JP2011078370A - ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 - Google Patents
ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011078370A JP2011078370A JP2009234583A JP2009234583A JP2011078370A JP 2011078370 A JP2011078370 A JP 2011078370A JP 2009234583 A JP2009234583 A JP 2009234583A JP 2009234583 A JP2009234583 A JP 2009234583A JP 2011078370 A JP2011078370 A JP 2011078370A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- cells
- pluripotent stem
- stem cells
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】ヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントまたはヒトラミニンα3β3γ2のE8フラグメントが、好ましくは0.5μg/cm2〜25μg/cm2の濃度でコーティングされているヒト多能性幹細胞培養用培養基材、および当該培養基材を用いて使用するヒト多能性幹細胞培養の培養方法である。単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を4×104cell/cm2〜10×104cell/cm2の密度で当該培養基材に播種することにより、ヒト多能性幹細胞を分化多能性を保持したまま急速拡大させることができる。
【選択図】図1
Description
[1]ヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントまたはヒトラミニンα3β3γ2のE8フラグメントがコーティングされていることを特徴とするヒト多能性幹細胞培養用培養基材。
[2]ヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントまたはヒトラミニンα3β3γ2のE8フラグメントが0.5μg/cm2〜25μg/cm2の濃度でコーティングされていることを特徴とする前記[1]に記載の培養基材。
[3]ヒト多能性幹細胞が、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞である前記[1]または[2]に記載の培養基材。
[4]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の培養基材を使用することを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
[5]単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を培養する方法であって、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、前記[1]〜[3]のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含むことを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
[6]ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、前記[1]〜[3]のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を2×104cell/cm2〜20×104cell/cm2の密度で播種することを特徴とするヒト多能性幹細胞の急速拡大方法。
[7]ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、前記[1]〜[3]のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞由来のコロニーを形成させることを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法。
[8]ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項1〜3のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞の状態で維持することを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法。
本発明は、ヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントまたはヒトラミニンα3β3γ2のE8フラグメントがコーティングされているヒト多能性幹細胞培養用培養基材を提供する。多能性幹細胞としては、ES細胞(胚性幹細胞)、iPS細胞(人工多能性幹細胞)、mGS細胞(多能性生殖幹細胞)、ヒトES細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。
さらに、異種由来の成分が排除されている培地を使用すれば、完全に異種由来の成分を含まない培養条件(ゼノフリー:Xeno−Free)でヒト多能性幹細胞を培養することができ、ヒトに対して免疫原性を発現する可能性が非常に低い、高安全性のヒト多能性幹細胞を提供することができる。
また、本発明の培養基材を用いれば、従来の培養系では不可能であった単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を培養することができる。したがって、従来の培養系と比較して、ヒト多能性幹細胞を顕著に急速拡大増殖させることができる。また、ヒト多能性幹細胞を単一細胞由来クローンを容易に分離することができ、単一細胞の状態で維持することができる。
本発明は、上記本発明の培養基材を用いてヒト多能性幹細胞を培養する方法を提供する。本発明の培養方法は、フィーダーフリーの培養条件でヒト多能性幹細胞を培養する場合に使用することが好ましく、フィーダーフリーかつゼノフリーの培養条件でヒト多能性幹細胞を培養する場合に使用することが特に好ましい。
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
以下の方法1または方法2のいずれかの方法で、フィーダー細胞との共培養系からヒトES細胞を回収する。
方法1:
フィーダー細胞(例えばMEF)と共培養しているヒトES細胞の培養ディッシュ(3〜5日目)に0.25%トリプシン/DMEM−F12を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で2〜3分間恒温処理し、培養ディッシュをDMEM−F12で洗浄してフィーダー細胞を除去する。培養液を加えて全体細胞を物理的に剥離した細胞懸濁液をBD Falconセルストレーナー100μm(BD Falcon #352460)に通した後、ストレーナーを洗浄することでヒトES細胞のコロニーのみを分離し、回収する。
