JPWO2017200039A1 - 細胞培養方法、培地及び培地キット - Google Patents
細胞培養方法、培地及び培地キット Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017200039A1 JPWO2017200039A1 JP2018518351A JP2018518351A JPWO2017200039A1 JP WO2017200039 A1 JPWO2017200039 A1 JP WO2017200039A1 JP 2018518351 A JP2018518351 A JP 2018518351A JP 2018518351 A JP2018518351 A JP 2018518351A JP WO2017200039 A1 JPWO2017200039 A1 JP WO2017200039A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- recombinant protein
- human recombinant
- cells
- amino acid
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 63
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 63
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 63
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 62
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 50
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 36
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 93
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 21
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 17
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 35
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 182
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 50
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 50
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 30
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 19
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 12
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 9
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 6
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- XQQUSYWGKLRJRA-RABCQHRBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XQQUSYWGKLRJRA-RABCQHRBSA-N 0.000 description 2
- MWOGMBZGFFZBMK-LJZWMIMPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical group NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MWOGMBZGFFZBMK-LJZWMIMPSA-N 0.000 description 2
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000001648 gingival epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- GQYAUZAWKROOLF-IPIKRLCPSA-N (2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GQYAUZAWKROOLF-IPIKRLCPSA-N 0.000 description 1
- HZHXMUPSBUKRBW-FXQIFTODSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[(1s)-1-carboxyethyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O HZHXMUPSBUKRBW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Ham Substances 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 description 1
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000803 cardiac myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 108010088381 isoleucyl-lysyl-valyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
[2] 培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜300μg/mLである、[1]に記載の細胞培養方法。
[3] ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、[1]又は[2]に記載の細胞培養方法。
[4] ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が2kDa以上100kDa以下である、[1]から[3]の何れか一に記載の細胞培養方法。
[6] ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質が細胞接着シグナルを一分子中に2配列以上含む、[1]から[5]の何れか一に記載の細胞培養方法。
[7] 細胞接着シグナルがArg−Gly−Aspで示されるアミノ酸配列である、[6]に記載の細胞培養方法。
