JP7079946B2 - 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)外来染色体を含むヒト人工多能性幹(iPS)細胞を製造するための方法であって、ウイルスエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する及び目的DNAを有する外来染色体を含む供与細胞を準備する工程、上記供与細胞から微小核細胞を作製する工程、並びにMMCT(Microcell-Mediated Chromosome Transfer)法を用いて、上記微小核細胞と、受容細胞としてのヒトiPS細胞とをフィーダー細胞非存在下で共培養して融合し、上記目的DNAを有する外来染色体を上記ヒトiPS細胞に導入する工程を含む、上記方法。
(2)上記外来染色体が、人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記(1)に記載の方法。
(3)上記ウイルスエンベロープタンパク質が、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質又はその改変体である、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4)上記改変体が、麻疹ウイルス由来Hタンパク質と、抗CD9抗体、抗CD13抗体もしくは抗CD71抗体、又は前記抗体のScFvとの融合タンパク質である、上記(3)に記載の方法。
(5)上記供与細胞が、哺乳類細胞である、上記(1)~(4)のいずれかに記載の方法。
(6)上記哺乳類細胞が、齧歯類細胞である、上記(5)に記載の方法。
(7)上記目的DNAが、外来遺伝子、遺伝子座又は染色体断片である、上記(1)~(6)のいずれかに記載の方法。
(8)上記(1)~(7)のいずれかに記載の方法によって、外来遺伝子を有する外来染色体を含むヒトiPS細胞を作製する工程、並びに、上記ヒトiPS細胞において、或いは上記ヒトiPS細胞から分化誘導されたヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞において、上記外来遺伝子を発現する工程を含む、ヒトiPS細胞又はヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞において外来遺伝子を発現する方法。
(9)上記ヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞が、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋衛星細胞、前駆細胞、成熟細胞、又はその細胞集団である、上記(8)に記載の方法。
(10)上記ヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞が、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、巨核球細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、膵細胞、腎細胞、及び小腸細胞からなる群から選択される、上記(9)に記載の方法。
(11)上記外来遺伝子を含むDNAの上流及び/又は下流にインスレーター様DNA配列を含む、上記(8)~(10)のいずれかに記載の方法。
本発明は、外来染色体を含むヒトiPS細胞を製造するための方法を提供する。
上記方法は、以下に説明する第1工程~第3工程を含む。
この工程は、ウイルスエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する及び目的DNAを有する外来染色体を含む供与細胞を準備する工程である。
この工程は、上記第1工程の供与細胞から微小核細胞を作製する工程である。
この工程は、MMCT(Microcell-Mediated Chromosome Transfer;微小核細胞融合)法を用いて、上記第2工程の微小核細胞と受容細胞としてのヒトiPS細胞とをフィーダー細胞非存在下で共培養して細胞融合し、目的DNAを有する外来染色体をヒトiPS細胞に導入する工程である。
本発明はさらに、上記1.で作製されたヒト人工多能性幹細胞、又はヒト人工多能性幹細胞由来未分化もしくは分化細胞、において外来染色体中の少なくとも1つの外来遺伝子を発現する方法を提供する。
[第1工程]
この工程では、上記1.に記載の方法によってヒトiPS細胞を作製する。したがって、上記1.に記載の方法をそのままここに引用する。
この工程では、上記1.に記載の方法によって作製されたヒトiPS細胞において、或いは上記ヒトiPS細胞から分化誘導されたヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞において、上記外来遺伝子を発現することを含む。
[A]薬剤耐性遺伝子で標識されたMACベクターをヒトiPS細胞に導入することで、人工染色体保持ヒト細胞株を樹立する。
