WO2023037986A1 - 多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2023037986A1
WO2023037986A1 PCT/JP2022/033173 JP2022033173W WO2023037986A1 WO 2023037986 A1 WO2023037986 A1 WO 2023037986A1 JP 2022033173 W JP2022033173 W JP 2022033173W WO 2023037986 A1 WO2023037986 A1 WO 2023037986A1
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atelocollagen
cell
culture
medium
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正義 塚原
義基 中島
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公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing stem cells such as pluripotent stem cells. More specifically, the present invention relates to a method for producing stem cells, etc., including a step of suspension culture of cells in a medium containing a scaffold material containing atelocollagen.
  • ES cells induced pluripotent stem cells
  • planar culture embryonic stem cells
  • EBs embryoid bodies
  • ES cells and iPS cells As a suspension culture method for ES cells and iPS cells, a suspension culture method that forms embryoid bodies (EBs) (three-dimensional cell aggregates formed by suspension culture of pluripotent stem cells) is known. ing. In the culture that forms embryoid bodies, it is necessary to perform an operation to keep the size of the embryoid bodies uniform. Specifically, an operation based on physical mechanics, such as crushing the cell clusters by the shear stress of the propeller in agitation culture, is required. necessary. Therefore, it is difficult to control the size of embryoid bodies in cells of types such as ES cells and iPS cells, which are characterized by the tendency to easily induce cell death by physical stress (see Non-Patent Document 3). there were.
  • microcarriers are sometimes used as scaffolding materials for cells.
  • Microcarriers are microparticles, and by adhering adherent animal cells to the microcarriers and culturing them in this state, mass culture can be carried out under suspension conditions without significantly changing the properties of the adherent animal cells ( See Non-Patent Document 4).
  • scaffolding materials such as microcarriers suitable for attaching pluripotent stem cells to surfaces have not been found so far.
  • microcarriers used for cell culture must be coated with an adhesive substrate containing biological components such as Matrigel (Corning) (a solubilized basement membrane preparation extracted from mouse sarcoma).
  • Matrigel a solubilized basement membrane preparation extracted from mouse sarcoma.
  • small microcarriers with a diameter of 100 ⁇ m or less are not suitable for cell growth, and if negatively charged residues such as carboxymethyl groups are dominant on the surface of the microcarriers, cells may not adhere. It is also known not to do so (see Non-Patent Document 5).
  • type I collagen has a history of being mainly used as a scaffolding material for cell culture dishes for pluripotent stem cells as gelatin, which is a hydrolyzed component thereof, in planar culture called a feeder culture method (Non-Patent Document 1). , 2). Collagen fibers have a cell-adhesive sequence called an RGD sequence, and it is reported that this sequence provides excellent cell affinity (see Non-Patent Document 6).
  • RGD sequence cell-adhesive sequence
  • Gelatin is collagen molecules and fragments thereof that have lost their triple-helical structure, and pluripotent stem cells using gelatin nanofibers have been reported to be cultured (see Patent Document 1).
  • type I collagen exerts its function as a scaffold material for human iPS cells, but in the feederless culture method, adhesion of human iPS cells It has long been known to be weak in its ability to maintain function and proliferation. Therefore, when using commercially available Cytodex-3 (GE Healthcare) using type I collagen (dextran beads bound and coated with denatured porcine skin-derived collagen on the surface), the feeders required for the production of clinical iPS cells In the less culture method, the adhesion function and the function of maintaining cell growth are weak, and it cannot be said to be practical.
  • Patent Document 1 states that human iPS cells cannot be cultured on 0.1% gelatin, and human iPS cells have been successfully grown by processing gelatin into nanofibers.
  • Patent Document 2 pluripotent stem cells are adhered onto a microcarrier coated with an extracellular matrix (such as a mixture of laminin, collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin 1), and the pluripotent stem cells are subcultured for 3 passages.
  • An extracellular matrix such as a mixture of laminin, collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin 1
  • Patent Document 3 discloses a method of using a polymer compound (polysaccharides such as hyaluronic acid, deacylated gellan gum, diutan gum, xanthan gum, and carrageenan) as a medium composition for cell or tissue suspension culture.
  • a polymer compound polysaccharides such as hyaluronic acid, deacylated gellan gum, diutan gum, xanthan gum, and carrageenan
  • Patent Document 4 discloses a xeno-free and serum-free medium containing bFGF, ascorbic acid, TGF ⁇ -3, etc., and a method of suspension culture of pluripotent stem cells in the medium.
  • Patent Document 5 discloses a scaffold material for stem cells containing a synthetic resin with a specific composition and a culture method using the same.
  • Patent Document 6 discloses an apparatus for culturing pluripotent stem cells, embryoid bodies, and the like by refluxing a solution between a cell culture tank and a component adjustment liquid reservoir.
  • none of the patent documents disclose a specific method of using atelocollagen as a coating material for microcarriers, and do not disclose specific examples of culturing pluripotent stem cells using atelocollagen. do not have.
  • Collagen has a long history of being used as a scaffold material for culturing pluripotent stem cells as gelatin.
  • the purpose was to use mouse embryonic fibroblasts (MEF) as a scaffold material for feeder culture method.
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • the culture method using MEF has become a classical method, and the feederless culture method has become mainstream instead.
  • the feederless culture method does not require MEFs or gelatin.
  • type I collagen which constitutes gelatin, has been used for culturing pluripotent stem cells for a long time.
  • the present inventors dared to focus on the culture of pluripotent stem cells using collagen, and as a result of extensive studies to solve the above problems, they were coated with atelocollagen instead of collagen.
  • pluripotent stem cells could be efficiently established and proliferated by using microcarriers for cell culture.
  • microcarriers coated with type I collagen were used, pluripotent stem cells could not be established from somatic cells, whereas when microcarriers coated with atelocollagen were used. found that pluripotent stem cells can be established from somatic cells. Since type I collagen and atelocollagen share most of their structures, the difference in establishment efficiency was surprising.
  • pluripotent stem cells can be efficiently proliferated by culturing pluripotent stem cells using microcarriers coated with atelocollagen.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of further studies based on these findings.
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing pluripotent stem cells comprising the step of suspension culture of cells in a medium containing free scaffold material containing atelocollagen.
  • the method of [1], wherein the cell is a somatic cell into which a reprogramming factor has been introduced.
  • the somatic cells are planktonic cells.
  • the planktonic cells are hematopoietic cells.
  • the method of [1], wherein the cells are pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells.
  • [4-2] The method according to any one of [1] to [4-1], wherein the cells are human-derived cells.
  • the scaffold material is a microcarrier.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the mass percent concentration of atelocollagen in the scaffold material is 10% or more.
  • [7-1] The method according to any one of [1] to [6], wherein the scaffold material consists essentially of atelocollagen.
  • [7-2] The method according to any one of [1] to [6], wherein the mass percent concentration of atelocollagen in the scaffold material is 95% or more.
  • a pluripotent stem cell produced by the method according to any one of [1] to [8].
  • a pluripotent stem cell proliferation promoting agent comprising a scaffold material containing atelocollagen and released in a medium.
  • a cell death inhibitor for pluripotent stem cells comprising a scaffold material containing atelocollagen and released in a medium.
  • a pluripotent stem cell viability maintenance agent comprising a scaffold material containing atelocollagen and released in a medium.
  • a pharmaceutical composition comprising the pluripotent stem cells of [9] or the differentiated cells of [12].
  • stem cells can be produced efficiently, and stem cells can be efficiently proliferated.
  • Pluripotent stem cells produced by the production method of the present invention can maintain their pluripotency even after being subjected to suspension culture for at least 8 passages on a scaffold material containing atelocollagen.
  • such a method includes a step of culturing cells in suspension. Suspension culture not only facilitates automation of culturing and mass culturing, but also allows stem cells obtained by the production method of the present invention to adhere to scaffold materials. It is also possible to construct a continuous system in which cells are expanded and cultured as they are and differentiated into specific cells.
  • the scaffold material used in the production method of the present invention can be prepared simply by coating atelocollagen on a microcarrier or the like, or by molding atelocollagen itself as a scaffold material, so it is excellent in terms of cost. Furthermore, the differentiated cells obtained by the method of the present invention can be transplanted into the body together with the scaffold material without being peeled off from the scaffold material.
  • Example 1 shows the results of human iPS cell proliferation test of bead culture in Example 1 (5-6 days after cell seeding).
  • the structure of collagen fibers is shown (Source: Hokkaido Medical University Dental Journal, 2008. 27. 7-14).
  • Collagen which is a major component of living organisms, is a structural protein, and its structural feature is a higher-order structure having three helices.
  • a microfibril is a cylinder (cross-section) in which five molecules are located at each vertex of a regular pentagon.
  • a large number of microfibril aggregates form a fibril, a large number of fibril aggregates form a fiber, and a large number of fibers intertwine to form a fiber bundle.
  • iPSCs were established on atelocollagen beads. 1 ⁇ 10 5 human mononuclear cells were reprogrammed on atelocollagen beads or Cytodex 3 with Sendai virus vector. Optical microscope image 15 days after initiation of initialization. White arrows indicate established hiPSCs (A, left panel) or incompletely established cell clusters (A, right panel). A total of 1 ⁇ 10 5 human mononuclear cells were reprogrammed on iMatrix-511 or atelocollagen beads using five Sendai virus vectors (SRV TM iPSC-1, 2, 3, 4, CytoTune 2.0.). Number of colonies/well on day 15 after initiation of initialization. **p ⁇ 0.01 (B).
  • hiPSCs established on atelocollagen beads were passaged 8 times on atelocollagen beads, and then harvested 11 days after initiation of induction of differentiation into cardiomyocytes (C), endoderm cells (D), and neural progenitor cells (E). Expression analysis of each differentiation marker in mRNA. Data represent mean ⁇ SD. *P ⁇ 0.05. **P ⁇ 0.01. Effects of iMatrix-511-coated plates, atelocollagen-coated plates, and atelocollagen beads on cardiomyocyte differentiation induction. Cardiomyocytes 8 days after initiation of differentiation induction from hiPSCs for strain 201B7. Optical microscope images are shown (top).
  • telocollagen-coated wells B or iMatrix-511-coated wells (C), with or without the reagent TC-I 15 at 1 or 10 ⁇ g/well.
  • Optical micrograph 3 days after addition. Scale bar 100 ⁇ m. Diagram showing how atelocollagen induces filopodia elongation in hiPSCs. Atelocollagen activates integrin ⁇ 2 ⁇ 1 in hiPSCs, activating self-renewal capacity and filopodia elongation. This mechanism works not only under 2D culture conditions (D, left panel) but also under 3D culture conditions (D, right panel).
  • HE Hematoxylin and eosin staining was applied to inner hollow fiber (IC) and outer hollow fiber (EC) sections.
  • IC inner hollow fiber
  • EC outer hollow fiber
  • a (pluripotent) stem cell proliferation-promoting agent (hereinafter sometimes referred to as "the agent of the present invention") containing a scaffold material containing atelocollagen is provided.
  • the agent of the present invention a (pluripotent) stem cell proliferation-promoting agent containing a scaffold material containing atelocollagen is provided.
  • the above effect of the atelocollagen-containing scaffold material is that cells such as stem cells and differentiated cells adhere to atelocollagen, thereby suppressing cell death due to shear stress in suspension culture. presumed to be the result.
  • a cell death inhibitor or cell viability maintenance agent comprising a scaffold material containing atelocollagen is also provided.
  • the agent of the present invention may be in the form of a medium. Therefore, a medium containing a scaffold material containing atelocollagen (hereinafter sometimes referred to as "the medium of the present invention") is also provided. The atelocollagen-containing scaffold material contained in the medium or the like of the present invention is released in the medium.
  • the agent of the present invention may be a medium for culturing somatic cells, a medium for culturing stem cells, a medium for inducing differentiation of stem cells, a cell preservation solution for stem cells or stem cell-derived differentiated cells, It can also be used as an organ preservation solution for organs made from stem cell-derived differentiated cells.
  • a cell to be cultured may be a single cell, but is typically a cell population consisting of a plurality of cells. Therefore, in the present specification, unless otherwise specified, "cells" include “cell populations.”
  • a cell population may be composed of one type of cell, or may be composed of two or more types of cells.
  • the agent of the present invention can be used as a composition for preparing a culture medium, using a scaffold material containing atelocollagen as an essential component. That is, all or part of the components in the medium of the present invention are used as composition components, which are solidified or concentrated solutions, dissolved or diluted, compositions for addition to existing media (medium supplements), liquid media and solid components
  • composition components which are solidified or concentrated solutions, dissolved or diluted, compositions for addition to existing media (medium supplements), liquid media and solid components
  • the composition for finally preparing the medium in the present invention can be made in various aspects such as the set of.
  • the term “scaffolding material”, also called scaffold, means a material or base material that functions as a scaffold for cells in cell culture.
  • the atelocollagen-containing scaffolding material used in the present invention is not limited as long as it can be used for cell suspension culture (in other words, it can be released into the medium), but it preferably contains a synthetic resin.
  • the scaffolding material may be made of atelocollagen. Specifically, atelocollagen may be molded into a shape suitable for the scaffolding material.
  • scaffolding materials used in the present invention are materials other than nanofibers.
  • “Synthetic resin” means a material whose main component is a polymer (hereinafter simply referred to as “polymer”) obtained by polymerizing (including polycondensation) a polymerizable monomer (hereinafter simply referred to as “monomer”).
  • the polymers also include copolymers of one or more polymerizable monomers.
  • the scaffolding material may be based on an inorganic material such as glass or silicone.
  • polymer examples include (un)saturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, (unsaturated) fatty acids, aromatic carboxylic acids, (unsaturated) ketones, aromatic ketones, (unsaturated) alcohols, aromatic alcohols, Examples thereof include polymers composed of one or more polymerizable monomers selected from (un)saturated amines, aromatic amines, (un)saturated thiols, aromatic thiols, and organosilicon compounds.
  • polystyrene examples include polystyrene, polyolefin, polyether, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, polyester, poly(meth)acrylate, epoxy resin, polyamide, polyimide, polyurethane, polycarbonate, cellulose, dextran, and polypeptide. (eg, gelatin, etc.). These polymers may be used singly or in combination of two or more. When two or more types of polymers are combined, two or more types of polymers may be mixed and used, or a polymer obtained by chemically bonding skeletons of two or more types of polymers may be used.
  • the scaffolding material may be manufactured by a known method, or a commercially available product may be used.
  • Commercially available products include, for example, Cytodex-1 (GE Healthcare).
  • a scaffold material containing atelocollagen can be prepared by coating all or part of the surface of the scaffold material with atelocollagen.
  • the adhesion between pluripotent stem cells and atelocollagen is caused by the interaction between integrin ⁇ 2 ⁇ 1 present on the surface of pluripotent stem cells and atelocollagen. It was suggested that it was fixed to Therefore, when the surface of the scaffold material is coated with atelocollagen, a portion of the surface of the scaffold is sufficient as long as the above interaction occurs.
  • the purity of atelocollagen used for coating is not particularly limited, but high purity (for example, 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 100%) is preferable.
  • any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • native collagen has an inhibitory effect on cell proliferation, native collagen is substantially absent (e.g., 10% or less, more preferably 5% or less). (eg: 4%, 3%, 2%, 1%, 0%)
  • the cell-supporting substrate can be any substance intended for attachment of stem cells or feeder cells (if used).
  • Such cell-supporting matrices include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin (or partial structures of laminin), and fibronectin and mixtures thereof such as matrigel, and dissolved Examples include cell membrane preparations (see Lancet, 2005.365.9471.1636-1641).As used herein, unless otherwise specified, the term “purity” is used as an indicator of high quality (low percentage of impurities). (Hereinafter, “mass percent concentration” is simply referred to as “concentration”.), However, a specific component (e.g., , atelocollagen) concentration.
  • the shape of the scaffold material used in the present invention is not particularly limited. Specific examples of such spherical scaffold materials include microcarriers and the like. As shown in the examples below, in culture using bioreactors, pluripotent microcarriers using microcarriers with diameters of 105 ⁇ m or less, 105-250 ⁇ m, 250-425 ⁇ m, and 425-600 ⁇ m. It was shown that sex stem cells can proliferate.
  • the size of the scaffolding material is also not particularly limited, but when spherical particles such as microcarriers are used, the particle size (diameter) of the scaffolding material is typically 50 to 1000 ⁇ m, preferably 70 to 700 ⁇ m. 100 to 400 ⁇ m is preferable.
  • the particle size is 600 ⁇ m.
  • the particle size can be measured by the Coulter counter method described in the international standard ISO 13319 "Measurement of particle size distribution - electrical detection zone method".
  • a type I collagen molecule consists of about 95% helical (helical) part and about 5% non-helical part (telopeptide) (Fig. 2).
  • This non-helical portion is a highly antigenic region and is cleaved by proteases (proteolytic enzymes).
  • Atelocollagen contained in the scaffold material is a highly purified natural polymer material with extremely low antigenicity obtained by digesting and removing the highly antigenic telopeptide portion with a protease such as pepsin (Matrix, 1992, 12. 274-281 reference).
  • collagen present in vivo is an insoluble fibrous protein with a “triple helix structure” in which three polypeptide chains are wound in a helix, and is also called native collagen.
  • the origin of the atelocollagen used in the present invention is not limited, and examples thereof include those derived from mammals (eg, humans, mice, rats, monkeys, cows, horses, pigs, dogs, etc.). From the viewpoint of preventing contamination with components derived from different species, it is preferable to use atelocollagen derived from the same origin as the cells to be cultured.
  • Such atelocollagen may be produced by a known method, or a commercially available product may be used.
  • atelocollagen can be purified by treating collagen extracted from cells or tissues containing atelocollagen or collagen secreted from cultured cells with a protease.
  • the “stem cells” targeted by the present invention refer to immature cells having self-renewal ability and differentiation/proliferation ability. cells), unipotent stem cells, and the like. “Pluripotent stem cells” are generally defined as undifferentiated cells that have “self-renewal ability” that can proliferate while maintaining an undifferentiated state and “pluripotency” that can differentiate into all three germ layer lineages. .
  • a pluripotent stem cell means a cell that has the ability to differentiate into all tissues and cells that constitute a living body.
  • Multipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into multiple, but not all, types of tissues and cells.
  • a unipotent stem cell means a cell that has the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • the origin of the stem cells is also not particularly limited. It may be cells of eyes, humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, primates such as chimpanzees, and the like.
  • stem cells include mesenchymal stem cells that differentiate into myoblasts, vascular endothelial cells, osteoblasts, adipocytes, muscle cells, cardiomyocytes, chondrocytes, etc., and neural stem cells that differentiate into neurons and glial cells. , hematopoietic stem cells or bone marrow stem cells that differentiate into leukocytes, erythrocytes, platelets, mast cells, dendritic cells, etc., differentiation into various tissues through the formation of a pseudo-embryo called an embryoid body (EB body) from a spheroid state.
  • EB body embryoid body
  • Embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells (iPS cells), which are known to proceed to the induction step, embryonic germ cells derived from primordial germ cells (EG ) cells, multipotent germlin EStem (mGS) cells isolated during the establishment and culture process of GS cells from testis tissue, multipotent stem cells such as multipotent adult progenitor cells (MAPC) isolated from bone marrow, and the like.
  • EG primordial germ cells
  • mGS multipotent germlin EStem
  • MPC multipotent adult progenitor cells
  • the pluripotent stem cell is an ES cell or any cell derived from a human embryo, the cell may be a cell produced by destroying the embryo, or a cell produced without destroying the embryo. However, from an ethical point of view, the cells are preferably produced without destroying the embryo.
  • the human ES cells used in the present invention are preferably those established from human embryos within 14 days of fertilization.
  • Pluripotent stem cells include, in particular, the above-mentioned ES cells or iPS cells.
  • Stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 1997.385.810-813, Science, 1998.280.1253-1256, Nature Biotechnology, 1999.17.456-461, Nature. 1998.394.369-374, Nature Genetics. 1999.22.127-128, Proc Natl Acad Sci USA.
  • human ES cell lines WA01 (H1) and WA09 (H9) are from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (Kyoto, Japan). Available.
  • the human ES cell line KthES11 for clinical research is available from the Institute for Virology and Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • iPS cells include cells that have acquired pluripotency similar to ES cells, obtained by introducing multiple genes or proteins (reprogramming factors) into somatic cells such as skin cells.
  • iPS cells include iPS cells obtained by introducing Oct3/4 gene, Klf4 gene, C-Myc gene and Sox2 gene, and iPS cells obtained by introducing Oct3/4 gene, Klf4 gene and Sox2 gene. cells (Nature Biotechnology, 2008.26.101-106) and the like.
  • initialization factors include Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERAs, ECAT15-2, Tcl1 , beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, ESrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc., and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • Combinations of initialization factors include WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/091659 101407 ⁇ WO2009/102983 ⁇ WO2009/114949 ⁇ WO2009/117439 ⁇ WO2009/126250 ⁇ WO2009/126251 ⁇ WO2009/126655 ⁇ WO2009/157593 ⁇ WO2010/009015 ⁇ WO2010/033906 ⁇ WO2010/033920 ⁇ WO2010/042800 ⁇ WO2010/050626 ⁇ WO2010/056831 ⁇ WO2010/068955 ⁇ WO2010/098419 ⁇ WO2010/102267 ⁇ WO2010/111409 ⁇ WO2010/111422 ⁇ WO2010/115050 ⁇ WO2010/124290 ⁇ WO2010/147395 ⁇ WO2010/147612 ⁇ Nat Biotechnol,2008.26.795-797 ⁇ Cell Stem Cell,2008
  • iPS cells are available from designated institutions (RIKEN BioResource Center, Kyoto University). In addition, the establishment of clinical-grade iPS cells is also in Japan (Kyoto University Hospital, Kyoto University iPS Cell Research Institute https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/rESearch/stock.html), Kyoto University iPS Cellular Research Foundation https://www.cira-foundation.or.jp/j/, the United States (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03434808, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02056613), Fujifilm's US subsidiary FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI), and the technology of the present invention can also be used for the establishment and maintenance culture of such iPS cells.
  • human iPS cells include strain 253G1 (Riken Cell Bank No. HPS0002), strain 201B7 (Riken Cell Bank No. HPS0063), strain 409B2 (Riken Cell Bank No. HPS0076), strain 454E2 (Riken Cell Bank No. HPS0077), HiPS-RIKEN-1A strain (Riken Cell Bank No. HPS0003), HiPS-RIKEN-2A strain (Riken Cell Bank No. HPS0009), HiPS-RIKEN-12A strain (Riken Cell Bank No. HPS0029), NiPS-B2 strain (Riken Cell Bank No. .HPS0223), iPS cells for clinical use, iPS cells for medical use, iPS cells for regenerative medicine, myiPS (Kyoto University iPS Cell Research Foundation), and the like.
  • Multipotent stem cells particularly include somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, nervous system stem cells, bone marrow stem cells and germ stem cells.
  • Multipotent stem cells are preferably mesenchymal stem cells, more preferably bone marrow mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells refer to stem cells capable of differentiating into all or some of mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts and lipoblasts, or populations of their progenitor cells. means broadly.
  • the term “suspension culture” refers to culture performed under conditions that maintain cells or cell aggregates floating in a culture medium, i.e., cells or cell aggregates, culture vessels and feeders. means culturing under conditions that prevent the formation of strong cell-substratum junctions and cell-cell junctions with cells (if used). When the cells adhere to the scaffold material released in the medium, the cells themselves are also released in the medium. In addition, “released” or “released” also includes a state in which the scaffolding material or cells or cell clusters attached to the scaffolding material float in the culture solution when the culture vessel is gently shaken.