フィーダー細胞(例えばMEF)と共培養しているヒトES細胞の培養ディッシュ(3〜5日目)にヒトES細胞剥離液(例えば、霊長類ES細胞用細胞剥離液(リプロセル RCHETP002、1mg/ml dispase/DMEM−F12、10mg/ml collagenaseIV/DMEM−F12など)を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理し、ヒトES細胞とMEFを剥離する。細胞を15ml遠心チューブに移し、培養液を約10ml入れて細胞を懸濁した後、5分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を2回以上繰り返して、ヒトES細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
回収したヒトES細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えばP−1000ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりコロニーを砕く方法等が挙げられる。単一細胞に分散させた後、適切な培養液(例えばTeSR2など)に懸濁し、本発明の培養基材(例えばヒトラミニン511E8をコーティング(1.5μg/cm2)した培養ディッシュ)に播種する。培養は、用いた培養液に適合するCO2濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
拡大エリアの不足あるいはコロニー内に死細胞の出現が目立つようになるのを目安に、継代操作を行う。本発明の培養方法では、従来の方法と同様にヒトES細胞を適度な大きさのコロニー形態を維持した状態で播種する方法で継代培養を行ってもよく、ヒトES細胞を単一細胞に分散させて播種する方法で継代培養を行ってもよい。ここで、単一細胞に分散された状態は、細胞懸濁液中の全細胞が単一細胞に分散されていることを要するものではなく、単一細胞に分散された細胞以外に数個〜十数個程度が接着した状態の細胞が細胞懸濁液中に含まれている状態も単一細胞に分散された状態に包含される。
ヒトES細胞を培養している本発明の培養基材(培養ディッシュ)に、TrypLE Select(商品名、Invitrogen #12563011)を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理する。例えばP−1000ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトES細胞のコロニーを砕き、単一細胞に分散させる。培養液を加えて細胞を懸濁し、遠心チューブに回収する。遠心(200×g、3分)と同培養液による洗浄操作を2度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、本発明の培養基材(例えばヒトラミニン511E8をコーティング(1.5μg/cm2)した培養ディッシュ)に、例えば約40000細胞/cm2の播種密度で単一細胞に分散したヒトES細胞を播種する。培養は、用いた培養液に適合するCO2濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
ヒトES細胞を単一細胞に分散しない場合は、細胞の剥離にCollagenaseIV、Dispase、Accutase等の酵素を用いる。ヒトES細胞を培養している本発明の培養基材に、10mg/ml collagenase/DMEM−F12、または2mg/ml dispase/DMEM−F12、またはAccutase(Millipore #SCR005)を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理する。酵素液を除いて培養液を加え、例えばP−1000のピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトES細胞が約50〜約100個のコロニー状を維持する程度に小さく砕く。細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、遠心(200×g、3分)と同培養液による洗浄操作を2度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、本発明の培養基材(例えばヒトラミニン511E8をコーティング(1.5μg/cm2)した培養ディッシュ)に2分の1〜4分の1希釈量を播種する。培養は、用いた培養液に適合するCO2濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
本発明は、ヒト多能性幹細胞の急速拡大方法を提供する。本発明の急速拡大方法は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、上記本発明の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を約2×104cell/cm2〜約20×104cell/cm2の密度で播種するものであればよい。播種密度は、約3×104cell/cm2〜約10×104cell/cm2がより好ましく、約4×104cell/cm2〜約5×104cell/cm2がさらに好ましい。従来の培養系では、単一に分散されたヒトES細胞を上記細胞密度で播種したときの接着効率が10%未満であるところ、本発明の急速拡大方法によれば、顕著に高い接着効率が得られ、その後旺盛に増殖するので、従来法と比較して格段の速度でヒト多能性幹細胞を増殖させることができる。
本発明は、ヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法を提供する。本発明の単一細胞由来クローン分離方法は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、上記本発明の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞由来のコロニーを形成させるものであればよい。本発明の単一細胞由来クローン分離方法によれば、従来の培養系では困難であったヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローンを形成させ、分離することができ、均一なヒト多能性幹細胞を容易に取得することが可能となる。
本発明は、ヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法を提供する。本発明の単一細胞培養方
法は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、上記本発明の培養基材を用いて培養する工程とを含み、細胞を増殖させることなく単一細胞の状態で維持するものであればよい。コロニーを形成したヒト多能性幹細胞は、コロニー周辺部とコロニー内部とで細胞の状態が異なる場合があるが、本発明の単一細胞培養方法によれば、細胞はコロニーを形成しないので、状態の均一なヒト多能性幹細胞を得ることができ、分化誘導効率の向上が期待できる。
(1)細胞外基質
組換えヒトラミニン511E8(以下「rhLM511E8」と記す。)、組換えヒトラミニン332E8(以下「rhLM332E8」と記す。)、組換えヒトラミニン511(以下「rhLM511」と記す。)、組換えヒトラミニン332(以下「rhLM332」と記す。)、組換えヒトラミニン111(以下「rhLM111」と記す。)、マトリゲル(BD Bioscience #354230)、ヒトフィブロネクチン(Sekiguchiらの方法(Sekiguchi K. and Hakomori S: Domain structure of human plasma fibronectin. Differences and similarities between human and hamster fibronectins. The Journal of Biological Chemistry, 258, 3967-3973, 2003.)に従い、ゼラチン不溶化アフィニティーカラムを用いて精製したもの)、およびビトロネクチン(Yatohgoらの方法(Yatohgo T., Izumi, M., Kashiwagi, H., and Hayashi, M. Novel purification of vitronectin from human plasma by heparin affinity chromatograhy. Cell Structure and Function, 13, 281-292, 1988 )に従いヘパリン不溶化アフィニティーカラムを用いて精製したもの)を使用した。