A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
[9] ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、[1]から[8]の何れか一に記載の細胞培養方法。
Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly
式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
[10] ヒト型リコンビナント蛋白質が、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、[1]から[9]の何れか一に記載の細胞培養方法。
[11] 細胞が、接着細胞である、[1]から[10]の何れか一に記載の細胞培養方法。
[13] 5容量%以下の血清をさらに含む、[12]に記載の培地。
[14] 基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを別々に含む培地キットであって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを混合して製造される培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜500μg/mLである、培地キット。
本発明の細胞培養方法は、ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む細胞培養方法であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜500μg/mLである方法である。
本発明の細胞培養方法、培地及び培地キットは、例えば、再生医療における治療用細胞の製造に利用することができる。
本発明の細胞培養方法は、添加したヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む。
ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解しているとは、培地が液体であり、この液体培地にヒト型リコンビナント蛋白質の60質量%以上、好ましくは70質量%以上、より好ましくは90質量%以上、特に好ましくはヒト型リコンビナント蛋白質の100質量%が溶解していることを意味する。
ヒト型とは、ヒトにおける蛋白質のアミノ酸配列に由来することを意味する。
リコンビナント蛋白質とは、遺伝子組み換え技術により製造される蛋白質であり、具体的には、目的蛋白質をコードする遺伝子を有する宿主細胞において発現された蛋白質を意味する。
改変体とは、ラミニン、コラーゲン又はゼラチンのアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有する蛋白質であって、改変を有さない元のラミニン、コラーゲン又はゼラチンと同等の生理活性を有する蛋白質と意味する。改変とは、1〜数個(好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個)のアミノ酸残基の欠失、置換、付加、及び/又は挿入を意味する。
本発明においては、培地にヒト型リコンビナント蛋白質を添加すればよく、培養器材にヒト型リコンビナント蛋白質をコートすることは不要である。間葉系幹細胞のような接着増殖系の細胞を培養する場合、培地にヒト型リコンビナント蛋白質を添加することによって、培養器材への接着能が改善され、結果として細胞増殖能が改善する。
本発明においては、ヒト型リコンビナント蛋白質として、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体を使用するが、好ましくはゼラチンである。
ゼラチンとしては、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を使用することができ、好ましくはコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを使用することができる。
リコンビナントゼラチンとしては、例えばEP1014176、米国特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最小アミノ酸配列の含有量は、蛋白質1分子中3〜50個が好ましく、さらに好ましくは4〜30個、特に好ましくは5〜20個である。最も好ましくは12個である。
A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。nは好ましくは3〜100の整数を示し、15〜70の整数がより好ましく、50〜65の整数がさらに好ましい。mは好ましくは2〜10の整数を示し、より好ましくは3〜5の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly
式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列;又は
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上)の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列:
を有する。
リコンビナントゼラチンであるヒト型リコンビナント蛋白質は、最も好ましくは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する。
%配列同一性=[(同一残基数)/(アラインメント長)]×100
2つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))プログラム(J.Mol.Biol.215:403−410,1990)等を使用して決定することができる。
「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「1若しくは数個」とは、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個を意味する。
本発明の方法で培養する細胞は、培地で培養できる細胞であればその種類は特に限定されない。細胞としては、接着細胞でも浮遊細胞の何れでもよいが、好ましくは接着細胞である。接着細胞とは、培養器や基材に接着する性質を有する細胞をいう。
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞(MSC)、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。
培養した細胞を移植に用いる場合、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