MACベクター(MAC5もしくはMAC6(図1))含有CHO細胞を10cm直径培養皿1枚に播種し、90%コンフルエントにまで培養した。これに抗CD9-ScFv融合MV-H発現プラスミドベクター12μg及びMV-F発現プラスミド12μgをLipofectamine2000を用いて添付のプロトコールに従い導入した。24時間後に25cm2フラスコ3個にパッセージした翌日から、コルセミド処理(F12/20%FBS/0.1μg/mLコルセミド)を48時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理(F12/20%FBS/0.1μg/mLコルセミド)を24時間行い、微小核を形成させた。コルセミド処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの9分目までをサイトカラシンBで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯(34℃)をフラスコが隠れない程度に加え、JLA-10,500 Rotor(BECKMAN)で8,000rpm、1時間、34℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンBを回収除去し、各フラスコ内のペレットを2mL無血清DMEM培地にて50mLチューブに回収した。孔径8μm、5μm、3μmフィルターの順にフィルトレーションした後、2,000rpm、10分、室温(RT)で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットを受容(「レシピエント」ともいう)細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はヒトiPS細胞に対して予めラミニン-511 0.5μg/mLでコーティングした10cm直径培養皿1枚に播種し、90%コンフルエントに培養したものを使用した。24時間後、10cm直径培養皿3枚に再播種した。更に24時間後に、90μg/mL G418により選択培養を行った。3~4週間選択培養した。結果として薬剤耐性コロニーがMAC5導入群から3個、MAC6導入群から1個獲得された(図2)。これらを単離し増殖させ、以下の解析を行った。
G418耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行い、MACベクターの存在を確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1:5'-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3'(配列番号1)
Neo R:5'-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA-3'(配列番号2)
上記PCR解析によって陽性であったクローンについて、上述の方法と同じようにキナクリン・ヘキスト二重染色を行った。キナクリン・ヘキスト二重染色したクローンの染色体像を蛍光顕微鏡により観察した(図4)。調べた2クローンにおいてMACベクターが65%以上の割合で保持されていることがわかった(図5)。
上記で得られた201B7/MAC5#2、201B7/MAC6#1について、1×106個の細胞をSCIDマウスの精巣に移植した。その後4~8週間後に形成された奇形種を採取し、10%中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックVIP6AI(サクラファインテックジャパン)を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織(図6左パネル)、中胚葉組織(図6中パネル)、外胚葉組織(図6右パネル)が観察された。これらの結果より、MACベクター導入ヒトiPS細胞株において、多能性を持つことが示された。
得られたMACベクター含有iPS細胞について、ヒトiPS細胞内における人工染色体ベクターの安定性を、蛍光顕微鏡を用いたGFP陽性率解析、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率により、評価した。
MAC6含有201B7についてのネオマイシン選択培養下での0PDLの培養開始時点,もしくは20PDLの長期培養後においてMAC6保持細胞を示すGFP陽性細胞の割合を、蛍光顕微鏡を用いて計測した結果、0PDL、20PDLにおいても90%以上の細胞がGFP陽性を示したことから、90%以上のMACベクター保持率であったことからヒトiPS細胞内でMACベクターは安定に保持され、遺伝子発現も安定していると示された(図7)。
上述の方法を用いて、MAC6含有201B7についてのネオマイシン誘導体G418非選択培養下での0PDLの培養開始時点,もしくは20PDLの長期培養後においてMAC6保持細胞を検証するために、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を実施し、MACベクター含有率を算出した。0PDL時点では、47,XX,+MAC6の核型を示す細胞がメジャーであり、90%の細胞がMAC6を含有していた(図8左パネル)。G418存在下における20PDL培養時点では、同様に47,XX,+MAC6である核型を示す細胞がメジャーであり、90%の細胞がMAC6を含有していた(図8中パネル)。G418非存在下における20PDL培養時点では、47,XX,+MAC6である核型を示す細胞がメジャーであり、75%の細胞がMAC6を含有していた(図8右パネル)。人工染色体ベクター含有ヒトiPS細胞は長期培養後も核型が安定であることが示された。また、人工染色体ベクターはヒトiPS細胞内において、長期間維持されることが示された。