ヒトES細胞は、京都大学再生医科学研究所樹立株(KhES−1、KhES−2、KhES−3)およびNational Stem Cell Bankより購入した株(H1、H9)を使用した。ヒトiPS細胞はNational Stem Cell Bankより購入した株(クローン名:iPS(IMR90)−1−DL−1、iPS(IMR90)−4−MCB−1、iPS(foreskin)−1−DL−1)を使用した。
rhLM511E8は、Idoら(Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.)に記載の方法に従い、以下のように作製した。
(i) 6×Hisタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号1)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’(reverse、配列番号2)
(ii) HAタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号3)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号4)
(iii) FLAGタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号5)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号4)
(iv) α5鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’(forward、配列番号6)
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’(reverse、配列番号7)
(v) β1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’(forward、配列番号8)
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’(reverse、配列番号9)
(vi) γ1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’(forward、配列番号10)
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’(reverse、配列番号11)
(4-1)ヒトラミニンα3鎖E8フラグメント発現ベクターの作製
クローニング用プラスミドpBluescript KS(+)(Stratagene社)を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてPCRを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のEcoRVの5’側に制限酵素AscI認識配列(GGCGCGCC)と6×Hisタグ(HHHHHH)をコードするDNAが挿入されたpBluescript KS(+)を作製した。
(vii) 6×Hisタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGGGCGCGCCAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号12)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGC-3’(reverse、配列番号13)
(viii) α3鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GCGGCCGAGGACGCAGCCAACAGG-3’(forward、配列番号14)
5’-GGTCTAGACTAAGCATCTTGCCACACC-3’(reverse、配列番号15)
5’側から、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド・HAタグ・β3鎖E8フラグメントを順にコードするcDNA断片を獲得するために、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド・HAタグをコードするcDNA断片とβ3鎖E8をコードするcDNA断片をそれぞれ取得し、エクステンションPCRによってそれら2種類の断片を連結・増幅した。
(ix) シグナルペプチド配列・HAタグ配列増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(forward、配列番号16)
5’-TCTGGGACAGATCTGCATAATCTGGCAC-3’(reverse、配列番号17)
(x) β3鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-AGATTATGCAGATCTGTCCCAGACCAAG-3’(forward、配列番号18)
5’-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3’(reverse、配列番号19)
(xi) マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド・HAタグ・β3鎖E8増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(forward、配列番号16)
5’-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3’(reverse、配列番号19)
5’側から、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド・FLAGタグ・γ2鎖E8フラグメントを順にコードするcDNA断片を獲得するために、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド・FLAGタグをコードするcDNA断片とγ2鎖E8をコードするcDNA断片をそれぞれ取得し、エクステンションPCRによってそれら2種類の断片を連結・増幅した。
(xii) シグナルペプチド配列・FLAGタグ配列増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(forward、配列番号16)
5’-GGATGCTCTCATCCTTATCATCATCATCC-3’(reverse、配列番号20)
(xiii) γ2鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GATGATGATAAGGATGAGAGCATCCTTAAAAAC-3’(forward、配列番号21)
5’-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3’(reverse、配列番号22)