本発明はさらに、基礎培地成分と、溶解したヒト型リコンビナント蛋白質とを含む培地であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜500μg/mLである、培地を提供する。
基礎培地としては、特に限定されないが、例えば、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、MEM(イーグル最小必須培地)、F12、Ham、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、131、153、199など)、L15、SkBM(登録商標)、RITC80−7、MesenPro(ライフテクノロジーズ)などを挙げることができる。これらの基礎培地の多くは市販されている。
基礎培地成分には、これらの成分のほか、D−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのpH指示薬、プトレシン、抗生物質などを含んでもよい。
リコンビナントゼラチンとして以下のCBE3を使用した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
以下の実験において、CBE3のコート量はEP0138092A2に記載の方法に準じて測定した。なお、試料は、CBE3をコートしたプレートにNaOHを添加し、50℃で6時間以上処理して得られたアミノ酸を用いた。
・水準
水準1:CBE3コート(コート量:5.7μg/well)
水準2:CBE3添加 (添加量:5.7μg/well、コート時と同一量の添加)
水準3:CBE3添加 (添加量:57ng/well、コート時の1/100量の添加)
水準4:CBE3無添加(対照)
使用細胞:Yub2478(国立成育医療研究センター(以降、成育研)で樹立された軟骨由来細胞)Yub2478は参考文献(Nasu, Takayama S, Umezawa A. Endochondral ossification model system: designed cell fate of human epiphyseal chondrocytes during long-term implantation.J. Cell Physiol. 2015 ; 230 : 1376-1388. )に記載の方法に準じて樹立した。
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:6well組織培養用(TC)プレート(Falcon)
CBE3コート法:
cellnest(登録商標)(0.1質量%CBE3水溶液、富士フイルム)をプレートの各wellに2mL滴下し、プレートを37℃のインキュベータ内で2時間放置した。cellnest(登録商標)を各wellから吸引除去し、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を各wellに6mL滴下し、プレートを30分間放置した。PBSを各wellから吸引除去し、プレートを使用するまで冷蔵保管した。プレートの各wellに培地2mLを滴下し、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、0.2×106cell/wellである。
培地を各wellに2mL滴下し、次いで、cellnest(登録商標)(0.1質量%CBE3水溶液、富士フイルム)を所定の濃度になるよう各wellに滴下した。対照(CBE3無添加)のwellには、cellnest(登録商標)と同量のPBSを滴下した。ピペッティングしてwell内の液を均一化した後、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、0.2×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。1週間経過後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、Vi−Cell(BD biosciences、以下「BD」とも表記する)を用いて細胞数を計測した。新たにプレートを準備して、細胞を再び播種(0.2×106cell/well)して継代し、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。1週間後に上記のトリプシン溶液による細胞の剥離、細胞数の計測、細胞の継代、及び37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でのプレートの保存という操作を繰り返し、5継代まで実施した。
PD(細胞の分裂回数)を以下の式により計算することにより得た細胞増殖曲線を図1に示す。
PD(細胞の分裂回数)=前回継代時のPD値+log2(計測細胞数/播種細胞数)
水準4に比べ、水準1〜3では全て増殖が改善される。また水準1〜3では増殖にほとんど差がなく、CBE3コートに比べCBE3添加は1/100まで減量しても効果が変わらない。
・水準
水準1:CBE3コート(コート:5.7μg/well)
水準2:CBE3添加 (添加量:57ng/well、コート時の1/100量の添加)
水準3:CBE3無添加(Control)
使用細胞:Yub2478(成育研で樹立された軟骨由来細胞)
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:6well組織培養用(TC)プレート(Falcon)
CBE3コート法は、実施例1と同様に行った。
CBE3添加法は、実施例1と同様に行った。
細胞播種量は、0.2×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。プレートは各水準2枚ずつ準備した。所定の期間経過後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、1日後に1枚のプレート、3日後に残りの1枚のプレートについて、Vi−Cell(BD)を用いて細胞数を計測した。
以下の式により計算することにより得た細胞増殖率を図2に示す。
細胞増殖率 = 培養3日後の細胞数/培養1日後の細胞数
水準3に比べ、水準1及び水準2はともに増殖率が改善される。また水準1と水準2では細胞増殖率にほとんど差がなく、CBE3コートとCBE3添加(1/100量)では効果が変わらない。
・水準
水準1:CBE3添加(添加量1:57ng/well)
水準2:CBE3無添加(Control)
使用細胞:骨髄由来幹細胞(Bone marrow derived stem cell: BMSC)(骨髄由来細胞、Lonza)(商品名HMSC、カタログ番号PT-2501)
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:6φ(直径6cm)のディッシュ(Falcon)上に、培養バッグ(ニプロ)を切り取ったシートをバッグ内部が上になるように置き、その上に穴の空いた(底がない)シリコン製well(SARSTEDT社)を密着させ、培養容器とした(図3)。
