞（ＨＡＴ耐性クローン：各６クローン）について、オレンジ色蛍光タンパク質の発現を指標として、ＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。太い四角で囲まれた部分は陽性画分を示す。上段の図はｐＵＬベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１３００である。中段の図はｐＵＬ２．５ベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１４４００である。下段の図はｐＳＵＬ１５ベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１４０００である。 図１１－２は、ｐＵＬベクター、ｐＵＬ２．５ベクター又はｐＳＵＬ１５ベクターが挿入されたＢａｓａｌ－ＨＡＣベクターが導入されたＣＨＯ細胞（ＨＡＴ耐性クローン：各６クローン）について、オレンジ色蛍光タンパク質の発現を指標として、ＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。太い四角で囲まれた部分は陽性画分を示す。上段の図はｐＵＬベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１３００である。中段の図はｐＵＬ２．５ベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１４４００である。下段の図はｐＳＵＬ１５ベクターを有するＣＨＯ細胞についてのＦＡＣＳ解析のデータであり、陽性ピーク中央値は１４０００である。 図１２は、ＥＦ１α遺伝子プロモーターを用いたｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターであるｐＥＦｍｓベクター、ｐＥＦｍｓベクターにＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列２．５ｋｂを付加したｐＥＦ２．５ｍｓベクター、ＰＧＫ遺伝子プロモーターを用いたｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターであるｐＰＧＫｍｓベクター、ｐＰＧＫｍｓベクターにＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列２．５ｋｂを付加したｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターの構造を示す図である。 図１３は、ｐＥＦｍｓベクター又はｐＥＦ２．５ｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたＣＨＯ細胞（ＨＡＴ耐性細胞集団）について、導入から４週間培養後と７週間培養後に、赤色蛍光タンパク質の発現を指標としてＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。太い四角で囲まれた部分は陽性画分を示す。左側の図はｐＥＦｍｓベクターを有するＣＨＯ細胞についてのデータであり、右側の図はｐＥＦ２．５ｍｓベクターを有するＣＨＯ細胞についてのデータである。上段の図は遺伝子導入から４週間培養後のデータであり、下段の図は遺伝子導入から７週間培養後のデータである。 図１４は、ｐＰＧＫｍｓベクター又はｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたＣＨＯ細胞（ＨＡＴ耐性細胞集団）について、導入から４週間培養後と７週間培養後に、赤色蛍光タンパク質の発現を指標としてＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。太い四角で囲まれた部分は陽性画分を示す。左側の図はｐＰＧＫｍｓベクターを有するＣＨＯ細胞についてのデータであり、右側の図はｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターを有するＣＨＯ細胞についてのデータである。上段の図は遺伝子導入から４週間培養後のデータであり、下段の図は遺伝子導入から７週間培養後のデータである。 図１５は、ｐＰＧＫｍｓベクター又はｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたヒト間葉系幹細胞（ＨＡＴ耐性細胞集団）について、電気パルスによる導入から４週間培養後にＦＡＣＳ解析を行ない、赤色蛍光タンパク質の発現を指標としてＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。上段の図はｐＰＧＫｍｓベクターを有するヒト間葉系幹細胞についてのデータであり、下段の図はｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターを有するヒト間葉系幹細胞についてのデータである。 図１６は、ＳｐｅＩおよびＦｓｅＩで消化したｐＵＬ２．５ｍｓベクターに、ＳｐｅＩおよびＦｓｅＩで消化されたｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ増幅断片を挿入した、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターの構造を示す図である。 図１７は、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターから２．５ｋｂの領域が削除されたｐＵｍＮｓベクターの構造を示す図である。 図１８は、ｐＵｍＮｓベクター又はｐＵｍＬ２．５ｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたネオマイシン耐性ＣＨＯ細胞（Ｇ４１８耐性細胞）について、電気パルスによる導入から２週間培養後にＦＡＣＳ解析を行ない、赤色蛍光タンパク質の発現を指標としてＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。上段の図はｐＵｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞についてのデータであり、下段の図はｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを有するヒト間葉系幹細胞についてのデータである。ｐＵｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ陽性（Ｐ７の画分）の細胞数は、２０８２６個中１１３６個（５．５％）であった。ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ陽性（Ｐ７の画分）の細胞数は、１２５９５個中１４８１個（１１．８％）であった。 図１９は、ｐＵｍＮｓベクター又はｐＵｍＬ２．５ｍｓベクターを導入した後、７日目に観察されたＧ４１８耐性ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）コロニーの写真である。同一条件でベクター導入を行った結果、ｐＵｍＬ２．５ｍｓベクターを導入した場合の方が多数のＧ４１８耐性コロニーが出現した。 図２０－１は、ｐＵＬベクター又はｐＵＬ２．５ベクターが挿入されたＢａｓａｌ－ＨＡＣベクターが導入されたヒトｉＰＳクローンについて、オレンジ色蛍光タンパク質の発現を指標として、ＦＡＣＳ解析を行った結果を示している。図２０－１は代表的なクローンのＦＡＣＳ解析のデータであり、太い四角で囲まれた部分はＫｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）陽性画分を示す。横軸はＫＯの蛍光強度を示し、縦軸はＣｏｕｎｔを示す。 図２０－２は、ｐＵＬベクター又はｐＵＬ２．５ベクターが挿入されたＢａｓａｌ－ＨＡＣベクターが導入されたヒトｉＰＳクローン（ＨＡＴ耐性クローン：各１２クローン）について、オレンジ色蛍光タンパク質の発現を指標として、ＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した図である。図２０－２はＫＯが導入されたｉＰＳクローンの平均蛍光強度を示す。図２０－２の左側のバーはｐＵＬベクターが導入されたヒトｉＰＳクローンにおける平均蛍光強度を示し、右側の値はｐＵＬ２．５ベクターが挿入されたヒトｉＰＳクローンにおける平均蛍光強度を示す。＊Ｐ＜０．０１は、ｔ検定の結果、有意水準１％で優位差があることを示す。 図２１－１は、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｎｅｏ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞Ｍｉｘ（ｎ＝３）の、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した結果を示す。ｐＵｍＮｓベクター又はｐＵｍＬ２．５ｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたネオマイシン耐性ＣＨＯ細胞（Ｇ４１８耐性細胞）集団について、電気パルスによる導入から２週間目、４週間目、又は７週間目にＦＡＣＳ解析を行ない、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ強陽性の割合を評価した。図２１－１の太い四角で囲まれた部分はｍＣｈｅｒｒｙ-Ｎｅｏ陽性画分（Ｐ６）を示す。横軸はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度を示し、縦軸はＣｏｕｎｔを示す。 図２１－２は、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｎｅｏ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞Ｍｉｘ（ｎ＝３）のｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した結果を示す。ｐＵｍＮｓベクター又はｐＵｍＬ２．５ｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたネオマイシン耐性ＣＨＯ細胞（Ｇ４１８耐性細胞）集団について、電気パルスによる導入から２週間目、４週間目、又は７週間目にＦＡＣＳ解析を行ない、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ強陽性の割合を評価した。図２１－２は、導入から２週間目（２ｗｅｅｋ)、４週間目（４ｗｅｅｋ)、７週間目（７ｗｅｅｋ)において、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ強陽性画分（図２１－１のＰ６）の細胞数の割合を測定した結果を示す図である。ｍＣｈｅｒｒｙをランダムに挿入したＣＨＯ細胞集団（３つの独立した実験、ｎ＝３）における、ｍＣｈｅｒｒｙ強陽性画分の細胞数の割合（％）を、ｐＵｍＮｓベクターの場合（左側の３つのバー：２週間目、４週間目、７週間目）と、ｐＵ２．５ｍＮｓベクター（右側の３つのバー：２週間目、４週間目、７週間目）において比較した。 図２２は、ｐＥＦｍｓベクター及びｐＥＦ２．５ｍｓベクター（図１２）において、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子をｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ（ネオマイシン耐性）融合遺伝子と置換することにより構築した、ｐＥＦｍＮｓベクター及びｐＥＦ２．５ｍＮｓベクターの構造を示す図である。 図２３は、ＣＨＯ細胞へのランダム挿入遺伝子導入において、ＥＦ１Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討を行なった結果を示す。ｐＥＦｍＮｓベクター又はｐＥＦｍＮｓｍｓベクターを挿入したＨＡＣベクターが導入されたネオマイシン耐性ＣＨＯ細胞集団において、電気パルスによる導入から４週間培養後に、赤色蛍光タンパク質の発現を指標としてＦＡＣＳ解析を行った結果を比較した。上から1番目～２番目の図はｐＥＦ２．５ｍＮｓベクターを有するＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析のデータであり、上から３番目～５番目の図はｐＥＦｍＮｓベクターを有するＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析のデータである。各ＦＡＣＳ解析のデータにおいて、全細胞数におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の中央値と、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合も併せて示す。