(xiv) マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド・FLAGタグ・γ2鎖E8増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(forward、配列番号16)
5’-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3’(reverse、配列番号22)
rhLM332E8の発現は、作製した各鎖の発現ベクターをヒト腎臓由来293F細胞(インビトロジェン)に導入して行った。300mlの293F細胞(1.0×106個/ml)にトランスフェクション試薬293fectin(商品名、インビトロジェン)およびOpti−MEM(商品名、インビトロジェン)を用いて各鎖発現ベクターを70μgずつ同時にトランスフェクトし、72時間培養を行ったのち、培養液を回収した。培養液は1000×gで10分間遠心し、その上清をさらに15,000×gで30分間遠心し、細胞や不溶物を除去した。培養上清にイミダゾールを終濃度10mMとなるよう加え、よく撹拌した。その後、50%(v/v)Ni−NTA agarose(キアゲン社)を40ml添加し、4℃、一晩のバッチ法で目的タンパク質を吸着させた。Ni−NTA agaroseを回収し、TBS(−)で洗浄したのち200mMイミダゾール/TBS(−)で溶出した。280nmの吸光度を指標にしてrhLM332E8溶出画分を確認した。溶出された画分に2mlのANTI−FLAG M2 affinity Gel(シグマ)を添加し、4℃、一晩のバッチ法で目的タンパク質を吸着させた。ゲルをエコノカラム(バイオラッド社製)に移し、TBS(−)で洗浄後、100μg/ml FLAG peptide(シグマ)を含むTBS(−)で溶出した。溶出フラクションを銀染色で確認し、rhLM332E8の溶出された画分をTBS(−)に対して透析(20kDa cut)を行った。
rhLM511は、Idoら(Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” Jhe Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004.)に記載の方法に従って作製した。
rhLM332は、Idoら(Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.)に記載の方法に従って作製した。
rhLM111は、Idoら(Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiki Yagi, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the function-blocking monoclonal antibody 4C7” Matrix Biology, 25, 112-117, 2006.)およびTaniguchiら(Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen, Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiuchi, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 284, 7820-7831, 2009.)に記載の方法に従って作製した。
96ウェルマイクロプレート(BD Bioscience #351172)に、rhLM511E8、rhLM332E8、rhLM511、rhLM332、rhLM111、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンをDulbecco’s PBS(和光純薬 #045-29795)またはDMEM−F12(シグマ #D6241)で希釈し、各細胞外基質溶液を最終濃度が0〜25μg/cm2の範囲になるように加え、室温で2時間静置してコーティングを行った。
mTeSR1培養細胞(P1)にTrypLE Select(インビトロジェン #12563011)を加えて3分間37℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。細胞数をカウントした後、プレートに5×104cell/wellの密度で細胞を播種した。細胞播種から6時間経過後、上清を除いてDMEM−F12で1度ウェルを洗浄し、10%中性ホルマリン緩衝液を加えて10分間細胞を固定した。100%エタノールに置換して5分経過した後、4%クリスタルバイオレット/100%メタノール溶液を加え、細胞を5分間染色した。プレートを大量の蒸留水に浸して過剰な染色液を除去した後、風乾させた。1%SDSを加えて細胞を可溶化し、マルチプレートリーダーを用いて波長570nmの吸光度を測定した。
ヒトES細胞の継代は、トリプシン/EDTA等を用いて単一細胞に分散すると細胞の生存率が極端に低下するため、コロニー形状を維持しながら植え継ぐのが一般的である。そこで、rhLM511E8をコーティングした場合の単一ヒトES細胞の接着効率を、マトリゲルをコーティングした場合と比較した。
mTeSR1培養細胞(P1)にTrypLE Selectを加えて3分間37℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。rhLM511E8またはマトリゲルをコーティングした48ウェルマルチウェルプレートに、細胞密度1×103cell/cm2〜5×105cell/cm2の範囲で3ウェルずつ播種した。細胞播種から6時間後、上清を除いてPBSで洗浄し、0.25%トリプシン/EDTAで細胞を剥離した。細胞数をカウントし、各細胞密度における播種細胞数に対する接着細胞数の比を求めた。
rhLM511E8またはrhLM332E8を最終濃度が1.5μg/cm2になるようにDulbecco’s PBSで希釈した。マトリゲルを最終濃度が25μg/cm2になるようにDMEM−F12で希釈した。各希釈液を35mmイージーグリップセルカルチャーディッシュ(BD Falcon #353001)に添加し、室温で2時間静置してコーティングを行った。
mTeSR1培養細胞(P1)にTrypLE Selectを加えて3分間37℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。rhLM511E8、rhLM332E8またはマトリゲルをコーティングした35mmイージーグリップセルカルチャーディッシュに、細胞密度5×104cell/cm2で播種した。細胞播種から毎日観察を行い、形態変化を撮影記録した。
細胞播種から5日後、表面抗原解析を行うために細胞をTrypLE Selectで3分間処理して細胞を単一細胞に分散し、Working Solution(0.1%BSA/PBS)で洗浄処理した。一次抗体として抗SSEA−1抗体、抗SSEA−4抗体、抗Tra−1−60抗体、抗Tra−1−81抗体、抗Tra−2−54抗体(以上、Developmental Studies Hybridoma Bank、アイオワ大学)または抗GCTM−2抗体(インビトロジェン)を添加して4℃で30分間染色した後、Working Solutionで洗浄した。次に二次抗体(Beckman Coulter #731735)を添加して4℃で30分間染色した。細胞をWorking Solutionで2度洗浄し、BD FACSCalibur HGを用いて蛍光強度を測定した。
Claims (8)
- ヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントまたはヒトラミニンα3β3γ2のE8フラグメントがコーティングされていることを特徴とするヒト多能性幹細胞培養用培養基材。
- ヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントまたはヒトラミニンα3β3γ2のE8フラグメントが0.5μg/cm2〜25μg/cm2の濃度でコーティングされていることを特徴とする請求項1に記載の培養基材。
- ヒト多能性幹細胞が、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞である請求項1または2に記載の培養基材。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の培養基材を使用することを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
- 単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を培養する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項1〜3のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含むことを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。 - ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項1〜3のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を2×104cell/cm2〜20×104cell/cm2の密度で播種することを特徴とするヒト多能性幹細胞の急速拡大方法。 - ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項1〜3のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、
単一細胞由来のコロニーを形成させることを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法。 - ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項1〜3のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、
単一細胞の状態で維持することを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法。
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009234583A JP5590646B2 (ja) | 2009-10-08 | 2009-10-08 | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
EP14187130.1A EP2821480B1 (en) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Culture substrate for human pluripotent stem cells and use thereof |
CN201080045114.8A CN102597217B (zh) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | 人多能干细胞用培养基质及其用途 |
ES10822075.7T ES2615555T3 (es) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Sustrato de cultivo para células madre pluripotentes humanas y uso del mismo |
PCT/JP2010/067618 WO2011043405A1 (ja) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
US13/500,452 US8877493B2 (en) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Culture substrate for human pluripotent stem cells and use thereof |
EP10822075.7A EP2487236B1 (en) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Culture substratum for human pluripotent stem cells, and use thereof |
CN201410776254.2A CN104498430A (zh) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | 人多能干细胞用培养基质及其用途 |
ES14187130.1T ES2643059T3 (es) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Sustrato de cultivo para células madre pluripotentes humanas y uso del mismo |
DK10822075.7T DK2487236T3 (en) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | CULTURAL SUBSTANCES FOR HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS AND USE THEREOF |
DK14187130.1T DK2821480T3 (en) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Culture substrate for human pluripotent stem cells and their use |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009234583A JP5590646B2 (ja) | 2009-10-08 | 2009-10-08 | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011078370A true JP2011078370A (ja) | 2011-04-21 |
JP5590646B2 JP5590646B2 (ja) | 2014-09-17 |
Family
ID=43856855
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009234583A Active JP5590646B2 (ja) | 2009-10-08 | 2009-10-08 | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8877493B2 (ja) |
EP (2) | EP2487236B1 (ja) |
JP (1) | JP5590646B2 (ja) |
CN (2) | CN102597217B (ja) |
DK (2) | DK2821480T3 (ja) |
ES (2) | ES2643059T3 (ja) |
WO (1) | WO2011043405A1 (ja) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013147264A1 (ja) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | 味の素株式会社 | 硫酸化化合物を含む幹細胞増殖用培地 |