[A]薬剤耐性遺伝子で標識されたDYS-HAC2ベクターをヒトDMD患者由来iPS細胞株へ導入する。
DYS-HAC2ベクター含有CHO細胞を10cm直径培養皿1枚に播種し、90%コンフルエントにまで培養した。これに野生型MV-H発現プラスミドベクターもしくは、抗CD71-ScFvもしくはCD9-ScFv融合MV-H発現プラスミドベクター12μg及びMV-F発現プラスミド12μgをLipofectamine2000を用いて添付のプロトコールに従い導入した。24時間後に25cm2フラスコ3個にパッセージした翌日から、コルセミド処理(F12/20%FBS/0.1μg/mLコルセミド)を48時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理(F12/20%FBS/0.1μg/mLコルセミド)を24時間行い、微小核を形成させた。コルセミド処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの9分目までをサイトカラシンBで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯(34℃)をフラスコが隠れない程度に加え、JLA-10,500 Rotor(BECKMAN)で8,000rpm、1時間、34℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンBを回収除去し、各フラスコ内のペレットを2mL無血清DMEM培地にて50mLチューブに回収した。孔径8μm、5μm、3μmフィルターの順にフィルトレーションした後、2,000rpm、10分、室温(RT)で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットをレシピエント細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はヒトiPS細胞(DMD-iPS#1)に対して予めGeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified(Thermo Fisher Scientific)(5%濃度)でコーティングした10cm直径培養皿1枚に播種し、90%コンフルエントに培養したものを使用した。24時間後、10cm直径培養皿3枚に再播種した。更に24時間後に、90μg/mL G418により選択培養を行った。3~4週間選択培養した。結果として薬剤耐性コロニーが野生型MV-Hを用いたDYS-HAC2導入群から10個、抗CD71-ScFv融合MV-H発現プラスミドベクターを用いたDYS-HAC2導入群から12個、もしくはCD9-ScFv融合MV-H発現プラスミドベクターを用いたDYS-HAC2導入群から10個、合計32個のクローンを得た。これらを単離し増殖させ、以下の解析を行った。
上記で得たG418耐性である32個のクローンのゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行った。そのプライマー配列を以下に示す。
NeoF:5'-CACAACAGACAATCGGCTGCTCT-3'(配列番号3)
DloxP3L:5'-GCATGGGGGAGGAGAGAAGAGAGATGTA-3'(配列番号4)
hCMV586:5'-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3'(配列番号5)
上記で得られたクローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163-1175,2001)に記された方法でFISH解析を行った。ヒトアルファサテライト及び、RP11-954B16をプローブとして用いたときの、ヒトiPS細胞株(DMD-iPS#1)にDYS-HAC2を導入したクローンのFISH染色結果を図10に示す。ヒト13番、21番、もしくはDYS-HAC2を赤色(矢印)で染色している。また、緑色(矢頭)でジストロフィン遺伝子を染色している。図10中、小窓にDYS-HAC2ベクターを拡大して示している。
上記で得られたDMD-iPS DYS-HAC2 #8 について、1×106個の細胞をSCIDマウスの精巣に移植した。その後4~8週間後に形成された奇形種を採取し、10%中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックVIP6AI(サクラファインテックジャパン)を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織(図11左パネル)、中胚葉組織(図11中パネル)、外胚葉組織(図11右パネル)が観察された。これらの結果より、DYS-HAC2ベクター含有ヒトDMD患者由来iPS細胞株において、多能性を持つことが示された。
[A]薬剤耐性遺伝子で標識されたヒト21番断片をヒトiPS細胞に導入することで、ヒト21番染色体断片保持ヒト細胞株(ダウン症モデルiPS細胞株)を樹立する。
ヒト21番染色体断片含有CHO細胞を10cm直径培養皿1枚に播種し、90%コンフルエントにまで培養した。これに抗CD9-ScFv融合MV-H発現プラスミドベクター12μg及びMV-F発現プラスミド12μgをLipofectamine2000を用いて添付のプロトコールに従い導入した。24時間後に25cm2フラスコ3個にパッセージした翌日から、コルセミド処理(F12/20%FBS/0.1μg/mLコルセミド)を48時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理(F12/20%FBS/0.1μg/mLコルセミド)を24時間行い、微小核を形成させた。コルセミド処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの9分目までをサイトカラシンBで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯(34℃)をフラスコが隠れない程度に加え、JLA-10,500 Rotor(BECKMAN)で8,000rpm、1時間、34℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンBを回収除去し、各フラスコ内のペレットを2mL無血清DMEM培地にて50mLチューブに回収した。孔径8μm、5μm、3μmフィルターの順にフィルトレーションした後、2,000rpm、10分、室温(RT)で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットをレシピエント細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はヒトiPS細胞に対して予めGeltrrexTM LDEV-Free hESC-qualified(5%濃度)でコーティングした10cm直径培養皿1枚に播種し、90%コンフルエントに培養したものを使用した。24時間後、10cm直径培養皿3枚に再播種した。更に24時間後に、50μg/mL G418により選択培養を行った。3~4週間選択培養した。結果として薬剤耐性コロニー1個を得た。これらを単離し増殖させた。
上記薬剤耐性であったクローンについて、上述の方法と同じようにキナクリン・ヘキスト二重染色を行い、21番染色体を導入したことにより、21番染色体を3本、独立に含有していることを確認することができた(図12)。
上記で得られた外来ヒト21番断片含有ヒトiPS細胞について、1×106個の細胞をSCIDマウスの精巣に移植した。その後4~8週間後に形成された奇形種を採取し、10%中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックVIP6AI(サクラファインテックジャパン)を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織(図13左パネル)、中胚葉組織(図13中パネル)、外胚葉組織(図13右パネル)が観察された。これらの結果より、外来ヒト21番断片含有ヒトiPS細胞において、多能性を持つことが示された。
[A]ヒトiPS細胞内における人工染色体上への遺伝子導入を実証するために、3遺伝子同時導入法により3種のプラスミドベクターを同時にヒトiPS細胞内のMACベクターに搭載した。
カセットベクターを以下のように作製した。
(1)pBG2-V0binsElucins
pBG2-V0のAscI/NheI切断サイトにpBG2-V0b(1C)のAscI/AvrIIサイトにCAG-ElucベクターのAscI/AvrII断片を挿入した。
tDNA pEF BGHpAのEcoRI切断サイトにEcoRI-XbaI-EcoRIを挿入した。tDNA pEF BGHpA-XbaIのXbaIサイトにpCMV tdTomatoのNheI/AvrII切断断片を挿入した(tDNA EF1a tdTomato)。tDNA Efia tdTomatoのAscI/NheIにpBG2-Vla(2A)のBxbI-PhiC31_CL_F/BxbI-PhiC31_CL_RでのPCR産物のAscI/AvrII切断断片を挿入した(GLV2-EF1a-tdTomato)。
tDNA-EF1aBGHpAのEcoRI切断サイトにpTagBFP2のBFP_cl_EcoRI_F/BFP_cl_EcoRI_RでのPCR産物のEcoRI切断断片を挿入した(tDNA-EF1a-BFP)。tDNA-EF1a-BFPのAscI/NheI切断サイトにpBG2-V2a(3A)のPhiC31att_3'HPRT_Asc1_F/PhiC31att_3'HPRT_cl_RでのPCR産物のAscI/AvrII切断断片を挿入した(GLV3-EF1a-BFP)。GLV3-EF1a-BFPのAscI/HindIII断片にpBG2-v1b1よりのSA-Neo AvrII Fw/SA-Neo AgeI RvでのPCR産物のAvrII/AgeI断片、GLV3-EF1a-BFPよりのPhiC31 AscI F/PhiC31 AvrII RでのPCR産物のAscI/AvrII断片、および、AgeI/HindIII Oligoの断片を挿入した(GLV3-Neo-BFP)。