観察装置:蛍光顕微鏡BZ−X710(キーエンス)
CBE3添加法:
培地を各wellに0.5mL滴下した。cellnest(登録商標)(0.1質量%CBE3水溶液、富士フイルム)を所定の濃度になるよう各wellに滴下した。Control(CBE3無添加)のwellには、cellnest(登録商標)と同量のPBSバッファーを滴下した。ペッティングしてwell内の液を均一化した後、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、0.05×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度の環境にした蛍光顕微鏡チャンバー内に上記培養容器を置いて、チャンバー蓋を閉じた。視野内の細胞数がほぼ同数になるよう、観察する視野の位置決めをした。5分に1枚、wellの画像を撮影し、180分まで継続した。各時間における画像から、接着していない細胞数をカウントした(接着した細胞は黒く映り、カウントされない)。0分、120分及び180分後における細胞の画像を図4に示す。白い点が接着していない細胞を示し、全体的に黒く、周囲が若干白く残っているものが接着した細胞を示す。
以下の式により計算することにより得た接着率を図5に示す。
接着率[%]=(1−その時間における細胞数の計測値/細胞数の最大計測値)×100
水準2に比べ水準1の接着が良好で、CBE3を添加することにより細胞が早く培養バッグ表面に接着する。
軟骨由来細胞Yub2505を用いた短期培養時(培養7日後)の細胞増殖
・水準
水準1:CBE3添加なし
水準2:CBE3添加量(0.0028μg/mL)
水準3:CBE3添加量(0.028μg/mL)
水準4:CBE3添加量(0.28μg/mL)
水準5:CBE3添加量(2.8μg/mL)
水準6:CBE3添加量(280μg/mL)
使用細胞:Yub2505(成育研で樹立された軟骨由来細胞)Yub2505は参考文献(Nasu, Takayama S, Umezawa A. Endochondral ossification model system: designed cell fate of human epiphyseal chondrocytes during long-term implantation. J. Cell Physiol. 2015 ; 230 : 1376-1388. )に記載の方法に準じて樹立した。
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:6well組織培養用(TC)プレート(Falcon)
CBE3添加法は、実施例1と同様に行った。細胞播種量は、0.1×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。7日後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、Vi−Cell(BD)を用いて細胞数を計測した。
細胞数の計測結果を図6に示す。
水準1に比べ、水準2〜水準6で増殖が良好であった。CBE3添加量0.028μg/mLである水準3以降は増殖能改善効果にあまり差がなく、CBE3添加量280μg/mLである水準6では、水準3から5と比較して、増殖能改善効果が逆に低下した。但し、無添加である水準1と比べると、水準6は良好な増殖を維持していた。
骨髄由来細胞BMSCを用いた短期培養時(培養7日後)の細胞増殖
・水準
水準1:CBE3添加なし
水準2:CBE3添加量(0.00009μg/mL=0.09ng/mL)
水準3:CBE3添加量(0.028μg/mL)
水準4:CBE3添加量(513μg/mL)
水準5:CBE3添加量(627μg/mL)
使用細胞:骨髄由来幹細胞(Bone marrow derived stem cell:BMSC) (骨髄由来細胞、Lonza) (商品名HMSC、カタログ番号PT−2501)
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:6φ(直径6cm)のディッシュ(住友ベークライト)
CBE3添加法は、実施例1と同様に行った。細胞播種量は、0.15×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でディッシュを保存した。7日後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、Vi−Cell(BD)を用いて細胞数を計測した。
細胞数の計測結果を表1に示す。
判定は、A:細胞数0.33×106cells以上、B:細胞数0.30×106cells以上0.33×106cells未満、C:0.27×106cells以上0.30×106cells未満、D:0.27×106cells未満とした。
水準1に比べ、水準2および水準3で増殖が良好であった。水準4および水準5では増殖能改善効果が低下した。
骨髄由来細胞UDE BMを用いて5継代での細胞増殖(5週間)を比較した。
・水準
水準1:CBE3コート(コート量:5.7μg/well)
水準2:フィブロネクチン・コート(市販品:バイオコート、Falcon)
使用細胞:UDE BM(成育研で樹立された骨髄由来細胞)UDE BMは以下の方法で樹立した。
骨から骨髄液を取り出し、密度勾配遠心分離によって細胞を集めた。回収した細胞をPBSで洗浄し、DMEM(10%FBS含有)培地中に播種して培養した。培養容器に接着した細胞を回収した。
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:
水準1:6well組織培養用(TC)プレート(Falcon)
水準2:市販品:バイオコート(既にフィブロネクチンがコートされたものをそのまま使用、Falcon)
CBE3コート法:
cellnest(登録商標)(0.1質量%CBE3水溶液、富士フイルム)をプレートの各wellに2mL滴下し、プレートを37℃インキュベータ内で2時間放置した。cellnest(登録商標)を各wellから吸引除去し、PBSを各wellに6mL滴下し、プレートを30分間放置した。PBSを各wellから吸引除去し、プレートを使用するまで冷蔵保管した。プレートの各wellに培地2mLを滴下し、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、0.2×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。1週間経過後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、Vi−Cell(BD)を用いて細胞数を計測した。新たにプレートを準備して、細胞を再び播種(0.2×106cell/well)して継代し、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。1週間後に上記のトリプシン溶液による細胞の剥離、細胞数の計測、細胞の継代、及び37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でのプレートの保存という操作を繰り返し、5継代まで実施した。