  • the medium of the present invention is a medium (basal medium) conventionally used for culturing somatic cells, culturing stem cells produced from somatic cells, and inducing differentiated cells from stem cells, and atelocollagen is added thereto. It can be prepared by adding free scaffold materials such as containing microcarriers singly or in combination. Examples of such media include the following.
  • basal medium examples include RPMI-1640 medium, Eagle's MEM medium, Dulbecco's modified MEM medium, Glasgow's MEM medium, ⁇ -MEM medium, 199 medium, IMDM medium, DMEM medium, Hybridoma Serum free medium, Chemically Defined Hybridoma Serum Free Medium, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz' s L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's MB752/1, CMRL-1066, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 Medium (Medium, E8 Thermo Fisher Scientific), ReproFF2, Primate ES Cell Medium, ReproStem (ReproCELL Co., Ltd.
  • the concentration of atelocollagen in the scaffold material ((mass of atelocollagen/mass of scaffold material containing atelocollagen) x 100) is not particularly limited as long as it exhibits a cell death inhibitory effect on cells. Such concentrations can be appropriately set by those skilled in the art using the methods described in the Examples and conventionally known methods.
  • the concentration of atelocollagen in the scaffold material is, for example, 0.1% or more (e.g., 0.1%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30% or more), 100% or less.
  • the concentration of atelocollagen in the cell-supporting substrate is 90% or more (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%). %, 95.5%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%).
  • the scaffold material consists essentially of atelocollagen, and the phrase “consisting essentially of atelocollagen” means not only when the atelocollagen concentration is 100%, but also when the concentration of atelocollagen is close to 100% (e.g., 95%). % or more, preferably 95.5% or more (eg, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%)).
  • the concentration of atelocollagen in the medium is not particularly limited, and it is possible to control the proliferation rate of cells by appropriately setting the concentration of atelocollagen.
  • the concentration of atelocollagen in the medium is, for example, 0.01-20%, preferably 0.05-5%, more preferably 0.1-2%.
  • the concentration of atelocollagen in the medium is preferably 0.5% to 20%, 1% to 15%, or 5% to 10%.
  • the medium can be supplemented with physiologically active substances and nutrient factors necessary for cell survival or proliferation as necessary.
  • physiologically active substances and nutrient factors necessary for cell survival or proliferation may be added to the medium in advance or may be added during cell culture.
  • the method of addition during culture may be in any form, such as a single solution or a mixed solution of two or more, and may be continuous or intermittent addition.
  • Physiologically active substances include insulin, IGF-1, transferrin, albumin, coenzyme Q10, various cytokines (interleukins (IL-2, IL-7, IL-15, etc.), stem cell factor (SCF), activin, etc.). , various hormones, various growth factors (leukemia inhibitory factor (LIF), basic fibroblast growth factor (bFGF), TGF- ⁇ , etc.).
  • Nutritional factors include sugars, amino acids, vitamins, hydrolysates or lipids. Sugars include glucose, mannose, fructose, and the like, and are used singly or in combination of two or more.
  • Amino acids include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, and L-lysine. , L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like, which may be used singly or in combination of two or more.
  • Vitamins include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyrodoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin, DL- ⁇ -tocopherol, etc., and may be used alone or in combination of two or more.
  • hydrolysates include those obtained by hydrolyzing soybeans, wheat, rice, peas, corn, cottonseed, yeast extracts, and the like.
  • Lipids include cholesterol, linoleic acid, linolenic acid, and the like.
  • antibiotics such as kanamycin, streptomycin, penicillin or hygromycin may be added to the medium as necessary.
  • an acidic substance such as sialic acid is added to the medium, it is desirable to adjust the pH of the medium to pH 5-9, preferably pH 6-8, which is a neutral range suitable for cell growth.
  • the medium of the present invention may be a serum (eg, fetal bovine serum (FBS), human serum, horse serum)-containing medium or serum-free medium.
  • serum-free medium means a medium that does not contain unadjusted or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain purified blood-derived components or animal tissue-derived components (eg, growth factors).
  • the medium of the present invention may or may not contain serum substitutes as well as serum.
  • Serum substitutes include, for example, albumin substitutes such as albumin, lipid-rich albumin and recombinant albumin, vegetable starch, dextrans, protein hydrolysates, transferrin or other iron transporters, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace amounts elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thioglycerol, or equivalents thereof.
  • Specific examples of serum substitutes include those prepared by the method described in International Publication No. 98/30679, commercially available knockout Serum Replacement [KSR] (Life Technologies), Chemically-defined Lipid concentrated (Life Technologies) ) and Glutamax (Life Technologies).
  • KSR knockout Serum Replacement
  • biological factors include platelet-rich plasma (PRP), culture supernatant components of human mesenchymal stem cells, and the like.
  • Cell preservation solutions and organ preservation solutions that have been widely used clinically include University of Wisconsin organ preservation solution (UW solution), HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), histidine-tryptophan-ketogluta-rate (HTK) solution, Euro-Collins liquid, Celsior liquid, ET-Kyoto liquid, IGL-1 liquid, EP-TU liquid, and the like.
  • UW solution University of Wisconsin organ preservation solution
  • HBSS Hort's Balanced Salt Solution
  • HTK histidine-tryptophan-ketogluta-rate
  • Euro-Collins liquid Celsior liquid
  • ET-Kyoto liquid IGL-1 liquid
  • EP-TU liquid and the like.
  • the present invention provides a method for producing stem cells (hereinafter sometimes referred to as "the method for producing stem cells of the present invention”), which comprises the step of suspension culture of cells in the medium of the present invention.
  • the method for producing stem cells of the present invention comprises the step of suspension culture of cells in the medium of the present invention.
  • the method for producing stem cells of the present invention comprises the step of suspension culture of cells in the medium of the present invention.
  • the self-renewal ability of stem cells proliferates (ie, produces stem cells). Therefore, a method for growing stem cells (or a method for maintaining and culturing stem cells), which includes a step of floating culturing stem cells in the medium of the present invention, is also provided.
  • the pluripotent stem cells produced by the production method of the present invention maintain their pluripotency (in other words, three It is also suitable for maintenance culture because it can maintain the ability to differentiate into all germ layer lineages.
  • pluripotent stem cells when the stem cells are pluripotent stem cells, pluripotent stem cells are established by culturing and reprogramming the cells (starting cells) that are the raw material for the pluripotent stem cells. can do. Therefore, in another aspect of the present invention, a method for producing pluripotent stem cells (hereinafter referred to as "method for producing pluripotent stem cells of the present invention") comprising a step of suspension culture of cells in the medium of the present invention. There is) or a method for establishing pluripotent stem cells is provided.
  • the term "production method of the present invention” may be used to include both the method of producing stem cells of the present invention and the method of producing pluripotent stem cells of the present invention.
  • stem cells produced by the production method of the present invention are also provided.
  • cells to be cultured in the medium of the present invention are not limited as long as they are cells that serve as raw materials for pluripotent stem cells (starting cells).
  • starting cells include somatic cells into which the reprogramming factors have been introduced.
  • they may be somatic cells in the process of reprogramming (eg, cells expressing at least Oct4, etc.).
  • Somatic cells used in the method for producing pluripotent stem cells of the present invention may be suspension cells (eg, blood cells, etc.) or adherent cells, preferably suspension cells.
  • somatic cells used in the production method of the present invention include skin fibroblasts, skin cells, visual cells, brain cells, hair cells, oral mucosa, lung cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, enterocytes, and spleen.
  • tissue stem cells pancreatic cells, renal cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells derived from wisdom teeth, tissue stem cells, tissue progenitor cells, hematopoietic cells (e.g., hematopoietic stem cells, peripheral blood mononuclear cells (T cells and non-T cells) ), umbilical cord blood cells, etc.), epithelial cells, endothelial cells (eg, vascular endothelial cells), muscle cells, etc., but are not limited thereto.
  • Methods for introducing reprogramming factors into somatic cells include, when the reprogramming factors are in the form of DNA, vectors such as viruses, plasmids, and artificial chromosomes, methods such as lipofection, liposomes, and microinjection, and techniques in the form of RNA. Examples include techniques such as lipofection and microinjection, and in the case of protein forms, techniques such as lipofection, fusion with cell membrane-permeable peptides (e.g., HIV-derived TAT and polyarginine), and microinjection. be able to.
  • vectors such as viruses, plasmids, and artificial chromosomes
  • methods such as lipofection, liposomes, and microinjection
  • techniques in the form of RNA include techniques such as lipofection and microinjection, and in the case of protein forms, techniques such as lipofection, fusion with cell membrane-permeable peptides (e.g., HIV-derived TAT and polyarginine), and microinjection.
  • Methods using viral vectors include methods using retroviral vectors, methods using episomal vectors, Sendai virus typified by ID Pharma's initialization kit "CytoTune (registered trademark)-iPS 2.0" Examples include, but are not limited to, methods using vectors, methods using lentiviral vectors, methods using adenoviral vectors, and the like.
  • the method for producing pluripotent stem cells of the present invention may include a step of introducing reprogramming factors into somatic cells.
  • the cells to be cultured can be dispersed cells or non-dispersed cells.
  • Dispersed cells refer to cells that have been treated to facilitate cell dispersal.
  • Dispersed cells include cells that form single cells or small clusters of a few (typically 2-50, 2-20, or 2-10) cells.
  • Dispersed cells can be free-floating (suspension) cells or cells adhered to free scaffolding materials such as microcarriers.
  • the step of culturing cells in suspension in the medium of the present invention may be a step in which a scaffold material containing atelocollagen is previously added to the medium and the cells are cultured in suspension in such a medium. It may be a step of adding a scaffold material containing and carrying out suspension culture.
  • the cells may be suspended cultured in the medium of the present invention over the entire period of cell culture in the production method of the present invention, or the cells may be suspended cultured in the medium of the present invention only for a part of the period.
  • the cells when establishing pluripotent stem cells, the cells may be suspended cultured in the medium of the present invention only at the stage where pluripotent stem cells or adherent cells in the process of reprogramming appear.
  • cells may be cultured in the medium of the present invention from the initial stage of establishment of pluripotent stem cells (eg, the stage of starting the culture of somatic cells into which reprogramming factors have been introduced).
  • the scaffolding material may be removed, or the scaffolding material and cells may be separated.
  • atelocollagen is dissolved by adding collagenase at a concentration of 0.1% and treating at 37° C. for 1 hour or longer. Collagenase may be added to the medium at the appropriate timing, or the medium may be replaced with a medium containing collagenase.
  • the culture vessel used for floating culture is not particularly limited as long as it allows "suspension culture", and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • Examples of such culture vessels include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, multiplates, multiwell plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, or roller bottles.
  • a bioreactor is exemplified as a vessel for suspension culture.
  • These culture vessels are preferably cell non-adhesive in order to enable suspension culture.
  • the non-cell-adhesive culture vessel the surface of the culture vessel is not artificially treated (for example, coated with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells.
  • Suspension culture can be carried out by, for example, seeding cells in the various containers described above, shaking or shaking the container by an appropriate method, or stirring the medium in the container.
  • suspension culture can be performed using a culture device such as a bioreactor or an automatic culture device.
  • cell culture is performed automatically in a closed environment under mechanical control of cell seeding, medium exchange, cell image acquisition, cultured cell collection, and pH, temperature, oxygen concentration, etc. are controlled.
  • a bioreactor or an automatic culture apparatus capable of high-density culture. Techniques for supplying new medium during cultivation using these devices to supply the cells with the required substances in just the right amount include fed-batch culture, continuous culture, and perfusion culture, all of which are methods of the present invention.
  • culture vessels used in bioreactors and automatic culture equipment include open culture vessels that are easy to open and close and have a large contact area with the outside (for example, culture vessels with lids), and open culture vessels that are not easy to open and close and have contact with the outside.
  • There are closed culture vessels with a small area for example, cartridge-type culture vessels), but any culture vessel can be used in the production method of the present invention.
  • the rotation speed can be set appropriately.
  • the rotation speed of the bioreactor is 10 to 100 rpm, 80 to 100 rpm for a 5 mL bioreactor, 30 to 50 rpm for a 100 mL bioreactor, and 30 to 50 rpm for a 500 mL bioreactor. is exemplified by 10 to 30 rpm.
  • the culture density of cells is not particularly limited as long as the cells can grow.
  • 1.0 ⁇ 10 1 to 1.0 ⁇ 10 9 cells/ml more preferably 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 9 cells/ml, still more preferably 1.0 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 9 cells/ml, most preferably 3.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 9 cells/ml.
  • stem cells When stem cells are adherently cultured on free scaffolding materials such as microcarriers, they may be cultured in the presence of feeder cells.
  • Stromal cells such as fetal fibroblasts can be used as feeder cells (e.g., Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Laboratory PrESs, 2014), Gene Targeting: A Practical Approach (Oxford University PrESs,1993), Proc Natl Acad Sci USA,1981.78.12.7634-7638, Nature,1981.292.5819.154-156, J.Virol,1969.4.5.549-553, Science,1996.272.5262.722-724, J 191.81 Cell Physiol -95, International Publication WO2001/088100, International Publication WO2005/080554).
  • some cells may be separated from free scaffold materials such as microcarriers. 236) or suspension culture using high-molecular polymers such as methylcellulose (StemCellReports, 2014.2.5.734-745).
  • Stem cell suspension culture includes stem cell dispersed culture and stem cell aggregate suspension culture.
  • the term “dispersed culture of stem cells” refers to the culture of suspended stem cells, and includes the dispersed culture of single cells or small cell clusters composed of several (eg, 2 to 20) stem cells. When the dispersion culture is continued, the cultured dispersed cells form a larger stem cell cluster, and then aggregate suspension culture can be performed.
  • flocculation suspension culture examples include embryoid body culture method (see Curr Opin Cell Biol, 1995.7.6.862-869), SFEB method (Nature Neuroscience, 2005.8.3.288-296, International Publication WO2005/123902), mesh filter A sphere culture method (StemCellReports, 2014.2.5.734-745) in which cell lines are passaged by mechanical treatment using .
  • Culture conditions such as temperature, dissolved CO 2 concentration, dissolved oxygen concentration and pH can be appropriately set based on techniques conventionally used for culturing cells derived from animal tissues.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be 30-40°C, preferably 37°C.
  • the temperature at which the organ preservation solution or cell preservation solution is used can be 0°C to room temperature, preferably 0°C to 4°C.
  • the dissolved CO 2 concentration can be 1-10%, preferably 2-5%.
  • the oxygen partial pressure can be 1-10%.
  • the number of days of culture is not particularly limited as long as stem cells are produced, but it is usually 2 days or longer, preferably 3 days or longer, and more preferably 4 days or longer.
  • the upper limit of the culture period is not particularly limited, it is usually 30 days or less, preferably 25 days or less.
  • Stem cell growth promoter is used for the content of the basal medium, physiologically active substances, nutritional factors, etc.
  • a scaffold material containing atelocollagen can have a cell death inhibitory effect on cells such as stem cells and differentiated cells. Therefore, the agent or medium of the present invention can also be used when producing differentiated cells from stem cells. Therefore, a method for producing differentiated cells (hereinafter sometimes referred to as "the method for producing differentiated cells of the present invention") comprising a step of suspension culture of cells in the medium of the present invention is also provided.
  • the cells cultured in the medium of the present invention may be stem cells (including stem cells produced by the method of producing the present invention), or cells after induction of differentiation (e.g., differentiated cells differentiating cells such as progenitor cells), or differentiated cells.
  • a step of preparing stem cells produced by the production method of the present invention or a step of producing stem cells by the production of the present invention (2) culturing the prepared cells in a medium for inducing differentiation; and (3) culturing the cultured cells in the medium of the present invention in fine suspension culture.
  • differentiated cells produced by the method for producing differentiated cells of the present invention are also provided.
  • the step of culturing cells in suspension in the medium of the present invention may be a step in which a scaffold material containing atelocollagen is previously added to the medium and the cells are cultured in suspension in such a medium. It may be a step of adding a scaffold material containing and culturing.
  • the cells may be suspended cultured in the medium of the present invention over the entire period of cell culture in the method for producing differentiated cells of the present invention, or the cells may be suspended cultured in the medium of the present invention only for a part of the period. good too.
  • the scaffolding material when the atelocollagen-containing scaffolding material is no longer needed, the scaffolding material may be removed, or the scaffolding material and the cells may be separated.
  • atelocollagen is dissolved by adding collagenase at a concentration of 0.1% and treating at 37° C. for 1 hour or longer. Collagenase may be added to the medium at the appropriate timing, or the medium may be replaced with a medium containing collagenase.
  • Differentiated cells produced by the method for producing differentiated cells of the present invention are not particularly limited. , immune cells such as dendritic cells, and the like.
  • the step of suspension culture of cells in the medium of the present invention is a step of suspension culture of stem cells in a differentiation-inducing medium containing a scaffold material containing atelocollagen.
  • Induction of differentiation of stem cells for example, in the process of inducing differentiation of cardiomyocytes, 0.5 ng/ml BMP-4 is added to the medium (for example, STEM diff APEL Medium, STEM CELL), and one day later, the medium is added to 10 ng/ml BMP-4.
  • mesenchymal stem cells are cultured in a medium (90% ⁇ MEM medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 0.1 ⁇ M dexamethasone).
  • a differentiation-inducing agent such as retinoic acid
  • BMP inhibitors, Wnt inhibitors, Nodal inhibitors, retinoic acid and the like can also be used as differentiation inducers.
  • TPO thrombopoietin
  • IL3 interleukin 3
  • IL6 interleukin 6
  • SCF stem cell factor
  • Production method of the present invention is “the production method of differentiated cells of the present invention”
  • the “stem cells” cultured in the medium of the present invention are “stem cells, cells after induction of differentiation, or cells in the process of differentiation”.
  • “Stem cells” to be manufactured shall be read as “differentiated cells”.
  • the method for producing differentiated cells may be performed by a one-through system.
  • the stem cells produced by the production of the present invention are expanded by suspension culture while adhered to the scaffold material, and further suspended culture is performed in a differentiation-inducing medium while the adhesion state is maintained. Cells can also be grown and differentiated continuously on the scaffold material.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention also contains stem cells or differentiated cells produced by the production method of the present invention or the differentiated cell production method of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the cells of the present invention”). , provides a cell pharmaceutical composition (hereinafter sometimes referred to as the “pharmaceutical composition of the present invention”).
  • the cells of the present invention may be dispersed cells, cell populations forming cell masses of a predetermined shape, or differentiated cell populations forming tissue structures or organelles (tissue construction using a bio 3D printer, etc.). Since the cell pharmaceutical composition can be used as a cell source for regenerative medicine, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for cell transplantation therapy, for example.
  • cells of the present invention may be isolated from scaffold materials.
  • the scaffolding material is one that does not seriously affect the living body when transplanted (for example, a material that is degraded in vivo, such as highly purified atelocollagen), cells are adhered to the scaffolding material. It can also be used for transplantation therapy as it is.
  • HLA-DR 3 loci or 4 loci including HLA-C are somatic cells that have the same HLA type.
  • the cells of the present invention are produced as parenteral preparations such as injections, suspensions, infusions, etc. by mixing with pharmaceutically acceptable carriers according to conventional methods. Accordingly, in one aspect, a method of making a cell pharmaceutical composition is also provided, comprising formulating the cells of the invention.
  • a production method includes (1) a step of preparing stem cells produced by the production method of the present invention or a step of producing stem cells by the production method of the present invention, and/or (2) a differentiated cell produced by the production method of the present invention.
  • a step of preparing cells or a step of producing differentiated cells by the method for producing differentiated cells of the present invention may be included. Further, a step of preserving stem cells or differentiated cells can be included.
  • compositions of the present invention contains, for example, buffers (e.g., phosphate buffers, sodium acetate buffers), soothing agents (e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (e.g., human serum), albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants and the like.
  • buffers e.g., phosphate buffers, sodium acetate buffers
  • soothing agents e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers e.g., human serum
  • albumin e.g., albumin, polyethylene glycol, etc.
  • cells When formulating the pharmaceutical composition of the present invention as an aqueous suspension, for example, cells may be suspended in the above aqueous solution at a concentration of about 1 ⁇ 10 6 to about 1 ⁇ 10 8 cells/mL. .
  • the dose or transplantation amount and the administration frequency or transplantation frequency of the cells or pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately determined according to the age, body weight, symptoms, etc. of the mammal to be administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is provided in a state of cryopreservation under conditions normally used for cryopreservation of cells, and can be thawed before use.
  • it may further contain serum or its substitutes, an organic solvent (eg, DMSO), and the like.
  • the concentration of serum or its substitutes is not particularly limited, but can be about 1 to about 30% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but can be from 0 to about 50% (v/v), preferably from about 5 to about 20% (v/v).
  • ⁇ Reagent> StemFit AK03N was obtained from Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd. (Tokyo, Japan).
  • iMatrix-511 was obtained from Matrixome Inc. (Osaka, Japan).
  • CHIR 99021 was obtained from Axon Medchem LLC (Reston, VA, USA).
  • 10-mmol/L Y-27632 solution, D-PBS(-), and 0.5 mol/l-EDTA solution (pH 8.0) were obtained from Nacalai Tesque (Kyoto, Japan).
  • RPMI 1640 medium B-27 TM minus insulin, TrypL TM Select Enzyme (1X), GlutaMAX TM supplement, Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1 (Clone 13-11), PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit, and PSC Neurons Induction media were obtained from Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (Kanagawa, Japan). 100 x non-essential amino acids (NEAA) were obtained from MP Biomedicals, LLC (Irvine, CA, USA). Recombinant human activin A was obtained from BioLegend, Inc. (San Diego, CA, USA). Recombinant human BMP-4 was obtained from PeproTech (Cranberry, NJ, USA).
  • Kyoto Probe 1 (KP-1) was obtained from Goryo Kayaku Co., Ltd. (Sapporo, Japan).
  • Human GloLIVE TRA-1-60(R) NorthernLights TM NL557 conjugated antibody was obtained from R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA).
  • Peptide-GFOGER bioink was obtained from Sigma-Aldrich Co. LLC (St. Louis, MO, USA).
  • Atelocollagen acidic solution (5 mg/mL, pH 3.0) and collagen (atelocollagen) microspheres were obtained from Koken Co., Ltd. (Tokyo, Japan).
  • GLS250 gelatin solution (1.0 mg/g) was purchased from Nitta Gelatin Co., Ltd. (Osaka, Japan). Cytodex® 1 gamma and Cytodex® 3 gamma were obtained from GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden). CultureSure® DMSO was obtained from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Tokyo, Japan). PES membranes were obtained from Terumo Blood and Cell Technologies (Lakewood, CO, USA). TC-I 15 was obtained from Tocris Bioscience (Bristol, England). GP antagonist-2A, NF023, NF449, and SB 225002 were obtained from Calbiochem (San Diego, CA, USA).
  • Dihydromunduletone was obtained from MedChemExpress LLC (Monmouth Junction, NJ, USA).
  • VU6015929, merestinib (LY2801653) and DDR1-IN-1 were obtained from Selleck Chemicals LLC (Houston, TX, USA).
  • hiPSC lines 201B7 and 15M66 were established by Shinya Yamanaka (Kyoto University iPS Cell Research Foundation) and were obtained from the Kyoto University iPS Cell Research Foundation (Kyoto, Japan).
  • iPSC culture a published method (CiRA_Ff-iPSC_protocol_Eng_v140310) was used (https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/Ff-iPSC-culture_protocol_E_v140311. pdf).