WO2014103534A1 (ja) | 2012-12-28 | 2014-07-03 | 国立大学法人大阪大学 | コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用 |
WO2014119219A1 (ja) | 2013-01-31 | 2014-08-07 | 味の素株式会社 | 多能性幹細胞の安定した未分化維持増殖を行うための培養方法 |
WO2014168157A1 (ja) | 2013-04-08 | 2014-10-16 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物 |
WO2014199754A1 (ja) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 |
WO2015080297A1 (en) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Application of laminin to corneal endothelial cell culture |
JP2015186474A (ja) * | 2014-03-13 | 2015-10-29 | アークレイ株式会社 | 細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置 |
WO2016043168A1 (ja) * | 2014-09-16 | 2016-03-24 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 |
JP2017006058A (ja) * | 2015-06-23 | 2017-01-12 | 国立大学法人京都大学 | 培養装置及び培養方法 |
WO2020075822A1 (ja) * | 2018-10-10 | 2020-04-16 | 国立大学法人鳥取大学 | 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法 |
WO2020235319A1 (ja) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | 味の素株式会社 | 軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法 |
WO2021025027A1 (ja) | 2019-08-06 | 2021-02-11 | 花王株式会社 | 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103649112B (zh) * | 2011-04-08 | 2017-07-18 | 国立大学法人大阪大学 | 改造层粘连蛋白及其利用 |
US9796962B2 (en) | 2013-08-07 | 2017-10-24 | Kyoto University | Method for generating pancreatic hormone-producing cells |
CA2923592A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Kyoto University | Method for inducing dopamine-producing neural precursor cells from pluripotent stem cells |
CN105849254A (zh) | 2013-10-09 | 2016-08-10 | 希里欧斯株式会社 | 用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法 |
WO2015133596A1 (ja) * | 2014-03-07 | 2015-09-11 | 国立大学法人京都大学 | 細胞培養用組成物 |
US10428311B2 (en) | 2014-07-16 | 2019-10-01 | Osaka University | Method for enhancing activity of laminin fragments as cell culture matrix |
JP6770435B2 (ja) | 2014-10-31 | 2020-10-14 | 京都府公立大学法人 | ラミニンによる網膜および神経の新規治療 |
CN107073067A (zh) | 2014-10-31 | 2017-08-18 | 京都府公立大学法人 | 使用层粘连蛋白的新的角膜的治疗 |
CN105002143B (zh) * | 2015-08-19 | 2018-12-14 | 湖南光琇高新生命科技有限公司 | 一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法 |
JP6849957B2 (ja) | 2015-11-10 | 2021-03-31 | 国立大学法人京都大学 | ラミニンフラグメント含有培地を用いる細胞培養方法 |
PL3444334T3 (pl) | 2016-04-15 | 2022-01-10 | Kyoto University | Sposób indukowania limfocytów t cd8-dodatnich swoistych wobec antygenu |
WO2017183736A1 (ja) | 2016-04-22 | 2017-10-26 | 国立大学法人京都大学 | ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法 |
JPWO2017200039A1 (ja) * | 2016-05-19 | 2019-03-22 | 富士フイルム株式会社 | 細胞培養方法、培地及び培地キット |
JP6949349B2 (ja) | 2016-12-20 | 2021-10-13 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞の増殖を促進するための組成物、及び多能性幹細胞の増殖促進方法 |
WO2018116904A1 (ja) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Dic株式会社 | 細胞培養基材 |
US11499136B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-11-15 | Dic Corporation | Cell culture substrate |
JP6942363B2 (ja) * | 2017-01-31 | 2021-09-29 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞の分化制御方法 |
JP7161775B2 (ja) | 2017-05-25 | 2022-10-27 | 国立大学法人京都大学 | 中間中胚葉細胞から腎前駆細胞への分化誘導方法、および多能性幹細胞から腎前駆細胞への分化誘導方法 |
EP3757208A4 (en) | 2018-02-19 | 2021-12-01 | Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. | CELLULAR AGGREGATE, MIXTURE OF CELLULAR AGGREGATES AND ITS PREPARATION METHOD |
