JP7202573B2 - 哺乳類人工染色体ベクターを利用するタンパク質の高生産方法 - Google Patents
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Description
[1] 哺乳類人工染色体ベクター内に、目的DNA配列、核マトリクス結合領域及び複製開始点を含み、かつ前記DNAを高発現するために使用されることを特徴とする核酸構築物。
[2] 上記哺乳類人工染色体ベクターが、ヒト人工染色体ベクター又は齧歯類人工染色体ベクターである、[1]に記載の核酸構築物。
[3] 前記齧歯類人工染色体ベクターが、マウス人工染色体ベクターである、[2]に記載の核酸構築物。
[4] 上記齧歯類人工染色体ベクターが、ハムスター由来の人工染色体ベクターである。[2]に記載の核酸構築物。
[5] 上記ハムスター由来の人工染色体ベクターが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞由来の人工染色体ベクターである、[4]に記載の核酸構築物。
[6] 上記核マトリクス結合領域が、Igκ遺伝子座の核マトリクス結合領域に由来する、[1]~[5]のいずれかに記載の核酸構築物。
[7] 上記複製開始点が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域に由来する、[1]~[6]のいずれかに記載の核酸構築物。
[8] 上記DNAが、タンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子座、cDNA、組換えDNA又は修飾DNA、あるいは、遺伝子制御領域とレポーター遺伝子を含むDNAを含む、[1]~[7]のいずれかに記載の核酸構築物。
[9] 上記目的DNA配列がコードするタンパク質が、ヒト由来である、[1]~[8]のいずれかに記載の核酸構築物。
[10] [1]~[9]のいずれかに記載の核酸構築物を含む、DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための哺乳類細胞。
[11] チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、[10]に記載の哺乳類細胞。
[12] 上記CHO細胞が、CHO K1細胞株である、[11]に記載の哺乳類細胞。
[13] DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための方法であって、[10]~[12]のいずれかに記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程を含む、上記方法。
[14] DNA配列がコードするタンパク質を生産する方法であって、[10]~[12]のいずれかに記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程、ならびに、産生されたタンパク質を回収する工程を含む、上記方法。
[15] [1]~[9]のいずれかに記載の核酸構築物を保持することを特徴とする、非ヒト動物。
[16] 齧歯動物である、[15]に記載の非ヒト動物。
[17] 上記齧歯動物がマウスである、[16]に記載の非ヒト動物。
[18] 上記齧歯動物がラットである、[16]に記載の非ヒト動物。
本発明のIR/MAR-MMAC核酸構築物は、宿主細胞の染色体から独立して維持され、搭載された目的DNAを安定に発現させることが可能である哺乳類人工染色体ベクター(「MMAC」という。)内に、少なくとも1つの目的DNA配列、核マトリックス結合領域(MAR)及び複製開始点(「複製開始領域」(IR)ともいう。)などのエレメントを含み、かつ上記目的DNAを高発現するために使用される。本明細書では、このようなエレメントを含むベクターを「IR/MAR-MMAC核酸構築物」(例えば、図7(ただしこの図では、外来DNAがEGFP遺伝子となっているが、この遺伝子を以下で例示するような他の目的DNAで置換しうる。))と称する。
本発明はさらに、上記1で説明したIR/MAR-MMAC核酸構築物を含む、目的DNAを高発現するための哺乳類細胞を提供する。
(A)タンパク質の高発現方法
本発明はさらに、上記のIR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞を培地中で培養する工程を含む、目的DNAがコードするタンパク質を高発現するための方法を提供する。
哺乳類細胞の培養培地は、使用する細胞の種類に適した培地が選択される。通常使用される基礎培地として、MEM培地、DMEM培地、RPMI培地、F12培地、Macy’s 5A培地、あるいはそれの混合培地(例えば、DMEM/F12)などを使用できる。基礎培地にはさらに、血清、血清代替品、抗生物質、グルタミン酸、ピルビン酸などのサプリメントなどの少なくとも1つの成分を補充することができる。培地のpHは、例えば、約7.0~7.4である。
タンパク質の高発現の別の例として、哺乳動物細胞内での目的タンパク質の挙動や生物学的機能をモニターするレポーター遺伝子の高発現が挙げられる。例えば、目的DNAに、例えば、遺伝子制御配列(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)を連結したレポーター遺伝子(例えば、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードするDNA)を作動可能(operably)に挿入することができる。レポーター遺伝子が高発現することにより、レポーターアッセイの検出感度を上げることができる。これにより、細胞内である刺激により発現された目的DNAの挙動を蛍光もしくは発光を指標にして観察することができる。このような観察は、通常、ラボで行うことができるので、細胞の培養は、細胞の種類に応じた固体培地を用いて行うことができる。また、観察は、一般にカメラ付蛍光顕微鏡などを使用して行うことができる。
本発明はさらに、上記のIR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞を培地中で培養する工程、ならびに、産生されたタンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の生産方法を提供する。
培養工程は、上記(A.1)に記載したとおりである。
本発明はさらに、上記のIR/MAR-MMAC核酸構築物を保持する非ヒト動物を提供する。
[A] ヒト21番染色体由来HACベクター含有CHO K1細胞からHACのCHO DG44細胞へ導入
IR/MAR配列による遺伝子増幅効率のよいCHO DG44細胞 (Y Araki et al. Plos. One. 7. 7. e41787. 2012)内のHAC上で目的遺伝子を挿入及び増幅するために、CHO DG44細胞にDNA配列挿入部位(loxP)をもつHACを導入する(図1、ステップ1)。
染色体供与細胞として、ヒト21番染色体由来のHACベクターを保持するCHO K1細胞由来の細胞株CHO kkpqN cl.10 (以下 「CHO kkpqN10」と記載する(特開第2007-295860号公報))を用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(コロンビア大学のDr. LA. Chasinより分与された。)を用いた。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に播種したCHO kkpqN10細胞にコルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%FBS、F12)中で72時間培養して微小核細胞の形成を誘導した。予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(F12中に10μg/ml、シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8, 000rpm(11,899×g)、1時間の遠心を行った(JLA-10.5ローター、ベックマン)。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX-25(ミリポア)で順に濾過して精製した。精製した微小核細胞(ミクロセル)は、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemagglutinin-P、Difco)を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90%飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)およびDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(コーニング)にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10%FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン(4μg/ml)を含む選択培地(10%FBS、F12)で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。2回の微小核細胞融合で12個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 N10)。
[A.2.1]mono-color FISH解析