  • the bioreactor coating material was 100 mL of atelocollagen acidic solution (5 mg/mL, pH 3.0) (Koken Co., Ltd., Tokyo, Japan). HE staining was performed at Biopathology Laboratory Co., Ltd. (Oita, Japan).
  • hiPSCs were cultured in StemFit AK03N medium in 6-well plates according to the manufacturer's instructions (Thermo Fisher Scientific, Inc.). PSC neuronal induction medium was used and cultured on carriers until confluent.
  • Cell proliferation was measured using Countess (Thermo Fisher Scientific, Inc.).
  • PBMC normal human PBMC (10M cells/vial) from Japanese donors were obtained from Fujifilm Wako Pure Chemical.
  • SCF stem cell factor/c-Kit ligand
  • TPO thrombopoietin
  • Flt3L final concentration 20 ng/mL
  • IL-6 final concentration 50 ng/mL
  • IL-3 20 ng/mL
  • G-CSF G-CSF
  • the following protocol is a method of culturing human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and is a brief description of the procedure routinely performed in our laboratory.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • hiPSCs were isolated using the TOKIWA-Bio SRV iPS-1 Vector, TOKIWA-Bio SRV iPS-2 Vector, TOKIWA-Bio SRV iPS-3 Vector and TOKIWA-Bio SRV iPS-4 Vector according to the manufacturer's instructions (Tokiwa-Bio Co., Ltd.). Briefly, 1 ⁇ 10 5 cells were aliquoted into microfuge tubes and centrifuged (300 g ⁇ 5 min). After removing the supernatant, 10 ⁇ L of the vector included in the kit was added. Another 10 ⁇ L of human mononuclear cell culture medium was then added and the solution was incubated at 37° C. for 2 hours.
  • Real-time PCR was performed using the StepOnePlus system (Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA).
  • Luna Universal qPCR Master Mix New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA was used according to the manufacturer's instructions.
  • TaqMan Array 96-Well FAST Plate Human Stem Cell Pluripotency, Applied Biosystems was used for mRNA expression analysis.
  • TaqMan TM Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) was used according to the manufacturer's instructions. Expression was calculated using the ⁇ Ct method. Expression of target genes was corrected by expression of housekeeping genes. For human ⁇ -actin, OCT3/4, NANOG, SOX2, Brachyury (T), NKX2.5, Troponin T (cTnT), SOX17, FOXA2, HNF4A, PAX6, MAP2, SOX1, CDH1, CDH2, Integrin ⁇ 5 and Integrin ⁇ 1 designed primers. Gene names were obtained from the US National Library of Medicine NIH website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).
  • the primers used for PCR are as follows. ⁇ Undifferentiated ES cells> Human OCT3/4 (NM_002701.4) 144 bp (Forward) GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG (SEQ ID NO: 1) (Reverse) CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC (SEQ ID NO: 2) Human NANOG (NM_024865.2) 391 bp (Forward) CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC (SEQ ID NO: 3) (reverse) CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC (SEQ ID NO: 4) Human SOX2 (NM_003106.2) 151 bp (Forward) GGGAAATGGGAGGGGGTGCAAAAGAGG (SEQ ID NO: 5) (reverse) TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG (SEQ ID NO: 6)
  • HA339122 (GPRC5A) (Forward) AATTGGAGGTGGCAGCTTCAG (SEQ ID NO: 75) (Reverse) GGGCCACAGMTTTCCMAGA (SEQ ID NO: 76) HA372963 (ADGRG1) (Forward) AGCTGCCTGGTGTCTGCTGTA (SEQ ID NO: 77) (reverse) AGCAAGGGCAATGCAGCTC (SEQ ID NO: 78) HA251255 (ADGRG2) (Forward) ATGAGGTACATACACTGCCGCTTC (SEQ ID NO: 79) (Reverse) TGGGCCAGAGTGTACCAGTCATA (SEQ ID NO: 80) HA362862 (ADGRL2) (Forward) ATAAATGAGCCGGGCAGCTT (SEQ ID NO: 81) (Reverse) CCATCAGTCTGCATCATTGATCTT (SEQ ID NO: 82) HA352953 (ADGRG6) (Forward) T
  • Example 1 Establishment of iPS cells
  • Human iPS cell establishment efficiencies were comparatively evaluated using atelocollagen microcarriers and collagen microcarriers.
  • Human mononuclear cells used for establishment of human iPS cells were purchased from PRECISION (Human PBMC 93219, Lot 2010114001). The method for culturing human mononuclear cells is the “Protocol for establishment of iPS cells for research ver. /img/protocol/20210507new_protocol_ver1_1.pdf).
  • the procedure was as follows. (1) Add IL-6 (50 ng/mL), SCF (50 ng/mL), TPO (10 ng/mL), Flt3L (20 ng/mL) to StemFit AK03 (Ajinomoto) medium A and B mixture ), IL-3 (20 ng/mL), and G-CSF (10 ng/mL) are added to prepare a medium for granulocytic cells. (2) Human mononuclear cells are seeded into one well of a 24-well plate (Sumitomo Bakelite MS-80240) at a concentration of 1.5 ⁇ 10 6 cells/mL and cultured using a medium for granulocytic cells.
  • microcarrier experimental conditions are as follows.
  • Collagen microcarriers Cytodex-3 (GE Healthcare) (dextran beads bound and coated with denatured porcine skin-derived collagen) at a concentration of 300 ⁇ g (equivalent to 100,000 beads)/well Addition to wells
  • Experimental conditions [2] Atelocollagen microcarriers: Atelocollagen-beads (MIC-00) (microcarriers for cell culture) (95.5% or higher purity) at a concentration of 300 ⁇ g (equivalent to 100,000 beads)/well (approximately 1%) added to 6 wells
  • Table 1 shows the results. Under the experimental condition [1], 0,0,0,0,0 iPS cell colonies were confirmed in 5 visual fields within the well 10 days after infection with the Sendai virus vector (mean value 0 per visual field). rice field. Under experimental conditions [2], 1, 1, 3, 1, and 1 iPS cell colonies were confirmed in the 5 visual fields in the well 10 days after infection with the Sendai virus vector (average value: 1.4 per visual field). there were. In addition, under the experimental condition [2], 15 days after infection with the Sendai virus vector, the colonies were confirmed to be viable iPS cell colonies by confirming pseudopodia using an optical microscope (x 400) (Fig. 1). ). Cells were passaged once, and the results of cell counting on the 12th day are described.
  • the total cell count was 1.76 ⁇ 10 4 cells/ml, the viable cell count was 0.00 ⁇ 10 0 cells/ml (viable cell rate: 0%), and no viable cells were observed. I didn't.
  • the total cell count was 6.39 ⁇ 10 5 cells/ml, the viable cell count was 4.22 ⁇ 10 5 cells/ml (viable cell rate: 66%), and viable cells were observed.
  • mRNA was obtained from a cell suspension of 1/10 the amount of cells used for passage, real-time PCR was performed, and mRNA expression analysis of iPS cell markers was performed. gone.
  • OCT3/4 (CT value: 20.94), NANOG (CT value: 20.93), SOX2 (CT value: 21.56), ⁇ -actin (CT value: 17.37), and mRNA expression of iPS cell markers were confirmed. rice field.
  • CT value: 20.94 CT value: 20.94
  • NANOG CT value: 20.93
  • SOX2 CT value: 21.56
  • ⁇ -actin CT value: 17.37
  • mRNA expression of iPS cell markers were confirmed. rice field.
  • iPS cells were then fluorescently immunostained with Tra-1-60, an iPS cell marker (Human GloLIVE TRA-1-60(R) NorthernLights TM NL557-conjugated Antibody).
  • iPS cell marker Human GloLIVE TRA-1-60(R) NorthernLights TM NL557-conjugated Antibody.
  • iPS cells cannot be established in a three-dimensional environment when the cell culture microcarrier surface is collagen, but iPS cells can be established in a three-dimensional environment when the surface is atelocollagen. became.
  • Example 2 Proliferation of human iPS cells
  • Human iPS cells and culture method For culturing human iPS cells, refer to “Protocol Feeder-Free Establishment and Maintenance of Human iPS Cells (Kyoto University iPS Cell Research Institute)” (https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/rESearch /img/protocol/hiPSprotocolFf_140311.pdf).
  • Table 2 shows the results.
  • the cell growth ability in three-dimensional culture using cell culture microcarriers with atelocollagen as a scaffold material is as follows: The average cell number on day 6 of culture is It was 2.4 ⁇ 10 6 cells. This result indicates that atelocollagen microcarriers are suitable scaffold materials for three-dimensional culture.
  • mouse iPS cells when cultured with Cytodex-3, it has been reported that the iPS cells grew only 4 times in 7 days (Cytotechnology, 2016. 68. 45-59). The proliferation seems to occur not on the bead surface but in the interstices between the beads), and the effect with atelocollagen microcarriers was more pronounced than that of the prior art.
  • Example 3 Effect of gelatin, collagen, laminin, and atelocollagen coat concentration and mixing ratio in human iPS cell culture (evaluation of cell proliferation)]
  • Method 3 Human iPS cells were cultured using 201B7 according to the following method (Kyoto University iPS Cell Research Institute protocol https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/hipsprotocolFf_140311. pdf). The following three types were used as coating materials.
  • the Y-27632-free medium was replaced on day 1 and day 3 after seeding the cells.
  • atelocollagen had the best cell proliferation.
  • the atelocollagen content was less than 98% in combination with gelatin, the number of viable cells was equal to or less than the number of seeded cells. It was found that the presence of atelocollagen on the surface of the scaffold material provides an excellent cell proliferation-promoting effect on iPSCs, but the coexistence of other coating materials impairs this effect. Specifically, it was suggested that if the ratio of other coating materials is less than 2%, the above effects are generally maintained.
  • Example 4 hiPSC culture using atelocollagen beads
  • 2D culture in which the culture substrate is coated with a scaffold material, is the mainstream method for the production of iPS cells for clinical use, from establishment to subsequent culture.
  • microcarriers that take advantage of the characteristics of 2D and 3D culture.
  • iMatrix-511 (a recombinant peptide of the cell adhesion active site of laminin 511) is the most versatile scaffold used for culturing human iPS cells (hiPSCs) for clinical use. This time, iMatrix-511 was coated (27.6 ⁇ l/10 ml PBS) on cell culture microcarriers Cytodex 1 (with protein-adsorbing surface treatment) and Cytodex 3 (collagen coating). Human mononuclear cell-derived strain 15M66 (a research strain of hiPSCs for clinical use) was seeded at a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells/well (6-well plate), and the number of cells was counted on days 1, 2, 3, 4, 5, and 6. Acquired.
  • iMatrix-511-coated beads As a result, the number of hiPSCs that proliferated on the two types of iMatrix-511-coated beads was significantly lower than that on the control plate (iMatrix-511-coated plate), indicating that almost no cells proliferated (Fig. 3A).
  • the iMatrix-511 coating method was tested many times through trial and error. We also evaluated the usefulness of various materials other than iMatrix-511 as scaffold materials. However, hiPSCs could not be cultured while attached to beads. Therefore, we explored new biomaterials to which hiPSCs can adhere.
  • a plate (9.2 ⁇ l/1.5 ml PBS/well [6-well plate]) coated with iMatrix-511 and atelocollagen beads (500 ⁇ l/well [6-well plate]) were prepared.
  • 15M66 cell line was seeded at a cell concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/well (6-well plate).
  • Fig. 3B, left panel shows light microscope images on days 1 and 6.
  • Cells cultured on iMatrix-511-coated plates and cells cultured on atelocollagen beads had similar numbers of total, viable, and dead cells. The cells adhered to the iMatrix-511-coated plate and atelocollagen beads from the day after seeding, and then proliferated.
  • a bioreactor which is the most versatile three-dimensional culture method (Fig. 3D).
  • a total of 1 ⁇ 10 5 cells of the 15M66 strain were seeded on Synthemax II (Corning; 500 ⁇ l/reactor; Singleuse bio-reactor [IABLE]) and atelocollagen beads (500 ⁇ l/reactor).
  • a photograph is shown in FIG. 3C.
  • Cells adhered to both Synthemax II and atelocollagen beads under gyration culture (60 rpm) conditions using a bioreactor.
  • Cell counts are shown in Figure 3F. The numbers of live and dead cells were comparable between cells cultured on both Synthemax II and atelocollagen beads.
  • mRNA expression analysis of cells cultured in a bioreactor by spinning revealed that the expression of undifferentiated markers OCT3/4 and SOX2 was similar in both Synthemax II and atelocollagen beads. was confirmed.
  • NANOG expression in cells cultured with atelocollagen beads was significantly lower than in cells cultured with Synthemax II (Fig. 3E).
  • Atelocollagen beads with a bead concentration of approximately 3 million/15 ml were mixed with beads with a diameter of 100-400 ⁇ m.
  • bead size affects cell adhesion and proliferation of hiPSCs.
  • strain 15M66 right panel of FIG. 4B
  • strain 201B7 right panel of FIG. 4C
  • Both the 15M66 and 201B7 strains proliferated more on large-diameter atelocollagen beads than on small-diameter beads.
  • strain 201B7 the total number of cells cultured on 600 ⁇ m diameter atelocollagen beads and viable cells was significantly higher than the number of cells cultured on 105 ⁇ m diameter atelocollagen beads. This result may have been influenced by the amount of space between the beads, the curvature angle of the bead surface, or the amount of medium feed flowing between the beads.
  • Example 5 Verification of undifferentiated potential of hiPSCs cultured on atelocollagen
  • 15M66 cells were seeded at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells/well (12-well plate), iMatrix-511 coated plate (9.2 ⁇ l/well), atelocollagen coated plate (95.5% or more pure atelocollagen coated plate) The same applies hereinafter.) (200 ⁇ l/well) and cultured on a gelatin-coated plate. Cells adhered to iMatrix-511 and atelocollagen-coated plates, but not to gelatin-coated plates (Fig. 5A).
  • iMatrix-511 is more active than atelocollagen in signaling pathways promoting cell proliferation.
  • the total number of cells cultured on the atelocollagen-coated plate and the number of viable cells were similar to the cells cultured on the iMatrix-511-coated plate, but the total number of cells cultured on the gelatin-coated plate was and viable cell numbers were lower than those cultured with iMatrix-511 (Fig. 6B). It is considered that the 201B7 strain suppresses filopodia expression without inducing cell death on atelocollagen (Fig. 6B).
  • 15M66 cells were seeded on iMatrix-511-coated plates (9.2 ⁇ l/well) and atelocollagen-coated plates (1 ml (1 mg/ml)/well) at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells/well. After sampling the cells, mRNA was extracted for mRNA expression analysis.
  • TaqMan Human Stem Cell Pluripotency Array (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) (Avilion, AA et al., Genes Dev 17, 126-140 (2003); Chambers, I.
  • Example 6 Verification of differentiation induction, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and mesenchymal-epithelial transition (MET) in hiPSCs cultured on atelocollagen
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • MET mesenchymal-epithelial transition
  • HBB is known to be expressed not only in hematopoietic stem cells but also in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and its expression is reported to increase in iPSCs derived from human blood (Joehanes, R. et al., Physiol Genomics 44, 59-75 (2012)) was also increased, and the expression of KRT1, an ectodermal marker, was also increased (Fig. 7A).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • 15M66 cells were seeded on iMatrix-511-coated plates (9.2 ⁇ l/well) and atelocollagen-coated plates (250 ⁇ l/well) at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells/well and cultured. was extracted and subjected to mRNA expression analysis.
  • mRNA expression of MET markers was examined, only the expression of E-cadherin was significantly increased in cells cultured on atelocollagen compared to cells cultured on iMatrix-511.
  • Expression of COL4A1 was significantly decreased, and no significant difference was observed for other factors (Fig. 7B).
  • KP-1 Kyoto Probe 1
  • iPSC-like cells or tissue-specific progenitor cells that can be generated by the iPSC generation method
  • Noguchi, H. et al., Mol Ther Methods Clin Dev 13, 243-252 (2019) was reported (Miyagi-Shiohira et al., Sci Rep 10, 18084 (2020)).
  • 15M66 cells were seeded on iMatrix-511-coated (9.2 ⁇ l/well) or atelocollagen-coated (250 ⁇ l/well) plates at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells/well (12-well plate). Four days after cell seeding, cells were fixed.
  • SRV TM iPSC-1, 2, 3, 4 (Tokiwa Bio Inc., Tsukuba, Japan) and CytoTune 2.0 (ID Pharma, Tokyo, Japan) are commercially available cell reprogramming agents for use in establishing clinical iPSCs. It is available as a Sendai virus vector. However, these cell-reprogramming Sendai virus vectors were developed for cells growing on cell culture plates and are optimized for hiPSC establishment under 2D conditions. The spherical surface of atelocollagen beads is a 3D environment, and it was verified whether or not hiPSCs could be established in a 3D environment using the Sendai virus vector.
  • Mononuclear cells (1 ⁇ 10 5 cells) isolated from human blood were infected with the vector (SRV TM iPSC-2) at a multiplicity of infection (MOI) of 3, and atelocollagen beads (spheres of atelocollagen with a purity of 95.5% or more were formed. , etc.) (500 ⁇ l/well) or Cytodex 3 (500 ⁇ l/well).
  • SRV TM iPSC-2 multiplicity of infection
  • atelocollagen beads spheres of atelocollagen with a purity of 95.5% or more were formed. , etc.
  • Cytodex 3 500 ⁇ l/well
  • hiPSC establishment efficiencies on normal iMatrix-511-coated plates and atelocollagen beads were compared.
  • Five vectors of SRV TM iPSC-1, 2, 3, 4 and CytoTune 2.0 were used and compared with atelocollagen.
  • HiPSC establishment efficiency was recorded by counting the number of colonies confirmed in the wells using an optical microscope and a fluorescence microscope on day 14 after Sendai virus infection.
  • four of the five vectors (except SRV TM iPSC-2) showed no significant difference in hiPSC establishment efficiency between iMatrix-511-coated plates and atelocollagen beads (Fig. 8B).
  • the hiPSCs established on the atelocollagen beads were detached with trypsin according to the normal hiPSC culture protocol, and then transferred to a plate containing new atelocollagen beads (500 ⁇ l/well).
  • mRNA was extracted from cardiomyocytes (Fig. 8C), endoderm cells (Fig. 8D), and neural progenitor cells (Fig. 8E) 11 days after induction of differentiation. and evaluated their ability to differentiate into three germ layers.
  • Fig. 9 As controls, iMatrix-511-coated plates (Fig.
  • atelocollagen-coated plates (Fig. 9, left panel) and atelocollagen-coated plates (Fig. 9, middle panel) were used.
  • the 201B7 strain was induced to differentiate into mature cardiomyocytes expressing troponin T on atelocollagen beads (Fig. 9, right panel).
  • CDC42 and WASL Central factors in cellular filopodia formation are CDC42 and WASL, CDC42 is a key factor that induces cytoskeletal rearrangements, and WASL is the gene encoding the Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP). . WASP acts downstream of CDC42 to form cellular filopodia (Thrasher, AJ, and Burns, SO Nat Rev Immunol 10, 182-192 (2010)). Thus, increased expression of CDC42 and WASL indicates activation of signaling pathways that lead to cytoskeletal rearrangement and filopodia formation.
  • WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein
  • 201B7 cells were seeded at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells/well (12-well plate) and allowed to adhere to iMatrix-511-coated and atelocollagen-coated plates (FIG. 12B).
  • mRNA was extracted from cells and analyzed for expression of factors associated with Rho family protein signaling.
  • Rho family protein signaling As a result, the expression of CDC42 and DIAPH3 was significantly increased in cells cultured on atelocollagen compared to cells cultured on iMatrix-511.
  • the expression of Rac1, DIAPH1, ROCK2, ROCK1P1, Profilin (PFN) 1, PFN2 and PFN5 was significantly decreased.
  • 15M66 cells were seeded at a density of 5 ⁇ 10 4 cells/well (12-well plate) and allowed to adhere to iMatrix-511-coated plates and atelocollagen-coated plates (FIG. 12C).
  • CDC42-induced WASL expression was significantly increased in cells cultured on atelocollagen compared to cells cultured on iMatrix-511.
  • the expression of PFN1 was significantly decreased.
  • integrin ⁇ 2 ⁇ 1 a receptor for collagen I, the main component of atelocollagen. 1 ⁇ g (dissolved in 0.1 ⁇ l of DMSO) or 10 ⁇ g (dissolved in 1 ⁇ l of DMSO) was prepared using TC-I15, an integrin ⁇ 2 ⁇ 1 inhibitor, as an additive reagent. DMSO (0.1 ⁇ l, 1 ⁇ l) alone was prepared as a control.
  • HiPSCs cultured with atelocollagen do not induce EMT or MET as described above (FIGS. 6C and 6D, FIGS. 7B and 7C).
  • Type I collagen is reported to induce EMT by being activated by two types of receptors, integrin ⁇ 2 ⁇ 1 and Discoid in domain receptor family, members (DDR) 1 and 2. This mechanism is explained by the strong enhancement of the integrin ⁇ 2 ⁇ 1 signal by the DDR receptor, which causes cell invasion (Xu, H. et al, PLoS One 7, e52209 (2012)). Three DDR receptor inhibitors (VU6015929, Merestinib, DDR1-IN-1) were used.
  • FIG. Integrin ⁇ 2 ⁇ 1 extends filopodia and anchors hiPSCs to atelocollagen like tent ropes under both 2D (Fig. 11, left) and 3D (Fig. 11, right) conditions. was confirmed. Self-renewal of hiPSCs attached to atelocollagen is then promoted.
  • Rho family of GTPases is a family of small ( ⁇ 21 kDa) signaling G proteins (El Masri, R., and Delon, J. Nat Rev Immunol 21, 499-513 (2021)).
  • 15M66 cells were seeded at a concentration of 2.5 ⁇ 10 4 cells/well (6-well plates) on iMatrix-511-coated plates and atelocollagen-coated plates together with a G protein inhibitor (NF023) (FIG. 12A).
  • NF023 did not change cell adhesion, cell proliferation, or cell morphology of cells cultured on iMatrix-511- or atelocollagen-coated plates (light microscope shown in Fig. 13). image). This result indicates that the G protein is relatively influential as a factor in the elongation of hiPSC filopodia on atelocollagen.
  • Example 9 Applicability to automatic culture equipment
  • IC hollow fiber intracapillary
  • EC extracapillary
  • the material of hollow fiber membranes used in cell bioreactors is mainly polyethersulfone (PES), which makes cell adhesion with existing hiPSC biomaterials difficult.
  • PES polyethersulfone
  • the inventors have found that the surface of PES has liquid-permeable irregularities resembling hybrid layers such as the dentin of teeth.
  • Atelocollagen is a liquid with good fluidity at an acid concentration of pH 3, but has the property of solidifying into a jelly-like state when the pH is neutralized.
  • a hybrid layer of atelocollagen is formed on the PES membrane. It is possible to make In fact, when the PES membrane was coated with atelocollagen by this method, the 15M66 cell line did not adhere to the PES membrane (Fig. 14A, left), but began to adhere to the atelocollagen-coated PES membrane (Fig. 14A). 14A, right). The bioreactor hollow fiber membrane was coated with atelocollagen.
  • mRNA was extracted for mRNA expression analysis.
  • the types of mRNA measured using the TaqMan Human Stem Cell Pluripotency Array (Applied Biosystems) were divided into "expression in undifferentiated cells,” “maintenance of pluripotency,” “correlation with stemness,” “differentiation marker,” and “control.” Selected from mRNA expression profiles.