PD(細胞の分裂回数)を以下の式により計算することにより得た細胞増殖曲線を図7に示す。
PD(細胞の分裂回数)=前回継代時のPD値+log2(計測細胞数/播種細胞数)
水準2に比べ水準1の増殖が良好で、コート材として一般的に使用されているフィブロネクチンよりもCBE3のほうが良好な増殖を示す。
軟骨由来細胞Yub2478を用いて短期培養時(培養1日後)の細胞増殖を比較した。
・水準
水準1:CBE3コート(コート量:5.7μg/well)
水準2:フィブロネクチン・コート(市販品:バイオコート、Falcon)
使用細胞:Yub2478(成育研で樹立された軟骨由来細胞)、
使用培地:DMEM/F12培地(10容量%ウシ胎児血清(FBS)添加)
培養容器:
水準1:6well組織培養用(TC)プレート(Falcon)
水準2:市販品:バイオコート(既にフィブロネクチンがコートされたものをそのまま使用、Falcon)
CBE3コート法:
cellnest(登録商標)(0.1質量%CBE3水溶液、富士フイルム)をプレートの各wellに2mL滴下し、プレートを37℃のインキュベータ内で2時間放置した。cellnest(登録商標)を各wellから吸引除去し、PBSを各wellに6mL滴下し、プレートを30分間放置した。PBSを各wellから吸引除去し、プレートを使用するまで冷蔵保管した。プレートの各wellに培地2mLを滴下し、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、0.2×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。1日後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、Vi−Cell(BD)を用いて細胞数を計測した。
細胞数の計測結果を図8に示す。
水準2に比べ、水準1は増殖が改善される。
骨髄由来細胞BMSCを用いた短期培養時(培養8日後)の細胞増殖と遺伝子発現
・水準
水準1:CBE3添加なし
水準2:CBE3添加量(0.028μg/mL)
使用細胞:骨髄由来幹細胞(Bone marrow derived stem cell:BMSC) (骨髄由来細胞、Lonza) (商品名HMSC、カタログ番号PT−2501)
使用培地:MesenPro RS(2容量%ウシ胎児血清(FBS)含有、ライフテクノロジーズ)
培養容器:10φ(直径10cm)のディッシュ(住友ベークライト)
CBE3添加法は、実施例1と同様に行った。細胞播種量は、0.4×106cell/wellである。
上記プロトコルにて培養開始後、37℃/5%CO2濃度のインキュベータ内でディッシュを保存した。8日後、トリプシン溶液(和光純薬工業)を用いて細胞を剥離し、Vi−Cell(BD)を用いて細胞数を計測した。
上記プロトコルにて細胞数計測後、その計測に使用した残りの細胞を用いて遠心(1000rpm、5分)して上清を除去した。PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を加えて懸濁し、エッペンチューブ(エッペンドルフ)に移して再び遠心(2000rpm、5分)して上清を除去、細胞ペレットとして−80℃にて保存した。細胞ペレットからのmRNA抽出は、RNeasy Plus MiniKit(キアゲン、74134)及びQIA Shredder(キアゲン、79656)を用いて行った。抽出したmRNAの検定は、Nano Drop ND−1000(サーモフィッシャーサイエンティフィック)を使用して260nmと280nmの吸光度を測定することによって実施した。
抽出したmRNA、プライマー、dNTP(サーモフィッシャーサイエンティフィック、18427−013)を混合してProFlexTMPCRシステム(ライフテクノロジーズ)を用いてアニーリングを行い、5×FSバッファー、0.1M DTT、RNase OUT、Super Script IV Reverse Transcriptase(何れもインビトロジェン)を用いてPCR反応を行い、cDNAを得た。上記プロトコルと同様にして調製したcDNAの検定を実施した。
上記水準1、2で培養した細胞から調製したcDNAを用いて遺伝子発現プロファイルの差を確認した。RT2 ProfilerTM PCR Arrays(キアゲン)のHuman Extracellular Matrix&Cell Adhesion Molecules(PAHS−013Z)及びHuman Cell Cycle(PAHS−020Z)を使用してRTPCRによる遺伝子発現の確認を行った。
細胞外マトリクス及び細胞接着関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを図9および図10に示し、細胞周期関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを図11および図12に示す。図9〜図12において、各遺伝子の欄の左側の棒グラフは、水準1(CBE3添加なし)を示し、各遺伝子の欄の右側の棒グラフは、水準2(CBE3添加)を示す。細胞外マトリクス及び細胞接着関連遺伝子群にはCBE3添加によって発現上昇する遺伝子が認められる一方で、細胞周期関連遺伝子群には発現変化がほとんど認められなかった。
Claims (14)
- ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む、細胞培養方法であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜500μg/mLである、細胞培養方法。
- 培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜300μg/mLである、請求項1に記載の細胞培養方法。
- ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、請求項1又は2に記載の細胞培養方法。
- ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が2kDa以上100kDa以下である、請求項1から3の何れか一項に記載の細胞培養方法。
- ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が10kDa以上90kDa以下である、請求項1から4の何れか一項に記載の細胞培養方法。
- ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有し、X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質が細胞接着シグナルを一分子中に2配列以上含む、請求項1から5の何れか一項に記載の細胞培養方法。