上記で得られたCHO DG44 N10細胞の12クローン中4クローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10: 1163-1175,2001)に記された方法でヒトCot-1 DNAをプローブにしたFISH解析を行った。それぞれの核型の特徴により、CHO K1細胞由来のCHO kkpqN10とCHO DG44株を区別することが可能で、CHO K1細胞には大きな染色体が3本あるのに対してCHO DG44細胞は2本である(図2及び図3)。この核型解析に加えてプローブによるシグナルの結果から、CHO DG44 N10細胞の2クローン(cl.10,11)で90%以上の保持率で正常なHACが導入されていることを確認した(図4)。
[A]ヒト21番染色体由来HACベクターへIR/MAR配列とEGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例1に記載のように、loxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO DG44細胞を用意した。一方でloxP配列およびIR/MAR配列およびEGFP遺伝子発現ユニットを含むプラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりヒト人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
[A.1.1]EGFP発現ベクターへのloxP配列の挿入
HAC搭載用のloxP配列は、pPAC4ベクター(Children’s Hospital Oakland Research InstituteのBAC PACリソースセンターより入手した。)を鋳型としてloxP配列を増幅した。
CMV loxP stuI F: 5’-GAAGGCCTGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT-3’(配列番号1)
CMV loxP stuI R: 5’-GAAGGCCTGGTGACCTAAGCTTGCATGCAACTTCGT-3’ (配列番号2)
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-plus-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP(dATP, dCTP , dGTP , dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃2分の熱変性後、98℃10秒、68℃50秒を16サイクル行った。PCR産物は、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。その後、制限酵素StuI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。
pCX-EGFP CMV loxPベクターおよびIR/MAR配列が搭載されたpΔBN AR1-Dhfrベクター(広島大学、清水典明博士より分与された。)は、両方ともにアンピシリン耐性遺伝子(Amp)が搭載されているため、pCX-EGFP CMV loxPベクターをpΔBN AR1-Dhfrベクターへ挿入する際に、ベクター自身がライゲーションしてしまうセルフライゲーションのプラスミドがたくさん得られ、目的とするpCX-EGFP CMV loxPベクターの配列をpΔBN AR1-Dhfrベクターへクローニングされたプラスミドが得られないことが懸念された。そこで、pCX-EGFP CMV loxPベクターをIR/MAR配列が搭載されたpΔBN AR1-Dhfrへ挿入する際の効率を上げるために、pCX-EGFP CMV loxPベクターのアンピシリン耐性遺伝子(Amp)をカナマイシン耐性遺伝子(Km)に変換する実験を実施した。なお、pΔBN AR1-Dhfrプラスミドの詳細は、C. Noguchi et al. Plos One. 7. 12. e52990. 2012.に掲載されている。
Km SpeI PAC4 F: 5’- AAAAGTACTCCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACT-3’ (配列番号3)
Km SpeI PAC4 R: 5’- GGACTAGTAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGAT-3’ (配列番号4)
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-plus-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP(dATP, dCTP , dGTP , dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃2分の熱変性後、98℃30秒、60℃30秒、72℃1分10秒を16サイクル行った。PCR産物は、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。その後、制限酵素ScaI/SpeI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。両端を制限酵素StuI(NEB)で消化して突出末端とした精製したKm遺伝子のDNA断片を、EGFP発現ユニットを持つpCX-EGFP CMV loxPのScaI/SpeIサイトにTOYOBO社のligation high v2を用いて推奨プロトコールによりクローニングした。Km遺伝子がクローニングされたベクターをpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターとした(図6)。
pCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターを制限酵素PstI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。線状化したpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターのDNA断片についてセルフライゲーションを抑制するためにDNA末端の脱リン酸化処理をrAPId Alkaline Phosphatase kit(Roche)を用いて推奨プロトコールに従って行った。pΔBN AR1-Dhfrベクターについても制限酵素PstI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。次に、脱リン酸化処理を行ったpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターのDNA断片とpΔBN AR1-DhfrベクターのDNA断片をTOYOBO社のligation high v2を用いて推奨プロトコールによりライゲーションを行った。
[A.3.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル(well)のCHO DG44 N10 cl.11細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとpCX-EGFP loxP dhfrベクター1μgをlipofectamine LTX(インビトロジェン)のプロトコールに従い、遺伝子搭載用のHACベクターが保持されているCHO DG44 N10へ導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、24クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:CHO DG44 N10 MAR-HAC)。
[A.4.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト人工染色体ベクターHAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現する2か所のJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ (配列番号5)
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ (配列番号6)
Another Junction領域
CMV188: 5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’ (配列番号7)
CX-EGFP HAC Junc R1: 5’-ATCCGCTCACAATTCCACACA-3’ (配列番号8)
[B.1.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のHACへの搭載により、EGFP遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 N10 MAR-HACクローンよりゲノムを抽出し、EGFP遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 N10 EGFP-HACクローンをコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った((注)このPCR解析ではEGFPのコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)。