  • “correlation with stem cells (Fig. 14F)” “expression in undifferentiated cells (Fig. 14D)”, “maintenance of pluripotency (Fig. 14E)”, “differentiation markers (Fig. 14G)” was analyzed.
  • telocollagen-coated PES hollow fiber membrane bioreactors The characteristics of the mRNA expression patterns of cells cultured in these atelocollagen-coated PES hollow fiber membrane bioreactors were similar in many respects to those of cells cultured in atelocollagen-coated plates (Fig. 5C, 5D, 5E, and 7A).
  • stem cells can be efficiently produced, and stem cells can be efficiently proliferated.
  • Such a method includes a step of suspension culture of cells, and suspension culture facilitates automation of culture and mass culture. Therefore, the present invention is extremely useful as a research tool using stem cells, or for producing safe stem cell-derived transplant cells that can be used in regenerative medicine.

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Abstract

本発明は、アテロコラーゲンを含有する足場材料を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、幹細胞の製造方法、およびアテロコラーゲンを含有する足場材料を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、分化細胞の製造方法を提供する。また、本発明は、前記方法により製造された幹細胞および分化細胞も提供する。

Description

多能性幹細胞の製造方法
　本発明は、多能性幹細胞などの幹細胞の製造方法等に関する。より詳しくは、アテロコラーゲンを含有する足場材料を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、幹細胞の製造方法等に関する。
　人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）等の多分化能幹細胞を、細胞培養ディッシュ等の底面へ細胞を接着させ培養する技術(平面培養)がこれまでに開発されてきた（非特許文献1、２参照）。一方、多分化能幹細胞であるES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来しており、本来の生育様態に近い培養方法とするためには、細胞の浮遊培養および半浮遊培養など、3次元（3D）的につくられた臓器(オルガノイド)形成の製造過程における培養と同様の培養を行う必要がある。
　ES細胞およびiPS細胞の浮遊培養方法として、胚様体(embryoid body; EB)（多能性幹細胞を浮遊培養することによって形成される三次元の細胞凝集塊）を形成する浮遊培養方法が知られている。胚様体を形成する培養において、胚様体のサイズを均一に保つ操作が必要であり、具体的には、攪拌培養におけるプロペラの剪断応力によって細胞塊を砕く等の物理的な力学による操作が必要となる。そのため、ES細胞やiPS細胞などの物理的ストレスによって容易に細胞死を誘発しやすい特徴を持つタイプの細胞（非特許文献３参照）においては、胚様体のサイズの制御が難しいとの欠点があった。
　ところで、細胞培養においては、マイクロキャリアを細胞の足場材料として用いることがある。マイクロキャリアは微小粒子であり、接着性動物細胞をマイクロキャリアに接着させ、この状態で培養を行うことで、接着性動物細胞の性質を大きく変えることなく、浮遊条件で大量培養することができる（非特許文献４参照）。しかし、多能性幹細胞を表面に接着させるのに適するマイクロキャリアなどの足場材料はこれまでに見つかっていなかった。
　細胞培養に用いるマイクロキャリアの表面は、マトリゲル(Corning)（マウス肉腫から抽出した、可溶化基底膜調製品）などの生体由来成分による接着基質で被覆する必要があることが報告されている。また、細胞培養において、直径100 μm以下の小さなマイクロキャリアは細胞の増殖に向かず、また、カルボキシメチル基などの負電荷を持つ残基がマイクロキャリアの表面において支配的であると、細胞が接着しないことも知られている（非特許文献５参照）。例えば、タイプIコラーゲンは、その加水分解成分であるゼラチンとして、多能性幹細胞の細胞培養ディッシュの足場材料として主にフィーダー培養法と呼ばれる平面培養に用いられてきた歴史がある(非特許文献1、２参照)。コラーゲン線維は、ＲＧＤ配列と呼ばれる細胞接着配列を有しており、かかる配列により細胞親和性に優れていることが報告されている（非特許文献６参照）。コラーゲン分子およびその断片で３本鎖らせん構造を失ったものがゼラチンであり、ゼラチンナノファイバーを用いた多能性幹細胞の培養実績が報告されている（特許文献１参照）。しかし、タイプI コラーゲンは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いたフィーダー培養法においては、ヒトiPS細胞の足場材料としての機能を発揮するが、フィーダーレス培養法においては、ヒトiPS細胞の接着機能および増殖を維持する機能が弱いことが以前から知られている。そのため、タイプIコラーゲンを用いた市販のCytodex-3(GE Healthcare)(表面に変性したブタ皮膚由来コラーゲンを結合・被覆したデキストランビーズ)を用いた場合、臨床用iPS細胞の製造に必要となるフィーダーレス培養法では、細胞の接着機能および増殖を維持する機能が弱く、実用に足るとはいえない。また、特許文献１では、0.1%ゼラチン上ではヒトiPS細胞は培養できないことが記載されており、ゼラチンをナノファイバーに加工することでヒトiPS細胞の増殖に成功している。
　また、特許文献２では、細胞外マトリックス(ラミニン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物等)で被覆したマイクロキャリア上に多能性幹細胞を付着させて、多能性幹細胞を３継代以上懸濁培養する方法が開示されている。特許文献３では、細胞または組織の浮遊培養用培地組成物として高分子化合物(ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン等の多糖類)を用いる方法が開示されている。特許文献４では、bFGF、アスコルビン酸、TGFβ-3等を含むゼノフリーかつ無血清の培地、および該培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。特許文献５では、特定組成の合成樹脂を含有する幹細胞用の足場材料と、それを用いた培養方法が開示されている。さらに、特許文献６では、細胞培養槽と成分調整液貯留槽との間で溶液を還流させて、多能性幹細胞や胚様体等を培養する装置が開示されている。しかし、いずれの特許文献においても、マイクロキャリアの被覆材料としてのアテロコラーゲンの具体的な利用方法は示されておらず、またアテロコラーゲンを用いた多能性幹細胞の培養に関する具体的な事例は開示されていない。
特開２０１３－２４７９４３ 特表２０１１－５１４１６９ ＷＯ２０１４／０１７５１３ 特表２０１３－５１０５６７ ＷＯ２０１９／１３１９８１ ＷＯ２０１３／１６１８８５
Nature, 1981. 292. 154-156 Science, 1998. 282. 1145-1147 Nature Biotechnology, 2007. 25. 681-686 Nature, 1967. 216. 64-65 Stem Cell RES, 2011. 7. 97-111 Biomaterials, 2003, 24. 4385-4415
　本発明は、幹細胞の樹立および増殖において、浮遊状態での培養を可能とする新規な方法を提供することを課題とする。また、かかる方法により、細胞の均質化や培養の自動化を可能とし、多能性幹細胞などの幹細胞の産業利用を加速することも課題とする。
　コラーゲンはゼラチンとして多能性幹細胞培養の足場材料として以前より使われてきた歴史があった。しかし、その目的はマウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いたフィーダー培養法の足場材料としての用途であった。近年においてはMEFを使う培養方法は古典的な手法との位置づけとなり、代わりにフィーダーレス培養法が主流となっている。フィーダーレス培養法ではMEFもゼラチンも不要である。そのため、ゼラチンを構成するタイプIコラーゲンを多能性幹細胞の培養に用いてきた歴史はあるが、フィーダーレス培養法が確立した近年においては、時系列において、多能性幹細胞の培養にコラーゲンを用いることはおろか、コラーゲンに代えてアテロコラーゲンを用いようとする動機付けは存在しなかった。このような状況下であったが、本発明者らは、あえてコラーゲンを用いた多能性幹細胞の培養に着目し、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、コラーゲンではなくアテロコラーゲンで被覆したマイクロキャリアを細胞培養に用いることで、効率よく多能性幹細胞を樹立でき、また多能性幹細胞を増殖できるのではないかとの着想を得た。かかる着想に基づき研究を進めた結果、タイプIコラーゲンで被覆したマイクロキャリアを用いた場合には、体細胞から多能性幹細胞が樹立できなかった一方で、アテロコラーゲンで被覆したマイクロキャリアを用いた場合には、体細胞から多能性幹細胞を樹立できることを見出した。タイプIコラーゲンとアテロコラーゲンでは、構造の大部分が共通するため、上記樹立効率の違いは驚くべきものであった。さらに、アテロコラーゲンで被覆したマイクロキャリアを用いて多能性幹細胞を培養することで、効率よく多能性幹細胞を増殖できることも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］
　アテロコラーゲンを含有する遊離した足場材料を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法。
［２］
　前記細胞が初期化因子が導入された体細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記体細胞が浮遊性細胞である、［２］に記載の方法。
［３－１］
　前記浮遊性細胞が血球系細胞である、［３］に記載の方法。
［４］
　前記細胞が多能性幹細胞である、［１］に記載の方法。
［４－１］
　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、［４］に記載の方法。
［４－２］
　前記細胞がヒト由来の細胞である、［１］～［４－１］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
　前記足場材料がマイクロキャリアである、［１］～［４－２］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
　前記足場材料におけるアテロコラーゲンの質量パーセント濃度が１０%以上である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７－１］
　前記足場材料が実質的にアテロコラーゲンからなる、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［７－２］
　前記足場材料におけるアテロコラーゲンの質量パーセント濃度が９５%以上である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
　前記細胞を浮遊培養する工程が培養装置を用いて行われる、［１］～［７－２］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
　［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法により製造された多能性幹細胞。
［１０］
　アテロコラーゲンを含有し、培地中で遊離する足場材料を含む、多能性幹細胞増殖促進剤。
［１０－１］
　アテロコラーゲンを含有し、培地中で遊離する足場材料を含む、多能性幹細胞の細胞死抑制剤。
［１０－２］
　アテロコラーゲンを含有し、培地中で遊離する足場材料を含む、多能性幹細胞生存維持剤。
［１１］
　［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法により製造された多能性幹細胞を準備する工程、
　該準備された細胞を分化誘導用培地中で培養する工程、および
　該培養された細胞を、アテロコラーゲンを含有する遊離した足場材料を含む培地中で浮遊培養する工程
を含む、分化細胞の製造方法。
［１２］
　［１１］に記載の方法により製造された分化細胞。
［１３］
　［９］に記載の多能性幹細胞または［１２］に記載の分化細胞を含む、医薬組成物。
　本発明の製造方法では、幹細胞を効率よく製造することができ、また幹細胞を効率よく増殖させることができる。本発明の製造方法により作製した多能性幹細胞は、アテロコラーゲンを含む足場材料上で少なくとも８継代以上浮遊培養してもその多能性を維持し得る。また、かかる方法では、細胞を浮遊培養する工程を含むが、浮遊培養は培養の自動化、大量培養が容易となるだけでなく、本発明の製造方法により得られた幹細胞を、足場材料に接着させたまま拡大培養し、特定の細胞に分化させる、という一気通貫型システムの構築も可能となる。そして、本発明の製造方法で用いる足場材料は、マイクロキャリア等にアテロコラーゲンを被覆するだけで、あるいはアテロコラーゲン自体を足場材料として成形するだけで調製することができるため、費用面でも優れている。さらには、本発明の方法で得られた分化細胞を、足場材料から剥がすことなく、足場材料ごと生体内に移植することも可能となる。
実施例１のビーズ培養のヒトiPS細胞増殖試験結果(細胞播種後５－６日目)を示す。 コラーゲン線維の構造を示す（出典：北海道医療大学歯学雑誌,2008. 27. 7-14）。生体主要構成成分であるコラーゲンは構造タンパク質で、その構造上の特徴は３本らせんを有する高次構造である。コラーゲン線維の基本単位はmicrofibrilであり、分子(矢印)が横隣りの分子と６７０Å=Ｄだけずれて並んでおり、同列上の分子間には０．６Ｄの間隙(hole zone)がある。分子間には分子末端(テロペプチド)で分子間架橋が生成される。microfibrilは５本の分子が正５角形の各頂点に位置した(断面)円筒である。microfibrilが多数集まってfibrilを作り、fibrilが多数集合してfiberを作り、多数のfiberがからみ合ってfiber bundleを作る。 アテロコラーゲンビーズを用いた3次元培養におけるhiPSCの細胞増殖。15M66細胞をiMatrix511でコーティングしたプレート、iMatrix-511でコーティングしたCytodex 1、iMatrix-511でコーティングしたCytodex 3に、1×105細胞/ウェルで播種後1、2、3、4、5、6日目にカウントした。データは平均±SDを表す。**P < 0.01 (A)。iMatrix 511でコーティングしたプレートとアテロコラーゲンビーズ上へ5×104cells/wellで細胞播種後6日目に15M66細胞をカウントした（n=3）。データは平均±SDを表す（B、左図）。15M66細胞をSynthemax IIまたはアテロコラーゲンビーズ上に1 × 105 cells/バイオリアクターで播種後4日間培養したもの。60 rpmで攪拌培養した後の光学顕微鏡写真（C、左パネル）。スケールバーは指定した長さを示す。撹拌培養中のバイオリアクターの側面図（D）。mRNA発現解析結果。データは平均値±SDを表す。**P < 0.01 (E)、細胞数データ (F)。 n=3。 異なる直径のアテロコラーゲンビーズを用いたhiPSCの増殖研究。直径105 μm以下、105-250 μm、250-425 μm、425-600 μmのアテロコラーゲンビーズに細胞を付着させた株15M66の光学顕微鏡写真（A）。直径≦105 μm、105-250 μm、250-425 μm、425-600 μmのアテロコラーゲンビーズに5×104個の細胞を播種してから5日後の15M66細胞の光学顕微鏡写真（B、左パネル）と細胞数（B、右パネル）。n＝6。直径≦105 μm、105-250 μm、250-425 μm、425-600 μmのアテロコラーゲンビーズに5×104個の細胞を播種してから5日後の201B7細胞の光学顕微鏡写真（C、左パネル）および細胞数（C、右パネル）。データは平均±SDを表す。*P < 0.05. **P < 0.01。 アテロコラーゲンコーティングプレート上で培養したhiPSCの特徴。iMatrix-511、アテロコラーゲン、ゼラチン上に5×104 cells/wellで培養した15M66細胞播種後4日目の光学顕微鏡画像。スケールバーは指定された長さを示す（A）、細胞数データ。データは平均値±SDを表す。**P < 0.01 (B)。iMatrix-511またはアテロコラーゲン上に15M66細胞を5×104 cells/wellで播種後、4日目におけるmRNA発現解析結果。幹細胞マーカーとの相関（C）、未分化細胞マーカーの発現（D）、多能性維持マーカーとの相関（E）。 アテロコラーゲンコートプレートで培養したhiPSCの特徴。iMatrix-511、アテロコラーゲン、ゼラチンをコートしたプレート上で201B7細胞を5×104cells/wellで播種後4日目に光学顕微鏡で観察した画像。スケールバーは指定長さ（A）、細胞数データ（B）。データは平均値±SDを表す。iMatrix-511またはアテロコラーゲンでコートしたプレートに5×104cells/wellで播種した201B7細胞の播種後4日目のmRNA発現解析の結果：幹細胞マーカーとの相関(C)、未分化細胞マーカーの発現(D)。データは平均値±SDを表す。*P < 0.05. **P < 0.01。 アテロコラーゲンコーティングプレート上で培養したhiPSCの分化と変性状態。5×104cells/wellで播種後、4日目にiMatrix-511またはアテロコラーゲン上で15M66細胞のmRNA発現を解析した結果。分化マーカー（A）。iMatrix-511またはアテロコラーゲン上に15M66細胞を5×104cells/wellで細胞播種4日後にmRNA発現解析した結果。上皮系マーカー、n=6。データは平均値±SDを表す。*P < 0.05. **p < 0.01 (B)。間葉系マーカー、n=6。データは平均値±SDを表す。*P < 0.05. **p < 0.01 (C)。iMatrix-511またはアテロコラーゲン上の15M66細胞（5×104細胞/ウェル）の蛍光顕微鏡写真。細胞播種4日後に、Kyoto Probe 1（D、上段）、Tra-1-60（D、下段）で染色した。スケールバー＝200 μm。 iPSCをアテロコラーゲンビーズ上で樹立した。1×105個のヒト単核細胞に対し、アテロコラーゲンビーズまたはCytodex 3上で、センダイウイルスベクターを用いて初期化した。初期化開始後15日目の光学顕微鏡画像。白い矢印は、樹立されたhiPSC（A、左パネル）または樹立が不完全な細胞塊（A、右パネル）を示す。合計1×105個のヒト単核細胞をiMatrix-511またはアテロコラーゲンビーズ上で5種類のセンダイウイルスベクター（SRVTM iPSC-1, 2, 3, 4, CytoTune 2.0.）を用いて初期化した。初期化開始後15日目におけるコロニー数／ウェル。**p＜0.01（B）。アテロコラーゲンビーズ上で樹立したhiPSCをアテロコラーゲンビーズ上で8回継代した後、心筋細胞（C）、内胚葉系細胞（D）、神経前駆細胞（E）への分化誘導開始から11日後に採取したmRNAにおける各分化マーカーの発現解析。データは平均±SDを表す。*P < 0.05. **P < 0.01。 iMatrix-511コーティングプレート、アテロコラーゲンコーティングプレート、アテロコラーゲンビーズが心筋細胞への分化誘導に与える影響。201B7株用hiPSCからの分化誘導開始後8日目の心筋細胞。光学顕微鏡画像を示す（上段）。トロポニンT抗体を用いた蛍光免疫染色による染色（上から2番目）、ヘキストを用いた蛍光免疫染色による染色（上から3番目）、それらの写真を合成して顕微鏡で撮影したもの（下段）。スケールバー＝200 μm。 コラゲナーゼによるアテロコラーゲンの分解。コラゲナーゼ（1g/10ml高濃度溶液を50 μl/ウェル）添加後0-30分後の光学顕微鏡像。スケールバー＝400 μm。 hiPSCがアテロコラーゲンに対する反応として糸状仮足の伸長を誘導する機構の解明。糸状仮足を伸してアテロコラーゲン上に付着したhiPSCの光学顕微鏡写真（白矢印）(A)。2.5 × 104 cells/wellの15M66細胞をアテロコラーゲンでコーティングしたウェル（B）またはiMatrix-511でコーティングしたウェル（C）に播種し、試薬TC-I 15を1または10 μg/wellで添加または無添加した3日後の光学顕微鏡写真。スケールバー＝100μm。アテロコラーゲンがどのようにhiPSCの糸状仮足の伸長を誘導しているかを示す図。アテロコラーゲンは、hiPSCのインテグリンα2β1を活性化し、自己複製能と糸状仮足の伸長を活性化する。このメカニズムは、2次元培養条件下（D、左図）だけでなく、3次元培養条件下（D、右図）でも機能する。 アテロコラーゲンがRhoファミリータンパク質シグナル伝達因子に与える影響。Rhoファミリータンパク質シグナル因子が糸状仮足を発現するシグナル伝達経路の説明図。受容体はGPCR、RTK、Integrinであるが、Integrinのみを描いている（A）。201B7細胞（B）または15M66細胞（C）を、iMatrix-511またはアテロコラーゲンでコートしたウェル上に5×104cells/wellで播種し、4日目後にRhoファミリー蛋白質シグナル伝達因子のmRNA発現解析を行った結果。n = 6。データは平均±SDを表す。*P < 0.05. **p < 0.01。 アテロコラーゲンへのhiPSCが糸状仮足の伸長を誘導するメカニズムの検討。光学顕微鏡像。試薬（対照：DMSO、NF023、NF449、SB 225002、GP Antagonist-2Aまたはジヒドロムンドレトンのみ）を1または10 μg/ウェルの濃度で使用または使用しないiMatrix-511またはアテロコラーゲンコーティングウェルに15M66細胞を2.5×104細胞/ウェルで播種後3日経過したもの。スケールバー＝100 μm。 アテロコラーゲンがhiPSCに対して糸状仮足の伸長を誘導するメカニズムの検討。光学顕微鏡像。試薬（VU6015929、メレスチニブまたはDDR1-IN-1のみ）を1または10 μg/ウェルの濃度で使用または使用しないiMatrix-511またはアテロコラーゲンコートウェルに15M66細胞を2.5×104細胞/ウェルで播種後3日経過したもの。スケールバー＝100 μm。 PES素材の中空糸膜をアテロコラーゲンでコーティングしたバイオリアクターでhiPSCを培養した。アテロコラーゲンをコーティングしていないPES膜（A、左パネル）、またはアテロコラーゲンをコーティングしたPES膜（A、右パネル）に接着した15M66細胞（白矢印）の光学顕微鏡画像（400倍）。PES素材の中空糸膜を用いたバイオリアクターを有する自動細胞培養装置の写真（B）。5×105cells/wellの15M66細胞をポリエーテルスルホン（PES）製中空糸膜バイオリアクターに播種後4日目にコラゲナーゼで細胞剥離し、回収した細胞の光学顕微鏡像（C）。アテロコラーゲンでコーティングしたPES製中空糸膜バイオリアクターに15M66細胞を5×105cells/well播種後、4日目にコラゲナーゼによる細胞剥離で回収した細胞のmRNA解析結果(D)。未分化細胞マーカーの発現（D）、多能性マーカーの維持（E）、幹細胞マーカーとの相関（F）、分化マーカー（G）。n = 1。 アテロコラーゲンでコーティングしたPES製中空糸膜を用いたバイオリアクターで培養したhiPSCの観察。中空糸内側（IC）および中空糸外側（EC）切片にヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を適用した。hiPSCのコロニー（黒矢印）。スケールバーは指定した長さを示す。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
１．幹細胞増殖促進剤
　後述の実施例で示される通り、アテロコラーゲンを含有する足場材料を用いることで、体細胞から多能性幹細胞を効率よく製造することができ、また幹細胞を効率よく増殖させることができた。したがって、アテロコラーゲンを含有する足場材料を含む、（多能性）幹細胞増殖促進剤（以下、「本発明の剤」と称することがある。）が提供される。いかなる理論にも拘束されることはないが、アテロコラーゲンを含有する足場材料による上記効果は、幹細胞や分化細胞などの細胞がアテロコラーゲンに接着することにより、浮遊培養におけるせん断応力による細胞死が抑制された結果であると推測される。したがって、アテロコラーゲンを含有する足場材料を含む、細胞死抑制剤または細胞生存維持剤も提供される。
　本発明の剤は、培地の形態であってもよい。したがって、アテロコラーゲンを含有する足場材料を含む培地（以下、「本発明の培地」と称することがある。）も提供される。本発明の培地等に含まれる、アテロコラーゲンを含有する足場材料は、培地中で遊離することとなる。あるいは、本発明の剤は、体細胞の培養のための培地、幹細胞の培養のための培地、幹細胞の分化誘導のための分化誘導用培地、幹細胞や幹細胞由来分化細胞のための細胞保存液、幹細胞由来分化細胞から作製された臓器のための臓器保存液として用いることもできる。本発明において、培養される細胞は、単一の細胞であってもよいが、典型的には、複数の細胞からなる細胞集団である。したがって、本明細書において、特に断りのない限り、「細胞」には、「細胞集団」が含まれるものとする。細胞集団は、１種類の細胞から構成されていてもよく、２種類以上の細胞から構成されていてもよい。
　また、本発明の剤は、アテロコラーゲンを含有する足場材料を必須の成分として、培地作製用組成物とすることができる。すなわち、本発明の培地における成分の全部ないし一部を組成成分として、これを固形化ないし濃縮溶液とし、溶解や希釈、既存培地に添加するための組成物（培地サプリメント）、液体培地と固形成分のセットなど種々の態様で、本発明における培地を最終的に作製するための組成物とすることができる。
［足場材料］
　本明細書において、「足場材料」とは、スキャフォールドとも呼ばれ、細胞培養において細胞の足場として機能する材料または基材を意味する。本発明に用いるアテロコラーゲンを含有する足場材料は、細胞の浮遊培養に用いることができる（換言すれば、培地中に遊離しても良い）限りに制限されないが、合成樹脂を含有することが好ましい。また、上記足場材料は、アテロコラーゲンからなるものであってもよく、具体的には、アテロコラーゲンを足場材料として適した形状に成形したものが挙げられる。典型的には、本発明で用いる足場材料は、ナノファイバー以外の材料である。
　合成樹脂は、重合性モノマー（以下、単に「モノマー」ともいう）を重合（重縮合も含む）して得られるポリマー（以下、単に「ポリマー」ともいう）を主成分とするものを意味する。上記ポリマーは一種または二種以上の重合性モノマーのコポリマーも含む。あるいは、足場材料は、ガラスやシリコーンなどの無機材料を主成分としたものでもよい。
　上記ポリマーとしては、例えば、（不）飽和炭化水素、芳香族炭化水素、（不）飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、（不）飽和ケトン、芳香族ケトン、（不）飽和アルコール、芳香族アルコール、（不）飽和アミン、芳香族アミン、（不）飽和チオール、芳香族チオール、有機ケイ素化合物の１種以上の重合性モノマーからなるポリマーが挙げられる。