- 細胞接着シグナルがArg−Gly−Aspで示されるアミノ酸配列である、請求項6に記載の細胞培養方法。
- ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項1から7の何れか一項に記載の細胞培養方法。
A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項1から8の何れか一項に記載の細胞培養方法。
Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)63]3−Gly
式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。 - ヒト型リコンビナント蛋白質が、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1から9の何れか一項に記載の細胞培養方法。
- 細胞が、接着細胞である、請求項1から10の何れか一項に記載の細胞培養方法。
- 基礎培地成分と、溶解したヒト型リコンビナント蛋白質とを含む培地であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜500μg/mLである、培地。
- 5容量%以下の血清をさらに含む、請求項12に記載の培地。
- 基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを別々に含む培地キットであって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを混合して製造される培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が0.01ng/mL〜500μg/mLである、培地キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016100318 | 2016-05-19 | ||
JP2016100318 | 2016-05-19 | ||
PCT/JP2017/018657 WO2017200039A1 (ja) | 2016-05-19 | 2017-05-18 | 細胞培養方法、培地及び培地キット |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017200039A1 true JPWO2017200039A1 (ja) | 2019-03-22 |
Family
ID=60325299
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018518351A Pending JPWO2017200039A1 (ja) | 2016-05-19 | 2017-05-18 | 細胞培養方法、培地及び培地キット |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190144525A1 (ja) |
EP (1) | EP3460050B1 (ja) |
JP (1) | JPWO2017200039A1 (ja) |
CN (1) | CN109153971A (ja) |
WO (1) | WO2017200039A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019063690A1 (en) * | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Bd Kiestra B.V. | METHODS AND SYSTEMS FOR AUTOMATED EVALUATION OF SENSITIVITY TO ONE OR MORE ANTIBIOTICS |
EP3864959A4 (en) * | 2018-10-12 | 2021-12-22 | FUJIFILM Corporation | MATERIAL FOR GROWING PEARLS, METHOD OF INSERTING A CORE AND COMPOSITION OF MATERIAL FOR GROWING PEARLS |
CN109943526B (zh) * | 2019-05-23 | 2019-09-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种促间充质干细胞增殖的无血清多肽组合物 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60196186A (ja) * | 1984-03-17 | 1985-10-04 | Agency Of Ind Science & Technol | 低分子ゼラチンを含む付着依存性細胞用無血清培地組成物を用いる培養方法 |
US20100129910A1 (en) * | 2008-07-02 | 2010-05-27 | Denis Evseenko | Cell matrix related compositions and their use for generating embryoid bodies |
JP2010519252A (ja) * | 2007-02-21 | 2010-06-03 | フジフィルム・マニュファクチュアリング・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ | Rgdを含有する組換えゼラチン |
WO2015111686A1 (ja) * | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5590646B2 (ja) * | 2009-10-08 | 2014-09-17 | 国立大学法人大阪大学 | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
JP5847418B2 (ja) * | 2011-03-30 | 2016-01-20 | 富士フイルム株式会社 | 細胞接着性タンパク質 |
JP5808631B2 (ja) * | 2011-09-29 | 2015-11-10 | 富士フイルム株式会社 | 血管新生用足場、及び再生医療用の血管の製造方法 |
JP6849957B2 (ja) * | 2015-11-10 | 2021-03-31 | 国立大学法人京都大学 | ラミニンフラグメント含有培地を用いる細胞培養方法 |
WO2017117333A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Cellular Dynamics International, Inc. | Microtissue formation using stem cell-derived human hepatocytes |