EGFP gqPCR F : 5’-CTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3’ (配列番号9)
EGFP gqPCR R: 5’-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT-3’ (配列番号10)
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ (配列番号11)
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ (配列番号12)
上記の結果から選んだ3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(日本)、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、すべてのクローンにおいてコントロールと比較して、染色体が大きく、またヒトcot-1のシグナル上に多数のEGFPシグナルが観察された(図9)。これらの結果から、HAC上でEGFP遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。
CHO DG44 N10 MAR-HACクローンのEGFP発現が遺伝子配列の増幅にともなって、増加しているか確認するために、ウェスタンブロッティングによってタンパクの発現量を解析した。
CHO K1細胞とCHO DG44細胞にそれぞれ1コピーのEGFPを搭載したHACを導入し、同じゲノム情報由来のEGFPの発現量を比較することで、細胞間におけるタンパク産生効率の比較を行った。
遺伝子搭載用のHACを保持するCHO K1細胞であるCHO kkpqN10細胞に実施例1で用いたpCX-EGFP CMV loxP Km2を導入し、Cre/loxPシステムによる組換えにより、HAC上に1コピーのEGFP遺伝子を搭載する。
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった10cm dishの細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Cre(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916)5μgとpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクター10μgをlipofectamine 2000(インビトロジェン)のプロトコールに従い、遺伝子搭載用のHACベクターが保持されているCHO kkpqN10へ導入した(クローン名:CHO K1 N10 EGFP-HAC)。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとBlasticidin S (Bsd)を8μg/ml, G418を800μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを20枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、42クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った。
[A.2.1]PCR解析
Bsd, G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト人工染色体ベクターHAC上の部位特異的にEGFP遺伝子の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現する2か所のJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ (配列番号5)
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ (配列番号6)
Another Junction領域
CMV188: 5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’ (配列番号7)
CX-EGFP HAC Junc R1: 5’-ATCCGCTCACAATTCCACACA-3’ (配列番号8)
上記の結果から選んだ8クローンの内5クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、1クローン(CHO K1 EGFP-HAC cl.27)でヒト人工染色体HACが100%の割合で保持されており、さらにHAC上にEGFP由来のシグナルが検出されたことから、部位特異的にHAC上へEGFP遺伝子が挿入されたと判断した(図11A)。加えて、CHO kkpqN10 pCX-EGFP HAC cl.27細胞はHACの保持率に相関して、蛍光顕微鏡下で高い割合でEGFPの蛍光を発していた(図11B)。これらの結果から、CHO K1 EGFP-HAC cl.27を今後の実験に用いた。
[B.1]CHO DG44 EGFP-HACの樹立
染色体供与細胞として、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞を用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(前出)を用いた。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に播種したCHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞にコルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%FBS、F12)中で72時間培養して微小核を誘導した。予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(F12中に10μg/ml、シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8,000rpm(11,899×g)、1時間の遠心を行った(JLA-10.5ローター、ベックマン)。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX-25(ミリポア)で順に濾過して精製した。精製したミクロセルは、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemagglutinin-P、Difco)を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90%飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)およびDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(コーニング)にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10%FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン(4μg/ml)を含む選択培地(10%FBS、F12)で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。2回の微小核細胞融合で14個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 EGFP-HAC)。
上記の結果から選んだ14クローンの内3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(日本)、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、2クローン(CHO DG44 EGFP- HAC cl.5およびcl.6)において、CHO DG44細胞の核型の特徴を呈し、かつヒト人工染色体HACが90%以上の割合で保持されており、さらにEGFP由来のシグナルが検出されたことから、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞からCHO DG44細胞へEGFP-HACが導入されたと判断した(図12)。
比較細胞にはCHO K1細胞株由来のCHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞とCHO DG44細胞由来のCHO DG44 EGFP- HAC cl.6細胞を用いた。それぞれの細胞に保持されたHACは由来は同じであることから、細胞内環境におけるEGFP遺伝子の発現量比較が可能であると考えた。
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライテスク)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテスク)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム(日本))を用いて行った。また、内部標準用のtubulinの検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム(日本))を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。