　具体的な上記ポリマーとしては、例えば、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、エポキシ樹脂、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネート、セルロース、デキストラン、ポリペプチド（例：ゼラチン等）などが挙げられる。これらのポリマーは、一種類で用いてもよいし、二種類以上組み合わせて用いてもよい。二種類以上のポリマーを組み合わせる場合は、二種類以上のポリマーを混合して用いてもよいし、二種類以上のポリマーの骨格を化学結合させたポリマーとして用いてもよい。
　足場材料は公知の方法により製造してもよいし、市販品を用いてもよい。市販品としては、例えば、Cytodex-1(GE Healthcare)などが挙げられる。
　典型的には、上記足場材料の表面の全部または一部をアテロコラーゲンで被覆（コーティング）することで、アテロコラーゲンを含有する足場材料を調製することができる。下述の実施例で示されるとおり、多能性幹細胞とアテロコラーゲンとの接着は、多能性幹細胞の表面に存在するインテグリンα2β1と、アテロコラーゲンとの間での相互作用により、多能性幹細胞がアテロコラーゲンに固定されていることが示唆された。よって、足場材料の表面をアテロコラーゲンで被覆する場合には、上記相互作用が生じる程度であれば、被覆部分は足場表面の一部でも十分である。また、被覆に用いるアテロコラーゲンの純度は、特に限定されないが、高純度（例えば、９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）であることが好ましい。マイクロキャリア等の遊離した足場材料の表面と細胞との接着性を向上させる目的で、アテロコラーゲンに加えて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。下述の実施例で示されるように、ネイティブコラーゲンは細胞増殖に対して、阻害的な効果が認められたため、ネイティブコラーゲンは実質的に含まれない（例えば、１０％以下、より好ましく５％以下（例：４％、３％、２％、１％、０％）ことが好ましい。細胞支持用基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。このような細胞支持用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン（または、ラミニンの一部構造体）、およびフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物などが挙げられる（Lancet,2005.365.9471.1636-1641参照）。本明細書において、「純度」とは、特に断らない限り品質の高さ（不純物の混入割合の低さ）を示す指標としての質量パーセント濃度（以下では、「質量パーセント濃度」を単に「濃度」と称する。）を意味するが、混合物（例えば、アテロコラーゲンとその他の細胞支持用基質との混合物など）中の特定成分（例えば、アテロコラーゲン）の濃度を指す場合もある。
　本発明に用いる足場材料の形状は特に限定されないが、例えば、円筒形、長球の形状、球形などが挙げられるが、好ましくは球形である。かかる球形の足場材料としては、具体的には、マイクロキャリアなどが挙げられる。下述の実施例で示される通り、バイオリアクターを用いた培養において、直径が105 μm以下、105～250 μm、250～425 μm、425～600 μmのマイクロキャリアのいずれを用いても、多能性幹細胞が増殖できることが示された。足場材料の大きさも特に限定されないが、マイクロキャリアなどの球形のものを用いる場合には、足場材料の粒径（直径）は、典型的には、50～1000μｍであり、70～700μmであってもよく、100～400μｍであることが好ましい。また、細胞の増殖率の観点から、好適な一態様において、粒径は600 μmである。粒径は、国際規格　ISO 13319「粒度分布の測定-電気的検知帯法」に記載のコールターカウンター法により測定することができる。
　I型コラーゲン分子は、約９５％のらせん(ヘリックス)部分と約５％の非らせん部分(テロペプチド)からできている(図２)。この非ヘリックス部分は抗原性の強い領域であり、プロテアーゼ(タンパク質分解酵素)により切断される。抗原性の強いテロペプチド部分をペプシンなどのプロテアーゼで消化・除去後に高度精製した抗原性の極めて低い天然高分子材料が、足場材料に含有されるアテロコラーゲンである（Matrix, 1992, 12. 274-281参照）。一方で、生体内に存在するコラーゲンは、3本のポリペプチド鎖がらせんを巻いた「3重らせん構造」の不溶性の線維状タンパク質でありNativeコラーゲンとも言われる。本発明に用いるアテロコラーゲンの由来は限定されず、例えば、哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）由来のものなどが挙げられる。異種動物由来成分の混入防止の観点からは、培養する細胞と同一由来のアテロコラーゲンを用いることが好ましい。かかるアテロコラーゲンは公知の方法により製造してもよく、市販品を用いてもよい。例えば、アテロコラーゲンを含む細胞や組織から抽出したコラーゲンや、培養細胞から分泌させたコラーゲンをプロテアーゼで処理してアテロコラーゲンを精製することができる。
［幹細胞］
　本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能および分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等が含まれる。「多能性幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
　多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってよい。
　幹細胞の具体例としては、例えば、筋芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞等へ分化する間葉系幹細胞、ニューロンやグリア細胞へ分化する神経幹細胞、白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等へ分化する造血幹細胞または骨髄幹細胞、スフェロイド状態から胚様体（ＥＢ体）と呼ばれる擬似的な胚の形成を経て様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが知られている胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ES細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：iPS細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎESｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞、骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ａｄｕｌｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等の多能性幹細胞などが挙げられる。上記多能性幹細胞がES細胞またはヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、倫理的な観点からは、胚を破壊することなく作製された細胞であることが好ましい。また、本発明で用いるヒトES細胞は、受精１４日以内のヒト胚から樹立されたものであることが好ましい。
　多能性幹細胞としては、特に、上述のES細胞またはiPS細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Nature,1997.385.810-813、Science,1998.280.1253-1256、Nature Biotechnology,1999.17.456-461、Nature.1998.394.369-374、Nature Genetics.1999.22.127-128、Proc Natl Acad Sci USA.1999.96.14984-14989、Nature Genetics,2000.24.372-376）。
　例えば、ヒトES細胞株であるＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ　ＲＥＳｅｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。また、臨床研究用ヒトES細胞株ＫｔｈＥＳ１１は、京都大学のウイルス・再生医科学研究所から入手可能である。
　iPS細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子またはタンパク質（初期化因子）を導入して得られる、ES細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。iPS細胞として、例えば、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるiPS細胞（Nature Biotechnology,2008.26.101-106）等が挙げられる。初期化因子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎ-Ｍｙｃ、Ｌ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５-２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ-ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、ESｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Nat Biotechnol,2008.26.795-797、Cell Stem Cell,2008.2.525-528、Stem Cells,2008.26.2467-2474、Nat Biotechnol,2008.26.1269-1275、Cell Stem Cell,2008.3.568-574、Cell Stem Cell,2008.3.475-479、Cell Stem Cell,2008.3.132-135、Nat Cell Biol,2009.11.197-203、Nat Biotechnol,2009.27.459-461、Proc Natl Acad Sci USA,2009.106.8912-8917、Nature,2009.461.643-649、Cell Stem Cell,2009.5.491-503、Cell Stem Cell,2010.6.167-74、Nature,2010.463.1096-1100、Stem Cells,2010.28.713-720、Nature,2011.474.225-229に記載の組み合わせが例示される。
　iPS細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学）より入手可能である。また、臨床グレードのiPS細胞の樹立も日本（京都大学病院、京都大学iPS細胞研究所　https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/rESearch/stock.html）、京都大学iPS細胞研究財団　https://www.cira-foundation.or.jp/j/、および米国（ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03434808、ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02056613）や、富士フィルム株式会社の米国子会社FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc.（FCDI社）にて進められており、かかるiPS細胞の樹立及び維持培養に本発明の技術も使われ得る。
　ヒトiPS細胞としてより具体的には、２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７７）、ＨiPS-ＲＩＫＥＮ-１Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００３）、ＨiPS-ＲＩＫＥＮ-２Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００９）、ＨiPS-ＲＩＫＥＮ-１２Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００２９）、ＮiPS-Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０２２３）、および、臨床用iPS細胞、医療用iPS細胞、再生医療用iPS細胞、ｍｙiPS(京都大学iPS細胞研究財団)などを挙げることができる。
　複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞および生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞および脂肪芽細胞等の間葉系の細胞の全て、または、いくつかへの分化が可能な幹細胞、または、その前駆細胞の集団を広義に意味する。
［培地］
　本明細書において、「浮遊培養」とは、細胞または細胞の凝集体が培養液中に浮遊して存在する状態を維持する条件で行われる培養、すなわち細胞または細胞の凝集体と培養容器およびフィーダー細胞（用いられる場合）との間に強固な細胞－基質間結合（cell-substratum junction）および細胞－細胞間結合（cell-cell junction）を作らせない条件での培養を意味する。培地中で遊離した足場材料に細胞が接着することで、該細胞自体も培地中で遊離することとなる。また、「遊離した」または「遊離する」には、培養容器を軽く揺らすと足場材料や足場材料に付着した細胞または細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態も含まれる。また、本発明の培地は、体細胞の培養や、体細胞から製造された幹細胞の培養、および幹細胞からの分化細胞の誘導のために従来から用いられている培地（基礎培地）に、アテロコラーゲンを含有するマイクロキャリア等の遊離した足場材料を単体もしくは組み合わせで添加することにより調製可能である。このような培地としては、例えば、以下を挙げることができる。
　上記基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ培地、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１０、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ-３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８　Ｍｅｄｉｕｍ（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２、Ｐｒｉｍａｔｅ　ES　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＲｅｐｒｏＳｔｅｍ（以上リプロセル株式会社）、ＰｒｏｃｕｌＡＤ（ロート製薬株式会社）、ＭＳＣＢＭ－ＣＤ、ＭＳＣＧＭ－ＣＤ（以上Ｌｏｎｚａ社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ３０２培地（ＳＡＦＣ社）またはＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）、ＲｅｐｒｏＭｅｄＴＭ　iPSＣ　Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル株式会社）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ　ＭＳＣ　Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ株式会社）、ＴESＲ－Ｅ８　(株式会社べリタス)、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ、ＡＫ０３Ｎ（味の素株式会社）およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
　足場材料におけるアテロコラーゲンの濃度（（アテロコラーゲンの質量／アテロコラーゲンを含有する足場材料の質量）×１００）は、細胞に対して細胞死抑制効果を示す濃度である限りにおいて、特に限定されない。このような濃度は、実施例記載の方法および従来公知の方法を用いて当業者が適宜設定することができる。足場材料におけるアテロコラーゲンの濃度は、例えば、０．１％以上（例：０．１％、１％、３％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％またはそれ以上）であり、１００％以下である。足場材料に、アテロコラーゲンを含む細胞支持用基質がコーティングされている場合には、該細胞支持用基質におけるアテロコラーゲンの濃度は、９０％以上（例：９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）である。本発明の一態様において、足場材料は実質的にアテロコラーゲンからなるが、「実質的にアテロコラーゲンからなる」とは、アテロコラーゲンの濃度が１００％の場合だけでなく、１００％に近い濃度（例えば、９５％以上、好ましくは９５．５％以上（例：９６％、９７％、９８％、９９％または１００％））であることを意味する。
　また、培地におけるアテロコラーゲンの濃度も特に制限されず、アテロコラーゲンの濃度を適宜設定することで、細胞の増殖率を制御することも可能となる。培地におけるアテロコラーゲンの濃度は、例えば０．０１～２０％、好ましくは０．０５～５％、より好ましくは０．１～２％である。また、培地におけるアテロコラーゲンの濃度は、０．５％～２０％、１％～１５％または５％～１０％であることも好ましい。
　また、培地には、必要に応じて細胞の生存または増殖に必要な生理活性物質および栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。培養中に添加する方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態によってでもよく、連続的または断続的な添加であってもよい。
　生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ-１、トランスフェリン、アルブミン、補酵素Ｑ１０、各種サイトカイン（インターロイキン類（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、アクチビン等）、各種ホルモン、各種増殖因子（白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ-β等）などが挙げられる。
　栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
　糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　アミノ酸としては、Ｌ-アラニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-アスパラギン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-リジン、Ｌ-メチオニン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシンまたはＬ-バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　ビタミンとしては、ｄ-ビオチン、Ｄ-パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ-イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ-α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
　脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
　さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５～９、好ましくはｐＨ６～８に調整することが望ましい。
　本発明の培地は、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清、ウマ血清）含有培地であっても無血清培地であってもよい。異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないか、培養される細胞と同種動物由来の血清が用いられることが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を含有していてもよい。
　本発明の培地は、血清と同様に、血清代替物についてもこれを含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミンおよび組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリンまたは他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-メルカプトエタノール、３’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。血清代替物の具体例として、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ［ＫＳＲ］（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉes社）などが挙げられる。また、生体由来因子としては、多血小板血漿(PRP)、ヒト間葉系幹細胞の培養上清成分などが挙げられる。
［細胞保存液や臓器保存液］
　臨床で汎用されてきた細胞保存液や臓器保存液としては、University of Wisconsin臓器保存液(UW液)、HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)、histidine-tryptophan-ketogluta- rate(HTK)液、Euro-Collins液、Celsior液、ET-Kyoto液、IGL-1液、EP-TU液などが挙げられる。
２．幹細胞の製造方法
　別の態様において、本発明は、本発明の培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、幹細胞の製造方法（以下、「本発明の幹細胞の製法」と称することがある。）を提供する。本発明の培地中で幹細胞を培養することで、幹細胞の自己再生能により、幹細胞が増殖する（すなわち、幹細胞が製造される）。したがって、本発明の培地中で幹細胞を浮遊培養する工程を含む、幹細胞の増殖方法（あるいは維持培養方法）も提供される。下述の実施例で示されるとおり、本発明の製造方法により作製した多能性幹細胞は、本発明の培地中で少なくとも８継代以上浮遊培養してもその多能性（換言すれば、三胚葉系列すべてに分化できる能力）を維持し得るので、維持培養にも好適である。
　また、本発明の幹細胞の製法において、幹細胞が多能性幹細胞である場合、該多能性幹細胞の原料となる細胞（出発細胞）を培養して初期化することで、多能性幹細胞を樹立することができる。したがって、本発明の別の態様において、本発明の培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法（以下、「本発明の多能性幹細胞の製法」と称することがある）または多能性幹細胞の樹立方法が提供される。本明細書において、本発明の幹細胞の製法と本発明の多能性幹細胞の製法の両方が包含されるものとして、「本発明の製法」との用語を用いる場合がある。
　さらに別の態様において、本発明の製法により製造された幹細胞も提供される。
［細胞］
　本発明の多能性幹細胞の製法において、本発明の培地で培養する細胞としては、多能性幹細胞の原料となる細胞（出発細胞）であれば限定されない。例えば、製造される多能性幹細胞がiPS細胞の場合には、出発細胞として、上記初期化因子が導入された体細胞が挙げられる。あるいは、初期化途上の体細胞（例：少なくともOct4を発現する細胞等）であってもよい。本発明の多能性幹細胞の製法に用いる体細胞としては、浮遊性細胞（例：血球系細胞等）であっても接着性細胞であってもよいが、好ましくは浮遊性細胞である。本発明の製法で用いる体細胞としては、例えば、皮膚等の線維芽細胞、皮膚細胞、視覚細胞、脳細胞、有毛細胞、口腔粘膜、肺細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、神経幹細胞、智歯などに由来する間葉系幹細胞、組織幹細胞、組織前駆細胞、血球系細胞（例：造血幹細胞、末梢血単核球細胞（T細胞および非T細胞を含む）、臍帯血細胞等）、上皮細胞、内皮細胞（例：血管内皮細胞）、筋肉細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　初期化因子を体細胞に導入する方法としては、初期化因子がDNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体等のベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション等の手法等、RNAの形態の場合、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション等の手法等、タンパク質の形態の場合、例えば、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法等を挙げることができる。ウイルスベクターを用いた方法としては、レトロウイルスベクターを用いた方法、エピソーマルベクターを用いた方法、IDファーマ社の初期化キット「CytoTune（登録商標）-iPS 2.0」に代表されるようなセンダイウイルスベクターを用いた方法、レンチウイルスベクターを用いた方法、アデノウイルスベクターを用いた方法等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の多能性幹細胞の製法において、体細胞に初期化因子を導入する工程が含まれていてもよい。
　培養される細胞は、分散細胞または非分散細胞であり得る。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、シングルセル、もしくは、数個（典型的に２～５０、２～２０、または２～１０個）の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊性（懸濁）細胞、またはマイクロキャリア等の遊離した足場材料に接着した細胞であり得る。
［培養方法］
　本発明の培地中で細胞を浮遊培養する工程は、培地にアテロコラーゲンを含有する足場材料を予め添加しておき、かかる培地で細胞を浮遊培養する工程であってもよく、あるいは細胞培養中にアテロコラーゲンを含有する足場材料を添加して浮遊培養する工程であってもよい。また、本発明の製法における細胞培養の全期間に亘って本発明の培地中で細胞を浮遊培養してもよく、一部の期間のみ本発明の培地中で細胞を浮遊培養してもよい。例えば、多能性幹細胞を樹立する場合には、多能性幹細胞や初期化途上の接着性細胞が現れる段階でのみ本発明の培地中で細胞を浮遊培養してもよい。また、多能性幹細胞の樹立の初期段階（例えば、初期化因子を導入した体細胞の培養を開始する段階など）から、細胞を本発明の培地中で培養してもよい。また、本発明の製法において、アテロコラーゲンを含有する足場材料が必要なくなった時点で、該足場材料を除去してもよく、あるいは足場材料と細胞とを分離してもよい。具体的には、例えば、０．１％濃度のコラゲナーゼを添加し、３７℃の条件において１時間以上処理することでアテロコラーゲンは溶解することが知られているため、本発明の製法において、任意のタイミングでコラゲナーゼを培地に添加するか、あるいはコラゲナーゼを含む培地と培地交換をしてもよい。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養容器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養容器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、またはローラーボトルが挙げられる。さらに、浮遊培養用の容器としてバイオリアクターが例示される。これらの培養容器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