-
2017
- 2017-05-18 JP JP2018518351A patent/JPWO2017200039A1/ja active Pending
- 2017-05-18 CN CN201780030935.6A patent/CN109153971A/zh active Pending
- 2017-05-18 EP EP17799463.9A patent/EP3460050B1/en active Active
- 2017-05-18 WO PCT/JP2017/018657 patent/WO2017200039A1/ja unknown
-
2018
- 2018-11-16 US US16/193,427 patent/US20190144525A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60196186A (ja) * | 1984-03-17 | 1985-10-04 | Agency Of Ind Science & Technol | 低分子ゼラチンを含む付着依存性細胞用無血清培地組成物を用いる培養方法 |
JP2010519252A (ja) * | 2007-02-21 | 2010-06-03 | フジフィルム・マニュファクチュアリング・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ | Rgdを含有する組換えゼラチン |
US20100129910A1 (en) * | 2008-07-02 | 2010-05-27 | Denis Evseenko | Cell matrix related compositions and their use for generating embryoid bodies |
WO2015111686A1 (ja) * | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3460050B1 (en) | 2021-11-03 |
EP3460050A1 (en) | 2019-03-27 |
US20190144525A1 (en) | 2019-05-16 |
CN109153971A (zh) | 2019-01-04 |
WO2017200039A1 (ja) | 2017-11-23 |
EP3460050A4 (en) | 2019-03-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2019107024A (ja) | 網膜色素上皮細胞の製造方法 | |
US20190144525A1 (en) | Cell culture method, medium, and medium kit | |
TWI720333B (zh) | 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 | |
US20050233446A1 (en) | Defined media for stem cell culture | |
US20120021509A1 (en) | Isolating method for umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells expressing znf281 | |
WO2015025030A1 (en) | Method for producing engineered heart muscle (ehm) | |
US20150030681A1 (en) | Method of making a hydrogel | |
EP2985340A1 (en) | Method for culturing hepatoblast-like cells and culture product thereof | |
US20220073873A1 (en) | Method for purifying neural crest cells or corneal epithelial cells | |
JP7285520B2 (ja) | 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 | |
WO2011016485A1 (ja) | iPS細胞から肝実質細胞への分化誘導方法 | |
JP6906231B2 (ja) | アストロサイト様細胞及びその調製方法 | |
US20230002729A1 (en) | Cell culture medium composition | |
Akasha et al. | Entrapment of embryonic stem cells-derived cardiomyocytes in macroporous biodegradable microspheres: preparation and characterization | |
US20200015475A1 (en) | Cell mass or cell structure-embedding agent, cell mass or cell structure-containing composition, and kit | |
WO2017082296A1 (ja) | 軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地 | |
CA3195608A1 (en) | Method for producing cardiac muscle stem/precursor cells and method for inhibiting myocardial fibrosis | |
WO2017082295A1 (ja) | 軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地 | |
WO2017082294A1 (ja) | 幹細胞の培養用培地、増殖促進剤及び培養方法、並びに幹細胞を含む細胞組成物及びその製造方法 | |
WO2018207923A1 (ja) | 間葉系幹細胞の製造方法、およびその応用 | |
WO2023037986A1 (ja) | 多能性幹細胞の製造方法 | |
JP2023058788A (ja) | 組織の製造方法 | |
CA3176593A1 (en) | Hepes-containing medium | |
JP2023019942A (ja) | 細胞培養基材、及び細胞培養方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191001 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191129 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20200414 |