１．本発明のプロモーター活性化配列
　本発明のプロモーター活性化配列は配列番号１で示される塩基配列又はその塩基配列において変異を有する塩基配列の中の８５０以上の塩基配列を含む。配列番号１で示される塩基配列は、ヒト染色体ＤＮＡ上のＵｂＣ遺伝子の発現プロモーターの、更に上流に位置する配列である。より具体的には配列番号１で示される塩基配列は、ヒト１２番染色体の１２４，９２７，０４５～１２４，９２９，５９３番に対応する２５４９ｂｐの塩基配列である。ヒト１２番染色体の塩基配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋにＮＣ＿００００１２．１２として開示されている。配列番号１の塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のプロモーター活性化配列は、最も好ましくは、配列番号１の全塩基配列、すなわち配列番号１の２５４９ｂｐの塩基配列からなる。しかし本発明のプロモーター活性化配列は、それより短い配列番号１の部分配列であってもよい。例えば配列番号１の塩基配列の１５００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上、又は８５０ｂｐ以上からなるものでも良い。
　上記で述べたように本発明のプロモーター活性化配列は、配列番号１の塩基配列において変異を有する塩基配列も包含する。すなわち配列番号１の塩基配列において変異を有する塩基配列とは、配列番号１で表される塩基配列と好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列をあげることができる。塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とすることができる。
　更に本発明のプロモーター活性化配列は、配列番号１で表される塩基配列において１個～数個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列も包含する。ここで数個とは１０個以内、好ましくは８個以内、更に好ましくは６個以内、最も好ましくは４個以下を意味する。
　更に本発明のプロモーター活性化配列は、配列番号１で示される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列も包含する。ここでストリンジェントな条件下とは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，６．３．１－６．３．６，　１９９９に記載される条件、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ／５０～６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
　なお、下記の実施例で示すように、配列番号１の配列の一部である図１の「約０．８ｋｂ」の塩基配列を本発明のプロモーター活性化配列として使用した場合には目的とする効果は得られなかった。よって本発明のプロモーター活性化配列としては、配列番号１で示される塩基配列中の８５０以上の塩基配列が必要であると考えられる。図１の「約０．８ｋｂ」の塩基配列を配列番号２とし、その塩基配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　既に述べたように特許文献１と非特許文献１には、ヒト染色体ＤＮＡ上のＵｂＣ遺伝子のプロモーターの上流に位置する約１５ｋｂのＤＮＡ配列が、遺伝子発現を増強することが開示されている。ＵＳＣＣ　ｇｅｎｏｍｅ　ｂｒｏｗｓｅｒより得た、ヒト１２番染色体の１２４，９１０，０００～１２４，９５５，０００の領域の遺伝子マップを図１に示す。
　図１において左向きの矢印で示されているのは、１２番染色体におけるＵｂＣ遺伝子（左側）とＤＨＸ３７遺伝子（右側）が存在する領域である。ヒト１２番染色体における塩基番号を示す線の下に、「本願配列（約２．５ｂｐ）」という記載で示されている棒線は、配列番号１（２５４９ｂｐ）で示される塩基配列に対応する領域を示す。更にその下にある「１５ｋｂ領域」いう記載の左側にある棒線は、特許文献１と非特許文献１に開示されている１５ｋｂの塩基配列に対応する領域を示す。この１５ｋｂの塩基配列は、ヒト１２番染色体（ＮＣ＿００００１２．１２　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１２，　ＧＲＣｈ３８．ｐ１３　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ）の１２４９１４９８１～１２４９２９６４６の領域に相当する。
　特許文献１と非特許文献１には、プロモーター活性化配列が１５ｋｂ、４ｋｂ、１．３ｋｂと短くなるに従って、活性増強効果が低下したことが開示されている。すなわち特許文献１と非特許文献１には、１５ｋｂ、４ｋｂ、１．３ｋｂのプロモーター活性化配列をプロモーターに連結したベクターを導入したＣＨＯ細胞において、目的遺伝子であるエリスロポエチン遺伝子から産生されたエリスロポエチンの産生量を指標として、それぞれ４．５倍、２．５倍、１．２倍の活性増強作用が得られたことが開示されている。特許文献１と非特許文献１の開示によれば、長い配列（１５ｋｂ）では活性増強効果が高くなり、それより短い部分配列のみでは、１５ｋｂの配列と同等の活性増強効果を達成することはできない。
　よって上記の１５ｋｂの部分配列である本発明の約２．５ｋｂの配列（配列番号１）の本発明のプロモーター活性化配列が、先行技術の１５ｋｂの配列と同程度にプロモーター活性化作用を有することは予測されるものではなかった。
　加えて汎用的なＥＦ１α、ＰＧＫ、ＵｂＣプロモーターは全て２ｋｂ以下の領域に位置し、ハウスキーピング遺伝子プロモーターの機能に必要な配列要素は転写開始点を含む１～２ｋｂの領域に含まれると一般的に考えられている。よってその点からも、ヒトＵｂＣ遺伝子プロモーターから約１３ｋｂ離れ、隣接するＤＥＡＨ－ｂｏｘ　ｈｅｌｉｃａｓｅ３７（ＤＨＸ３７）遺伝子との中間付近に位置する本発明の配列番号１の塩基配列（２５４９ｂｐ）が、約１５ｋｂ領域と同等の活性増強効果を持つとは予測されなかった。
　以上述べてきた理由から配列番号１又はその部分配列からなる塩基配列（すなわち本発明のプロモーター活性化配列）が、プロモーター活性化配列としての機能を有することは全く予測されず、その効果は驚くべきものであった。
２．本発明の発現ベクター
　本発明の発現ベクターは１．に記載のプロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む。
　本発明における目的ＤＮＡは、発現させてそれがコードするタンパク質の取得を目的とするＤＮＡ、あるいは、それを導入することによって目的とする遺伝子治療の効果を達成するＤＮＡであり、例えば、遺伝子もしくは遺伝子座、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、修飾ＤＮＡなどの核酸を含む。
　本発明において目的ＤＮＡは、非限定的に、例えば、疾患原因遺伝子、治療用遺伝子、それらの遺伝子を含む染色体断片、細胞分化に必要な遺伝子などを包含し、例えば、サイトカイン類、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン（細胞遊走活性をもつ因子）、顆粒球コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、成長因子（例えば血小板由来生長因子、血管内皮成長因子、肝細胞成長因子、ケラチノサイト増殖因子、神経成長因子、上皮幹細胞増殖因子、造血幹細胞増殖因子等）、栄養因子（例えば神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、等）、エリスロポエチン、血液凝固系タンパク質、血小板産生促進因子、ホルモン類、抗体類（例えば、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖなどの組換え抗体、等）、酵素類などのタンパク質をコードする遺伝子もしくはＤＮＡを含むことができる。目的ＤＮＡはさらに、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患、腫瘍などの疾患に関連する治療用遺伝子もしくはＤＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの免疫系遺伝子又はＤＮＡを含むことができる。
　本発明における目的ＤＮＡから、それがコードするタンパク質が発現する。本明細書中の「タンパク質」という用語は、特に断らない限り、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含み、産業上有用であればいずれのタンパク質でもよく、ヒト由来タンパク質が好ましい。当該タンパク質の例は、上記で述べた病気の治療や予防、あるいは病気の診断などに使用するための任意のタンパク質を含む。
　本発明の発現ベクターは本発明のプロモーター活性化配列を、上記プロモーターの５’側上流に含んでも、３’側下流に含んでもよい。より好適には、本発明の発現ベクターは、本発明のプロモーター活性化配列を上記プロモーターの５’側上流に含む。
　本発明のベクターに含まれるプロモーターとして、哺乳動物細胞中でプロモーターとしての機能を発揮できるものであれば何れも用いることができ、特に限定されるものではない。構成的プロモーターは常に目的ＤＮＡを一定量発現させるので、本発明の目的において有利である。よって好適には、本発明で使用するプロモーターは、本技術分野で発現ベクターの構成的な発現を活性化することが知られている構成的発現プロモーターであり、好ましくはハウスキーピング遺伝子のプロモーターである。
　そのような構成的プロモーターの例として、ヒトポリペプチド伸長因子１α遺伝子プロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫプロモーター）及びヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター等の非ウイルスプロモーター、並びにＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧ等のウイルスプロモーターを挙げることができる。本発明で使用されるプロモーターは特に好ましくは、下記の実施例で使用しているＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、又はＵＢＣプロモーターである。
　本発明のプロモーター活性化配列、プロモーター及び目的ＤＮＡを含むＤＮＡカセットを発現ベクターへ挿入することにより、本発明の発現ベクターを作製することができる。本発明において、プロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを導入する発現ベクターは、該ベクターに挿入した目的ＤＮＡを発現させるために適当な位置にプロモーターを有し、哺乳動物細胞中において該目的ＤＮＡからタンパク質を発現することができるものであれば特に限定されるものではない。なお上記ＤＮＡカセットの１つの例として、それに限定されるものではないが、アンピシリン耐性遺伝子、ＨＳ４（下記で述べるインスレーター配列）、ポリＡ配列、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）遺伝子のコード領域配列、ＵＢＣＰプロモーター配列、本発明のプロモーター活性化配列（２．５ｋｂ）、及びさらにＨＳ４を有するｐＵＬ２．５ｍｓを挙げることができる（実施例において述べる図４を参照）。
　本発明においてそれに限定されるものではないが、哺乳動物の人工染色体ベクターやプラスミドベクターを用いることは好適である。しかしそれに限定されるものではなく、本発明において従来のベクター系である、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドなども使用することができる。
　ここで哺乳動物の人工染色体ベクターとしては、特に限定されるものではないが、例えばヒト、サル、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類、イヌ、ネコなどの人工染色体ベクターを挙げることができる。特に好適な哺乳動物の人工染色体ベクターは、ヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；ＨＡＣ）ベクター、マウス人工染色体（Ｍｏｕｓｅ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；　ＭＡＣ）ベクター、及びラット人工染色体（Ｒａｔ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；ＲＡＣ）ベクターである。ヒト人工染色体ベクターは最も好適なベクターであり、具体的なヒト人工染色体ベクターとしては、ヒト２１番染色体を利用した２１ＨＡＣやヒト１４番染色体を利用した１４ＨＡＣ、ヒト２番染色体を利用した２ＨＡＣなどを挙げることができる。