　浮遊培養は、例えば前記の各種容器に細胞を播種し、容器を適切な方法で搖動もしくは振とうするか、あるいは容器中の培地を撹拌して実施することができる。あるいは、浮遊培養は、バイオリアクターや自動培養装置などの培養装置を用いて行うこともできる。具体的には、細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うことができる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞に供給する手法として、流加培養、連続培養および灌流培養があるが、いずれの手法も本発明の製法に用いることができる。また、バイオリアクターや自動培養装置に用いられる培養容器には、開閉が容易で外界との接触面積が大きい開放系培養容器（例えば蓋を有する培養容器）と、開閉が容易ではなく外界との接触面積の小さい閉鎖系培養容器（例えばカートリッジ型培養容器）があるが、いずれの培養容器も本発明の製法に用いることができる。
　浮遊培養の容器として撹拌子を備えたバイオリアクターを用いる場合、回転数は適宜設定することができる。特に限定されないが、バイオリアクターの回転数としては１０～１００ｒｐｍが例示され、５ｍＬバイオリアクターの回転数としては８０～１００ｒｐｍ、１００ｍＬバイオリアクターの回転数としては３０～５０ｒｐｍ、５００ｍＬバイオリアクターの回転数としては１０～３０ｒｐｍが例示される。
　細胞の培養密度は、細胞が増殖できる限り特に限定されない。好ましくは１．０×１０１～１．０×１０９細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０２～１．０×１０９細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは１．０×１０３～１．０×１０９細胞／ｍｌ、最も好ましくは３．０×１０４～１．０×１０９細胞／ｍｌである。
　幹細胞をマイクロキャリア等の遊離した足場材料上で接着培養を行う場合、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Fourth Edition(Cold Spring Harbor Laboratory PrESs,2014)、Gene Targeting: A Practical Approach(Oxford University PrESs,1993)、Proc Natl Acad Sci USA,1981.78.12.7634-7638、 Nature,1981.292.5819.154-156、J.Virol,1969.4.5.549-553、Science,1996.272.5262.722-724、J Cell Physiol,1982.112.1.89-95、国際公開ＷＯ２００１／０８８１００号、国際公開ＷＯ２００５／０８０５５４号参照）。
　本発明の製法において、一部の細胞がマイクロキャリア等の遊離した足場材料から遊離していても良く、幹細胞の浮遊培養の態様としては、担体上での浮遊培養（J Biotechnol,2007.132.2.227-236)またはメチルセルロースなどの高分子ポリマーを用いた浮遊培養(Stem Cell Reports,2014.2.5.734-745）などが挙げられる。
　幹細胞の浮遊培養としては、幹細胞の分散培養および幹細胞の凝集浮遊培養が挙げられる。幹細胞の分散培養との用語は、懸濁された幹細胞を培養することをいい、シングルセル、もしくは、数個（例、２～２０個）の幹細胞からなる小さな細胞塊の分散培養が挙げられる。分散培養を継続した場合、培養された分散細胞がより大きな幹細胞塊を形成し、その後凝集浮遊培養が実行され得る。このような凝集浮遊培養としては、胚様体培養法（Curr Opin Cell Biol,1995.7.6.862-869参照）、ＳＦＥＢ法（Nature Neuroscience,2005.8.3.288-296、国際公開ＷＯ２００５／１２３９０２号）、メッシュフィルターを用いて機械的処理により細胞株を継代させるスフェア培養法（Stem Cell Reports,2014.2.5.734-745)が挙げられる。
　温度、溶存ＣＯ２濃度、溶存酸素濃度およびｐＨなどの培養条件は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３０～４０℃、好ましくは３７℃であり得る。臓器保存液や細胞保存液を用いる温度は０℃～室温、好ましくは０℃～４℃であり得る。溶存ＣＯ２濃度は、１～１０％、好ましくは２～５％であり得る。酸素分圧は、１～１０％であり得る。培養日数も、幹細胞が製造される限り特に限定されないが、通常２日以上、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上である。培養期間の上限も特に制限されないが、通常３０日以下、好ましくは２５日以下である。
　基礎培地、生理活性物質や栄養因子などの内容は、「１．幹細胞増殖促進剤」の内容が全て援用される。
３．分化細胞の製造方法
　上述の通り、アテロコラーゲンを含有する足場材料は、幹細胞や分化細胞などの細胞に対して、細胞死抑制効果を有し得る。よって、本発明の剤または培地は、幹体細胞から分化細胞を製造する際にも用いることができる。したがって、本発明の培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、分化細胞の製造方法（以下、「本発明の分化細胞の製法」と称することがある。）も提供される。本発明の分化細胞の製法において、本発明の培地で培養する細胞は、幹細胞（本発明の製法により製造された幹細胞を含む）であってもよく、また分化誘導後の細胞（例：分化細胞の前駆細胞などの分化途上の細胞）であってもよく、さらには分化細胞であってもよい。
　本発明の分化細胞の製法の一態様において、
　（１）本発明の製法により製造された幹細胞を準備する工程または本発明の製造により幹細胞を製造する工程、
　（２）該準備された細胞を分化誘導用培地中で培養する工程、および
　（３）該培養された細胞を本発明の培地中で細浮遊培養する工程
を含む、分化細胞の製造方法
が提供される。
　さらに別の態様において、本発明の分化細胞の製法により製造された分化細胞も提供される。
　本発明の培地中で細胞を浮遊培養する工程は、培地にアテロコラーゲンを含有する足場材料を予め添加しておき、かかる培地で細胞を浮遊培養する工程であってもよく、あるいは細胞培養中にアテロコラーゲンを含有する足場材料を添加して培養する工程であってもよい。また、本発明の分化細胞の製法における細胞培養の全期間に亘って本発明の培地中で細胞を浮遊培養してもよく、一部の期間のみ本発明の培地中で細胞を浮遊培養してもよい。例えば、本発明の分化細胞の製法において、アテロコラーゲンを含有する足場材料が必要なくなった時点で、該足場材料を除去してもよく、あるいは足場材料と細胞とを分離してもよい。具体的には、例えば、０．１％濃度のコラゲナーゼを添加し、３７℃の条件において１時間以上処理することでアテロコラーゲンは溶解することが知られているため、本発明の製法において、任意のタイミングでコラゲナーゼを培地に添加するか、あるいはコラゲナーゼを含む培地と培地交換をしてもよい。
　本発明の分化細胞の製法で製造される分化細胞としては、特に制限されず、例えば、骨芽細胞、神経細胞、肝細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、心筋細胞、上皮細胞、網膜色素上皮細胞、樹状細胞等の免疫細胞等が挙げられる。
　一態様において、本発明の培地中で細胞を浮遊培養する工程は、幹細胞を、アテロコラーゲンを含有する足場材料を含む分化誘導用培地中で浮遊培養する工程である。幹細胞の分化誘導は、例えば心筋細胞の分化誘導プロセスでは、培地（例えば、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に０．５ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ-４を添加し、１日後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ-４、１０ｎｇ／ｍｌ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した物に交換し、４日目後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ　Ｄｋｋ１を添加した物に交換し、８日目後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ　Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した物に交換することで自律的な拍動を伴う心筋細胞を確認できる。臨床試験の例では、ヒトES細胞由来の心筋前駆細胞（（ＣＤ１５＋、Ｉｓｌ－１＋）ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）をフィブリンバッチへ封入したシートなどが報告されている(ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２０５７９００）。また、大阪大学の澤芳樹教授らのグループは、iPS細胞由来心筋細胞をシート状に培養し心不全患者の心臓に貼って機能の再生を促す「心筋シート」の開発および臨床応用を進めており（http://www2.med.osaka-u.ac.jp/surg1/technology/regenerative-medicine/）、同手法に対して本発明を用いて培養された細胞も使われ得る。さらに、病態の解明を目的とした活動としては、患者由来の心疾患モデルiPS細胞（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２４１３４５０）を用いた心疾患のリスク評価（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１５１７４２５、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８６５９８１）などの例も報告されており、同方法に対して本発明を用いて培養された細胞も使われ得る。
　また、例えば、軟骨細胞の分化誘導プロセスでは、培地（９０％αＭＥＭ培地、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ　Ｌ-グルタミン、０．１μMのデキサメタゾン）中で、間葉系幹細胞を培養することによって行うことができる。さらに、例えばレチノイン酸などの分化誘導剤を培地に添加することにより、幹細胞を神経系細胞などに分化させることが可能となる。分化誘導剤には、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸なども用いることができる。血小板分化誘導プロセスの過程で必要となる巨核球の形成には、血清含有培地（２０％ＦＣＳ）において誘導された胚葉体を経て、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）および幹細胞因子（ＳＣＦ）等の因子が使用され得る。
　培養容器、出発細胞の幹細胞、細胞の培養密度、培養条件、培養容器や培養装置、浮遊培養の様態などの内容は、「１．幹細胞増殖促進剤および２．幹細胞の製造方法」の内容が全て援用される。この場合において、「本発明の製法」は「本発明の分化細胞の製法」と、本発明の培地で培養される「幹細胞」は「幹細胞、分化誘導後の細胞または分化途上の細胞」と、製造される「幹細胞」は「分化細胞」と読み替えるものとする。
　また、分化細胞の製法は、一気通貫型システムにより行ってもよい。例えば、本発明の製造により製造された幹細胞を、足場材料に接着された状態で浮遊培養により拡大培養を行い、さらに、接着状態が維持されたまま分化誘導用培地中で浮遊培養することで、足場材料上で、連続して細胞を増殖および分化させることもできる。
４．細胞医薬組成物
　本発明はまた、本発明の製法または本発明の分化細胞の製法により製造された幹細胞または分化細胞（以下、「本発明の細胞」と称することがある。）を含有してなる、細胞医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称することがある。）を提供する。本発明の細胞は、分散された細胞、所定形状の細胞塊を形成した細胞集団、あるいは組織構造や小器官を形成した分化細胞集団（バイオ3Dプリンターを用いた組織構築など）であり得る。細胞医薬組成物は、再生医療用の細胞ソースのために利用され得るため、本発明の医薬組成物は、例えば、細胞移植療法に用いることができる。また、本発明の細胞の有効量を治療または予防の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与または移植する、疾患の治療または予防方法も、本発明に包含される。本発明の細胞は、足場材料から単離されたものを用いてもよい。また、足場材料が、移植により生体に重篤な影響を与えないもの（例えば、高純度のアテロコラーゲンのように、生体内により分解されるものなど）である場合には、細胞に足場材料に接着されたままの状態で、移植療法に用いることもできる。
　本発明の細胞を、細胞移植療法に用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したiPS細胞に由来する細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座或いはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。上記細胞が、疾患の患者由来の細胞である場合には、例えば、ゲノム編集（例:CRISPRシステム、TALEN、ZFN等）などの手法を用いて、疾患の原因となる遺伝子の変異を予め修復しておくことが好ましい。年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコーンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。
　本発明の細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。したがって、一態様において、本発明の細胞を製剤化する工程を含む、細胞医薬組成物の製法も提供される。かかる製法は、（１）本発明の製法により製造された幹細胞を準備する工程もしくは本発明の製法により幹細胞を製造する工程、および／または（２）本発明の分化細胞の製法により製造された分化細胞を準備する工程もしくは本発明の分化細胞の製法により分化細胞を製造する工程、を含んでいてもよい。さらに、幹細胞または分化細胞を保存する工程を含むことができる。
　当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。本発明の医薬組成物を水性懸濁液剤として製剤化する場合、例えば、上記水性液に約1×106～約1×108細胞/mLとなるように、細胞を懸濁させればよい。また、本発明の細胞または医薬組成物の投与量または移植量および投与回数または移植回数は、投与される哺乳動物の年齢、体重、症状などによって適宜決定することができる。
　本発明の医薬組成物は、細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清若しくはその代替物、有機溶剤（例、DMSO）等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清若しくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1～約30%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0～約50%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。
　以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（材料および方法）
　下記の実施例では、実施例中に方法が記載されているものを除き、以下の材料を用い、または以下の方法により実験を行った。
　＜試薬＞
　StemFit AK03Nは、味の素ヘルシーサプライ株式会社(東京、日本)から入手した。iMatrix-511は、株式会社マトリクソーム(大阪、日本)から入手した。CHIR 99021（CT 99021）は、Axon Medchem LLC(レストン、バージニア州、USA)から入手した。10-mmol/L Y-27632溶液、D-PBS(-)、および0.5 mol/l-EDTA溶液(pH 8.0)は、ナカライテスク(京都、日本)から入手した。RPMI 1640培地、インスリンを除いたB-27TM、TrypLTM Select Enzyme (1X)、GlutaMAXTM サプリメント、トロポニンT、Cardiac Isoform Ab-1 (Clone 13-11)、PSC心筋細胞分化キット、およびPSC神経細胞誘導培は、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社(神奈川、日本)より入手した。100 x 非必須アミノ酸(NEAA)は、MP Biomedicals, LLC(アーバイン、カリフォルニア州、USA)から入手した。組換えヒトアクチビンAは、BioLegend, Inc.(サンディアゴ、カリフォルニア州、USA)から入手した。組換えヒトBMP-4は、PeproTech(クランベリー、ニュージャージー州、USA)から入手した。Kyoto Probe 1(KP-1)は、五稜化薬株式会社(札幌、日本)から入手した。ヒトGloLIVE TRA-1-60(R) NorthernLightsTM NL557をコンジュゲートした抗体は、R&D Systems, Inc.(ミネアポリス、ミネソタ州、USA)から入手した。ペプチド-GFOGERバイオインクは、Sigma-Aldrich Co. LLC(セントルイス、ミズーリ州、USA)から入手した。アテロコラーゲン酸性溶液(5 mg/mL、pH 3.0)およびコラーゲン(アテロコラーゲン)マイクロスフェアは、株式会社高研（東京、日本）から入手した。低濃度のSynthemax（登録商標） IIマイクロキャリア、10 gバイアルは、Corning（コーニング、ニューヨーク州、USA)から入手した。GLS250ゼラチン溶液(1.0 mg/g)は、新田ゼラチン株式会社(大阪、日本)から購入した。Cytodex（登録商標） 1 ガンマおよびCytodex（登録商標） 3 ガンマは、GE Healthcare Bio-Sciences AB(ウプサラ、スウェーデン)から入手した。CultureSure（登録商標）DMSOは、富士フイルム和光純薬株式会社(東京、日本)から入手した。PESメンブレンは、Terumo Blood and Cell Technologies(レイクウッド、コロラド州、USA)から入手した。TC-I 15は、Tocris Bioscience（ブリストル、イングランド）から入手した。GPアンタゴニスト-2A、NF023、NF449、およびSB 225002は、Calbiochem (サンディエゴ、カリフォルニア州、USA)から入手した。Dihydromunduletoneは、MedChemExpress LLC (モンマス・ジャンクション、ニュージャージー州、USA)から入手した。VU6015929、メレスチニブ(LY2801653)およびDDR1-IN-1は、Selleck Chemicals LLC(ヒューストン、テキサス州、USA)から入手した。
＜hiPSCの維持培養＞
　hiPSC系統の201B7および15M66は、山中伸弥(京都大学iPS細胞研究財団)によって樹立されたものであり、京都大学iPS細胞研究財団(京都、日本)から入手した。iPSCの培養には、公開されている方法(CiRA_Ff-iPSC_protocol_Eng_v140310)を使用した(https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/Ff-iPSC-culture_protocol_E_v140311.pdf)。ABLE 5 mL Disposable Bioreactor およびABLE Bioreactor Magnetic Stir System Base 5 mLは、エイブル(東京、日本)から入手した。Quantum（テルモBCT）の操作手順は、製造元の説明書に従い、標準プロトコルで行った。バイオリアクターのコーティング材は、100 mLのアテロコラーゲン酸性溶液(5 mg/mL、pH 3.0)(株式会社高研、東京、日本)であった。HE染色は株式会社バイオ病理研究所(大分、日本)で行った。
＜細胞分化アッセイ＞
・心筋細胞への分化
　心筋細胞への分化を誘導するために、製造元の説明書（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に従って、hiPSCを、6ウェルプレート内のStemFit AK03N培地中で培養し、PSC心筋細胞分化キットを使用して、担体上でコンフルエントになるまで培養した。
・胚体内胚葉への分化
　胚体内胚葉への分化を誘導するために、hiPSCを、6ウェルプレート内のStemFit AK03N培地中でコンフルエントになるまで培養した。胚体内胚葉への分化誘導は、既報のプロトコル（Si-Tayeb, K. et al., Hepatology 51, 297-305 (2010)）に従った。
・神経前駆細胞への分化
　神経前駆細胞への分化を誘導するために、製造元の説明書（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に従って、hiPSCを、6ウェルプレート内のStemFit AK03N培地中で培養し、PSC神経細胞誘導培を使用して、担体上でコンフルエントになるまで培養した。
＜細胞増殖アッセイ＞
　細胞増殖は、Countess（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定した。
＜ヒト単核細胞の維持培養＞
　日本人ドナーの、精製および特徴付け済みの正常なヒトPBMC(10M 細胞/バイアル)は、富士フイルム和光純薬株式会社から入手した。ヒト単核細胞用培地を調製するため、幹細胞因子/c-Kitリガンド(SCF; 終濃度 50 ng/mL)、トロンボポエチン(TPO; 終濃度 10 ng/mL)、Flt3L(終濃度 20 ng/mL)、IL-6(終濃度 50 ng/mL)、IL-3(20 ng/mL)、およびG-CSF(10 ng/mL)を、StemFit AK03N(味の素ヘルシーサプライ株式会社、東京、日本）のA液とB液の混合液に添加した。
　次のプロトコルは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を培養する方法であり、本発明者らの研究所で通常行われる手順の簡単な説明である。(1) 正常ヒトPBMCの凍結バイアルを、37 ℃のウォーターバス内で1分間解凍する。(2) StemFit AK03NのA液とB液の混合液5 mLにPBMCを溶解し、サンプルを遠心分離する(22℃で5分間、440 g)。(3) 上清を除去した後、ヒト単核細胞用培地1 mLを加えて混合し、細胞数を数える。本実施例の場合、ヒト単核細胞用培地に合計3 x 106細胞/mLを添加した。(4) 1 mL/ウェルのボリュームで24ウェルプレート内に細胞を播種する。(5) 37℃、5% CO2で細胞を5日間インキュベートする。
＜hiPSC樹立プロトコル＞
　hiPSCは、TOKIWA-Bio SRV iPS-1 Vector、TOKIWA-Bio SRV iPS-2 Vector、TOKIWA-Bio SRV iPS-3 VectorおよびTOKIWA-Bio SRV iPS-4 Vectorを使用して、製造元の説明書(ときわバイオ株式会社)に従い樹立した。簡単に説明すると、1×105 個の細胞をマイクロチューブに分注し、遠心分離した(300 g×5分)。上清を除去した後、キットに含まれているベクターを10 μL添加した。次いで、別の10 μLのヒト単核細胞培養培地を加え、溶液を37℃で2時間インキュベートした。遠心分離を繰り返し（300 g × 5 分）、続いてヒト単核細胞培養培地を使用して3回洗浄した。次いで、ヒト単核細胞培地を用いた培養を開始し、培養1、3、5、および7日目に2/3容量のStemFit AK03N培地を添加した。培養開始後9、11、13日目に、StemFit AK03N培地で培地を交換した。培養15日目から細胞継代およびコロニーピッキングを行った。
　hiPSCは、CytoTune（登録商標）-iPS 2.0ベクターを使用して、製造元の説明書(株式会社IDファーマ、東京、日本)に従って樹立した。簡単に説明すると、1×105個の細胞をマイクロチューブに分注し、遠心分離した(300 g × 5 分)。キットに付属されたデータシートに従い、キットに同封されているベクターである、7.14 μLのTube KOS(オレンジ色のキャップ)、6.66 μLのTube KLF4(赤色のキャップ)、10.00 μLのTube C-MYC(白色のキャップ)を、2 mLのヒト単核細胞用培地に添加した。次いで、合計1 × 105個の細胞を6ウェルプレート上に播種した。各種ベクターを添加したヒト単核細胞培地で培養を開始した（MOI=5）。次に、2/3容量のStemFit AK03N培地を、培養1、3、5、および7日目に加えた。培養9、11、13日目に、培地をStemFit AK03N培地に交換した。培養15日目から細胞継代およびコロニーピッキングを行った。
＜リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および定量的PCR(qPCR)アレイ＞
　製造元の説明書に従って、定量的PCR用のSuperPREP II Cell Lysis & RT Kit(東洋紡株式会社、大阪、日本)を使用して、RNAを調製した。リアルタイムPCRを、StepOnePlusシステム(Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州、USA)を用いて実行した。Luna Universal qPCR Master Mix(New England Biolabs Inc.、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、USA)を、製造元の説明書に従って使用した。mRNA発現解析のため、TaqMan Array 96-Well FAST Plate(Human Stem Cell Pluripotency、Applied Biosystems)を使用した。TaqManTM Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific)は、製造元の説明書に従って使用した。
　発現は、ΔΔCt法を使用して計算した。標的遺伝子の発現を、ハウスキーピング遺伝子の発現によって補正した。ヒトβ-アクチン、OCT3/4、NANOG、SOX2、ブラキウリ(T)、NKX2.5、トロポニンT(cTnT)、SOX17、FOXA2、HNF4A、PAX6、MAP2、SOX1、CDH1、CDH2、インテグリンα5およびインテグリンβ1用のプライマーを設計した。遺伝子名は、米国国立医学図書館NIHウェブサイト(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)から取得した。ヒトβ-アクチン、OCT3/4、NANOG、SOX2、ブラキウリ(T)、NKX2.5、トロポニンT(cTnT)、SOX17、FOXA2、HNF4A、PAX6、MAP2、SOX1、CDH1、CDH2、インテグリンα5、およびインテグリンβ1は、Primer 3 Plusアプリケーション(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)を使用して設計した。他のプライマーは、タカラバイオ株式会社（滋賀、日本）から購入した。
　PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
＜未分化ES細胞＞
ヒトOCT3/4 (NM_002701.4) 144 bp 
(フォワード) GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG （配列番号１）
(リバース) CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC （配列番号２）
ヒトNANOG (NM_024865.2) 391 bp 
(フォワード) CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC （配列番号３）
(リバース) CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC （配列番号４）