実施例2で、MAR-HACシステムによってHAC上で増幅させたEGFP遺伝子を、実施例3で得られた知見から、CHO K1細胞へ移入することでEGFP遺伝子の発現量をさらに向上させることが可能か検討を行った(図14)。
これまでCHO DG44細胞を用いての微小核細胞融合法の実績がなかったため、微小核細胞の形成能力について検討を行った。
CHO DG44細胞が微小核細胞形成能をもつか否かを確認するために、CHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞(前出)を用いて、コルセミド処理を行った。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)に播種したCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞にコルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%FBS、F12)中で72時間培養して微小核を誘導した。その結果、多数の微小核細胞の形成が確認できた(図15)。
[B.1] MAR-HACのCHO K1細胞への移入
染色体供与細胞として、増幅したEGFP遺伝子が搭載されたHACを保持するCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞(前出)を用いた。受容細胞としては、CHO K1細胞由来のCHO kkpqN10細胞(前出)を用いた。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に播種したCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞にコルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%FBS、F12)中で72時間培養して微小核を誘導した。予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(F12中に10μg/ml、シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8,000rpm(11,899×g)、1時間の遠心を行った(JLA-10.5ローター、ベックマン)。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX-25(ミリポア)で順に濾過して精製した。精製したミクロセルは、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemagglutinin-P、Difco)を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO kkpqN10細胞を90%飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)およびDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(コーニング)にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10%FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。G418(800μg/ml)を含む選択培地(10%FBS、F12)で1週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。2回の微小核細胞融合で24個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO K1R N10 MAR-HAC)。
上記の結果から選んだ24クローンの内5クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(日本)、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、全てのクローンにおいてCHO K1細胞の核型の特徴を呈し、通常のHACと比較して大きなヒトcot-1プローブで染色された染色体が確認され、さらにその上に複数のEGFP由来のシグナルが検出できた(図16)。
MAR-HACをCHO K1細胞へ移入することでEGFPの発現量が向上するかを確かめるために、CHO DG44 MAR-HAC cl.1細胞とCHO K1R N10 MAR-HAC細胞クローン間におけるEGFPタンパクの発現量を比較した。
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライ)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム(日本))を用いて行った。また、内部標準用のtubulinの検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム(日本))を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。
MAR-HACシステムによる遺伝子増幅の効果を正確に測定することを目的に、EGFP遺伝子を1コピー搭載したHACと、MAR-HACシステムで増幅させたEGFP搭載HACにおけるEGFPの発現比較を、タンパク発現効率の良いCHO K1細胞を宿主として実験を行った。
EGFP遺伝子を1コピー搭載したHACをもつ細胞として、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27 細胞(前出)を用い、MAR-HACシステムでEGFPを増幅させたHACをもつ細胞としてはCHO K1R N10 MAR-HAC細胞のクローンを用いた。
MAR-HACシステムにより構築したHAC上の増幅遺伝子が長期間安定的に発現可能かを検証するために、CHO K1R N10 MAR-HAC cl.13細胞(前出)を用いて、長期継代培養を行い、初期培養とEGFPの発現量を比較した。培養期間はPDL (Population doubling level :分裂回数)で計測し、PDL3, PDL30, PDL50の段階でウェスタンブロッティングによりEGFPの発現量の比較解析を行った。
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライテスク)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム)を用いて行った。また、内部標準用のチューブリン(tubulin)の検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム(日本))を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。
[A]ヒト21番染色体由来HACベクターへIR/MAR配列と抗VEGF抗体遺伝子を挿入する方法を示した。実施例1に記載のように、loxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO DG44細胞を用意した(図20、step1)。一方でloxP配列およびIR/MAR配列および抗VEGF抗体遺伝子発現ユニットを含むプラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりヒト人工染色体に挿入することとした(図20、step2)。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
遺伝子の発現を向上させる機能をもつエンハンサー配列A7をクローニングし、抗VEGF抗体の重鎖遺伝子と軽遺伝子を人工合成遺伝子で作製し、A7エレメントをもつ抗VEGF抗体産生ベクターを作製した。以下に詳細な作製方法を記載する。
サブクローニング用ベクターの準備するために、inspB4ins2ベクター(鳥取大学研究推進機構基盤研究センター(日本) 大林徹也博士より分与された)をAvrII(NEB)とSpeI-HF(NEB)で消化したものを0.8%アガロースゲルで電気泳動し、MonoFas DNA精製キット(ジーエルサイエンス)で精製した。精製した断片をLigation High ver.2(TOYOBO)にてセルフライゲーションしサブクローニングベクターpB4ins1を作製した。なお、inspB4ins2ベクターの詳細はY.Yoshimura et al. Transgenic Research. 24. 4. p717-727. 2015.に掲載されている。
A7領域はヒト11番染色体88992123~89000542に位置している8420bpのポリヌクレオチドである(アクセッション番号:AP003400.2)。配列情報をもとに以下のプライマーを設計した。
A7-PacI-41F: 5’-ATTAATTAATCTTAGTATGGTAAACCTTTTGAAGTAGATTC-3’(配列番号13)
A7-MluI-45R: 5’-GTAACGCGTCAAGTTTTTATTTTGTTCTCACAATTAAGTCTATAC-3’(配列番号14)
抗VEGF抗体遺伝子に関して、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子のアミノ酸配列はGeneBankのデータベースより(アクセッション番号:KX119517およびKX119516)入手した。また、遺伝子を発現させるプロモーターにはGeneBankのデータベースより入手した塩基配列(アクセッション番号:NG_011744.1)をもとにヒトRPS7遺伝子のプロモーター配列を入手した。これらの配列情報をもとにファスマックス社に合成遺伝子の作製を委託し、抗VEGF抗体遺伝子を搭載した以下のプラスミドベクターを作製した(図21)。
ATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCTTCAATGGTATCGCCCAGATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATTAAATGCCCCAAAACATCAGGTTAATGGCGTTCTTGATGTCATTCTCGCGATGCGACAGATCCGCAACCTCTTCGCCAATTACCGACACTGGTACTGACGCCATATCCGTGGTCATCATACGCCAGCTTTCATCCCCAATGTGGACAACCGGATAGAGTTCACGGGAAACTTTGTCGCTCAGTAACCGTGCAGAAGCCAACGGAATCACCGTGCGACGACCAGGAGTATCGATGATGTCGCTTTGCACATCCACAAACAGGCGATAGCGACTTTCGCGTTTGTAGGTGTAGACTTTGAACTGCGGTACGTTACAGAGAGCGCAACTGCTGTGACGGACGATCTGTACGCGCTTCTTCGCTATTCCGCCAACTCGCAAACGGAGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCTGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATAGCTCTCTGAGTACGGAACACTCTTTCCCTTAACGACGCTCTTCCGATCTGATgaacgcgttccttaaggacggatcgggagatctcccgatcccctatgtctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatattgacattgattattgactaggcttttgcaaaaagcttgtttaaaccttgtatattaacagcacattaacagctaaaaagaaaaactcacataatcatattagttcatagaaacaatgcatttgacatactccaacatccattcatgattttattttattttttatttatatattttttttgagatggagtctcgctgtcacccaggctggagtgcaatggctcgatctcggctcactgcaggctccgcccccggcggttcacgccattctcctgcctcagcctcccgagtagctgggactacaggcgcccgccacctcgcccagctaattttttgtatttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcgtgatccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgtgcccggcccatgattttaaaaaaacctctcagaaatagaaacagagggaacttcctgaatttgattaaaaatacctgcaaaatcctagagctaatattatacttaatggtgaaagactgaatggttttcccctaagatggagaacaaggcacggatgtccttgctcaccactcctattcaacaaaggactggaaaccagaaataactttaattttttttgttctcaagtgataggttcacagagaaaaagctttactggatgaacttttagattactacttttatagagcagcagagataaaagccaggtcgaaaagtgcatgtggagtaaggaaatggacctagttcgacaaaagggctcagaacgactgcccagatgagattgtagacgcagctgtagtttactttctatctggaagaaacttcaagttatccttaattttccaaggagacagtcacttaccttttaaaaaacattattagagaagcaccgggcgggagcatatctagcattaaaaatgtgggatgaataccatctctgcttggtaaaggtggttgggaatcctgagagagggcacctagtgtggcttctgcatttttcacagtgcctggaccacggctgaaagtaactcttgcatgacatttgacagaagaggaaaccgaagctcagattaaattccctgtccacagcgggatcattcggcacgagttcctccctgtctggaatgctcttccccagcaatagatcctgcggctcttccgtgtctcagtctaatgtcattccgttccaggattcccgacttcttaaagcataaataatccctccccaccctctcattgtactgttatgtaagttattacaatatgtcattatatatttagtcatactgctttaggtaatgtcttctccactgaactgtaagctccatgagggcaagagttcagtcggttttacttaataattagcacctagtacagtactagcatagaatgaaggcctcgcaattttttttaaatttatttttagacagggtcttgcgctgtcgcccaggctggagtgcagtggtgcaacctcggctcacggcagcctcgacctttcggctccagcgatcctcccgcgtcggcctccggggtagctgggactgcaggcgcgcaccaccatgactggctaatttttttttttttttttttgtagacatggggtctcgccatgttgcccaggctggttcctgagctcaagtgatcctcctgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagcctcagcgcccagccaagttagccttttttaaacgtcctgtctccggaggttgccga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合成軽鎖ベクターpUCFa-RPS7-VEGF-LcをAscI(NEB)とXhoI(NEB)で酵素消化、また合成重鎖ベクターpUCFa-RPS7-VEGF-HcをMluI-HF(NEB)とXhoIで酵素消化し、アガロースゲルで電気泳動した。目的のサイズ断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2(TOYOBO)を使用しライゲーションしVEGF軽鎖と重鎖を繋いだベクターpUC-Fa-RPS7-VEGF-LcHcを作製した。
pB4-A7をNaeI(NEB)とMluIで消化、またpUC-Fa-RPS7-VEGF-LcHcをMluIとSnaBI(NEB)で消化し、アガロースゲルで電気泳動した。目的のサイズ断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2(TOYOBO)を使用しライゲーションしA7エレメントを持つベクターpUC-Fa-A7-RPS7-VEGF-LcHcを作製した。
IR/MARベクターへ抗体遺伝子を挿入するために、pΔBN AR1-DhfrのPst1サイトに追加の制限酵素サイトとしてPacI, AscI, FseI, SacIIと組換え用のloxG配列を挿入したベクターを構築した。以下に、作製方法を記載する。
Pst1 loxG Km2 F: 5’-AACTGCAGGCCGGCCGCGGAGGCCTGGTGACCTAAGCTTGCATGC-3’ (配列番号17)
Pst1 loxG Km2 R: 5’-ATTGGTTCTGCAGAGCTTGGCGCGCCAAGCTTAATTAAATGAGCCATATTCAACGGG-3’ (配列番号18)
IR/MARベクター(pΔBN AR1-Dhfr loxG Km2 MSC)をAscI消化し、Antarctic Phosphatase(NEB)にて脱リン酸化処理した。pUC-Fa-A7-RPS7-VEGF-LcHcをAscIで消化し、共にアガロースゲル電気泳動にて分離した。これらのDNA断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2を使用してライゲーションした。こうして得られた人工染色体搭載用VEGF抗体産生IR/MARベクターをA7-VEGF IR MAR(図23)とした。さらに、コントロール用としてIR/MAR領域を欠損するベクターを作製した。A7-VEGF IR MARをHpaI(NEB)とFseI(NEB)で消化し、Blunting high(TOYOBO)の方法に従って平滑化した。平滑化したプラスミドDNAをアガロースゲルで電気泳動し、目的断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2を使用してライゲーションした。こうして得られたコントロールベクターをA7-VEGF loxG(図24)とした。
[A.2.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル(well)のCHO DG44 N10 cl.11細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとA7-VEGF IR MARベクター1μgをlipofectamine LTX(インビトロジェン)のプロトコールに従い、遺伝子搭載用のHACベクターが保持されているCHO DG44 N10へ導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現した。その内、18クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:CHO DG44 VEGF MAR-HAC)。