　本明細書中の「人工染色体ベクター」は、上記哺乳動物由来の染色体のセントロメア、長腕及び、もしあれば、短腕のセントロメア近傍の断片（可能なかぎり遺伝子類が除去されている。）、及び天然もしくは人工テロメアを含む、人工的に作製された染色体由来ベクターを指す。
　マウス人工染色体ベクターについては、例えば日本国特許第５５５７２１７号公報、日本国特許第４９９７５４４号公報などに、またヒト人工染色体ベクターについては、例えば日本国特許第４８９５１００号公報にそれぞれ記載されている。
　ヒト人工染色体ベクターの作製に使用するためのヒト染色体は、ヒト染色体１～２２、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番～２２番染色体のいずれかである。或いは、ヒト染色体ベクターとして、ヒトｉＰＳ細胞由来の染色体を使用することができる。ヒト人工染色体の作製は、例えば特開２０１０－００４８８７号公報、ＷＯ２００８／０１３０６７などに記載されている方法、マウス人工染色体ベクターの作製に関する上記文献に記載される手法などを参照することができる。
　マウス人工染色体ベクターの作製に使用するためのマウス染色体は、マウス染色体１～１９、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番～１９番染色体のいずれかである。例えばマウス１１番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、上記長腕断片は、非限定的に例えば、該１１番染色体の長腕のＡＬ６７１９６８、或いはＢＸ５７２６４０（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、ＣＲ９５４１７０（ＡＬ６７１９６８及びＢＸ５７２６４０よりセントロメア側に位置する。）又はＡＬ７１３８７５（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１５番染色体断片由来のマウス人工染色体ベクターの場合、上記長腕断片は、例えば、ＡＣ１２１３０７、ＡＣ１６１７９９などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１６番染色体断片由来のマウス人工染色体ベクターの場合、上記長腕断片は、例えば、ＡＣ１２７６８７、ＡＣ１４０９８２などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。
　上記の人工染色体ベクターはさらに、所望の核酸（例えば遺伝子、遺伝子座、染色体断片など）を挿入するための、ｌｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位）、ＦＲＴ（Ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位）、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ（φＣ３１リコンビナーゼ認識部位）、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ（Ｒ４リコンビナーゼ認識部位）、ＴＰ９０１－１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１－１ａｔｔＰ（ＴＰ９０１－１リコンビナーゼ認識部位）、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位）などのＤＮＡ配列挿入部位を含むことができる。また、上記の人工染色体ベクターは、所望の核酸配列を挿入するための部位を含むことができるため、この部位に、所望の核酸を組み込むことによって、該人工染色体ベクターが任意の細胞に導入されたときに該所望の核酸を発現することが可能となる。
　また所望の核酸配列を挿入するための特定ＤＮＡ配列挿入部位を使用せずに、本発明のプロモーター活性化配列、プロモーター及び目的ＤＮＡを含むＤＮＡカセットを人工染色体に導入することにより、本発明の目的を達成することができる。
　なお下記の実施例１３と実施例１４は、人工染色体ベクターにＤＮＡカセットを挿入する際に部位特異的組み換え酵素／該酵素認識部位を使用しない例示であって、この場合には該ベクターのセントロメア及びテロメア以外の任意の部位、あるいは該細胞のゲノムにＤＮＡカセットがランダムに挿入される。
　あるいは上記ＤＮＡカセットが挿入された、プラスミドベクターやウイルスベクター等の他のベクターを細胞に導入して、該細胞のゲノムに特異的に又はランダムに前記ＤＮＡカセットを挿入することも可能である。ＤＮＡカセットをゲノムに挿入する技術として、例えばジーンターゲティング法又はゲノム編集技術を用いて、所望の標的部位又はランダムにＤＮＡカセットを挿入することも可能である。
　ゲノム編集は、例えばＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒヌクレアーゼ）、ＺＦＮ（Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼ）などの人工切断酵素、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどを使用してゲノムＤＮＡの編集や遺伝子改変を行う技術である。上記システムのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌のウイルスやプラスミドに対する適応免疫機構から発見されたが、ベクターの構築が比較的簡便であり、複数の遺伝子を同時に改変することが可能である（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７，３３７（６０９６）：８１６－８２１，２０１２；Ｓａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５，２０１４）。このシステムは、ゲノム上の二本鎖ＤＮＡを切断するＣａｓ９ヌクレアーゼと、ゲノム上の標的配列を認識する約２０塩基対の配列をもつガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ又は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ）＋ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ））とを含む。細胞内でこれらを共発現させることにより、ｇＲＮＡが標的配列近傍のＰＡＭ配列を認識して標的ゲノムＤＮＡと特異的に結合し、Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列（ＮＧＧ（Ｎ＝Ｃ，Ｇ，ＡもしくはＴ））の５’側上流で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。このとき、細胞内に上記ＤＮＡカセットを含むベクターが存在すると、該ＤＮＡカセットを上記切断部位に挿入させることができる。
　哺乳動物人工染色体ベクターには、好ましくは、目的とする上記遺伝子又は遺伝子座の配列の他に、レポーター遺伝子を挿入してもよい。レポーター遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ又はＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、等）遺伝子、タグタンパク質コードＤＮＡ、β－ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
　哺乳動物人工染色体ベクターにはさらに、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカーは、該ベクターで形質転換された細胞を選別する際に有効である。選択マーカー遺伝子としては、ポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子のいずれか、又はその両方が例示される。ポジティブ選択マーカー遺伝子には、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ（ＢＳ）耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが含まれる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子には、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡ断片（ＤＴ－Ａ）遺伝子などが包含される。一般に、ＨＳＶ－ＴＫは、ガンシクロビル又はアシクロビルと組み合わせて使用される。
　本発明における発現ベクターである人工染色体ベクターも、本発明のプロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む核酸を挿入することができる核酸挿入部位が含まれており、この部位に該核酸が挿入される。
　本発明の人工染色体における上記核酸挿入部位の近傍又は挿入部位の両側には、少なくとも１つのインスレーター配列を存在させることができる。インスレーター配列は、エンハンサーブロッキング効果（すなわち、隣り合う遺伝子が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を有する。このような配列には、例えばヒトβグロビンＨＳ１～ＨＳ５、ニワトリβグロビンＨＳ４などが包含されてもよい。
　上記供与細胞に、例えばゲノム編集法や部位特異的組み換え法などの遺伝子導入技術を用いて供与細胞中のヒト人工染色体、哺乳類人工染色体などの人工染色体上に、本発明のプロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む核酸を導入することができる。核酸を導入した後に、目的ＤＮＡを含む供与細胞は、例えばＨＡＴ選択法によって検出し回収することができる。
３．本発明の哺乳動物細胞
　上記の外来遺伝子発現用ベクターを、宿主細胞である哺乳動物細胞に導入することにより、本発明の発現ベクターを含む哺乳動物細胞（以下、単に本発明の哺乳動物細胞と略記する）を作製することができる。
　本発明において宿主細胞として使用される哺乳類細胞は、目的ＤＮＡの核酸増幅を起こすことができるのであれば特に限定されず、哺乳動物の体細胞、哺乳動物の幹細胞、哺乳動物の株化細胞、ヒト細胞、齧歯類の細胞（ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞等）が挙げられる。好適な例として、特にヒト細胞とハムスター細胞が好適に使用される。
　ヒト細胞においては、ヒト由来の幹細胞、例えばヒト多能性幹細胞、又はヒト体性幹細胞を用いることができる。とりわけヒト体性幹細胞においてはヒト間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＭＳＣ細胞）を用いること、ヒト多能性幹細胞においてはヒト人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）を用いることは特に好適である。
　またマウス細胞又はラット細胞においても、マウス又はラット由来の幹細胞、例えばマウス又はラット由来の多能性幹細胞又は体性幹細胞を用いることができる。マウス又はラットの体性幹細胞においては、マウス又はラットのＭＳＣ細胞を用いることは特に好適である。マウス又はラットの多能性幹細胞においては、マウス又はラットの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いることは特に好適であり、マウス若しくはラットの胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）を用いることも特に好適である。ラットのＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞の場合と同様に（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ　１９８１；２９２（５８１９）：１５４－１５６）、ラット胚盤胞期胚又は８細胞期胚の内部細胞塊から樹立される、多分化能と自己複製能をもつ細胞株である。