遺伝子導入はエレクトロポーレーターNEPA21(NEPAGENE Co.Ltd.)を用いて行った。3×106個のiPS細胞をPBS、5mLを用いて洗浄し、1200rpmにて室温で5分間、遠心分離し、細胞を回収した。さらにOpti-MEM(Thermo Fiser Scientific Inc.),5mLを用いて、1200rpmにて室温で5分間、遠心分離し、細胞を回収した。これを90μLのOpti-MEMに懸濁した。これにpBG2-V0binsElucins3.5μg、GLV2-EF1a-tdTomato7μg、GLV3-EF1a-BFP10.5μg、Cre発現ベクター3μg、Bxb1インテグレース発現ベクター3μg、PhiC31インテグレース発現ベクター3μgを混合し、NEPA21エレクトロポーレーターを用いて、添付のプロトコールに従い、Poring Pulse(Voltage 135V、Pulse Length 5.0msec、Pulse Interval 50msec、Number of Pulse 2、Decay Rate 10%、Polarity +)、 Transfer Pulse(Voltage 20V、Pulse Length 50.0msec、Pulse interval 50.0msec、Number of Pulse 5、Decay Rate 40%、Polarity +/-)の条件にて導入した。導入後48時間からG418(90μg/mL)選択培養下で3~4週間培養すると、蛍光陽性薬剤耐性コロニーが出現した。MACベクター含有ヒトiPS細胞より1回の導入で得た1個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。
[B.1.1]PCR
HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的に導入した遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1:5'-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3'(配列番号6)
SIM Neo Rv:5'-CGCCTTGAGCCTGGCGAACA-3'(配列番号7)
tdTomatoF:5'-ACAACAACATGGCCGTCATC-3'(配列番号8)
tdTomatoR:5'-CATGCCGTACAGGAACAGGT-3'(配列番号9)
ElucF:5'-CGATCCTGGTCTTCACCACT-3'(配列番号10)
ElucR:5'-TGCAGAGGCTTGAATGTTTG-3'(配列番号11)
BFP Fw:5'-CTGGAAGGCAGAAACGACAT-3'(配列番号12)
BFP Rv:5'-TGCTAGGGAGGTCGCAGTAT-3'(配列番号13)
各クローンの各蛍光陽性頻度を定量するために、BD社製Fortessaを用いて、EGFP、BFP、tdTomatoの陽性頻度を測定した。各クローン1×105個を500μLのPBS(-)に懸濁し、測定を行った。結果としてEGFP、BFP、Tdtomato三重陽性細胞を含むクローンであった。
各クローンのEmerald Luciferase発現を検出するために、東洋ビーネット株式会社製のルシフェラーゼ・アッセイシステムを用いて発光測定を試薬の標準手順書に従い実施した。細胞は1×104個を用いて測定を実施し、Emerald Luciferase発現陽性であった。
上記で得られたクローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10:1163-1175,2001)に記された方法でmouse cot-1配列を赤色プローブとした(図15の矢印)。pBG2-V0binsElucins、GLV2-EF1a-tdTomatoもしくはGLV3-EF1a-BFPを緑色プローブとしたFISH解析を行った(図15の矢頭)。代表例としてEmerald Luciferase遺伝子(Eluc)の搭載を示すpBG2-V0binsElucinsおよび、mouse cot-1配列をプローブとした染色結果を示す。結果から、外来DNAを挿入されたMACベクターが宿主染色体から独立して保持されていた。
上記で得られた外来DNA搭載MACベクター含有ヒトiPS細胞について、1×106個の細胞をSCIDマウスの精巣に移植した。その後4~8週間後に形成された奇形種を採取し、10%中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックVIP6AI(サクラファインテックジャパン、日本)を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織(図16左パネル)、中胚葉組織(図16中パネル)、外胚葉組織(図16右パネル)が観察された。これらの結果より、外来DNA搭載MACベクター含有ヒトiPS細胞において、多能性を持つことが示された。