また、IR/MAR配列を含まないコントロール用のHACの作製には、A7-VEGF loxGベクターを用いて上記の方法で同様にCHO DG44 N10 cl.11細胞へ遺伝子導入を行ったところ、22クローン単離し増殖させて、以後の実験を行った(クローン名: CHO DG44 VEGF-HAC)。
[A.3.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト人工染色体ベクターHAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現する1か所のJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ (配列番号5)
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ (配列番号6)
Another Junction領域
CMV188: 5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’ (配列番号7)
MAR junction 5’-CAGTGCTGCAATGATACCGC-3’ (配列番号19)
[B.4.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のHACへの搭載により、抗VEGF抗体遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 VEGF MAR-HACクローンよりゲノムを抽出し、抗VEGF抗体遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 VEGF-HACクローンをコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った。((注)このPCR解析では抗VEGF抗体遺伝子のコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)
用いたプライマー配列を以下に示す。抗VEGF抗体遺伝子の重鎖(Hc)と軽鎖(Lc)用と、ゲノムの内部標準としてNV1を用いた(Nissom PM et al. Biologiacls. 35. 211-5. 2007)。
VEGF Hc qRT F: 5’- CTGCACCTGAACTTTTGGGC-3’ (配列番号20)
VEGF Hc qRT R: 5’- TCGGGTGTACGGGAGATCAT-3’ (配列番号21)
VEGF Lc qRT F: 5’- CAGTACAGTACCGTGCCCTG-3’ (配列番号22)
VEGF Lc qRT R: 5’- AATACAGATGGGGCTGCGAC-3’ (配列番号23)
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ (配列番号11)
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ (配列番号12)
得られたCHO DG44 VEGF MAR-HACのクローン9個の内、5クローンをリアルタイムPCRによって解析した結果、4つのクローンでコントロールの1コピーで抗VEGF抗体遺伝子を保持する細胞(CHO DG44 VEGF-HAC cl.7)よりも抗VEGF抗体遺伝子配列が多い結果を得た。特に、多かったクローン4つ(cl.8,9,10,13)について今後の解析を行った(図25)。
上記の結果から選んだ4クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(日本)、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびA7-VEGF-loxGプラスミドベクターをプローブにしてFISH解析を行ったところ、1つのクローン(CHO DG44 VEGF MAR-HAC cl.8)において細胞内で宿主染色体から独立して維持されており、なおかつコントロール(CHO DG44 VEGF-HAC cl.7)と比較して、染色体が大きく、またヒトcot-1のシグナル上に多数の抗VEGF抗体遺伝子のシグナルが観察された(図26)。これらの結果から、HAC上で抗VEGF抗体遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。また、HACの保持率は、両方のクローンにおいて、90%以上であることを確認した。
CHO DG44 VEGF MAR-HACクローンの抗VEGF抗体の発現が遺伝子配列の増幅にともなって増加しているかを検討するために、培養上清より産生抗体を精製し濃度を測定し解析した。抗体の精製は、スピンカラム型IgG抗体精製キット(コスモバイオ(日本):APK-10G)を用いて添付資料に従って行い、抗体濃度測定には、吸光度計測計(スクラム社: Denovix)を用いて測定した。コントロールにはCHO DG44 VEGF-HAC cl.7を、IR/MARを保持する細胞にはCHO DG44 VEGF MAR-HAC cl.8を使用した。DG44 培養上清は、6cm培養ディッシュに1X105個/mlになるように細胞を播種し、2日毎に3回行い、合計6日間の培養上清を用意し、抗体を精製し濃度を測定した。その結果、増殖速度は同程度であったが(図27A)、コントロールに比較してMAR-HACクローンでは6日目で約2倍、抗体産生量が高くなることが示された(図27B)。
DG44細胞から産生された抗体が特異的抗原であるVEGFタンパクを認識するかを確認するためにEnzyme Linked ImmunoSorubrnt Assay(ELISA)方によって行った。ELISAは、タンパクを固相化することが可能な96wellプレート(Thermo Fisher:442404)へ、50ng/wellになるようにPBSで希釈したVEGF抗原タンパク(Sino Biological:11086-HNAH)を100μlずつ加えて、1時間常温で静置することで抗原の固相化を行った。次にTBS-T(wako)で3回洗浄後、ブロッキングバッファーとして5% skim milk/T-BST(wako)を350μlずつ加え1時間常温で静置した。TBS-T(wako)で3回洗浄後、DG44細胞の各培養上清100μlを1次抗体として用い、1時間常温で静置した。その後、TBS-T(wako)で3回洗浄し、2次抗体としてヒト抗体に対する抗体(Goat anti-Human IgG HRP:BETHYL社:A80-119P)を1/50000倍希釈して100μlずつ加えて、30分常温で静置した。TBS-T(wako)で3回洗浄し、酵素基質としてOPDを0.5mg/mlとなるように基質バッファーに加えて(Thermo Fisher)、H2O2(Wako)を1/1000量添加した溶液を1000μlずつ加えて30分反応を行った。その後、1M H2SO4(wako)加えて反応を停止させて、吸光度測定プレートリーダー(Baio Tek社:EPOCH2)でA492nmの波長を計測し抗体反応を数値化した。
その結果、抗体濃度測定の結果(図27B)に相関して、VEGF抗原に特異的に反応する抗体が細胞から産生されていることが確認された。加えて、コントロールのVEGF-HACに比較してVEGF MAR-HACでは2倍以上の抗原特異的な抗体の結合反応が認められた(図27C及び27D)。これらの結果から、IR/MAR配列と抗VEGF抗体遺伝子をHACへ搭載することで、遺伝子を増幅することができ、さらに遺伝子増幅に起因して抗VEGF抗体の産生量を上昇させることが可能であると判断した(図20、ステップ3)。
[A] マウス11番染色体由来MACベクター含有CHO K1細胞からHACのCHO DG44細胞へ導入
遺伝子増幅システムをヒト人工染色体だけでなく、マウス人工染色体(MAC)への応用について検討した。MACベクターの詳細は特開2011-549044号公報に記載されている。IR/MAR配列による遺伝子増幅効率のよいCHO DG44細胞内のHAC上で目的遺伝子を挿入及び増幅するために、CHO DG44細胞にDNA配列挿入部位(loxP)をもつMACを導入する(図28、ステップ1)。