ヒトSOX2 (NM_003106.2) 151 bp 
(フォワード) GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG （配列番号５）
(リバース) TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG （配列番号６）
<中胚葉>
ヒトブラキウリ (T) (NM_001270484.1) 211 bp 
(フォワード) GCTGAACTCCTTGCATAAGTATGAG （配列番号７）
(リバース) CATCTCTTTGTGATCACTTCTTTCC （配列番号８）
ヒトNKX2.5 (NM_001166175.1) 221 bp 
(フォワード) GAAATTTTAAGTCACCGTCTGTCTC （配列番号９）
(リバース) AGTAATGGTAAGGGATCCTCGTG （配列番号１０）
ヒトトロポニンT (cTnT) (NM_001001432.1) 238 bp 
(フォワード) ATGAGCGGGAGAAGGAGCGGCAGAAC （配列番号１１）
(リバース) TCAATGGCCAGCACCTTCCTCCTCTC （配列番号１２）
<内胚葉>
ヒトSOX17 (NM_022454.3) 608 bp 
(フォワード) CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG （配列番号１３）
(リバース) TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG （配列番号１４）
ヒトFOXA2 (NM_153675.2) 216 bp 
(フォワード) TGGGAGCGGTGAAGATGGAAGGGCAC （配列番号１５）
(リバース) TCATGCCAGCGCCCACGTACGACGAC （配列番号１６）
ヒトHNF4A (NM_000457.4) 239 bp 
(フォワード) GAACAGGAGCTCTTAACTACAGTGG （配列番号１７）
(リバース) CTGTCAAGAGTCATGAATTCTCCTT （配列番号１８）
<外胚葉>
ヒトPAX6 (NM_001604.4) 317 bp 
(フォワード) ACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAG （配列番号１９）
(リバース) ATGGTGAAGCTGGGCATAGGCGGCAG （配列番号２０）
ヒトMAP2 (NM_001039538.1) 212 bp 
(フォワード) CAGGTGGCGGACGTGTGAAAATTGAGAGTG （配列番号２１）
(リバース) CACGCTGGATCTGCCTGGGGACTGTG （配列番号２２）
ヒトSOX1 (NM_005986.3) 158 bp 
(フォワード) ACTCTCTCTGAGGTTCTTTGACTGA （配列番号２３）
(リバース) AGCTTTTCATAGTCTGTGCCTCTAA （配列番号２４）
<上皮マーカー遺伝子>
ヒトカドヘリン1 (CDH1) (NM_004360.4) 191 bp 
(フォワード) GCCACATCTTGACTAGGTATTGTCT （配列番号２５）
(リバース) GCAGCACTTTAGGCACTATTCTAAG （配列番号２６）
HA324529 (TJP1) 
(フォワード) GCACGGGCATTGTTTAATGTC （配列番号２７）
(リバース) GGATTCAGTCCACAAAGGTGTTTAC （配列番号２８）
HA380619 (MUC1) 
(フォワード) GAACTACGGGCAGCTGGACA （配列番号２９）
(リバース) CTGCCACCATTACCTGCAGAA （配列番号３０）
HA265338 (COL4A1) 
(フォワード) CCAGGATTTATAGGCGAAATTGGA （配列番号３１）
(リバース) CATCTCTGCCAGGCAAACCTC （配列番号３２）
HA346490 (SDC1) 
(フォワード) GGATCAGAGATGCACCACCM （配列番号３３）
(リバース) CCAGCAGATGAGCATGGTCAG （配列番号３４）
<間葉系マーカー遺伝子>
ヒトカドヘリン2 (CDH2) (NM_001792.4) 219 bp 
(フォワード) AGTGTTCCCAAGACAATTCAGTAAG （配列番号３５）
(リバース) GGGTTGATAATGAAGATACCAGTTG （配列番号３６）
HA283325 (VIM) 
(フォワード) AACCTGGCCGAGGACATCA （配列番号３７）
(リバース) TCAAGGTCAAGACGTGCCAGA （配列番号３８）
HA333211 (FN1) 
(フォワード) GGCCAGATGATGAGCTGCAC （配列番号３９）
(リバース) GGAGCAAATGGCACCGAGATA （配列番号４０）
ヒトインテグリンα5 (NM_002205.4) 229 bp 
(フォワード) CTGCTACCTCTCCACAGATAACTTC （配列番号４１）
(リバース) GATCAGGTACTCGGGGTAATAAGAT （配列番号４２）
ヒトインテグリンβ1 (NM_002211.3) 179 bp 
(フォワード) CTGAAGACTATCCCATTGACCTCTA （配列番号４３）
(リバース) GCTAATGTAAGGCATCACAGTCTTT （配列番号４４）
HA328103 (SNAI1) 
(フォワード) CCAGTGCCTCGACCACTATG （配列番号４５）
(リバース) TTAGAGTCCTGCAGCTCGCTGTA （配列番号４６）
<Rhoファミリータンパク質シグナル伝達因子>
HA311735 (CDC42) 
(フォワード) TTGACTTCTGGGTCTTAAACTGCTG （配列番号４７）
(リバース) CCATGGTGGGTCTGGAACTC （配列番号４８）
HA339862 (WASL)
(フォワード) GGAGTTCAGTCCAGGCATGAAG （配列番号４９）
(リバース) TGCTCACAGTGCAGGATGGTAG （配列番号５０）
HA356749 (RAC1) 
(フォワード) CCTGTAGTCGCTTTGCCTATTGA （配列番号５１）
(リバース) AGGGTCCCACGCTGTATTCTC （配列番号５２）
HA342384 (CYFIP1) 
(フォワード) TCCTGACGGACCACATCCTG （配列番号５３）
(リバース) TCGGCCTCAATTTCGTCGTA （配列番号５４）
HA349400 (DIAPH1) 
(フォワード) CCAGCTTCTGCCACGCTTTA （配列番号５５）
(リバース) CCCATAGTCCAGATGAGATGCAC （配列番号５６）
HA390884 (RHOA) 
(フォワード) CAGCTGCMGGTACTCTGGTGA （配列番号５７）
(リバース) CTCTGCCACAGCTGCATGAA （配列番号５８）
HA355736 (ROCK1) 
(フォワード) TGCAACTGGAACTCAACCAAGAA （配列番号５９）
(リバース) GCTGGCCAACTGCATCTGAA （配列番号６０）
HA359025 (ROCK2) 
(フォワード) GCAAGTCACTGCCGAGCTTC （配列番号６１）
(リバース) GCTGTCACACAGTGCTTATGTTCA （配列番号６２）
HA271276 (ROCK1P1) 
(フォワード) ACAAATATCACAGGCTTCAGGGTTA （配列番号６３）
(リバース) TGTAGGCAAACCCGCGATA （配列番号６４）
HA102338 (DIAPH3) 
(フォワード) CTCAGAGGCCTGTTCTGAAAGTTTG （配列番号６５）
(リバース) GGCGACTGGAGTCCTTGTTGA （配列番号６６）
HA368551 (PFN1) 
(フォワード) CCATCGTGGGCTACAAGGA （配列番号６７）
(リバース) CAAGTGTCAGCCCATTCACGTAA （配列番号６８）
HA260170 (PFN2) 
(フォワード) GTGTCCACGGAGGCACACTTA （配列番号６９）
(リバース) GGGTTGTTGATGAAGACAGTTGCTA （配列番号７０）
HA118642 (PFN4) 
(フォワード) TGTGTGTAGCATCACCAGGTTTCA （配列番号７１）
(リバース) GGCAAA TCCATTCACCAGTGTTC （配列番号７２）
HA347617 (PFN5P) 
(フォワード) ACCATGTACCTGCGCACCAA （配列番号７３）
(リバース) CTGTCCAATCACCACAAGCCTTA （配列番号７４）
<接着GPCR遺伝子> 
HA339122 (GPRC5A) 
(フォワード) AATTGGAGGTGGCAGCTTCAG （配列番号７５）
(リバース) GGGCCACAGMTTTCCMAGA （配列番号７６）
HA372963 (ADGRG1) 
(フォワード) AGCTGCCTGGTGTCTGCTGTA （配列番号７７）
(リバース) AGCAAGGGCAATGCAGCTC （配列番号７８）
HA251255 (ADGRG2) 
(フォワード) ATGAGGTACATACACTGCCGCTTC （配列番号７９）
(リバース) TGGGCCAGAGTGTACCAGTCATA （配列番号８０）
HA362862 (ADGRL2) 
(フォワード) ATAAATGAGCCGGGCAGCTT （配列番号８１）
(リバース) CCATCAGTCTGCATCATTGATCTT （配列番号８２）
HA352953 (ADGRG6) 
(フォワード) TGGCTCCAGCAGATGATGAGA （配列番号８３）
(リバース) CGTGAAAGCCAAGCTGGGTAA （配列番号８４）
HA161540 (ADGRF4) 
(フォワード) GAGATGCTTTGAGGATGAGGATGTC （配列番号８５）
(リバース) TCCATTGGTTGGGCCTAGTGA （配列番号８６）
<ハウスキーピング遺伝子> 
ヒトβ-アクチン (NM_001101.5) 223 bp 
(フォワード) TGACATTAAGGAGAAGCTGTGCTAC （配列番号８７）
(リバース) CTTCATGATGGAGTTGAAGGTAGTT （配列番号８８）
＜染色分析＞
　KP-1（五稜化薬、北海道、日本）およびAntiTRA-1-60、Mouse-Mono（TRA-1-60）、NL557、GloLIVE（R＆D Systems、Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州、USA）を使用して、ライブ染色を実施した。画像は、BZ-X800蛍光顕微鏡(株式会社キーエンス、大阪、日本)を使用して記録した。
＜統計分析＞
　スチューデントのt検定を使用して統計分析を行い、2つのサンプルの平均を比較した。複数のグループ(3つ以上のグループ)間の比較は、StatPlusソフトウェアプログラム (AnalystSoft、ウォールナット、カリフォルニア州、USA)を使用した一元配置分散分析を使用して実行した。統計学的有意性は、すべてのテストにおいて、*P < 0.05または**P < 0.01と設定した。
［実施例1：iPS細胞の樹立］
　アテロコラーゲンマイクロキャリアおよびコラーゲンマイクロキャリアを用いて、ヒトiPS細胞樹立効率を比較評価した。
（方法）
　ヒトiPS細胞の樹立に用いるヒト単核球はPRECISION社より購入した(Human PBMC 93219, Lot 2010114001)。ヒト単核球の培養法は、「研究用iPS 細胞の樹立プロトコール ver.1.1」（京都大学 iPS 細胞研究財団のホームページより入手可能　https://www.cira-foundation.or.jp/j/research/img/protocol/20210507new_protocol_ver1_1.pdf）に従い実施した。また、センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞樹立のプロトコールは、「SRVTM iPSC-2 Vector を用いたヒト末梢血単核球・単球からのiPS細胞誘導プロトコール(TKB_P-003-02)」（ときわバイオのホームページより入手可能　https://tokiwa-bio.com/jp/wp/wp-content/uploads/2020/12/3_%E3%83%92%E3%83%88%E6%9C%AB%E6%A2%A2%E8%A1%80%E5%8D%98%E6%A0%B8%E7%90%83%E3%83%BB%E5%8D%98%E7%90%83%E3%81%8B%E3%82%89%E3%81%AEiPS%E7%B4%B0%E8%83%9E%E8%AA%98%E5%B0%8E%E3%83%95%E3%82%9A%E3%83%AD%E3%83%88%E3%82%B3%E3%83%AB_02.pdf）に従い実施した。
　具体的には以下の手順により行った。
(1)StemFit AK03(味の素)培地のA,B液混合液に、IL-6(50 ng/mL)、SCF(50 ng/mL)、TPO(10 ng/mL)、Flt3L(20 ng/mL)、IL-3(20 ng/mL)、G-CSF(10 ng/mL)を添加し、顆粒球系細胞用培地を調製する。
(2)ヒト単核球は、1.5×106cell/mLの濃度で24well plate (住友ベークライト MS-80240)の1 wellへ播種し、顆粒球系細胞用培地を用いて培養する。
(3)播種後３日目に細胞を回収し、細胞を1.0×105cell/tube(1.5 mLチューブ)に分注し遠心(300g×5 min×4℃)する。
(4)遠心後に得られた細胞ペレットに、SRV iPSC-2 vector (ときわバイオ S1011694A, Lot T002)を10 μLを添加する。
(5)顆粒球系細胞用培地10 μLを添加する。
(6)CO2インキュベーター(37℃)で2時間静置する。
(7)顆粒球系細胞用培地で洗浄し遠心する(3回繰り返す)。
(8)顆粒球系細胞用培地で培養する。この際に、下記実験条件に示すマイクロキャリアをそれぞれ添加する。
(9)顆粒球系細胞用培地で培養後1日目、3日目、5日目、7日目に、StemFit AK03(味の素)培地のA,B,C液混合液を添加する(2/3量)。
(10)顆粒球系細胞用培地で培養後9日目、11日目、13日目に、StemFit AK03(味の素)培地のA,B,C液混合液で培地交換する。
　マイクロキャリアの実験条件は以下の通りである。
実験条件[1]コラーゲンマイクロキャリア：Cytodex-3(GE Healthcare)(表面に変性したブタ皮膚由来コラーゲンを結合・被覆したデキストランビーズ)を300μg（ビーズ量で10万個相当）/wellの濃度で6 wellへ添加
実験条件[2] アテロコラーゲンマイクロキャリア：Atelocollagen-beads(MIC-00)(細胞培養用マイクロキャリア)（純度95.5%以上）を300μg（ビーズ量で10万個相当）/wellの濃度（約1%）で6 wellへ添加
（結果）
　結果を表1に示す。実験条件[1]では、センダイウイルスベクター感染10日後にwell内の5視野内に確認されたiPS細胞コロニー数は0,0,0,0,0個(平均値0個/視野内)であった。実験条件[2]では、センダイウイルスベクター感染10日後にwell内の5視野内に確認されたiPS細胞コロニー数は1,1,3,1,1個(平均値1.4個/1視野内)であった。また、実験条件[2]では、センダイウイルスベクター感染15日後に、光学顕微鏡(×400)を用いてコロニーが仮足を出すことを確認し生きたiPS細胞コロニーであることを確認した（図１）。細胞を1継代し、12日目にセルカウントを行った結果を記載する。細胞培養用マイクロキャリア表面がコラーゲンの場合には総細胞数：1.76×104 cells/ml、生細胞数：0.00×100 cells/ml (生細胞率：0%)であり生細胞は認められなかった。表面がアテロコラーゲンの場合には総細胞数：6.39×105 cells/ml、生細胞数：4.22×105 cells/ml(生細胞率：66%)であり生細胞が認められた。また、この細胞がiPS細胞であることを確認するために、継代に用いる細胞の1/10量の細胞懸濁液からmRNAを取得し、リアルタイムPCRを行い、iPS細胞マーカーのmRNA発現解析を行った。その結果、OCT3/4(CT値：20.94)、NANOG(CT値：20.93)、SOX2(CT値：21.56)、β-actin(CT値：17.37)であり、iPS細胞マーカーのmRNA発現が確認された。また、iPS細胞の樹立直後においては細胞の初期化を誘導するベクターの残留により細胞の初期化が強く誘導されている可能性もあり得るため、樹立後に6回継代を行い、6継代目の細胞を、今度は、iPS細胞マーカーであるTra-1-60で蛍光免疫染色した(Human GloLIVE TRA-1-60(R) NorthernLightsTM NL557-conjugated Antibody)。その結果、アテロコラーゲン上で樹立された細胞はTra-1-60陽性細胞でありiPS細胞と判断された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果より、細胞培養用マイクロキャリア表面がコラーゲンの場合には３次元環境下におけるiPS細胞樹立はできないが、表面がアテロコラーゲンの場合には３次元環境下におけるiPS細胞樹立が出来ることが明らかとなった。
［実施例２：ヒトiPS細胞の増殖］
　アテロコラーゲンマイクロキャリアを用いた樹立済iPS細胞の増殖を試験した。他方、コラーゲンマイクロキャリア：Cytodex-3(GE Healthcare)では、iPS細胞が樹立出来なかったため、増殖試験は行っていない。一方、樹立済のヒトiPS細胞を用いて、コラーゲンマイクロキャリア：Cytodex-3(GE Healthcare)を用いて、培養実験を行ったが、細胞は増殖しなかった。
（ヒトiPS細胞と培養方法）
　ヒトiPS細胞の培養は、「プロトコール　フィーダーフリーでのヒト iPS 細胞の樹立・維持培養（京都大学iPS細胞研究所）」（https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/rESearch/img/protocol/hiPSprotocolFf_140311.pdf）に従い行った。
実験条件［3］：６ well plate (FALCON 353046)の各 wellへ、Y-27632 (富士フィルムWako) １０ μM濃度を含むStemFit AK03(味の素)５ mLを１.０×１０５cells/mL/wellの濃度のヒトiPS細胞株（15M66）と共に、Atelocollagen-beads(MIC-00)(細胞培養用マイクロキャリア)を300μg（ビーズ量で10万個相当）/wellの濃度で細胞と混合した。播種後6日目まで培地交換は行わなかった。細胞播種６日目に、細胞をトリプシン・EDTAで剥離してセルカウントを行った。
（結果）
　結果を表2に示す。アテロコラーゲンを足場材料とする細胞培養用マイクロキャリアを用いた３次元培養における細胞増殖能は、細胞播種量(１.０×１０５cells)に対して、培養６日目の細胞数の平均値は２.４×１０６cellsであった。この結果は、アテロコラーゲンマイクロキャリアが３次元培養に適する足場材料であることを示す。マウスiPS細胞において、Cytodex-3を用いて培養した場合には、7日間でiPS細胞が4倍しか増殖しなかったことが報告されている（Cytotechnology, 2016. 68. 45-59）ため（しかも増殖はビーズ表面ではなく、ビーズ間の間隙で起こっているようにも見える）、アテロコラーゲンマイクロキャリアでの効果は従来技術の効果よりも顕著なものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例３：ヒトｉＰＳ細胞培養におけるゼラチン、コラーゲン、ラミニン、アテロコラーゲンコートの濃度と配合比率の影響(細胞増殖の評価)］
（方法）
　ヒトｉＰＳ細胞は、２０１Ｂ７を使用し、以下の方法に従い培養した（京都大学ｉＰＳ細胞研究所プロトコールhttps://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/hipsprotocolFf_140311.pdf）。
　コート材料として、次の３種を用いた。
(1)ゼラチン(GLS250、新田ゼラチン、0.1%ゼラチン溶液)
(2)ネイティブコラーゲン(AteloCell（登録商標） IAC-50、高研、5mg/mL（=0.5%）ネイティブコラーゲン酸性溶液)
(3)アテロコラーゲン(AteloCell（登録商標） IPC-50、高研、5mg/mL（=0.5%）アテロコラーゲン酸性溶液)
　6 well plate(住友ベークライト:MS-80060)に対してコート材料の総量を200μL/wellとしセルスクレーパーを用いて均一に塗布後、37℃・5%CO2インキュベータ内で、24時間保持しコートした。コートしたwellは、2 mLのPBSで5分×2回のWashを行った後に、培養に使用した。5×104cells/mL/wellの濃度のヒト人工多能性幹細胞（２０１Ｂ７）をY-27632 (CultureSure（登録商標） Y-27632、富士フィルム和光純薬) 10 μM濃度を含むStemFit培地（AK03、味の素）1.5 mLと共に6well plateの各3 wellへ細胞播種した(n=3)。細胞播種後、1日目、3日目にY-27632を含まない培地を交換した。細胞播種後5日目に細胞をトリプシン・ EDTAで剥離して生細胞数を計測した。
(コート条件：容量％)
(1)ゼラチン100.0%+アテロコラーゲン0.0%
(2)ゼラチン97.4%+アテロコラーゲン2.6%
(3)ゼラチン95.0%+アテロコラーゲン5.0%
(4)ゼラチン90.0%+アテロコラーゲン10.0%
(5)ゼラチン70.0%+アテロコラーゲン30.0%
(6)ゼラチン50.0%+アテロコラーゲン50.0%
(7)ゼラチン30.0%+アテロコラーゲン70.0%
(8)ゼラチン10.0%+アテロコラーゲン90.0%
(9)ゼラチン5.0%+アテロコラーゲン95.0%
(10)ゼラチン0.0%+アテロコラーゲン100.0%
(11)ネイティブコラーゲン100.0%+アテロコラーゲン0.0%
(12)ネイティブコラーゲン97.4%+アテロコラーゲン2.6%
(13)ネイティブコラーゲン95.0%+アテロコラーゲン5.0%
(14)ネイティブコラーゲン90.0%+アテロコラーゲン10.0%
(15)ネイティブコラーゲン70.0%+アテロコラーゲン30.0%
(16)ネイティブコラーゲン50.0%+アテロコラーゲン50.0%
(17)ネイティブコラーゲン30.0%+アテロコラーゲン70.0%
(18)ネイティブコラーゲン10.0%+アテロコラーゲン90.0%
(19)ネイティブコラーゲン5.0%+アテロコラーゲン95.0%
(20)ネイティブコラーゲン0.0%+アテロコラーゲン100.0%
（結果）
コーティング液100mL中に含まれる各コート材料の質量（mg）と、細胞培養開始後5日目の生細胞数[×104]:平均値±標準偏差を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本結果より、アテロコラーゲン100%で、最も細胞増殖が良かった。ゼラチンとの組合せでアテロコラーゲンの含有率が98%未満の場合では生細胞数は播種細胞数と同等もしくは減少した。足場材表面にアテロコラーゲンが存在するとiPSCに対する優れた細胞増殖促進効果が得られるが、他のコート材料が共存すると当該効果が損なわれることが明らかとなった。具体的には、他のコート材料の割合が２％未満であれば、前記効果はおおむね維持されることが示唆された。
［実施例４：アテロコラーゲンビーズによるhiPSCの培養］
　現在、臨床用iPS細胞の製造には樹立からその後の培養まで培養基材を足場材料でコーティングした2D培養が主流であるが、機械化や大量生産を目的とした臨床用iPS細胞の工業化製造では課題がある。2Dと3D培養の特徴を生かしたマイクロキャリアを用いてiPS細の樹立、拡大培養が可能であるか、検証した。
　iMatrix-511(ラミニン511の細胞接着活性部位のリコンビナントペプチド)は、臨床用ヒトiPS細胞(hiPSC)の培養に使用されている最も汎用性の高い培養用足場材である。今回は、iMatrix-511を細胞培養用マイクロキャリアであるCytodex 1（タンパク質吸着性表面処理あり）およびCytodex 3（コラーゲンコーティング）へコーティング（27.6 μl/10ml PBS）したものを使用した。ヒト単核細胞由来株15M66（臨床用hiPSCsの研究株）を、細胞濃度1×105cells/well（6wellプレート）で播種後1、2、3、4、5、6日目に細胞数を取得した。その結果、2種類のiMatrix-511コーティングビーズ上で増殖したhiPSCの数は、コントロールプレート（iMatrix-511コーティングプレート）上に比べて著しく少なく、ほとんど細胞が増殖しないことが判明した（図3A）。iMatrix-511コーティング方法を、試行錯誤を繰り返して何度もテストした。また、足場材料として、iMatrix-511以外のさまざまな材料の有用性も評価した。しかし、ビーズに接着したままhiPSCを培養することはできなかった。そのため、hiPSCが付着できる新しい生体材料を探求した。その結果、フィーダー培養法（Ludwig, T.E. et al., Nat Methods 3, 637-646 (2006)； Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-872 (2007)）で使用されるゼラチンの原料であるコラーゲンから酸処理により抽出されたアテロコラーゲンが、hiPSCの糸状仮足の極端に長い伸長を誘導することを見出した(図11A、上部および下部パネル)。長い仮足は、アテロコラーゲンとhiPSCをテントロープのように固定するのに十分な強度があった。
　iMatrix-511でコーティングしたプレート（9.2 μl/1.5 ml PBS/well [6-well plate]）とアテロコラーゲンビーズ(500 μl/well [6-well plate])を準備した。細胞濃度1×105cells/well（6-well plate）で15M66細胞株を播種した。細胞播種後6日目に、細胞を剥離し、計数した（図3B、左図)(図3B、右図に1日目と6日目の光学顕微鏡画像を示す）。iMatrix-511でコーティングしたプレートで培養した細胞とアテロコラーゲンビーズで培養した細胞は、総細胞数、生細胞数、死細胞数で同程度であった。細胞は、播種翌日から iMatrix-511コーティングプレートとアテロコラーゲンビーズに接着し、その後増殖した。
　次に、最も汎用性の高い3次元培養法であるバイオリアクターを用いて旋回培養（60 rpm）を行った（図3D）。Synthemax II (Corning; 500 μl/reactor; Singleuse bio-reactor [IABLE])とアテロコラーゲンビーズ (500 μl/リアクター)に15M66株の細胞を合計1×105個播種した細胞播種後4日目の光学顕微鏡写真を図3Cに示す。バイオリアクターを用いた旋回培養（60 rpm）条件下で、細胞はSynthemax IIとアテロコラーゲンビーズの両方に付着した。細胞数を図3Fに示す。生細胞と死細胞の数は、Synthemax IIとアテロコラーゲンビーズの両方で培養した細胞間で同等であった。さらに、バイオリアクターを用いて旋回培養（60 rpm）を行った細胞のmRNA発現解析では、未分化マーカーであるOCT3/4とSOX2の発現が、Synthemax IIとアテロコラーゲンビーズの両方で同程度であることが確認された。アテロコラーゲンビーズで培養した細胞におけるNANOGの発現は、Synthemax IIで培養した細胞よりも有意に低かった（図3E）。約300万個/15mlのビーズ濃度からなるアテロコラーゲンビーズと、直径100～400 μmのビーズを混合した。次に、ビーズの大きさがhiPSCの細胞接着や増殖に影響を与えるかどうかを検討した。直径が105 μm以下、105-250 μm、250-425 μm、425-600 μmの4種類のビーズを用意し、15M66株の細胞接着を光学顕微鏡像に示した（図4A）。