　ハムスター細胞においては、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　ｃｅｌｌ：ＣＨＯ細胞）を使用することは好適であり、より具体的には、例えば、ＣＨＯ―Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４などは特に好適である。
　体細胞の例としては、非限定的に、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞などを挙げることができる。
　なお、本明細書中の「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」は、哺乳動物由来の受精卵の胚盤胞の内部細胞塊から樹立された分化多能性と半永久的増殖能とを備えた幹細胞である（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４－１５６；　Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５－１１４７；　Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：７８４４－７８４８；　Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）　Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４－２５９；　Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８）　Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３－１６５）。
　この細胞と同等の性質をもつ、体細胞の再プログラミングによって人工的に誘導された細胞が「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ　（２００６）　Ｃｅｌｌ　１２６：６６３－６７６；　Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．　（２００７）　Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２；　Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　（２００７）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８：１９１７－１９２０）。ｉＰＳ細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む）に、ある特定の再プログラム化因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３～５週間でコロニーを生成することができる。再プログラム化因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；或いは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ　１２６：６６３－６７６（２００６）；ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８：１９１７－１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１８，６００－６０３（２００８））。
　本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、任意の哺乳動物細胞に移入又は導入することができる。そのための手法には、例えば、微小核細胞融合法、リポフェクション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれるが、好ましい手法はＷＯ２０２０／０７５８２３に開示されている微小核細胞融合法である。
　微小核細胞融合法は、哺乳動物人工染色体ベクターを含有する微小核形成能を有する細胞と、所望の他の細胞との微小核融合によって上記ベクターを上記他の細胞に移入する方法である。微小核形成能を有する細胞は、倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理して微小核多核細胞を形成し、サイトカラシン処理により微小核体を形成する処理を行ったのちに、所望の細胞との細胞融合を行うことができる。
　本発明の発現ベクターを含む哺乳動物細胞は、該発現ベクターに含まれる本発明のプロモーター活性化配列の存在により、発現を目的とするＤＮＡの安定的な高発現を達成することができる。そしてそのような目的ＤＮＡの安定的な高発現は、その目的ＤＮＡの発現増強活性及び／又は抗サイレンシング活性によりもたらされることが、下記に述べる実施例において実証されている。
４．本発明のタンパク質製造方法
　３．に記載の哺乳動物細胞を、動物細胞培養用の培地内で培養し、該培養により得らえた培養物から前記目的ＤＮＡがコードするタンパク質（以下、所望のタンパク質と称する）を採取することにより、所望のタンパク質を製造することができる。上記で述べたように、本発明のプロモーター活性化配列の存在により目的ＤＮＡの安定的な高発現をもたらすからである。
　本発明の動物細胞の培養は、哺乳動物細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　本発明のタンパク質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるタンパク質の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　哺乳類細胞の培養培地は、使用する細胞の種類に適した培地が選択される。通常使用される基礎培地として、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、Ｆ１２培地、Ｍａｃｙ’ｓ　５Ａ培地、あるいはそれの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）などを使用できる。基礎培地にはさらに、血清、血清代替品、抗生物質、グルタミン酸、ピルビン酸などのサプリメントなどの少なくとも１つの成分を補充することができる。培地のｐＨは、例えば、７．２～７．４である。
　ｉＰＳ細胞の培養例は、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（例えば約１０４～１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ－１２培地、それらの混合培地などであり、ＥＳ細胞用培地は、マウスＥＳ細胞用培地、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）などを使用することができる。また例えば、動物由来成分を含まないＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、フィーダーフリー条件でヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞を培養できる。
　ラットのＥＳ細胞は、例えば、卵透明帯を溶解したラット胚盤胞を、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含有する培地を用いてマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦＦ）フィーダー上で培養し、７～１０日後に胚盤胞から形成されるアウトグロウス（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を分散し、これをＭＥＦフィーダー上に移して培養し、約７日後、ＥＳ細胞が出現する。ラットＥＳ細胞の作製については、例えばＫ．Ｋａｗａｈａｒａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２０１５；７（７）：１０５４－１０６３に記載されている。マウスのＥＳ細胞もラットのＥＳ細胞と同様に培養することができる。
　培養は、約２～１０％（通常、約５％）ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、温度は、約３５～４０℃（通常、約３７℃）が適する。
　培養方法は、バッチ培養、フラスコ培養、流加培養、連続培養、浮遊培養、振盪培養、攪拌培養、循環培養などのいずれでもよい。また、細胞凝集を抑制するために、培養中の培養液を中空糸繊維フィルターに通すなどして凝集体をバラバラにするなどの方法を用いることも可能である。
　培養装置は、動物細胞培養に使用される装置を使用できる。装置には、通気、温調、攪拌、ｐＨ、ＤＯ調節機能を備えているのがよい。装置の例は、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置、バッグ式培養装置等を用いて培養することができる。
　タンパク質を高発現させる別の例として、哺乳動物細胞内での目的タンパク質の挙動や生物学的機能をモニターするレポーター遺伝子の高発現が挙げられる。例えば、目的ＤＮＡに、例えば、遺伝子制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を連結したレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードするＤＮＡ）を作動可能（ｏｐｅｒａｂｌｙ）に挿入することができる。レポーター遺伝子が高発現することにより、レポーターアッセイの検出感度を上げることができる。これにより、細胞内である刺激により発現された目的ＤＮＡの挙動を蛍光もしくは発光を指標にして観察することができる。このような観察は、通常、ラボで行うことができるので、細胞の培養は、細胞の種類に応じた固体培地を用いて行うことができる。また、観察は、一般にカメラ付蛍光顕微鏡などを使用して行うことができる。
　タンパク質が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、特開平０５－３３６９６３、またはＷＯ９４／２３０２１などに記載の方法を用いることにより、所望のタンパク質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（特開平２－２２７０７５）を利用して所望のタンパク質の生産量を上昇させることもできる。
　採取の工程では、培養によって産生された所望のタンパク質を得るために、例えば遠心分離もしくは濾過後の上清又は細胞を、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、それらの組み合わせなどに掛けることができる。回収方法は、上記の方法に限定されないものとし、一般にタンパク質の精製に使用可能なあらゆる方法を包含する。
　特に所望のタンパク質が抗体などの糖タンパク質であれば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム又はプロテインＬカラム、あるいはＩｇＧ結合ペプチドカラムを用いて回収することができる。
　所望のタンパク質が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　所望のタンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該タンパク質の不溶体を回収する。回収した該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該タンパク質を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　所望のタンパク質またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該タンパク質またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
５．本発明の発現ベクターを保持する非ヒト動物
　本発明はさらに、本発明の発現ベクターを保持する非ヒト動物を提供する。本明細書中の「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除く、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ科動物等の有蹄類などの哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
　非ヒト動物の作出は、例えば、上記発現ベクターをＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に導入し、この細胞を初期胚に導入したのち、仮親の子宮に移植し、出産させて非ヒト動物を得ることができる。以下に、その作出方法について説明する。
　ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マイトマイシンＣ処理マウス胎仔線維芽細胞をフィーダーにして樹立し維持することができる(Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４－１５６（１９８１）)。
　また、ｉＰＳ細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む）に、ある特定の再プログラム化因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３～５週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；あるいは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ　１２６：６６３－６７６（２００６）；ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８：１９１７－１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１８，６００－６０３（２００８））。培養例は、マイトマイシンC処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（約１０４～１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ－１２培地、それらの混合培地などであり、ＥＳ細胞用培地は、マウスＥＳ細胞用培地、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社、日本）などを使用することができる。
　ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、生殖系列に寄与することが知られているので、目的ＤＮＡを含む本発明の発現ベクターを導入したこれらの細胞を、当該細胞が由来する同種の哺乳動物の胚の初期胚に注入し、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させることを含む手法によって、非ヒト動物（又は、トランスジェニック非ヒト動物）を作製することができる。さらにまた、得られた雌雄のトランスジェニック動物を交配することによって、ホモ接合性動物、さらにその子孫動物を作出することができる。
　さらにまた、上記非ヒト動物を用いて、例えば目的ＤＮＡがコードする異種（例えばヒト）タンパク質を生産する場合、当該目的ＤＮＡに相当する内在性遺伝子が欠失されたもしくは完全に不活性化された動物を使用することができる。
６．本発明の発現ベクターによる遺伝子細胞治療
　本発明の発現ベクターを哺乳動物、特にヒトに投与し、該哺乳動物の体内で目的ＤＮＡがコードするタンパク質を発現させることにより、遺伝子治療を行うことができる。
　更に本発明の発現ベクターを導入した哺乳動物、特にヒトの細胞、あるいは該ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を分化させることにより作製した細胞あるいは組織を投与・移植し、該哺乳動物の体内で目的ＤＮＡがコードするタンパク質を発現させることにより、遺伝子細胞治療を行うことができる。
　すなわち、目的ＤＮＡとして疾患原因遺伝子や治療用遺伝子等を含む本発明の発現ベクター、又は該発現ベクターを導入した細胞や組織を、患者に投与・移植することにより遺伝子細胞治療の効果を得ることが期待される。例えば癌、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、又は遺伝性疾患を有する患者に、それらの疾患の原因遺伝子や治療用遺伝子等、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む本発明の発現ベクター、又は該発現ベクターを導入した細胞や組織を、患者に投与・移植することにより、導入された遺伝子による治療効果を期待することができる。
　なお、下記の実施例においては、プロモーター（ＵＢＣＰプロモーター、ＥＦ１αプロモーター及びＰＧＫプロモーター）の５’側上流に本発明のプロモーター活性化配列（２５４９ｂｐ：配列番号１）を有し、且つ該プロモーターの３’側下流にインジケーター遺伝子（赤色蛍光タンパク質の遺伝子又はオレンジ色蛍光タンパク質）を有するＨＡＣベクターを構築した。そして該ＨＡＣベクターをＣＨＯ細胞又はヒト間葉系細胞に導入し、インジケータータンパク質の発現を指標として、本発明のプロモーター活性化配列の抗サイレンシング効果と活性発現増強効果を評価した。その結果、本発明のプロモーター活性化配列は実際に抗サイレンシング効果と活性発現増強効果を有することが実証された。
　下記の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は該実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］　ヒト人工染色体（ＨＡＣ）導入用赤色蛍光タンパク（ｍＣｈｅｒｒｙ）発現ベクターの構築
　ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）を保持するＣＨＯ　ｈｐｒｔ欠損（ｈｐｒｔ－）細胞株（２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－；Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）において、汎用プロモーターに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果を検討した。Ｉ－ＥＧＦＰ－Ｉ－ｌｏｘＰ－３’ＨＰＲＴベクター（図２；Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）のＣＡＧプロモーター－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡ部分が、他の様々な発現ユニットと置換されたベクターを、Ｃｒｅ発現ベクター（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）と同時に２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－にトランスフェクションすることで、１コピーの当該発現ユニットが２１ＨＡＣ２に挿入されたＨＡＴ耐性クローンが得られる（図２）。
１．ｐＵｍｓベクターの構築
　Ｉ－ＥＧＦＰ－Ｉ－ｌｏｘＰ－３’ＨＰＲＴベクターを鋳型として、ＨＳ４（トリインシュレーター配列要素）とＮｏｔＩ／ＳａｌＩ／ＳｐｅＩを含む断片を増幅した。下記プライマー及びＰｒｉｍｅｓｔａｒ　ＧＸＬ　ｐｒｅｍｉｘ（タカラ）を用い、９８℃１０秒→６８℃４分、３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。またＩ－ＥＧＦＰ－Ｉ－ｌｏｘＰ－３’ＨＰＲＴベクターを制限酵素ＮｃｏＩ（ＮＥＢ）及びＳｐｅＩ（ＮＥＢ）で消化し、上記増幅した断片を挿入してＸ３．１－ＭＣＳベクター（図３）を作製した。ヒトユビキチンＣコアプロモーター（約１．２ｋｂ、Ｓｃｈｏｒｐｐ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２４（９）：１７８７－１７８８　１９９６）、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｎａｔｈａｎ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２２（１２）：１５６７－７２　２００４）遺伝子コード領域、及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列からなる発現ユニットについては、その両端にＮｏｔＩ部位が配置されるように設計し、その配列をベクタービルダー社にて合成した。ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化したＸ３．１－ＭＣＳベクターに、上記合成ＤＮＡ由来のＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡ配列（ＮｏｔＩ断片）を挿入して、Ｘ３．１－ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡを作製した（図３；以下、ｐＵｍｓベクターと称す）。
HS4-F2：5’-ATCCATGGATCGACTCTAGAGGGACAGCC-3’(配列番号３)
HS4-R1：5’-ATAACTAGTCGACGCGGCCGCCTCACTGACTCCGTCCTGGA-3’(配列番号４)
２．ｐＵｍｓベクターにＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列を付加したｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターの構築
　ヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列約１５ｋｂ　（以下ＵＬ１５と称す）内の約２．５ｋｂ領域（図１）又はその部分断片（０．８ｋｂ；図１）がそれぞれ付加された、ＵｂＣＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列からなる発現ユニットを持つＨＡＣ導入用ベクターを以下の手順で作製した（それぞれ、ｐＵＬ０．８ｍｓベクター、ｐＵＬ２．５ｍｓベクターと称す）。２種のヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列は、下記のプライマーをそれぞれ用い、ヒト染色体ＢＡＣクローンＲＰ１１－５９２Ｏ２を鋳型としたＰＣＲ増幅により調製した。下記のプライマー及びＰｒｉｍｅｓｔａｒ　ＧＸＬ　ｐｒｅｍｉｘ（タカラ）を用い、９８℃１０秒→７２℃１０分、５サイクル、９８℃１０秒→７０℃１０分、５サイクル、９８℃１０秒→６８℃１０分、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。さらに増幅断片をＳａｌＩお及びＫｐｎＩで消化し、得られた断片をＳａｌＩ及びＫｐｎＩで消化されたｐＵｍｓベクターにクローニングした。ベクターの構築について概略を図４に示す。
pUL0.8ms-F：5’-CATGTCGACCCAGAGACAACCACAGAACC-3’(配列番号５)
pUL0.8ms-R：5’-AGTGGTACCCGCACGCAGTCCCTGCTGAA-3’(配列番号６)
pUL2.5ms-F：5’-CATGTCGACACCCGGAAGGCGGAGGTTAC-3’(配列番号７)
pUL2.5ms-R：5’-AGTGGTACCAGGAAGTTCAGGAAATTGGC-3’(配列番号８)
３．ｐＳＵＬ１５ｍｓベクターの構築
　ＵＬ１５が付加されたＵｂＣＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列からなる発現ユニットを持つＨＡＣ導入用ベクターを以下の手順で作製した。ｐＳＴＶ２８ベクター（タカラ）をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、下記合成ＤＮＡ配列をアニーリングして作製したＡｓｃＩサイト及びＳｍａＩサイトを含むＤＮＡ断片を挿入し、ｐＳＴＶ２８＋ＭＣＳベクターを作製した（図５）。
pSTV28-MCS_1: 5’-CTAGACCCGGGATTGGCGCGCCG-3’(配列番号９)
pSTV28-MCS_2: 5’-AATTCGGCGCGCCAATCCCGGGT-3’(配列番号１０)
　ヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列約１５ｋｂ（以下ＵＬ１５と称す）内のＵＢＣ遺伝子コード領域近位側約４ｋｂ領域及びＵＢＣ遺伝子コード領域遠位側約１１ｋｂがそれぞれ付加されたＵｂＣＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列からなる発現ユニットを持つＨＡＣ導入用ベクターを、２．に示した通りの方法で作製した（それぞれｐＵＬ４ｍｓベクター、ｐＵＬ１１ｍｓベクターと称す）。２種のヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列は、下記のプライマーをそれぞれ用い、ヒト染色体ＢＡＣクローンＲＰ１１－５９２Ｏ２を鋳型としたＰＣＲ増幅により調製した。下記プライマー及びＰｒｉｍｅｓｔａｒ　ＧＸＬ　ｐｒｅｍｉｘ（タカラ）を用い、９８℃１０秒→７２℃１０分、５サイクル、９８℃１０秒→７０℃１０分、５サイクル、９８℃１０秒→６８℃１０分、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。さらに増幅断片をＳａｌＩおよびＫｐｎＩ消化し、得られた断片をＳａｌＩ及びＫｐｎＩで消化されたｐＵｍｓベクターにクローニングした。
pUL4ms-F：5’-ACTGGTACCATCGATTCAGCCAGGCACATTAGCTC-3’(配列番号１１)
pUL4ms-R：5’-GAGGTCGACCGGGAGCGGGTGGGCGGCCC-3’(配列番号１２)
pUL11ms-F：5’-TATGTCGACATCGATATACAGACATGAGCTAATGT-3’(配列番号１３)
pUL11ms-F：5’-AGTGGTACCAGGAAGTTCAGGAAATTGGC-3’(配列番号１４)
　ｐＳＴＶ２８＋ＭＣＳベクターのＡｓｃＩサイトからＳｍａＩサイト間のＤＮＡ断片を、ｐＵＬ４ｍｓベクターのＵＬ４－ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡを含むＳｃａＩからＡｓｃＩサイト間のＤＮＡ断片と置換して、ｐＳＴＶ－ＵＬ４－ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡを作製した（図５；以下、ｐＳＵＬ４ｍｓベクターと称す）。ｐＳＵＬ４ｍｓベクターをＫｐｎＩ及びＣｌａＩで消化し、ｐＵＬ１１ｍｓベクターのＵＬ１１配列を含むＫｐｎＩからＣｌａＩサイト間のＤＮＡ断片を挿入して、ｐＳＴＶ－ＵＬ１５－ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡを作製した（図６；以下、ｐＳＵＬ１５ｍｓベクターと称す）。
［実施例２］　ＣＨＯ細胞における、ＵＢＣＰ－ｍｃｈｅｒｒｙ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例１で作製したｐＵｍｓベクター又はｐＵＬ２．５ｍｓベクターを、２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞中の２１ＨＡＣ２ベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）とともに２１ＨＡＣ２ベクターを保持する２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン、１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュ１枚に細胞を播種し、４８時間後に２％ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）と１０％　ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で培養し、ＨＡＴ耐性コロニーを取得した。得られたＨＡＴ耐性細胞集団について導入から７週間後にＦＡＣＳ解析を行ない、赤色蛍光タンパク質の発現を評価した。その結果を図７に示す。ｐＵＬ２．５ｍｓベクターが導入されたＨＡＴ耐性細胞集団の陽性ピーク中央値の平均（４３０２）は、ｐＵｍｓベクターが導入された細胞集団の陽性ピーク中央値の平均（１６６２）より高かった。すなわちＵＢＣＰへ２．５ｋｂ断片を付加することにより、プロモーター活性増強効果がもたらされることが示された。
［実施例３］　ヒト間葉系幹細胞における、ＵＢＣＰ－ｍｃｈｅｒｒｙ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例１で作製したｐＵｍｓベクター、ｐＵＬ０．８ｍｓベクター、ｐＵＬ２．５ｍｓベクターを、２１ＨＡＣ２／ヒト不死化間葉系幹細胞（Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＢＲＣ　２９５：３５４－３６１　２００２）ｈｐｒｔ－株中の２１ＨＡＣ２ベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）と共に、２１ＨＡＣ２ベクターを保持する２１ＨＡＣ２／ｈｉＭＳＣｈｐｒｔ－細胞へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン，１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュに細胞を播種し、４８時間後に２％ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）と１０％　ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＤＭＥＭ培地で培養し、ＨＡＴ耐性コロニーを取得した。得られたＨＡＴ耐性細胞について、導入から２週間後に顕微鏡下で赤色蛍光タンパク質の発現を観察した結果を、明視野像と共に図８に示す。ｐＵｍｓベクター、及びｐＵＬ０．８ｍｓベクターが導入された細胞における赤色蛍光強度と比較して、ｐＵＬ２．５ｍｓベクターが導入された細胞における赤色蛍光強度は明らかに強かった。すなわちＵＢＣＰへの約２．５ｋｂ断片の付加は、プロモーター活性増強効果をもたらすこと、及び約０．８ｋｂ断片の付加はその効果が無いことが示された。
[実施例４]　ヒト人工染色体（ＨＡＣ）導入用オレンジ色蛍光タンパク質（Ｋｕｓａｂｉｒａ　Ｏｒａｎｇｅ：　ＫＯ）発現ベクターの構築
　φＣ３１　ａｔｔＢ－ＮｅｏＲ－ｐＵｂｃ－ＫＯ１ベクター（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　２３：６２９－６３９　２０２１に記載）は、ヒトユビキチンＣコアプロモーター（約１．２ｋｂ、Ｓｃｈｏｒｐｐ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２４（９）：　１７８７－１７８８　１９９６）、オレンジ色蛍光タンパク質ＫＯ（ＭＢＬ）遺伝子コード領域、及びウシ成長ホルモン遺伝子由来ｐｏｌｙＡ配列からなる発現ユニットを含む。該ベクターをφＣ３１インテグラーゼ発現ベクター（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　　２３：６２９－６３９　２０２１）と同時にＢａｓａｌ－ＨＡＣ／ＣＨＯ細胞にトランスフェクションすることで、１コピーの当該発現ユニットがＢａｓａｌ－ＨＡＣに挿入されたＧ４１８耐性クローンが得られる（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　２３：６２９－６３９　２０２１）。
　まず、φＣ３１　ａｔｔＢ－ＮｅｏＲ－ｐＵｂｃ－ＫＯ１ベクターをＫｐｎＩで消化し、平滑末端化、セルフライゲーションし、φＣ３１　ａｔｔＢ－ＮｅｏＲ－ｐＵｂｃ－ＫＯ１（ＫｐｎＩ－）ベクター（図９）を作製した。次に下記の配列をアニーリングして作製したＳａｌＩサイト及びＫｐｎＩサイト（マルチクローニングサイト）を含むＤＮＡ断片をＵｂＣプロモーター上流のＳａｌＩサイトに挿入して、ｐＵｂＣ－ｈＫＯ＋ＭＣＳベクターを構築した（以下、ｐＵＬベクターと称す；図９）。
Fw.XhoI-KpnI-SalI: 5’- TCGAGAGTCGGTACCATGCG -3’(配列番号１５)
XhoI-KpnI-SalI: 5’- TCGACGCATGGTACCGACTC -3’(配列番号１６)
　さらに、ｐＵＬベクターのＵＢＣＰにヒトＵｂＣ遺伝子５’上流のゲノム配列約２．５ｋｂを付加したベクターを、実施例１と同様に構築した（図９；ｐＵＬ２．５ベクターと称す）。
　また実施例１で作製したｐＳＴＶ２８＋ＭＣＳベクターのＰｖｕＩサイトからＳａｃＩサイト間のＤＮＡ断片を、ｐＵＬベクターのＵｂＣ－ＫＯ－ＢＧＨｐＡを含むＰｖｕＩからＳａｃＩサイト間のＤＮＡ断片と置換して、ｐＳＴＶ－ＵｂＣ－ｈＫＯ－ＢＧＨｐＡベクターを作製した（以下、ｐＳＵｋｂベクターと称す；図１０）。ｐＳＵｋｂベクターをＳａｌＩ及びＫｐｎＩで消化し、ｐＳＵＬ１５ｍｓベクターのＳａｌＩサイトからＫｐｎＩサイト間のＵｂＣ遺伝子５’上流のゲノム配列約１５ｋｂを含むＤＮＡ断片を挿入してｐＳＵＬ１５ベクターを作製した（図１０）。
［実施例５］　ＣＨＯ細胞における、ＵＢＣＰ－ＫＯ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例４で作製したｐＵＬベクター、ｐＵＬ２．５ベクター、ｐＳＵＬ１５ベクターを、Ｂａｓａｌ－ＨＡＣ／ＣＨＯ細胞中のＢａｓａｌ－ＨＡＣベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（φＣ３１インテグラーゼ）発現ベクター（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　２３：６２９－６３９　２０２１）と共に、Ｂａｓａｌ－ＨＡＣ／ＣＨＯ細胞へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン，１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、９６　ｗｅｌｌプレートに細胞を播種し、４８時間後にＧ４１８（Ｗａｋｏ）と１０％　ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で培養し、Ｇ４１８耐性コロニーを単離し拡大培養した。各ベクターについて５個以上のクローンを選択してＦＡＣＳ解析を行ない、オレンジ色蛍光タンパク質の発現を評価した。その結果を図１１に示す。ｐＵＬベクターの６クローンの陽性ピーク中央値の平均は１３００であり、ｐＵＬ２．５ベクター及びｐＵＬ１５ベクターにおいてはそれぞれ平均１４４００、１４０００であった。またｐＵＬベクターの６クローンのうち、２クローンは陰性集団の割合が陽性集団より高かったが、ｐＵＬ２．５ベクター及びｐＳＵＬ１５ベクターにおいては、６クローン全てにおいて陰性集団は観察されなかった。すなわち２．５ｋｂ断片の付加は、１５ｋｂ断片の付加と同等レベルの発現増強活性と抗サイレンシング活性をもたらすことが示された。
［実施例６］　ヒトｉＰＳ細胞における、ＵＢＣＰ－ＫＯ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例４で作製したｐＵＬベクター、ｐＵＬ２．５ベクターを、Ｂａｓａｌ－ＨＡＣ／ヒトｉＰＳ細胞（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　２３：６２９－６３９　２０２１）中のＢａｓａｌ－ＨＡＣベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（φＣ３１インテグラーゼ）発現ベクター（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　２３：６２９－６３９　２０２１）と共に、Ｂａｓａｌ－ＨＡＣ／ヒトｉＰＳ細胞へ電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、９６　ｗｅｌｌプレートに細胞を播種し、４８時間後にＧ４１８（９０μｇ／ｍＬ）を含むＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＴＡＫＡＲＡ）で培養し、Ｇ４１８耐性コロニーを単離し拡大培養した。各ベクターについて１２個以上のシングルクローンを選択しＦＡＣＳ解析を行ない、オレンジ色蛍光タンパク質Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）の発現を評価した。各ベクターを導入したクローンにおけるＫＯの蛍光強度を評価した結果を図２０に示す。その結果、ｐＵＬ２．５ベクターを導入した場合のＫＯ陽性集団の割合は、ｐＵＬベクターを導入した場合と比較して高かったことから、２．５ｋｂ断片のＵＢＣＰに対する抗サイレンシング効果及び活性増強効果により、ヒトｉＰＳ細胞においてＫＯ発現細胞の割合が高まることが示された。
［実施例７］　ＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列を付加したＥＦ１Ａプロモーターを用いたｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターの構築
　ヒトｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ１α１（ＥＦ１α）遺伝子プロモーター（ＥＦ１ＡＰ；約１．２ｋｂ、Ｑｉｎ　ＪＹ　ｅｔ　ａｌ．　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　５（５）：　ｅ１０６１１　２０１０）、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子コード領域、及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列からなる発現ユニットについては、その両端にＮｏｔＩ部位が配置されるように設計し、その配列をベクタービルダー社にて合成した。実施例１と同様にＮｏｔＩで消化したＸ３．１－ＭＣＳベクターに、上記合成ＤＮＡ由来のＥＦ１Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡ配列（ＮｏｔＩ断片）を挿入して、Ｘ３．１－ＥＦ１Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡを作製した（以下、ｐＥＦｍｓベクターと称す；図１２）。実施例１と同様に、ヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列約２．５ｋｂがそれぞれ付加されたＥＦ１ＡＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列からなる発現ユニットを持つＨＡＣ導入用ベクターを作製した（以下、ｐＥＦ２．５ｍｓベクターと称す；図１２）。
［実施例８］　ＣＨＯ細胞における、ＥＦ１ＡＰ－ｍｃｈｅｒｒｙ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例７で作製したｐＥＦｍｓベクター、ｐＥＦ２．５ｍｓベクターを２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞中の２１ＨＡＣ２ベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）と共に、２１ＨＡＣ２ベクターを保持する２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン，１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュ１枚に細胞を播種し、４８時間後に２％ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）と１０％　ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で培養し、ＨＡＴ耐性コロニーを取得した。得られたＨＡＴ耐性細胞集団について導入から４週間後と７週間後にＦＡＣＳ解析を行ない、赤色蛍光タンパク質の発現を評価した。その結果を図１３に示す。ｐＥＦｍｓベクターが導入されたＨＡＴ耐性細胞集団においては、ｍｃｈｅｒｒｙ陰性集団の割合が陽性集団より高かったが、ｐＵＬ２．５ベクターが導入された細胞集団においては、陰性集団はほとんど観察されなかった。すなわちＥＦ１ＡＰへの２．５ｋｂ断片を付加することにより、抗サイレンシング効果がもたらされることが示された。
［実施例９］　ＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列を付加したＰＧＫプロモーターを用いたｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターの構築
　ヒトｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　１（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター（ＰＧＫＰ；約０．５ｋｂ、Ｋｉｔａ－Ｍａｔｓｕｏ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　４（４）：　ｅ５０４６．　２００９）、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子コード領域、及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列からなる発現ユニットについては、その両端にＮｏｔＩ部位が配置されるように設計し、その配列をベクタービルダー社にて合成した。実施例１と同様にＮｏｔＩで消化したＸ３．１－ＭＣＳベクターに、上記合成ＤＮＡ由来のＰＧＫＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡ配列（ＮｏｔＩ断片）を挿入してＸ３．１－　ＰＧＫＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐＡを作製した（以下、ｐＰＧＫｍｓベクターと称す；図１２）。実施例１と同様に、ヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列約２．５ｋｂが付加されたＰＧＫＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列からなる発現ユニットを持つＨＡＣ導入用ベクターを作製した（以下、ｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターと称す；図１２）。
［実施例１０］　ＣＨＯ細胞における、ＰＧＫＰ－ｍｃｈｅｒｒｙ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例９で作製したｐＰＧＫｍｓベクター、ｐＰＧＫ２．５ｍｓベクター、ｐＰＧＫ４ｍｓベクターを、２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞中の２１ＨＡＣ２ベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）と共に、２１ＨＡＣ２ベクターを保持する２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン，１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュ１枚に細胞を播種し、４８時間後に２％ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）と１０％　ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で培養し、ＨＡＴ耐性コロニーを取得した。得られたＨＡＴ耐性細胞集団について導入から４週間後と７週間後にＦＡＣＳ解析を行ない、赤色蛍光タンパク質の発現を評価した。その結果を図１４に示す。ｐＰＧＫｍｓベクターが導入されたＨＡＴ耐性細胞集団においては、ｍｃｈｅｒｒｙ陰性集団の割合が陽性集団より高かった。一方ｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターが導入された細胞集団においては、陰性集団はほとんど観察されなかった。すなわちＥＦ１ＡＰへの２．５ｋｂ断片の付加により、抗サイレンシング効果がもたらされることが示された。
［実施例１１］　ヒト間葉系幹細胞における、ＰＧＫＰ－ｍｃｈｅｒｒｙ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例９で作製したｐＰＧＫｍｓベクター、ｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターを、２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞中の２１ＨＡＣ２ベクターへ挿入した。上記発現ベクターを組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｋａｚｕｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８（４）：３８４－９３　２０１１）と共に、２１ＨＡＣ２ベクターを保持する２１ＨＡＣ２／ｈｉＭＳＣｈｐｒｔ－細胞へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン，１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュに細胞を播種し、４８時間後に２％ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）と１０％　ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＤＭＥＭ培地で培養し、ＨＡＴ耐性コロニーを取得した。得られたＨＡＴ耐性細胞集団について導入から４週間後にＦＡＣＳ解析を行ない、赤色蛍光タンパク質の発現を評価した。その結果を図１５に示す。ｐＰＧＫｍｓベクターが導入されたＨＡＴ耐性細胞集団においては、ｍｃｈｅｒｒｙ陰性集団の割合が陽性集団より高かった。一方ｐＰＧＫ２．５ｍｓベクターが導入された細胞集団においては、陰性集団はほとんど観察されなかった。すなわちＰＧＫＰへの２．５ｋｂ断片の付加により、抗サイレンシング効果がもたらされることが示された。
［実施例１２］　ＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列を付加したランダム挿入用ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターの構築
　ヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列約１５ｋｂ内の約２．５ｋｂ領域（図１）が付加された、ＵｂＣＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ―ＮｅｏＲ（ネオマイシン耐性）融合遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列からなる発現ユニットを持つランダム挿入用ベクターを以下の手順で作製した（ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターと称す）。
　まず、下記のプライマーを用いて、ベクタービルダー社にて合成したｍＣｈｅｒｒｙ＿ＮｅｏＲ－ＣＭＶ＿Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクターを鋳型としたＰＣＲを行い、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲの両端にＳｐｅＩサイトとＦｓｅＩサイトを付加した断片を増幅した。下記のプライマー及びＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃１０秒→６０℃５秒→６８℃５秒、３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。(実施例１)で作製したｐＵＬ２．５ｍｓベクターをＳｐｅＩおよびＦｓｅＩで消化したものに、ＳｐｅＩおよびＦｓｅＩで消化された上記ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ増幅断片を挿入してｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを作製した。ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターの構成について概略を図１６に示す。
SpeI_mCherry Fw：5’- TAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGA -3’(配列番号１７)
FseI_NeoR Rv：5’- CTTAGGCCGGCCACTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG -3’(配列番号１８)
　またｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターから上記約２．５ｋｂ領域を削除したｐＵｍＮｓベクターは、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターをＳａｌＩおよびＫｐｎＩで消化後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）で平滑末端化して作製した。ｐＵｍＮｓベクターの構造について概略を図１７に示す。
［実施例１３］　ＣＨＯでのランダム挿入遺伝子導入における、ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例１２で作製したｐＵｍＮｓベクター、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞へ導入した。実施例２等と異なり、組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターを同時に導入しなかった。それにより、導入されたベクターがＣＨＯ細胞ゲノムにランダムに挿入された場合にネオマイシン（Ｇ４１８）耐性となる。上記ベクターを制限酵素ＳｃａＩで消化後、エタノール沈殿法で回収して２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン、１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュ２枚に細胞を播種し、４８時間後に８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｗａｋｏ）と１０％ ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。導入から２週間後に、得られた薬剤耐性コロニーを混合した細胞集団についてＦＡＣＳ解析を行い、赤色蛍光強度を比較した。その結果を図１８に示す。ｐＵｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ陽性（Ｐ７の画分）の細胞数は、２０８２６個中１１３６個（５．５％）であった。ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ陽性（Ｐ７の画分）の細胞数は、１２５９５個中１４８１個（１１．８％）であった。さらに導入から２週目、４週目、７週目において、薬剤耐性細胞集団のＦＡＣＳ解析によって全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ強陽性画分の割合を評価した結果を図２１-１と図２１-２に示す。図２１－１の太い四角で囲まれた部分はｍＣｈｅｒｒｙ強陽性画分（Ｐ６）を示す。図２１－２は電気パルスによる導入から２週間目、４週間目、又は７週間目のＧ４１８耐性細胞についてＦＡＣＳ解析を行ない、全細胞数に対するｍＣｈｅｒｒｙ強陽性画分（Ｐ６）の割合を測定した示す。３つの独立した遺伝子導入実験において、蛍光強度１０００以上を示すｍＣｈｅｒｒｙ強陽性画分（Ｐ６）の細胞の割合は、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを有する４週目と７週目のＧ４１８耐性細胞においては全て１０％以上（４週目の平均：１５．８７％、７週目の平均：１３．１０％）であったのに対して、ｐＵｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全て０．１％以下であった。以上、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターを導入した場合のｍｃｈｅｒｒｙ陽性集団の割合は、ｐＵｍＮｓベクターを導入した場合と比較して高かったことから、２．５ｋｂ断片のＵＢＣＰに対する抗サイレンシング効果及び活性増強効果により、ｍｃｈｅｒｒｙ発現細胞の割合が高まることが示された。
［実施例１４］　ヒトｉＰＳ細胞でのランダム挿入遺伝子導入における、ＵｂＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例１２で作製したｐＵｍＮｓベクター、ｐＵＬ２．５ｍＮｓベクターをヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７：ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ　Ｎｏ．ＨＰＳ００６３）へ導入した。実施例２等と異なり、組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターを同時に導入しない。それにより、導入されたベクターがＣＨＯ細胞ゲノムにランダムに挿入された場合にネオマイシン（Ｇ４１８）耐性となる。上記ベクターを制限酵素ＳｃａＩで消化後、エタノール沈殿法で回収して２０１Ｂ７へＮＥＰＡ２１（ネッパジーン、１７５Ｖ，　２．５ｍｓｅｃ）を用いて電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュ２枚に細胞を播種し、４８時間後に７０μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｗａｋｏ）を含むＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＴＡＫＡＲＡ）で培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。導入から７日後に１０ｃｍディッシュ１枚についてメタノールで１５分処理した後、ＣＢＢ染色液（０．２５％ＣＢＢ／１０％エタノール／４０％メタノール）で１５分染色した。染色処理した１０ｃｍディッシュを撮影し、コロニー数を計測・比較した。その結果、２．５ｋｂ断片のＵＢＣＰに対する抗サイレンシング効果及び活性増強効果により、薬剤耐性コロニー出現率が高まった（図１９）。さらに１０cmディッシュ１枚について導入後８日以降はＧ４１８濃度を５０μｇ／ｍｌに変えて培養し、導入２週間後にＦＡＣＳ解析を行い、赤色蛍光強度を比較する。その結果、２．５ｋｂ断片のＵＢＣＰに対する抗サイレンシング効果及び活性増強効果により、ｍｃｈｅｒｒｙ発現細胞の割合が高まることが示される。
［実施例１５］　ＵｂＣ遺伝子上流ゲノム配列を付加したＥＦ１Ａプロモーターを用いたランダム挿入用ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターの構築
　実施例７で構築した、ＥＦ１ＡＰ／赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子コード領域／及びＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列からなる発現ユニットを含むＨＡＣ導入用ベクター（ｐＥＦｍｓベクター；図１２の1番上）、およびヒトＵｂＣ遺伝子５’上流ゲノム配列約２．５ｋｂが付加されたＥＦ１ＡＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子／ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列からなる発現ユニットを持つＨＡＣ導入用ベクター（ｐＥＦ２．５ｍｓベクター；図１２の上から２番目）をそれぞれ出発材料として、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を［実施例１２］で示したｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ（ネオマイシン耐性）融合遺伝子と置換することにより、ｐＥＦｍＮｓベクター（図２２）、およびｐＥＦ２．５ｍＮｓベクター（図２２）を構築した。
［実施例１６］　ＣＨＯ細胞でのランダム挿入遺伝子導入における、ＥＦ１Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＮｅｏＲ発現ユニットに対する付加配列要素の抗サイレンシング効果及び活性増強効果の検討
　実施例１５で作製したｐＥＦｍＮｓベクター、ｐＥＦ２．５ｍＮｓベクターを実施例１３と同様に２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－細胞へ導入した。実施例２等と異なり、組み換え酵素（Ｃｒｅ）発現ベクターを同時に導入することは行なわなかったため、導入されたベクターがＣＨＯ細胞ゲノムにランダムに挿入された場合にネオマイシン（Ｇ４１８）耐性となる。上記ベクターを制限酵素ＳｃａＩで消化後、エタノール沈殿法で回収し、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン、１５０Ｖ，　５．０ｍｓｅｃ）を用いて、２１ＨＡＣ２／ＣＨＯｈｐｒｔ－へ電気パルス法により導入した。電気パルスにて導入した後、１０ｃｍディッシュ２枚に細胞を播種し、４８時間後に８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｗａｋｏ）と１０％ ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。導入から４週間後に、得られた薬剤耐性コロニーを混合した細胞集団についてＦＡＣＳ解析を行い、赤色蛍光強度を比較した。その結果を図２３に示す。なおｐＥＦｍＮｓベクターについては３回の、ｐＥＦ２．５ｍＮｓベクターについては２回の独立した実験の結果が示されている。ｐＥＦｍＮｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全細胞数におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の中央値は、それぞれ６４９、８２８、５０９、またｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合は、それぞれ６７％、７７．４２％、６２．５６％であった。一方ｐＥＦ２．５ｍNｓベクターを有するＧ４１８耐性細胞においては、全細胞数におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の中央値は、それぞれ２９８６、２６２５、またｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合は、それぞれ９４．１５％、８９．２２％、であった。以上、ｐＥＦ２．５ｍＮｓベクターを導入した場合のｍｃｈｅｒｒｙ陽性集団の割合は、ｐＥＦｍNｓベクターを導入した場合と比較して高かったことから、２．５ｋｂ断片のＥＦ１Ａプロモーターに対する抗サイレンシング効果及び活性増強効果により、ｍｃｈｅｒｒｙ発現細胞の割合が高まることが示された。
　プロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む発現ベクターを含む、本発明の発現ベクターを有する哺乳動物細胞を作製することにより、目的ＤＮＡがコードするタンパク質を該哺乳動物細胞において、安定的且つ効率的に生産する目的で有用である。
配列番号３～８：プライマー
配列番号９～１０：ＡｓｃＩサイト及びＳｍａＩサイトを含むＤＮＡ断片を作製するためのアニーリング配列
配列番号１１～１４：プライマー
配列番号１５～１６：ＳａｌＩサイト及びＫｐｎＩサイトを含むＤＮＡ断片を作製するためのアニーリング配列
配列番号１７～１８：プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　配列番号１で示される塩基配列又はそれと８５％以上の配列同一性を有する塩基配列の中の８５０以上の塩基配列を含む、プロモーター活性化配列。
  2. 　請求項１に記載のプロモーター活性化配列、プロモーター、及び目的ＤＮＡを含む発現ベクター。
  3. 　前記プロモーターが、構成的発現プロモーターである、請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 　前記構成的発現プロモーターが、ＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項３に記載の発現ベクター。
  5. 　請求項１に記載のプロモーター活性化配列を、前記プロモーターの５’側上流に含む請求項２～請求項４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  6. 　哺乳動物の人工染色体ベクターである、請求項２～請求項５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
  7. 　ヒト人工染色体ベクターである、請求項６に記載の発現ベクター。
  8. 　請求項２～請求項７のいずれか１項に記載の発現ベクターを保持する哺乳動物細胞。
  9. 　前記動物細胞がヒト細胞又はＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の細胞。
  10. 　前記ヒト細胞が、ヒト多能性幹細胞又はヒト体性幹細胞である、請求項９に記載の細胞。
  11. 　前記ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞であり、前記ヒト体性幹細胞がヒトＭＳＣ細胞である、請求項１０に記載の細胞。
  12. 　請求項２～請求項７のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む非ヒト哺乳動物。
  13. 　請求項８～請求項１１のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞を、動物細胞培養用の培地内で培養し、該培養により得らえた培養物から前記目的ＤＮＡがコードするタンパク質を採取することを含む、前記目的ＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造する方法。
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