染色体供与細胞として、マウス11番染色体由来のMACベクターを保持するCHO K1細胞由来の細胞株CHO K1 MAC(以下「CHO K1 MAC」と記載する(特開2011-549044号公報))を用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(コロンビア大学のDr. LA. Chasinより分与された。)を用いた。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に播種したCHO K1 MAC細胞にコルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%FBS、F12)中で72時間培養して微小核細胞の形成を誘導した。予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(F12中に10μg/ml、シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8, 000rpm(11,899×g)、1時間の遠心を行った(JLA-10.5ローター、ベックマン)。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX-25(ミリポア)で順に濾過して精製した。精製した微小核細胞(ミクロセル)は、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemagglutinin-P、Difco)を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90%飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)およびDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(コーニング)にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10%FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン(4μg/ml)を含む選択培地(10%FBS、F12)で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。この微小核細胞融合で4個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 MAC)。
[A.2.1]mono-color FISH解析
上記で得られたCHO DG44 MAC細胞の4クローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10: 1163-1175,2001)に記された方法でマウスCot-1 DNAをプローブにしたFISH解析を行った。それぞれの核型の特徴により、CHO K1細胞由来のCHO K1 MACとCHO DG44株を区別することが可能で、CHO K1細胞には大きな染色体が3本あるのに対してCHO DG44細胞は2本である(図2及び図3)。この核型解析に加えてプローブによるシグナルの結果から、CHO DG44 MAC細胞の2クローン(cl.611-1および611-4)で少し低いが30%以上の保持率で正常なMACが導入されていることを確認した(図29)。
[A]マウス11番染色体由来MACベクターへIR/MAR配列とEGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例7に記載のように、loxPサイトを導入したマウス11番染色体由来MACベクターを保持するCHO DG44 MAC細胞を用意した。一方でloxP配列およびIR/MAR配列およびEGFP遺伝子発現ユニットを含む実施例2で使用したpCX-EGFP loxP dhfrプラスミドベクターを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりマウス人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
[A.1.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル(well)の遺伝子搭載用のMACベクターが保持されているCHO DG44 MAC cl.611-1およびcl.611-4細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとpCX-EGFP loxP dhfrベクター1μgをlipofectamine LTX(インビトロジェン)のプロトコールに従い導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、6クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:CHO DG44 MAR-MAC)。
[A.2.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現するJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ (配列番号5)
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ (配列番号6)
[B.1.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のMACへの搭載により、EGFP遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 MAR-MACクローンよりゲノムを抽出し、EGFP遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 EGFP-MACクローン(DG44 EGFP-MAC cl.12)をコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った。((注)このPCR解析ではEGFPのコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)
EGFP gqPCR F : 5’-CTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3’ (配列番号9)
EGFP gqPCR R: 5’-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT-3’ (配列番号10)
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ (配列番号11)
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ (配列番号12)
上記の結果から選んだ3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(日本)、1994)に従い行った。マウスcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、1クローンにおいてコントロール(DG44 EGFP-MAC cl.12)と比較して、宿主染色体と独立して維持されており、かつ、染色体が大きく、またマウスcot-1のシグナル上に多数のEGFPシグナルが観察された(図31)。これらの結果から、MAC上でEGFP遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。
CHO DG44 MAR-MACクローンのEGFP発現が遺伝子配列の増幅にともなって、増加しているか確認するために、ウェスタンブロッティングによってタンパクの発現量を解析した。
[A] ボトムアップ型人工染色体(tet-O HAC)ベクター含有CHO K1細胞からHACのCHO DG44細胞へ導入
この実施例では、遺伝子増幅システムをトップダウン型の人工染色体だけでなく、ボトムアップ型人工染色体についても適応可能か検討を行った。なお、ボトムアップ型人工染色体tet-O HACベクターの詳細はY Iida et al. ACS Synth Biol.21. 3. P83-90. 2014に記載されている。IR/MAR配列による遺伝子増幅効率のよいCHO DG44細胞内のHAC上で目的遺伝子を挿入及び増幅するために、CHO DG44細胞にDNA配列挿入部位(loxP)をもつtet-O HACを導入する(図33、ステップ1)。
染色体供与細胞として、tet-O HACベクターを保持するCHO K1細胞由来の細胞株CHO K1 tet-O HACを用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(コロンビア大学のDr. LA. Chasinより分与された。)を用いた。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に播種したCHO kkpqN10細胞にコルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%FBS、F12)中で72時間培養して微小核細胞の形成を誘導した。予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(F12中に10μg/ml、シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8, 000rpm(11,899×g)、1時間の遠心を行った(JLA-10.5ローター、ベックマン)。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX-25(ミリポア)で順に濾過して精製した。精製した微小核細胞(ミクロセル)は、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemagglutinin-P、Difco)を含むF12,2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90%飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)およびDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(コーニング)にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10%FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン(4μg/ml)を含む選択培地(10%FBS、F12)で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。この微小核細胞融合で多数の耐性コロニーが得られたので、12クローンを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 tet-O HAC)。