　本実施例では、直径105 μmのビーズは、ビーズ間の空間が小さいため、細胞塊に常に圧縮力を及ぼしていると考えられた。15M66株と201B7株は4種類のビーズ直径が105 μm以下、105-250 μm、250-425 μm、425-600 μmで使用され、細胞接着はすべてのサイズのビーズで観察された。細胞はアテロコラーゲンビーズを含むウェルに播種された（500 μl/ウェル［6ウェルプレート］）。細胞播種から5日後に撮影した光学顕微鏡の画像を示す（15M66系統：図4Bの左パネル、201B7系統：図4Cの左パネル）。全細胞、生細胞、および死細胞を数えた（15M66株：図4Bの右パネル、201B7株：図4Cの右パネル）。15M66株と201B7株は、ともに直径の大きなアテロコラーゲンビーズ上では、小さなビーズ上よりも増殖していた。201B7株では、直径600 μmのアテロコラーゲンビーズで培養した細胞数および生細胞数の合計が、直径105 μmのアテロコラーゲンビーズで培養した細胞数よりも有意に多くなっていた。この結果は、ビーズ間の空間量、ビーズ表面の曲率角度、あるいはビーズ間を流れる培地供給量に影響された可能性がある。
［実施例５：アテロコラーゲン上で培養されたhiPSCの未分化能の検証］
　5×104 cells/well (12-well plate)の濃度で15M66細胞を播種し、iMatrix-511コーティングプレート（9.2 μl/well）、アテロコラーゲンコーティングプレート（純度95.5%以上のアテロコラーゲンをプレートに塗布したもの。以下同様。）（200 μl/well)およびゼラチンコーティングプレート上で培養した。細胞はiMatrix-511とアテロコラーゲンでコーティングされたプレートに接着したが、ゼラチンでコーティングされたプレートには接着しなかった（図5A）。iMatrix-511およびアテロコラーゲンコーティングプレート上の細胞は糸状仮足を示し、糸状仮足はiMatrix-511コーティングプレート（図5A左下）よりもアテロコラーゲンコーティングプレート（図5A中央下）で有意により多く観察された。細胞数のカウントは、細胞播種後4日目に行った。15M66細胞では、アテロコラーゲン上で強い糸状仮足の発現が観察された（図5A）。iMatrix-511コーティングプレート上で培養したhiPSCの細胞数をコントロールとして使用した。その結果、アテロコラーゲンおよびゼラチンをコーティングしたプレートで培養した細胞の総数および生細胞数は、コントロールのプレートよりも有意に低いことが示された。しかし、アテロコラーゲンを塗布したプレートで培養した細胞の細胞接着や増殖のレベルは、iMatrix-511を塗布したプレートで培養した細胞の値の約半分にとどまった（図5B）。この結果は、iMatrix-511がアテロコラーゲンよりも、細胞増殖を促進するシグナル伝達経路においてより活性が高いことを示している。
　201B7細胞を5×104 cells/wellの濃度で播種したところ、iMatrix-511でコーティングしたプレートとアテロコラーゲンでコーティングしたプレートにはよく接着したが、ゼラチンでコーティングしたプレートにはほとんど接着しなかった（図6A）。アテロコラーゲンコーティングプレートに接着した細胞は糸状仮足を示さなかった（図6A、下中段）。これらの結果は、アテロコラーゲンに反応した糸状仮足の形成が、細胞の特性によって異なることを示している。iMatrix-511でコーティングしたプレートで培養した細胞の計数を、細胞播種後4日目に行いコントロールとした。その結果、アテロコラーゲンを塗布したプレートで培養した細胞の総数および生細胞数は、iMatrix-511を塗布したプレートで培養した細胞と同程度であったが、ゼラチンを塗布したプレートで培養した細胞の総数および生細胞数はiMatrix-511で培養した細胞より低かった（図6B）。201B7株はアテロコラーゲン上で細胞死を誘導することなく、糸状仮足の発現を抑制していると考えられる（図6B）。
　iMatrix-511コーティングプレート（9.2 μl/well）およびアテロコラーゲンコーティングプレート（1 ml（1 mg/ml）/well）に、15M66細胞を5 × 104 cells/wellの細胞濃度で播種し、5日目に細胞をサンプリングした後、mRNA発現解析用にmRNAを抽出した。TaqMan Human Stem Cell Pluripotency Array (Applied Biosystems, ウォルサム、マサチューセッツ州、USA)(Avilion, A.A. et al., Genes Dev 17, 126-140 (2003)； Chambers, I. et al., Cell 113, 643-655 (2003)；International Stem Cell et al., Nat Biotechnol 25, 803-816 (2007)； Matin, M.M. et al., Stem Cells 22, 659-668 (2004)； Mitsui, K. et al., Cell 113, 631-642 (2003))を用いてmRNA発現レベルを測定した。mRNAの種類は、「未分化細胞での発現」「多能性に分類したリストの維持」「幹性への相関」「分化マーカー」「コントロール」のmRNA発現プロファイルから選択した。まず、未分化状態を解析するために、「幹細胞との相関（図5C）」、「未分化細胞での発現（図5D）」、「多能性維持（図5E）」を解析した。iMatrix-511を塗布したプレートで培養した細胞をコントロールとして、mRNAの発現を色分けした。その結果、アテロコラーゲンコーティングプレート上で培養した細胞は、コントロールに比べてOCT3/4（POU5F1）の発現が高く（図5D、5E）、全体的に未分化な状態であることが示された。
［実施例６：アテロコラーゲン上で培養したhiPSCにおける、分化誘導や上皮間葉転換（EMT）、間葉上皮転換（MET）の検証］
　分化誘導状況を解析するために、「分化マーカー」のリストからヒートマップを作成した（図7A）。iMatrix-511を塗布したプレート上で培養した細胞をコントロールとして、mRNAの発現量を色分けした。アテロコラーゲンコーティングプレートで培養した細胞は、内胚葉マーカーであるAFP、SOX17、Collagen Type I Alpha 1 Chain（COL1A1）の発現量が増加していることが確認された。また、造血幹細胞のみならず末梢血単核細胞（PBMC）に発現することが知られており、ヒト血液由来iPSCで発現が増加することが報告されているHBB (Joehanes, R. et al., Physiol Genomics 44, 59-75 (2012))の発現も増加し、外胚葉マーカーであるKRT1の発現も増加した（図7A）。
　15M66細胞を、5×104 cells/wellの濃度でiMatrix-511コーティングプレート(9.2 μl/well)とアテロコラーゲンコーティングプレート(250 μl/well)に播種して培養し、4日目にサンプリングしてmRNAを抽出し、mRNA発現解析に供した。METのマーカーのmRNA発現を調べたところ、アテロコラーゲン上で培養した細胞では、iMatrix-511上で培養した細胞と比較してE-カドヘリンの発現のみが有意に増加した。COL4A1の発現は有意に減少し、その他の因子について有意差は認められなかった（図7B）。これらの結果は、アテロコラーゲン上で培養された細胞において、METが誘導されることを示唆するものではなかった。201B7細胞を用いた実験でも、MET関連因子のmRNA発現パターンは同様であった（図6C）。ビメンチン、フィブロネクチン、α5インテグリン、β1インテグリンなどのEMTのマーカーのmRNA発現は、有意に減少していた（図7C）。これらの結果は、アテロコラーゲン上で培養した細胞では、EMTが誘導されないだけでなく、そのような培養条件下ではEMTが誘導されにくいことを示唆している。
　hiPSCは培養条件の環境劣化により未分化状態を維持できなくなり、脱分化するとコロニー周辺にビメンチンを高発現するEMT誘導細胞が現れやすくなることが知られている。したがって、EMTが起こりにくい培養材料は未分化な細胞を維持する能力に優れていると推察される。しかし、201B7株では、アテロコラーゲン上で培養した細胞でN-カドヘリンのみが有意に増加し、フィブロネクチン、β1インテグリン、Snailの発現は有意に減少していた（図6D）。これらの結果からも、アテロコラーゲン上で培養した細胞でEMTが誘導されたとは考えられなかった。
　最近、iPSC作製法により作製できるiPSC様細胞または組織特異的前駆細胞を染色する蛍光免疫染色法であるKyoto Probe 1(KP-1) (Noguchi, H. et al., Mol Ther Methods Clin Dev 13, 243-252 (2019))が報告された(Miyagi-Shiohira et al., Sci Rep 10, 18084 (2020)）。iMatrix-511コーティング（9.2 μl/well）またはアテロコラーゲンコーティング（250 μl/well）プレートに15M66細胞を5×104 cells/well（12-well プレート）の濃度で播種した。細胞播種後4日目に、細胞を固定した。iMatrix-511でコーティングしたプレートおよびアテロコラーゲンでコーティングしたプレート上の細胞は、KP-1陽性(iPSCの最も代表的な染色マーカー)（図7D、上段）とTra-1-60陽性（iPSCの最も代表的な特異抗体）の両方を示した（図7D、下段）。これらの結果から、アテロコラーゲン上で培養された細胞はiPSCであることが示された。
［実施例７：アテロコラーゲンビーズ上でのhiPSCの樹立］
　SRVTM iPSC-1、2、3、4(ときわバイオ株式会社、つくば、日本)およびCytoTune 2.0 (IDファーマ、東京、日本)は、臨床用iPSCの樹立での使用を目的した市販の細胞初期化センダイウイルスベクターとして入手できる。しかし、これらの細胞初期化センダイウイルスベクターは、細胞培養プレート上で増殖する細胞用に開発されたものであり、2D条件下でのhiPSCの樹立に最適化されている。アテロコラーゲンビーズの球面は3D環境であり、上記センダイウイルスベクターを用いて、３D環境下でhiPSCを樹立できるか否かを検証した。
　ヒト血液から分離した単核細胞（1×105個）にベクター（SRVTM iPSC-2）を感染倍率（MOI）3で感染させ、アテロコラーゲンビーズ（純度95.5%以上のアテロコラーゲンを球状に成形したもの。以下同様。）（500 μl/ウェル）またはCytodex 3（500 μl/ウェル）の入った6ウェルに細胞を播種した。培養15日目に、樹立されたhiPSCのコロニーを光学顕微鏡で観察した。その結果、hiPSCは糸状仮足を伸ばしてアテロコラーゲンビーズに付着していた（白矢印）（図8A、左図）。一方、Cytodex 3ビーズ表面にはコロニーが形成されず、細胞塊のみがマイクロキャリアから遊離している様子が観察された（白矢印）（図8A、右図）。これらの結果から、アテロコラーゲンビーズ上にhiPSCを樹立できる可能性が示された。
　次に、5種類のhiPSC樹立用ベクターを用いて、通常のiMatrix-511コーティングプレート上とアテロコラーゲンビーズ上でのhiPSC樹立効率を比較した。SRVTM iPSC-1、2、3、4、CytoTune 2.0の5種類のベクターを用いて、アテロコラーゲン上と比較した。hiPSCの樹立効率は、センダイウイルス感染後14日目に光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いてウェル内で確認されたコロニー数をカウントすることで記録した。その結果、5つのベクターのうち4つ（SRVTM iPSC-2を除く）では、iMatrix-511でコーティングしたプレートとアテロコラーゲンビーズの間でhiPSC樹立効率に著しい差は認められなかった（図8B）。iMatrix-511コーティングプレート上でのhiPSC樹立効率の向上が、アテロコラーゲンビーズ上でのhiPSC樹立の相対的効率に有意差が生じた理由であった。その結果、iMatrix-511を塗布したプレート上のhiPSCとアテロコラーゲンビーズ上のhiPSCの樹立効率に顕著な差はないと結論づけた。
　アテロコラーゲンビーズ上に樹立したhiPSCは、通常のhiPSCの培養プロトコルに従ってトリプシンで細胞を剥離した後、新しいアテロコラーゲンビーズ（500 μl/ウェル）を含むプレートに移した。8回の細胞継代後の多能性を評価するため、分化誘導後11日目の心筋細胞（図8C）、内胚葉系細胞（図8D）、神経前駆細胞（図8E）からmRNAを抽出し、三胚葉への分化能を評価した。さらに、201B7株を用い、心筋細胞分化誘導後8日目にアテロコラーゲンビーズ上での心筋細胞の成熟を調べた（図9）。コントロールとして、iMatrix-511コーティングプレート（図9、左パネル）およびアテロコラーゲンコーティングプレート（図9、中央パネル）を使用した。その結果、201B7株は、アテロコラーゲンビーズ上でトロポニンTを発現する成熟心筋細胞への分化が誘導された（図9、右パネル）。
　従来のマイクロキャリアを用いた心筋細胞などの臨床細胞の作製では、治療用細胞のマイクロキャリアからの剥離が大きな問題であった。治療用細胞の種類（膵島など）によっては、トリプシン処理によって細胞同士の接着が個々の細胞単位で解除されてしまうため、トリプシン処理は好ましくない。したがって、分化した細胞を組織として確保するためには、コラゲナーゼを用いたアテロコラーゲンビーズの溶解が適している。コラゲナーゼ（1g/10ml高濃度溶液を1ウェルあたり50 μl［6ウェルプレート］）添加後30分で、室温から37℃までの温度で、細胞間接着を損なわずにアテロコラーゲンビーズが完全に消失した（図10）。
［実施例８：糸状仮足の伸長によるhiPSCのアテロコラーゲンへの細胞接着のメカニズム］
　アテロコラーゲンへのhiPSCの細胞接着を光学顕微鏡で観察すると、hiPSCは極めて長い糸状仮足（白矢印）を伸長していることがわかる（図11A）。糸状仮足の形成に強く関与するRhoファミリータンパク質のシグナル伝達に関連するタンパク質の挙動を調べた（Bar-Sagi, D., and Hall, A. Cell 103, 227-238 (2000); Heasman, S.J., and Ridley, A.J. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 690-701. (2008)）（図12A）。 細胞の糸状仮足の形成の中心的な因子はCDC42とWASLであり、CDC42は細胞骨格の再編成を誘導する重要な因子であり、WASLはWiskott-Aldrich症候群タンパク質（WASP）のコード遺伝子である。WASPはCDC42の下流で細胞のフィロポディアを形成するために作用する(Thrasher, A.J., and Burns, S.O. Nat Rev Immunol 10, 182-192 (2010))。したがって、CDC42とWASLの発現増加は、細胞骨格の再編成とフィロポディアの形成をもたらすシグナル伝達経路の活性化を示している。
　201B7細胞を5×104 cells/wellの濃度で播種し（12-well プレート）、iMatrix-511コーティングおよびアテロコラーゲンコーティングプレートに接着させた（図12B）。細胞からmRNAを抽出し、Rhoファミリータンパク質シグナルに関連する因子の発現を分析した。その結果、CDC42とDIAPH3の発現は、iMatrix-511上で培養した細胞と比較して、アテロコラーゲン上で培養した細胞で有意に増加した。また、Rac1、DIAPH1、ROCK2、ROCK1P1、Profilin（PFN）1、PFN2、PFN5の発現は有意に減少していた。これらの結果から、アテロコラーゲン上で培養した201B7細胞では、糸上仮足の誘導のためのシグナル伝達経路がCDC42-DIAPH3まで活性化され、アクチンフィラメントの再編成が誘導されるが、アクチンフィラメントへの接着による細胞膜からの糸上仮足の発現に必要なPFN43，44の発現は低かったことが示された(Lee, C.W. et al., Curr Biol 23, 1046-1056 (2013)； Romero, S. et al., Cell 119, 419-429 (2004))。逆に、DIAPH1の発現が低いために、iPS細胞特有のROCK関連細胞死誘導のためのシグナル伝達が活性化されないと考えられた。これらの知見から、201B7株は、アテロコラーゲン上で細胞死を誘発することなく、糸状仮足の発現を抑制するようにみえる(図6A、および6B)。
　15M66細胞を5×104 cells/wellの濃度で播種し（12-well plate）、iMatrix-511コーティングプレートと、アテロコラーゲンコーティングしたプレートに接着させた（図12C）。細胞からmRNAを抽出し、Rhoファミリータンパク質シグナルに関わる因子の発現を解析した。その結果、CDC42によって誘導されるWASLの発現は、iMatrix-511上で培養した細胞と比較して、アテロコラーゲン上で培養した細胞で有意に増加した。また、PFN1の発現は有意に減少していた。これらの結果は、アテロコラーゲン上で培養した15M66細胞における糸状仮足誘導のためのシグナル伝達経路は、CDC42発現活性化が既に収束し、WASL活性化が残っていることから、糸状仮足の形成のためのシグナル伝達活性化の後期または終期にあることを示唆している。また、これらの結果は、hiPSCにおいてアテロコラーゲンがCDC42-WASP経路の活性化を促し、糸状仮足の形成を誘導していることを示唆している。CDC42は細胞極性に強く関与するタンパク質でもあることから(Iden, S., and Collard, J.G. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 846-859 (2008))、細胞極性に関連するシグナルが、アテロコラーゲンビーズ上のhiPSCが3次元条件下で定着し培養されるメカニズムに影響を与えた可能性がある。
　アテロコラーゲン上でiPSCの糸状仮足が伸長する機構を調べるために、まずアテロコラーゲンの主成分であるコラーゲンIの受容体であるintegrin α2β1について検討した。integrin α2β1 阻害剤であるTC-I 15を添加試薬として1 μg（DMSO 0.1 μlに溶解）または10 μg（DMSO 1 μlに溶解）を調製した。コントロールとして、DMSO（0.1 μl、1 μl）のみを用意した。2.5×104 cells/wellの濃度の15M66細胞（6-well プレート）をiMatrix-511でコーティングプレート、アテロコラーゲンでコーティングしたプレートに試薬と共に播種した（図11Bおよび11C）。TC-I 15を1 μgまたは10 μg添加したウェルでは、培養3日目にアテロコラーゲン上の細胞がEB様細胞塊として観察された（図11B、下段）。試薬の希釈液と同量のDMSOを添加したコントロールウェルでは、部分的な細胞死が起こったが、糸状仮足の形成が観察された（白矢印）（図11B、上段）。この結果は、アテロコラーゲン上のhiPSCによる糸足仮足の形成誘導は、integrin α2β1からの信号によってのみ活性化されることを示している。一方、0、1、10 μgのTC-I 15を添加したすべてのウェルのiMatrix-511上の細胞は、3日目に接着し、短い糸状仮足を形成した（図11C、下段）。この結果は、iMatrix-511上のhiPSCによる糸状仮足形成の誘導は、インテグリンα2β1からの信号のみによって活性化されるのではないことを示す。
　アテロコラーゲンで培養されたhiPSCがEMTまたはMETを誘導しないことは、上述の通りである（図6Cおよび6D、図7Bおよび7C）。I型コラーゲンは、インテグリンα2β1、Discoid in domain receptor family, members (DDR) 1、2の2種類の受容体によって活性化されることによりEMTを誘導すると報告されている。このメカニズムは、DDR受容体がインテグリンα2β1のシグナルを強く増強することで細胞浸潤を引き起こすことで説明される(Xu, H. et al, PLoS One 7, e52209 (2012))。3種類のDDR受容体阻害剤（VU6015929、Merestinib、DDR1-IN-1）を使用した。2.5×104細胞/ウェル（6ウェルプレート）の濃度の15M66細胞を、iMatrix-511コーティングプレートおよびアテロコラーゲンコーティングプレートにDDR受容体阻害剤（VU6015929、Merestinib、またはDDR1-IN-1）と共に播種した（図13）。すべてのDDR受容体阻害剤は、試薬濃度1 μg/wellで細胞増殖を弱く阻害し、10 μg/wellでiMatrix-511コーティングプレートおよびアテロコラーゲンコーティングプレートの両方で非常に強く増殖を阻害した。しかし、いずれのDDR受容体阻害剤も、iMatrix-511コーティングプレートおよびアテロコラーゲンコーティングプレート上の糸状仮足の発現を抑制せず、細胞の形態変化や細胞接着を阻害することもなかった（図13）。これらの結果は、DDR受容体シグナル伝達とアテロコラーゲンによるhiPSCの糸状仮足形成のメカニズムが無関係であることを示している。しかし、iMatrix-511やアテロコラーゲンを塗布したプレートで培養しても、hiPSCは明らかにDDR受容体を発現し、その阻害により細胞増殖が抑制された。
　以上のことから、アテロコラーゲンによってhiPSCsに誘導される糸状仮足の形成は、DDR受容体とは無関係であり、したがってEMT誘導とは独立した機構であることが判明した。さらに、アテロコラーゲンによってhiPSCsに誘導される糸状仮足の形成は、インテグリンα2β1単独のシグナル活性によって引き起こされることが明らかとなった。タイプIコラーゲンは、マウスES細胞において、インテグリンα2β1とDDR1依存性のBmi-1を介して自己複製を活性化することが報告されている。DDR受容体阻害剤がhiPSCの増殖も阻害したこの実験結果から、iMatrix-511だけでなくアテロコラーゲンもDDR受容体活性に影響を与える可能性があると推察される。アテロコラーゲンのhiPSCに対する効果を、図11に示す。インテグリンα2β1は、2次元条件下（図11、左図）だけでなく3次元条件下（図11、右図）でも、糸状仮足を伸ばし、テントロープのようにhiPSCをアテロコラーゲンに固定していることが確認された。そして、アテロコラーゲンに付着したhiPSCの自己複製が促進される。
　GTPaseのRho ファミリーは、小さな(約21 kDa)シグナル伝達Gタンパク質のファミリーである(El Masri, R., and Delon, J. Nat Rev Immunol 21, 499-513 (2021))。15M66細胞を2.5×104 cells/wellの濃度で(6-well プレート)iMatrix-511でコーティングしたプレート、およびアテロコラーゲンでコーティングしたプレートに、Gタンパク質阻害剤(NF023)とともに播種した(図12A)。プレートに付着した生細胞をカウントしたところ、NF023はiMatrix-511-またはアテロコラーゲンでコーティングしたプレート上で培養した細胞の細胞接着、細胞増殖、細胞形態に変化を与えなかった（図13に示す光顕微鏡画像）。この結果は、Gタンパク質は、アテロコラーゲン上でのhiPSC糸状仮足の伸長における因子として、比較的影響力がないことを示している。
［実施例９：自動培養装置への応用可能性］
　現在、自動化された臨床細胞培養システムは、従来のスイベルバイオリアクターから中空糸膜バイオリアクターに進化しており、中空糸膜バイオリアクターは、臨床用の間葉系幹細胞の培養の主流になりつつある（図14B）。以前のモダリティに対する中空糸膜バイオリアクターの利点は、中空糸膜の特性を活かした、細胞培養のための中空糸内側(intracapillary; IC)スペースと、酸素供給および乳酸などの細胞代謝産物の除去のための中空糸外側(extracapillary; EC)スペースを有することである。これにより、高度な培養条件の制御が可能となる。
　しかし、細胞バイオリアクターで使用される中空糸膜の材料は主にポリエーテルスルホン(PES)であり、既存のhiPSC生体材料との細胞接着が困難となる。本発明者らは、PESの表面には、歯の象牙質のようなハイブリッド層に似た液体透過性の凹凸があることを見出した。アテロコラーゲンは、酸濃度pH3では流動性の良い液体であるが、pHが中和されるとゼリー状に固まる性質がある。そこで、PES膜の凹凸部分にpH3のアテロコラーゲンを液体として注入し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）や培養液でPES膜表面を中性にすることで、PES膜上にアテロコラーゲンのハイブリッド層を作ることが可能である。実際、この方法でPES膜にアテロコラーゲンをコーティングしたところ、15M66細胞株はPES膜に接着しなかったが（図14A、左図）、アテロコラーゲンをコーティングしたPES膜には接着するようになった（図14A、右図）。バイオリアクターの中空糸膜は、アテロコラーゲンでコーティングされていた。5×105個の濃度で15M66細胞を播種し、4日後にコラゲナーゼで細胞を剥離した。収穫した細胞の光学顕微鏡写真を示す（図14C）。培養7日目のICおよびEC切片にヘマトキシリン－エオシン（HE）染色を施した。hiPSCのコロニーを示した（黒矢印）（図15）。培養7日目にバイオリアクター内の中空糸膜を除去してパラフィン包埋し、顕微鏡検査用の組織切片を作製した。コラゲナーゼで細胞を剥離したため、細胞間の接着が維持され、細胞塊としてサンプリングすることができた（細胞生存率：80%）。
　mRNA発現分析のためにmRNAを抽出した。TaqMan Human Stem Cell Pluripotency Array（Applied Biosystems）を用いて測定したmRNAの種類は、「未分化細胞での発現」「多能性の維持」「幹性との相関」「分化マーカー」「コントロール」のmRNA発現プロファイルから選択した。未分化状態を解析するために、「幹細胞との相関（図14F）」、「未分化細胞での発現（図14D）」、「多能性の維持（図14E）」、「分化マーカー（図14G）」を分析した。iMatrix-511を塗布したプレートで培養した細胞をコントロールとして、mRNAの発現を色分けした。その結果、アテロコラーゲンでコーティングしたPES中空糸膜バイオリアクター上で培養した細胞は、OCT3/4（POU5F1）の発現量が高く（図14D、14E）、全体的に未分化状態が高い傾向にあることが判明した。アテロコラーゲンでコーティングしたPES中空糸膜バイオリアクターで培養した15M66細胞株は、発生器官の左右非対称性に関与するLEFTY2（図14F）と造血幹細胞に高発現するHBB（図14G）の発現が増加していた。これらのアテロコラーゲンでコーティングされたPES中空糸膜バイオリアクターで培養された細胞のmRNA発現パターンの特徴は、アテロコラーゲンでコーティングされたプレートで培養された細胞のものと多くの点で類似していた(図5C、5D、5E、および7A)。
　本発明によれば、幹細胞を効率よく製造することができ、また幹細胞を効率よく増殖させることができる。かかる方法では、細胞を浮遊培養する工程を含むが、浮遊培養は培養の自動化、大量培養が容易となる。したがって、本発明は幹細胞を用いたリサーチツールとして、あるいは、再生医療に利用可能な安全な幹細胞由来の移植細胞を作製するのに、きわめて有用である。

Claims (11)

  1. 　アテロコラーゲンを含有する遊離した足場材料を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法。
  2. 　前記細胞が初期化因子が導入された体細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記体細胞が浮遊性細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記足場材料がマイクロキャリアである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記足場材料におけるアテロコラーゲンの質量パーセント濃度が１０%以上である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記足場材料におけるアテロコラーゲンの質量パーセント濃度が９５%以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記細胞を浮遊培養する工程が培養装置を用いて行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法により製造された多能性幹細胞。
  10. 　アテロコラーゲンを含有し、培地中で遊離する足場材料を含む、多能性幹細胞増殖促進剤。
  11. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法により製造された多能性幹細胞を準備する工程、
    　該準備された細胞を分化誘導用培地中で培養する工程、および
    　該培養された細胞を、アテロコラーゲンを含有する遊離した足場材料を含む培地中で浮遊培養する工程
    を含む、分化細胞の製造方法。
     

     
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