WO2022035895A1 (en) * | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Lineage Cell Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for embryonic stem cell expansion |
WO2022149616A1 (ja) | 2021-01-08 | 2022-07-14 | 国立大学法人京都大学 | ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008084401A2 (en) * | 2007-01-04 | 2008-07-17 | Karl Tryggvason | Composition and method for enabling proliferation of pluripotent stem cells |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI334443B (en) * | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
JP5001155B2 (ja) | 2005-08-23 | 2012-08-15 | 公立大学法人横浜市立大学 | ラミニン5を利用した間葉系幹細胞の培養技術 |
WO2007139929A2 (en) * | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
US10829733B2 (en) | 2007-01-04 | 2020-11-10 | Biolamina Ab | Composition and method for enabling proliferation of pluripotent human stem cells |
US20110117645A1 (en) * | 2008-03-31 | 2011-05-19 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method for proliferation of pluripotent stem cells |
-
2009
- 2009-10-08 JP JP2009234583A patent/JP5590646B2/ja active Active
-
2010
- 2010-10-07 CN CN201080045114.8A patent/CN102597217B/zh active Active
- 2010-10-07 EP EP10822075.7A patent/EP2487236B1/en active Active
- 2010-10-07 ES ES14187130.1T patent/ES2643059T3/es active Active
- 2010-10-07 WO PCT/JP2010/067618 patent/WO2011043405A1/ja active Application Filing
- 2010-10-07 DK DK14187130.1T patent/DK2821480T3/en active
- 2010-10-07 US US13/500,452 patent/US8877493B2/en active Active
- 2010-10-07 EP EP14187130.1A patent/EP2821480B1/en active Active
- 2010-10-07 ES ES10822075.7T patent/ES2615555T3/es active Active
- 2010-10-07 CN CN201410776254.2A patent/CN104498430A/zh active Pending
- 2010-10-07 DK DK10822075.7T patent/DK2487236T3/en active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008084401A2 (en) * | 2007-01-04 | 2008-07-17 | Karl Tryggvason | Composition and method for enabling proliferation of pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6010071891; VUORISTO, S., et al.: J. Cell. Mol. Med. 13(8B), 200908, pp.2622-2633 * |
JPN6010071893; 西内涼子ら: '細胞接着因子の生物学' ティッシュエンジニアリング2007 第1版第1刷, 20070627, pp.88-95, 株式会社日本医学館 * |
JPN6014013816; TANIGUCHI, Y., et al.: J. Biol. Chem. 284(12), 20090320, pp.7820-7831 * |
JPN6014013819; ROWLAND, T.J., et al.: STEM CELLS AND DEVELOPMENT 19(8), 2010, pp.1231-1240 * |
JPN6014013822; PHILLIPS, B.W., et al.: Journal of Biotechnology 138, 2008, pp.24-32 * |
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013147264A1 (ja) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | 味の素株式会社 | 硫酸化化合物を含む幹細胞増殖用培地 |
WO2014103534A1 (ja) | 2012-12-28 | 2014-07-03 | 国立大学法人大阪大学 | コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用 |
US10000554B2 (en) | 2012-12-28 | 2018-06-19 | Osaka University | Modified laminin containing collagen binding molecule and use thereof |
WO2014119219A1 (ja) | 2013-01-31 | 2014-08-07 | 味の素株式会社 | 多能性幹細胞の安定した未分化維持増殖を行うための培養方法 |
KR20150110807A (ko) | 2013-01-31 | 2015-10-02 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 다능성 줄기 세포의 안정한 미분화 유지 증식을 실시하기 위한 배양 방법 |
WO2014168157A1 (ja) | 2013-04-08 | 2014-10-16 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物 |
JPWO2014199754A1 (ja) * | 2013-06-12 | 2017-02-23 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 |
WO2014199754A1 (ja) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 国立大学法人大阪大学 | ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 |