得られた外来DNA搭載MACベクター含有iPS細胞について、ヒトiPS細胞内における人工染色体ベクターの安定性を、蛍光顕微鏡を用いた蛍光タンパク質陽性率解析、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率解析により、評価した。
上記で得られた外来DNA搭載MACベクター含有ヒトiPS細胞について、0PDL培養開始時点、ネオマイシン非選択培養下での20PDL長期培養時点での、外来DNA搭載MACベクター含有ヒトiPS細胞のGFP陽性率、tdTomato陽性率、BFP2陽性率を蛍光顕微鏡により評価した。計測の結果、0PDLにおいては、GFP,tdTomato,BFP2いずれも陽性である細胞が存在した(図17)。20PDL長期培養後も遺伝子発現が認められた。このことから、外来DNA搭載MACベクターはヒトiPS細胞内において、長期間、搭載した外来DNAを発現可能であると示された。
外来DNA搭載MACベクター含有ヒトiPS細胞におけるキナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率の評価
上述の方法を用いて、外来DNA搭載MACベクター含有201B7についてのネオマイシン誘導体G418非選択培養下での0PDLの培養開始時点,もしくは20PDLの長期培養後においてMAC6保持率を検証するために、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を実施し、MACベクター含有率を算出した。0PDL時点では、47,XX,+MAC6の核型を示す細胞がメジャーであり、95%の細胞がMAC6を含有していた(図18左パネル)。G418存在下における20PDL培養時点では、同様に47,XX,+MAC6である核型を示す細胞がメジャーであり、90%の細胞がMAC6を含有していた(図18中パネル)。G418非存在下における20PDL培養時点では、47,XX,+MAC6である核型を示す細胞がメジャーであり、75%の細胞がMAC6を含有していた(図18右パネル)。人工染色体ベクター含有ヒトiPS細胞は長期培養後も核型が安定であることが示された。また、外来DNA搭載人工染色体ベクターはヒトiPS細胞内において、長期間維持されることが示された。
Claims (6)
- 外来染色体を含むヒト人工多能性幹(iPS)細胞を製造するための方法であって、麻疹ウイルス由来エンベロープHタンパク質及びFタンパク質、又は麻疹ウイルス由来Hタンパク質と抗CD9抗体のScFvとの融合タンパク質、を細胞表面に発現する及び目的DNAを有する外来染色体を含む、供与細胞としてのヒトもしくは齧歯類細胞を準備する工程、前記供与細胞から目的DNAを有する外来染色体を含む微小核細胞を作製する工程、MMCT(Microcell-Mediated Chromosome Transfer)法を用いて、前記微小核細胞と、予め90%コンフルエントになるまで培養した受容細胞としてのヒトiPS細胞とをフィーダー細胞非存在下で3~4週間共培養して融合する工程、並びに、前記目的DNAを有する外来染色体が導入された前記ヒトiPS細胞を回収する工程を含む、但し前記外来染色体がヒトもしくは齧歯類由来の人工染色体又は染色体断片である、前記方法。
- 前記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記目的DNAが、外来遺伝子又はその遺伝子座である、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載の方法によって、外来遺伝子もしくはその遺伝子座を有する外来染色体を含むヒトiPS細胞を作製する、但し前記外来染色体がヒトもしくは齧歯類由来の人工染色体又は染色体断片である、工程、並びに、前記ヒトiPS細胞において、或いは前記ヒトiPS細胞から分化誘導されたヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞において、前記外来遺伝子を発現する工程を含む、ヒトiPS細胞又はヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞において外来遺伝子を発現する方法。
- 前記ヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞が、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋衛星細胞、前駆細胞、成熟細胞、又はその細胞集団である、請求項4に記載の方法。
- 前記ヒトiPS細胞由来未分化もしくは分化細胞が、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、巨核球細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、膵細胞、腎細胞、及び小腸細胞、並びにそれらの前駆細胞からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
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