[A.2.1]mono-color FISH解析
上記で得られたCHO DG44 tet-O HAC細胞の12クローン中9クローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10: 1163-1175,2001)に記された方法でヒトCot-1 DNAをプローブにしたFISH解析を行った。それぞれの核型の特徴により、CHO K1細胞由来のCHO K1 tet-O HACとCHO DG44株を区別することが可能で、CHO K1細胞には大きな染色体が3本あるのに対してCHO DG44細胞は2本である(図2及び図3)。この核型解析に加えてプローブによるシグナルの結果から、CHO DG44 tet-O HAC細胞の2クローン(cl.6、cl.9)で90%以上の保持率で正常なtet-O HACが導入されていることを確認した(図34)。
[A] tet-O HACベクターへIR/MAR配列とEGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例9に記載のように、loxPサイトを導入したtet-O HACベクターを保持するCHO DG44 tet-O HAC細胞を用意した(cl.6、cl.9)。一方でloxP配列およびIR/MAR配列およびEGFP遺伝子発現ユニットを含む実施例2で使用したpCX-EGFP loxP dhfrプラスミドベクターを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりtet-O HACに挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
[A.1.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル(well)のCHO DG44 tet-O HAC cl.6、cl.9細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとpCX-EGFP loxP dhfrベクター1μgをlipofectamine LTX(インビトロジェン)のプロトコールに従い導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、16クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:CHO DG44 MAR-tet-O HAC)。
[A.2.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現するJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ (配列番号5)
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ (配列番号6)
[B.1.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のMACへの搭載により、EGFP遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 tet-O HACクローンよりゲノムを抽出し、EGFP遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 N10 EGFP-HACをコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った。((注)このPCR解析ではEGFPのコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)
EGFP gqPCR F : 5’-CTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3’ (配列番号9)
EGFP gqPCR R: 5’-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT-3’ (配列番号10)
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ (配列番号11)
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ (配列番号12)
上記の結果から選んだ2クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社(日本)、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、両方のクローンにおいてコントロール(CHO DG44 N10 EGFP-HAC)と比較して、染色体が大きく、またヒトcot-1のシグナル上に多数のEGFPシグナルが観察された(図36)。これらの結果から、tet-O HAC上でEGFP遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。
CHO DG44 tet-O HACクローン(cl.6-1,cl.9-7)のEGFP発現が遺伝子配列の増幅にともなって、増加しているか確認するために、ウェスタンブロッティングによってタンパクの発現量を解析した。
配列番号5~8、19:結合領域
配列番号15:抗VEGF軽鎖遺伝子ベクター
配列番号16:抗VEGF軽鎖遺伝子ベクター
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (18)
- 哺乳類人工染色体ベクター内に、目的DNA配列、核マトリクス結合領域及び複製開始点を含み、かつ前記DNAを高発現するために使用されることを特徴とし、前記核マトリックス結合領域と前記複製開始点は、5’側からこの順番で連結される、核酸構築物。
- 前記哺乳類人工染色体ベクターが、ヒト人工染色体ベクター又は齧歯類人工染色体ベクターである、請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記齧歯類人工染色体ベクターが、マウス人工染色体ベクターである、請求項2に記載の核酸構築物。
- 前記齧歯類人工染色体ベクターが、ハムスター由来の人工染色体ベクターである、請求項2に記載の核酸構築物。
- 前記ハムスター由来の人工染色体ベクターが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞由来の人工染色体ベクターである、請求項4に記載の核酸構築物。
- 前記核マトリクス結合領域が、Igκ遺伝子座の核マトリクス結合領域に由来する、請求項1~5のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記複製開始点が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域に由来する、請求項1~6のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記DNAが、タンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子座、cDNA、組換えDNA又は修飾DNA、あるいは、遺伝子制御領域とレポーター遺伝子を含むDNAを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記目的DNA配列がコードするタンパク質が、ヒト由来である、請求項1~8のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む、DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための哺乳類細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項10に記載の哺乳類細胞。
- 前記CHO細胞が、CHO K1細胞株である、請求項11に記載の哺乳類細胞。
- DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための方法であって、請求項10~12のいずれか1項に記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程を含む、前記方法。
- DNA配列がコードするタンパク質を生産する方法であって、請求項10~12のいずれか1項に記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程、ならびに、産生されたタンパク質を回収する工程を含む、前記方法。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の核酸構築物を保持することを特徴とする、非ヒト動物。
- 齧歯動物である、請求項15に記載の非ヒト動物。
- 前記齧歯動物がマウスである、請求項16に記載の非ヒト動物。
- 前記齧歯動物がラットである、請求項16に記載の非ヒト動物。
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