US10287541B2 (en) | 2013-06-12 | 2019-05-14 | Osaka University | Cell culture vessel coated with laminin fragment in dry state |
WO2015080297A1 (en) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Application of laminin to corneal endothelial cell culture |
JP2015186474A (ja) * | 2014-03-13 | 2015-10-29 | アークレイ株式会社 | 細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置 |
JPWO2016043168A1 (ja) * | 2014-09-16 | 2017-06-22 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 |
WO2016043168A1 (ja) * | 2014-09-16 | 2016-03-24 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 |
US10696948B2 (en) | 2014-09-16 | 2020-06-30 | Osaka University | Method for preparing pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte population |
JP2017006058A (ja) * | 2015-06-23 | 2017-01-12 | 国立大学法人京都大学 | 培養装置及び培養方法 |
WO2020075822A1 (ja) * | 2018-10-10 | 2020-04-16 | 国立大学法人鳥取大学 | 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法 |
JPWO2020075822A1 (ja) * | 2018-10-10 | 2021-06-03 | 国立大学法人鳥取大学 | 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法 |
JP7079946B2 (ja) | 2018-10-10 | 2022-06-03 | 国立大学法人鳥取大学 | 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法 |
WO2020235319A1 (ja) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | 味の素株式会社 | 軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法 |
WO2021025027A1 (ja) | 2019-08-06 | 2021-02-11 | 花王株式会社 | 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120220031A1 (en) | 2012-08-30 |
JP5590646B2 (ja) | 2014-09-17 |
EP2487236B1 (en) | 2016-11-23 |
EP2821480B1 (en) | 2017-08-16 |
CN102597217B (zh) | 2015-01-14 |
WO2011043405A1 (ja) | 2011-04-14 |
CN104498430A (zh) | 2015-04-08 |
CN102597217A (zh) | 2012-07-18 |
DK2487236T3 (en) | 2017-01-16 |
EP2487236A4 (en) | 2013-04-17 |
EP2487236A1 (en) | 2012-08-15 |
EP2821480A1 (en) | 2015-01-07 |
DK2821480T3 (en) | 2017-09-11 |
ES2615555T3 (es) | 2017-06-07 |
ES2643059T3 (es) | 2017-11-21 |
US8877493B2 (en) | 2014-11-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5590646B2 (ja) | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 | |
JP5761826B2 (ja) | 改変ラミニンおよびその利用 | |
JP5858411B2 (ja) | コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用 | |
WO2017082220A1 (ja) | ラミニンフラグメント含有培地を用いる細胞培養方法 | |
JP7023228B2 (ja) | 幹細胞の製造に用いられるフィブロネクチンフラグメント | |
Meng et al. | Extracellular matrix isolated from foreskin fibroblasts supports long-term xeno-free human embryonic stem cell culture | |
JPWO2014199754A1 (ja) | ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 | |
WO2016043168A1 (ja) | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 | |
JP6916523B2 (ja) | 筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 | |
KR102241349B1 (ko) | 각막상피세포 집단의 제조 방법 | |
JP2010004796A (ja) | 分化抑制剤、分化抑制基材及び分化抑制方法並びにその使用 | |
US11999972B2 (en) | Fibronectin fragment to be used for stem cell production | |
US20140120616A1 (en) | Recombinant human fibronectin fragment for cell culture |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120904 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120906 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140401 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140528 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140602 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140715 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140725 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5590646 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |