JP7285520B2 - 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法に関する。
近年、人工的に培養した細胞や組織を用いた再生医療が注目されている。例えば、毛包の再生による脱毛症の治療は、外見面（社会的側面）、健康面などから人々のクオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）の向上に重要である。
細胞や組織の人工的な培養に用いる細胞源の１種として、皮膚由来多能性前駆細胞（ｓｋｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ：以下、本明細書において「ＳＫＰｓ」ともいう）がある。ＳＫＰｓは毛乳頭に存在し、神経細胞、グリア細胞（神経膠細胞）、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、真皮線維芽細胞、毛乳頭細胞などに分化することが可能な細胞である。またＳＫＰｓは、真皮環境の維持、組織修復、毛包形成等に重要な機能を果たす細胞である（非特許文献１及び２参照）。
現在、再生医療分野で様々な臨床及び非臨床での研究が進んでいる。それらの研究のため、ＳＫＰｓを効率よく大量に入手する方法の開発が求められている。これまでに報告されているＳＫＰｓの入手方法としては、ヒト又はヒト以外の動物組織から浮遊細胞塊として採取培養する方法（例えば非特許文献１参照）、ヒト又はヒト以外の動物組織から培養した接着細胞より作製する方法（例えば非特許文献３参照）が報告されている。特許文献１には、ヒト由来の多能性幹細胞に由来する神経堤幹細胞をＷｎｔシグナルのアゴニストを含有する分化誘導培地で培養してＳＫＰｓに分化させることを含むＳＫＰｓの作製方法が開示されている。
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性細胞の培養は、通常フィーダー細胞の共存化で行われる。一方、ヒトの再生医療に用いる人工培養細胞は、フィーダー細胞を使用しないフィーダーフリー、さらには異種由来成分を含まない（ゼノフリー）条件下で培養されることが望ましい。フィーダー細胞の代わりに細胞接着分子を用いて、フィーダーフリー条件で多能性細胞を培養する方法が開発されている。特許文献２には、ラミニン５１１のＥ８フラグメント又はラミニン３３２のＥ８フラグメントがコーティングされた培養基材を用いるヒト多能性幹細胞の培養方法が開示されている。特許文献３には、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等の増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン又はラミニンフラグメントからなる改変ラミニンの存在下でＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の幹細胞を培養することを含む、哺乳動物細胞の培養方法が開示されている。特許文献４には、ラミニン４２１、ラミニン１２１又はそれらの断片を多能性幹細胞と接触させることを含む、多能性幹細胞の培養方法が開示されている。特許文献５にはラミニンＥ８フラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントが連結したコンジュゲートをヒト多能性幹細胞に接触させることを含む、多能性幹細胞の分化誘導方法が開示されている。
特開２０１５－２１３４９５号公報 特開２０１１－０７８３７０号公報 国際公開公報第２０１２／１３７９７０号 国際公開公報第２０１８／０３８２４２号 国際公開公報第２０１８／０８８５０１号
Nature Cell Biology, 2001, 3:778-784 Cell Stem Cell, 2009, 5:610-623 PLoS One, 2012, 7(11):e50742
特許文献１に記載されるような神経堤幹細胞からのＳＫＰｓの分化誘導における、ＳＫＰｓの収率の向上が望まれる。また、再生医療のための細胞源として好適な、フィーダーフリー条件で培養したＳＫＰｓが望まれる。
本発明者は、神経堤幹細胞からのＳＫＰｓの分化誘導培養において、特定のラミニン種を培養足場材として用いることにより、フィーダーフリーでの細胞培養が可能であることを見出した。また本発明者は、当該培養条件下で、神経堤幹細胞からＳＫＰｓへの分化が促進され、ＳＫＰｓの収率が向上することを見出した。
したがって一態様において、本発明は、皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法であって、 神経堤幹細胞を、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養して皮膚由来多能性前駆細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
方法、を提供する。
別の態様において、本発明は、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
足場材、を提供する。
さらなる態様において、本発明は、神経堤幹細胞の作製方法であって、
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で、多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
方法、を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
足場材、を提供する。
本発明によれば、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、毛乳頭細胞などに分化可能なＳＫＰｓを効率的に作製することができる。また本発明によれば、フィーダーフリーでの多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導、及び神経堤幹細胞からＳＫＰｓへの分化誘導が可能となる。したがって、本発明によれば、再生医療のための細胞源として好適なＳＫＰｓを提供することができる。
ラミニンフラグメント存在下でのＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導。ｉＰＳ－ＮＣＳ：分化誘導の開始直前の細胞、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０：分化誘導４日後の細胞、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１：継代培養後の細胞（全て倍率：４０倍）。最下段は、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１でのネスチン及びフィブロネクチンの蛍光染色像（倍率：５０倍）を示す。 ラミニンフラグメント存在下でのｉＰＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導。写真は継代培養後のＳＫＰｓを示す（全て倍率：４０倍）。上：非修飾ラミニンフラグメント存在下での培養、下：パールカン修飾ラミニンフラグメント存在下での培養。 パールカン修飾ラミニンフラグメント存在下で分化したＳＫＰｓにおけるマーカー遺伝子の発現。ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０：分化誘導後の細胞、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１：継代培養後の細胞。 パールカン修飾ラミニンフラグメント存在下で分化したＳＫＰｓにおけるマーカータンパク質の発現。免疫組織染色した細胞の蛍光顕微鏡写真。Ａ：ネスチンの発現、Ｂ：フィブロネクチンの発現、Ｃ：αＳＭＡの発現。 パールカン修飾ラミニンフラグメント存在下で分化したＳＫＰｓの組織細胞への分化。染色細胞の顕微鏡写真。Ａ：脂肪細胞、Ｂ：骨細胞、Ｃ：シュワン細胞。 ゼノフリー条件におけるラミニンフラグメント存在下でのｉＰＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導。ｉＰＳ－ＮＣＳ（上）：分化誘導の開始直前の細胞、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０（中）：分化誘導４日後の細胞、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１（下）：継代培養後の細胞（全て倍率：４０倍）。 ラミニンフラグメント存在下で分化したＮＣＳ細胞におけるマーカー遺伝子の発現。 ラミニンフラグメント存在下で分化誘導されたＳＫＰｓ数。ＬＭ：非修飾ラミニンフラグメント、Ｐ－ＬＭ：パールカン修飾ラミニンフラグメント。各バーの下のラベルはラミニン種を表す。エラーバー＝ＳＤ、＊：P < 0.0005、＊＊：P < 0.0001（ｔ検定）。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する種々の組織に分化できる多能性と自己複製能を有する未分化細胞を指す。本発明で用いる多能性幹細胞は適宜選択することができ、多能性幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」ともいう）、胚性腫瘍細胞（以下「ＥＣ細胞」ともいう）、胚性生殖幹細胞（以下、「ＥＧ細胞」ともいう）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、などが挙げられる。これらの細胞は常法により調製してもよいし、市販の細胞を用いてもよい。本発明で用いる多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。また、本発明で用いる多能性幹細胞は、哺乳動物由来の多能性幹細胞であればよく、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長類由来の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト由来多能性幹細胞である。なかでも、ヒト由来のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が好ましく、ヒト由来のｉＰＳ細胞がより好ましい。
本明細書において「皮膚由来多能性前駆細胞（ｓｋｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ；ＳＫＰｓ）」とは自己複製能を有する未分化細胞であり、神経細胞、グリア細胞（例えば、マイクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、衛星細胞など）、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、真皮線維芽細胞、毛乳頭細胞などに分化する能力を有する細胞をいう。ＳＫＰｓは、ネスチン、フィブロネクチン、αＳＭＡ等のマーカータンパク質の発現に基づいて同定することができ、好ましくは、ネスチン及びフィブロネクチンの共発現に基づいて同定することができる。あるいは、ＳＫＰｓは、Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、Ｓｌｕｇ遺伝子、Ｓｏｘ９遺伝子、Ｄｅｒｍｏ－１遺伝子、ＢＭＰ－４遺伝子、Ｗｎｔ－５ａ遺伝子等のマーカー遺伝子の発現に基づいて同定することができる。
本明細書において「神経堤幹細胞」（ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下「ＮＣＳ細胞」ともいう）とは、自己複製能と多分化能を有する多能性の幹細胞であり、脊椎動物の発生過程で神経管の背側から体中に移動し、様々な組織の形成に寄与する細胞をいう。神経堤幹細胞は、ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６（ＰＡＸ６）、ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐ７５）等の公知のマーカーの発現に基づいて同定することができる。
細胞におけるマーカータンパク質又はマーカー遺伝子の発現は、常法に従って検出することができる。例えば、細胞におけるマーカータンパク質の発現は、該マーカータンパク質に対する抗体を用いた免疫組織染色、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどにより検出することができる。また例えば、細胞におけるマーカー遺伝子の発現は、ＰＣＲ、マイクロアレイ、シーケンシングなどにより検出することができる。
本明細書において、「Ｗｎｔシグナル」は、Ｗｎｔタンパク質の受容体への結合により惹起される、β－カテニン経路、ＰＣＰ経路、及びＣａ2+経路の３つの経路を活性化する一連の経路をいう。Ｗｎｔシグナルの活性化は、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御する。好ましくは、本明細書における「Ｗｎｔシグナル」は、β－カテニン経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃａｓｃａｄｅ）をいう。この経路では、Ｗｎｔタンパク質の受容体への結合によりβ－カテニンが安定化し、核内へと移行して転写因子として働いて遺伝子の転写を活性化する。またβ－カテニンは細胞接着にも関与すると考えられる。一方、該β－カテニン経路がオフの場合、β－カテニンは、複数のタンパク質からなる分解複合体を形成し、該複合体中のセリン／スレオニン・キナーゼであるＧｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ３（ＧＳＫ－３）やＣａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １α（ＣＫ１α）によるリン酸化の後に分解され、それによって細胞内β－カテニンは低レベルに維持される。
本明細書において、「Ｗｎｔシグナルアゴニスト」とは、上述したＷｎｔシグナルを活性化する因子をいい、好ましくは上述したβ－カテニン経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃａｓｃａｄｅ）を活性化する因子をいう。β－カテニン経路を活性化する因子の例としては、ＧＳＫ－３などのβ－カテニンのリン酸化酵素を阻害することによりβ－カテニンの核内移行を促進することで遺伝子の転写を活性化する因子が挙げられる。したがって、β－カテニンのリン酸化酵素阻害剤であるＧＳＫ－３阻害剤は、β－カテニン経路を活性化する因子の例として挙げられる。
ラミニンは、主要な細胞外マトリックスの１つであり、細胞の接着、移動、増殖等に関与するタンパク質である。ラミニンは、３つの異なるサブユニット（α鎖、β鎖、γ鎖）を有するヘテロ３量体分子である。これまでに、５種類のα鎖（α１、α２、α３、α４、α５）、３種類のβ鎖（β１、β２、β３）及び３種類のγ鎖（γ１、γ２、γ３）が見出されており、それらの組み合わせの違いによって、ラミニンには多数のアイソフォームが存在する。ラミニンファミリーのメンバーは、サブユニットの種類に従って命名される。例えば、α５鎖、β１鎖、γ１鎖からなるラミニンはラミニン５１１と称される。
本明細書において、「ラミニンのＥ８フラグメント」（以下、単に「ラミニンＥ８」ともいう）は、ラミニンα鎖のＣ末端フラグメントから球状ドメイン４及び５が除かれたフラグメント（以下「α鎖Ｅ８」という）、β鎖のＣ末端フラグメント（以下「β鎖Ｅ８」という）及びγ鎖のＣ末端フラグメント（以下「γ鎖Ｅ８」という）の３量体からなるフラグメントをいう。この３量体の分子量は約１５０～約１７０ｋＤａである。α鎖Ｅ８は通常約７７０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側の約２３０アミノ酸が３量体形成に関わる。β鎖Ｅ８は通常約２２０～約２３０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８は通常約２４０～約２５０個のアミノ酸からなり、Ｃ末端部から３番目のグルタミン酸残基はラミニンＥ８のインテグリン結合活性に必須である（The Journal of Biological Chemistry, 2007, 282:11144-11154を参照）。
哺乳動物のラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖のアミノ酸配列及びこれらをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ[www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]等）から取得することができる。表１に、ヒトのラミニンを構成する各鎖のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を示す。ラミニンは、例えば、ラミニン高発現細胞から精製する方法、組換えタンパク質として製造する方法など、公知の方法に従って製造することができる。またラミニンフラグメントは、全長ラミニンをタンパク質分解酵素で消化する方法、組換え体としてラミニンフラグメントを直接発現させる方法など、公知の方法に従って製造することができる。あるいは、ラミニン又はそのフラグメントは、市販品を購入することができる。
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一態様において、本発明は、皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）の作製方法を提供する。当該方法では、神経堤幹細胞（ＮＣＳ細胞）をＳＫＰｓへ分化誘導する。より詳細には、当該方法は、ＮＣＳ細胞を、ラミニン及び／又はそのフラグメントの存在下で培養してＳＫＰｓへと分化させることを含む。
当該ＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニンとしては、ラミニン１１１（α１β１γ１）、ラミニン１２１（α１β２γ１）、ラミニン３３２（α３β３γ２）、ラミニン４２１（α４β２γ１）、ラミニン５１１（α５β１γ１）、及びラミニン５２１（α５β２γ１）からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくは、ラミニン１１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、及びラミニン５１１からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
該ラミニンとそのフラグメントは、いずれか一方を用いてもよく、又は両方を組み合わせて用いてもよい。したがって、該ＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及び／又はそのフラグメントとは、好ましくは、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種であり得、より好ましくは、ラミニン１１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、及びラミニン５１１、ならびにそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
該ラミニンフラグメントの例としては、上記に挙げたラミニン種の全長タンパク質と同様の細胞接着活性を有するラミニンのフラグメントであればよく、その分子量及び構造は特に限定されない。該ＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニンフラグメントの好ましい例としては、インテグリン結合活性を有する、上記に挙げたラミニン種のフラグメントが挙げられ、より好ましい例としては、上記に挙げたラミニン種のＥ８フラグメントを含むフラグメントが挙げられ、さらに好ましい例としては、上記に挙げたラミニン種のＥ８フラグメントが挙げられる。
当該ＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及び／又はそのフラグメントは、ヒト由来ラミニン及び／又はそのフラグメントであっても、非ヒト哺乳動物由来ラミニン及び／又はそのフラグメントであってもよい。好ましくは、該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、作製されるＳＫＰｓと同種由来のラミニン及び／又はそのフラグメントであり、より好ましくはヒトラミニン及び／又はそのフラグメントである。
当該ＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及び／又はそのフラグメントは、天然型ラミニン及び／又はそのフラグメントであっても、その変異体であっても、あるいはそれらの組合せであってもよい。当該ラミニン及び／又はそのフラグメントの変異体の例としては、親となる天然型ラミニン又はそのフラグメント（例えばラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、又はそれらのフラグメント）において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつインテグリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、数個とは、例えば、２～１０個であってもよく、２～８個であってもよく、２～６個であってもよく、２～４個であってもよい。よって本明細書において、ラミニンは、天然型ラミニン及びその変異体を包含する。ラミニンフラグメントについても同様である。
さらに、当該ＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及び／又はそのフラグメントは、上述したラミニン及び／又はそのフラグメントにさらなる改変を加えた改変ラミニン及び／又はそのフラグメントであってもよい。該改変ラミニン及び／又はそのフラグメントの例としては、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、該ラミニン及び／又はそのフラグメント（本明細書において「パールカン修飾－ラミニン／フラグメント」ともいう）（特許文献３、５参照）が挙げられる。ＳＫＰｓへの分化誘導の効率の観点からは、本発明においてＳＫＰｓへの分化誘導培養に用いられる該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、パールカン修飾－ラミニン／フラグメントであることが好ましい。該修飾に用いるパールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントは、ラミニン又はそのフラグメントと同種由来のものが好ましく、より好ましくはヒトパールカン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００５５２０、ＮＭ＿００５５２９）、もしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントである。パールカンの増殖因子結合部位としては、パールカンのドメインＩ～III（例えば、ヒトパールカンのアミノ酸配列のＮ末端より２２番目のバリンから１６７６番目のプロリンまでの領域）（The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278：30106-30114）が挙げられ、このうち、このうちドメインＩ（Ｇｌｙ25－Ｐｒｏ196）が好ましい。該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントは、例えば、それを高発現する細胞から精製する方法、組換えタンパク質として製造する方法など、公知の方法に従って製造することができる。
当該パールカン修飾－ラミニン／フラグメントにおいて、該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントは、ラミニン又はそのフラグメントのα鎖のＮ末端、α鎖のＣ末端、β鎖のＮ末端、及びγ鎖のＮ末端のうちの少なくとも１箇所に結合していればよい。したがって、該パールカン修飾－ラミニン／フラグメントは、該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントを１個、２個、３個、又は４個有し得、その各々は、全てパールカンであっても、全て増殖因子結合部位を含むパールカンフラグメントであってもよく、又は一部がパールカンで一部が増殖因子結合部位を含むパールカンフラグメントであってもよい。本発明に用いられる該パールカン修飾－ラミニン／フラグメントは、好ましくは、ラミニン又はそのフラグメントのα鎖のＣ末端にパールカンもしくはその増殖因子結合部位を１個結合したものであり、より好ましくは、ラミニンフラグメントのα鎖のＣ末端にパールカンの増殖因子結合部位を１個結合したものである。該パールカン修飾－ラミニン／フラグメントに含まれるラミニン、ラミニンフラグメント、ならびにパールカン及びその増殖因子結合部位の好ましい例は、上述したとおりである。
当該パールカン修飾－ラミニン／フラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いて、例えば特許文献３に記載された手順に従って調製することができる。より詳細には、ラミニン又はそのフラグメントをコードするＤＮＡと、パールカン又はその増殖因子結合部位を含むフラグメントをコードするＤＮＡとを連結して、パールカン又はその増殖因子結合部位を含むフラグメントとラミニン又はそのフラグメントとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを構築する。該融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入して発現させることで、目的のパールカン修飾－ラミニン／フラグメントを調製することができる。あるいは、ラミニン又はそのフラグメントの適切な位置にパールカン又はその増殖因子結合部位を含むフラグメントを化学的に結合させることによって、目的のパールカン修飾－ラミニン／フラグメントを合成することができる。
上述した本発明で利用可能なラミニン及び／又はそのフラグメントは、それらの構築、分離、精製、又は前述したパールカンもしくはそのフラグメントとの結合に用いられる配列、例えばタグ配列、リンカー配列等、を含んでいてもよい。
本発明のＳＫＰｓの作製方法においては、当該ラミニン及び／又はそのフラグメントの存在下で、ＮＣＳ細胞を培養してＳＫＰｓへと分化させる。本工程において、該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養の際の培養足場材として使用される。したがって、本発明の方法においては、従来のＳＫＰｓ分化誘導培養方法のようにフィーダー細胞を用いる必要がなく、フィーダーフリーでの培養が可能となる。
本発明のＳＫＰｓの作製方法で用いられるＮＣＳ細胞は、公知の方法により調製することができる。例えば、ＮＣＳ細胞は、初期胚からＮＣＳ細胞を採取し、必要に応じて増殖させること、多能性幹細胞から分化誘導することなどによって調製することができる。本発明の方法で用いられるＮＣＳ細胞は、好ましくは、多能性幹細胞から分化誘導された、多能性幹細胞に由来するＮＣＳ細胞であり、より好ましくは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導された、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来するＮＣＳ細胞である。
したがって、一実施形態において、本発明のＳＫＰｓの作製方法は、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞を分化誘導して、多能性幹細胞に由来するＮＣＳ細胞を作製する工程をさらに含んでいてもよい。好ましい実施形態において、該多能性幹細胞に由来するＮＣＳ細胞を作製する工程は、ラミニン及び／又はそのフラグメントの存在下で多能性幹細胞を培養してＮＣＳ細胞へと分化させることを含む。
さらに必要に応じて、上記ＮＣＳ細胞への分化誘導を行う前に、多能性幹細胞を前培養してもよい。該前培養もまた、ラミニン及び／又はそのフラグメントの存在下で行われることが好ましい。該前培養の後、多能性を維持している幹細胞を、該ＮＣＳ細胞への分化誘導に用いることができる。
当該ＮＣＳ細胞の作製工程で使用されるラミニン及び／又はそのフラグメントの種類としては、特に限定されず、上述したＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及び／又はそのフラグメント；特許文献２～５に記載される多能性幹細胞の培養に用いられるラミニン、ラミニンフラグメント及び改変ラミニン、などが挙げられる。好ましくは、本工程で使用されるラミニン及び／又はそのフラグメントは、上述したＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。本工程で使用されるラミニン及び／又はそのフラグメントは、上述したＳＫＰｓの分化誘導に用いられるラミニン及び／又はそのフラグメントと同じ種類であっても、異なる種類であってもよい。好ましい実施形態において、当該ＮＣＳ細胞の作製工程で使用されるラミニン及び／又はそのフラグメントは、上述したＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なパールカン修飾－ラミニン／フラグメントである。パールカン修飾－ラミニン／フラグメントを用いることで、ＮＣＳ細胞への分化誘導の効率を向上させることができる。本発明の好ましい実施形態においては、上述したＳＫＰｓへの分化誘導培養に利用可能なパールカン修飾－ラミニン／フラグメントの存在下で、多能性幹細胞を培養してＮＣＳ細胞へと分化させた後、続けて該ＮＣＳ細胞を培養してＳＫＰｓへと分化させる。
当該ＮＣＳ細胞の作製工程において、当該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養の際の培養足場材として使用される。したがって、本工程においては、従来の多能性幹細胞の培養方法のようにフィーダー細胞を用いる必要がなく、フィーダーフリーでの培養が可能となる。
本発明における多能性幹細胞の前培養、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養、及びＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養は、好ましくは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われ、生きたヒト又は動物の個体上又は個体内での培養を含まない。したがって、本発明で培養足場材として使用される該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、好ましくは、ｅｘ ｖｉｖｏで使用され、生きたヒト又は動物の個体上又は個体内での培養には使用されない。
本発明において、当該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、培養足場として機能する限り、いかなる方法で使用されてもよい。例えば、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養基材上で細胞を培養してもよい。該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養基材の例としては、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含有するコーティングを有する培養基材（例えばプレート、メッシュ、ディッシュ等）が挙げられ、その例としては、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含むコーティング剤によりコートすることで該ラミニン及び／又はそのフラグメントが吸着している培養基材が挙げられる。このような培養基材における該ラミニン及び／又はそのフラグメントの含有量は、該培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであればよい。例えば、コーティングする面積１ｃｍ2あたり、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇ含むコーティング剤により、該培養基材をコーティング処理し、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを該培養基材に吸着させればよい。
あるいは、本発明においては、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを添加した培地で細胞を培養してもよい。該培地に該ラミニン及び／又はそのフラグメントを添加する場合、細胞の播種に先立って培地に該ラミニン及び／又はそのフラグメントを添加してもよく、あるいは細胞と一緒に培地に該ラミニン及び／又はそのフラグメントを添加してもよい。該培地における該ラミニン及び／又はそのフラグメントの含有量を、培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇになるように調整するとよい。
当該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養基材やコーティング剤、培地には、該ラミニン及び／又はそのフラグメント以外の足場材又は細胞接着分子が含まれていてもよい。該足場材又は細胞接着分子の例としては、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ポリ－Ｌ－リジンなどが挙げられる。
ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養に用いる培地、及び多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養に用いる培地には、いずれも、幹細胞の分化誘導に通常用いられる分化培地を使用することができる。また多能性幹細胞の前培養には、幹細胞の維持培養に通常用いられる維持培地を使用することができる。これらの培地の基礎培地は、幹細胞の培養に通常用いられる基礎培地から適宜選択することができ、かつ市販品を使用することもできる。該基礎培地の例としては、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ培地（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハム培地、ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。このうち、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（以下、単に「ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地」ともいう）が好ましい。フィーダーフリーでの培養の場合は、幹細胞のフィーダーフリーでの培養用に調製された基礎培地から適宜選択することができ、市販品を使用することもできる。その例としては、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素（株））などが挙げられる。
当該培地は、血清含有培地であっても、無血清培地であっても、血清代替物を含有する培地であってもよいが、好ましくは無血清培地又は血清代替物を含有する培地である。該血清代替物は、血清中に含まれる成分である、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン等）、栄養因子（ＥＧＦ（上皮成長因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）等）などの成分が含まれる組成物であり、その組成は細胞増殖能がある限り限定されない。具体的な例として、Ｂ－２７（商標）サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメントなどが挙げられる。さらには、必要に応じてビタミン、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えば、ペニシリン、カナマイシン、ストレプトマイシン）、２－メルカプトエタノール等、幹細胞の培地に通常用いられる成分を培地に含有させてもよい。好ましくは、該培地は、培養する細胞に対して異種の生物由来の成分を含まないゼノフリー培地である。なおフィーダーフリー、好ましくはさらにゼノフリーでの培養を実現できる限りにおいて、該培地は市販品を用いてもよい。
当該ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養に用いる分化培地は、血清代替物、ＥＧＦ、及びｂＦＧＦからなる群より選ばれる少なくとも１種の栄養因子を含有していることが好ましく、血清代替物、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有していることがより好ましい。血清代替物としては、上述のＢ－２７（商標）サプリメント、Ｎ２サプリメント、又はノックアウトシーラムリプレースメントが好ましく、Ｂ－２７（商標）サプリメントがより好ましい。これらの栄養因子は、常法に従い調製してもよく、又は市販品を用いてもよい。該分化培地における該栄養因子の含有量は、培養条件、使用する多能性幹細胞の種類、阻害剤の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、該培地中における血清代替物の濃度は、０．５質量％以上が好ましく、１質量％以上がより好ましく、かつ２０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましく、あるいは濃度範囲０．５～２０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい。また例えば、該培地中におけるＥＧＦ及びｂＦＧＦの濃度は、それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、かつ１００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、あるいは濃度範囲１～１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０～５０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
さらに、該分化培地にＷｎｔシグナルアゴニストを含有させることで、ＮＣＳ細胞のＳＫＰｓへの分化誘導が促進され、ＳＫＰｓの収率が向上する。本発明で用いられるＷｎｔシグナルアゴニストは、上記で定義したとおりであるが、好ましい例としては、上述したβ－カテニン経路を活性化する因子、及びＧＳＫ－３阻害剤等の細胞内β－カテニンの分解を阻害する因子が挙げられる。ＧＳＫ－３阻害剤が好ましい。
ＧＳＫ－３阻害剤の例としては、アミノピリミジン化合物（例えばＧＳＫ－３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＶＩ、商品名ＣＨＩＲ９９０２１など；ＣＡＳ ２５２９１７－０６－９）、ビス－インドロ（インジルビン）化合物（以下、「ＢＩＯ」ともいう）（例えば、（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム；ＣＡＳ ６６７４６３－６２－９）、ＢＩＯのアセトキシム化合物（以下、「ＢＩＯ－アセトキシム」ともいう）（例えば、（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）化合物（例えば、４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、オキソチアジアゾリジン－３－チオン化合物（例えば、２，４－ジベンジル－５－オキソチアジアゾリジン－３－チオン）、チエニルα－クロロメチルケトン化合物（例えば、２－クロロ－１－（４，４－ジブロモ－チオフェンー２－イル）－エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（例えば、α－４－ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（例えば、Ｎ－（４－メトキシベンジル）－Ｎ’－（５－ニトロ－１，３－チアゾール－２－イル）ユレア）、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］キノキサリン－３－アミン：商品名ＮＳＣ６９３８６８（ＣＡＳ ４０２５４－９０－８）、（２，４ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン：商品名ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４－０９－４）、３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン：商品名ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ ２６４２１８－２３－７）、ＧＳＫ－３β ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＩＩ：商品名ＴＷＳ１１９（ＣＡＳ ６０１５１４－１９－６）、ＧＳＫ－３βペプチド阻害剤（例えばＨ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ2）、等が挙げられる。このうち、ＧＳＫ－３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＶＩ（ＣＡＳ ２５２９１７－０６－９）、（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＣＡＳ ６６７４６３－６２－９）、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］キノキサリン－３－アミン（ＣＡＳ ４０２５４－９０－８）、（２，４ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン（ＣＡＳ ２８０７４４－０９－４）、３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン（ＣＡＳ ２６４２１８－２３－７）、及びＧＳＫ－３β ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＩＩ（ＣＡＳ ６０１５１４－１９－６）から選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＧＳＫ－３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＶＩがさらに好ましい。
上記に挙げたＷｎｔシグナルアゴニストは、常法に従い調製してもよく、又は市販品を用いてもよい。分化培地に含まれるＷｎｔシグナルアゴニストの含有量は、培養条件、使用するＷｎｔシグナルアゴニストの種類等に応じて、Ｗｎｔシグナルが活性化され、かつ細胞増殖が停止しない範囲で適宜設定することができる。例えば、ＷｎｔシグナルアゴニストとしてＧＳＫ－３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＶＩを用いる場合、培地中の該Ｗｎｔシグナルアゴニストの濃度は、０．５μＭ以上が好ましく、２μＭ以上がより好ましく、かつ５μＭ以下が好ましく、４μＭ以下がより好ましい。あるいは、培地中の該Ｗｎｔシグナルアゴニストの濃度範囲は０．５～５μＭが好ましく、２～４μＭがより好ましい。さらに好ましくは、培地中の該Ｗｎｔシグナルアゴニストの濃度は３μＭである。
一方、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養に用いる分化培地は、ＴＧＦβシグナル阻害剤及び／又はＢＭＰシグナル阻害剤を含有していることが好ましい。これにより、ＮＣＳ細胞への分化誘導が促進され、結果として目的とするＳＫＰｓの収率が向上する。該ＴＧＦβシグナル阻害剤の例としては、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド（例えば、ＳＢ４３１５４２（商品名）；ＣＡＳ ３０１８３６－４１－９）等が挙げられる。該ＢＭＰシグナル阻害剤の例としては、ｎｏｇｇｉｎやＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ １０６２３６８－２４－４）等が挙げられる。これらのＴＧＦβシグナル阻害剤及びＢＭＰシグナル阻害剤は、常法に従い調製してもよく、又は市販品を用いてもよい。該ＮＣＳ細胞の作製に用いる分化培地における該ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＢＭＰシグナル阻害剤の含有量は、培養条件、使用する多能性幹細胞の種類、阻害剤の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、該培地中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、１μＭ以上が好ましく、５μＭ以上がより好ましく、かつ３０μＭ以下が好ましく、２０μＭ以下がより好ましく、あるいは濃度範囲１～３０μＭが好ましく、５～２０μＭがより好ましい。また例えば、該培地中におけるｎｏｇｇｉｎの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、かつ１０００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、７００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、あるいは濃度範囲１０～１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１００～７００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導のための培養条件は、使用する細胞の種類等に応じて、適宜設定することができる。例えば、多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を用いる場合、ＮＣＳ細胞への分化誘導のための培養期間は、好ましくは１～２０日間である。ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導のための培養条件もまた、適宜設定することができる。例えば、Ｗｎｔシグナルアゴニストを含有する分化誘導培地で、好ましくは３～５日間ＮＣＳ細胞を培養することで、効率的に細胞をＳＫＰｓに分化させることができる。本発明において、細胞の培養の手法は、接着培養及び浮遊培養のいずれであってもよいが、好ましくは接着培養が選択される。
好ましい実施形態においては、上記の分化させたＳＫＰｓに対して、１回又は２回以上の継代培養を行う。継代培養を行うことで、純度の高い細胞集団としてＳＫＰｓを得ることができる。ＳＫＰｓの継代方法及び継代回数は、培養条件などに応じて通常の継代方法から適宜選択することができる。例えば、接着培養系細胞については酵素等による細胞の剥離後、希釈培養により継代を行い、浮遊培養系細胞については希釈培養により継代を行う。
分化したＮＣＳ細胞又はＳＫＰｓは、上述した各々の細胞についてのマーカータンパク質又はマーカー遺伝子の発現に基づいて同定することができる。あるいは、顕微鏡観察下での細胞形態などに基づいて細胞のＮＣＳ細胞又はＳＫＰｓへの分化を確認することができる。
本発明のＳＫＰｓの作製方法では、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化が高確率で起こるため、培養後の細胞からのＳＫＰｓの分離回収は必ずしも必要ない。一方、ＳＫＰｓの純度をより高めるために、培養物からのＳＫＰｓの分離回収を行ってもよい。ＳＫＰｓの分離回収は、常法により行うことができ、例えば、セルソーターを用いた方法、磁気ビーズを用いた方法などにより行うことができる。
上述したように、本発明において、当該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養、及びＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養において、培養足場材として使用される。したがって、さらなる一態様において、本発明は、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを有効成分とする、ＮＣＳ細胞のＳＫＰｓへの分化誘導培養のための足場材を提供する。さらに本発明は、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを有効成分とする、多能性幹細胞のＮＣＳ細胞への分化誘導培養のための足場材を提供する。好ましい実施形態において、該多能性幹細胞のＮＣＳ細胞への分化誘導培養のための足場材に含まれるラミニン及び／又はそのフラグメントは、上述したパールカン修飾－ラミニン／フラグメントである。
一実施形態において、該本発明の足場材は、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養基材、例えば、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含有するコーティングを有する培養基材（例えばプレート、メッシュ、ディッシュ等）、より具体的には、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含むコーティング剤によりコートされることで該ラミニン及び／又はそのフラグメントが吸着している培養基材；該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含むコーティング剤；該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養培地、などの形態で提供される。該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養基材、コーティング剤、及び培養培地は、上述した該ラミニン及び／又はそのフラグメント以外の足場材又は細胞接着分子を含有していてもよい。また該コーティング剤は、通常の培養基材のコーティング剤に含有される他の成分（例えば溶媒として緩衝液）を含有していてもよい。また該培養培地は、通常の培養培地に含有される他の成分（例えば、上述したような基礎培地、血清、血清代替物、栄養因子等）を含有していてもよい。該培地がＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養に使用される場合、該培地は、好ましくは、上述したＷｎｔシグナルアゴニストを含有し、より好ましくは該Ｗｎｔシグナルアゴニストと、血清代替物、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有する。一方、該培地が多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養に使用される場合、該培地は、好ましくは、上述したＴＧＦβシグナル阻害剤及び／又はＢＭＰシグナル阻害剤を含有する。
一実施形態において、該本発明の足場材は、該ラミニン及び／又はそのフラグメントからなるものであってもよい。この場合、該本発明の足場材は、好ましくは、培養基材のコーティング剤に添加するか、又は培地に添加することによって使用される。
本発明の足場材が該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培養基材である場合、該培養基材における該ラミニン及び／又はそのフラグメントの含有量は、該培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであればよい。本発明の足場材が該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含むコーティング剤である場合、該コーティング剤における該ラミニン及び／又はそのフラグメントの含有量は、該コーティング剤がコーティングする面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであればよい。本発明の足場材が該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含む培地である場合、該培地中の該ラミニン及び／又はそのフラグメントの含有量は、該培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇであればよい。該本発明の足場材を培養基材のコーティング剤に添加して使用する場合、その使用量を、該コーティング剤における該ラミニン及び／又はそのフラグメントの含有量が上述の範囲になるように調整するとよい。あるいは、該本発明の足場材を培地に添加して使用する場合、その使用量を、該培地１ｍＬあたりの該ラミニン及び／又はそのフラグメントの最終濃度が上述の範囲になるように調整するとよい。
さらに別の一態様において、本発明は、該本発明の足場材を含有する、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養のための培養基材を提供する。また本発明は、該本発明の足場材を含有する、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導培養のための細胞培養キットを提供する。
さらに別の一態様において、本発明は、該本発明の足場材を含有する、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養のための培養基材を提供する。また本発明は、該本発明の足場材を含有する、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養のための細胞培養キットを提供する。好ましい実施形態において、該多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導培養のための培養基材又は細胞培養キットにおける、本発明の足場材に含まれるラミニン及び／又はそのフラグメントは、上述したパールカン修飾－ラミニン／フラグメントである。
好ましい実施形態において、該本発明の培養基材は、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含有するコーティングを有する培養基材（例えばプレート、メッシュ、ディッシュ等）であり、より好ましくは、該ラミニン及び／又はそのフラグメントを含むコーティング剤によりコートされることで該ラミニン及び／又はそのフラグメントが吸着している培養基材である。好ましい実施形態において、該本発明の細胞培養キットは、該ラミニン及び／又はそのフラグメントに加えて、必要に応じて、培養基材、多能性幹細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導もしくはＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導のための分化培地やその添加剤、多能性幹細胞の維持培養のための培地やその添加剤、などを含んでいてもよい。該本発明の細胞培養キットに含まれる該ラミニン及び／又はそのフラグメントは、培養基材にコーティングされていてもよく、又は培養基材をコーティングするためのコーティング剤もしくは培地に含有されていてもよい。
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法であって、
神経堤幹細胞を、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養して皮膚由来多能性前駆細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
方法。
〔２〕好ましくは、前記神経堤幹細胞を作製する工程をさらに含み、
該工程は、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させることを含み、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、予めラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で前記多能性幹細胞を維持培養することをさらに含む、〔２〕記載の方法。
〔４〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種が、
好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントを含み、
より好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、
〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインＩ～IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインＩを含むフラグメントである、
〔５〕記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下での神経堤幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培地で該細胞を培養することを含む、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下での多能性幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培地で該細胞を培養することを含む、〔２〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用量は、前記培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであるか、又は、前記培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇである、あるいは、
前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を前記培養基材のコーティング剤に添加して使用する場合、該コーティング剤における該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量は、コーティングする面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇである、
〔７〕又は〔８〕記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養が、Ｗｎｔシグナルアゴニストを含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記Ｗｎｔシグナルアゴニストが、
好ましくは、β－カテニン経路を活性化する因子であり、
より好ましくは、β－カテニンのリン酸化酵素阻害剤であり、
さらに好ましくは、ＧＳＫ－３阻害剤であり、
さらに好ましくは、アミノピリミジン化合物、ビス－インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）又はそのアセトキシム化合物、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）化合物、オキソチアジアゾリジン－３－チオン化合物、チエニルα－クロロメチルケトン化合物、フェニルαブロモメチルケトン化合物、チアゾール含有尿素化合物、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］キノキサリン－３－アミン、（２，４ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン、３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン、ＧＳＫ－３β ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＩＩ、及びＧＳＫ－３βペプチド阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、ＧＳＫ－３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＶＩ、（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＣＡＳ ６６７４６３－６２－９）、１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］キノキサリン－３－アミン、（２，４ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン、３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ビロール－２，５－ジオン、及びＧＳＫ－３β ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＩＩからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくはＧＳＫ－３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＸＶＩである、
〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記分化培地における前記Ｗｎｔシグナルアゴニストの濃度が、好ましくは０．５～５μＭ、より好ましくは２～４μＭである、〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養が、栄養因子を含有する分化培地で該細胞を培養することを含み、
該栄養因子が、
好ましくは血清代替物、ＥＧＦ、及びｂＦＧＦからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
より好ましくは血清代替物、ＥＧＦ及びｂＦＧＦである、
〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕前記分化培地における前記血清代替物の濃度が、好ましくは０．５～２０質量％、より好ましくは１～５質量％であり、
前記分化培地における前記ＥＧＦ及びｂＦＧＦの濃度が、それぞれ、好ましくは１～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０～５０ｎｇ／ｍＬである、
〔１３〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記多能性幹細胞を培養して分化させる工程が、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＢＭＰシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、〔２〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記ＴＧＦβシグナル阻害剤が４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドであり、前記ＢＭＰシグナル阻害剤がｎｏｇｇｉｎである、〔１５〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記皮膚由来多能性前駆細胞がネスチン及びフィブロネクチンを共発現する、〔１〕～〔１６〕のいずれか１項のいずれか１項記載の方法。
〔１８〕好ましくは、前記神経堤幹細胞がヒト由来神経堤幹細胞である、〔１〕～〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
〔１９〕好ましくは、前記神経堤幹細胞が多能性幹細胞に由来する神経堤幹細胞である、〔１〕～〔１８〕のいずれか１項記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養がフィーダー細胞を用いることなく行われる、〔１〕～〔１９〕のいずれか１項記載の方法。
〔２１〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養が異種由来成分の非存在下で行われる、〔１〕～〔２０〕のいずれか１項記載の方法。
〔２２〕神経堤幹細胞の作製方法であって、
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で、多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
方法。
〔２３〕好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で、前記多能性幹細胞を予め維持培養することをさらに含む、〔２２〕記載の方法。
〔２４〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔２２〕又は〔２３〕記載の方法。
〔２５〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインＩ～IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインＩを含むフラグメントである、
〔２２〕～〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２６〕好ましくは、前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下での細胞の培養が、該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培地で該細胞を培養することを含む、〔２２〕～〔２５〕のいずれか１項記載の方法。
〔２７〕好ましくは、前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用量は、前記培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであるか、又は、前記培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇである、
あるいは、
前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を前記培養基材のコーティング剤に添加して使用する場合、該コーティング剤における該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量は、コーティングする面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇである、
〔２６〕記載の方法。
〔２８〕好ましくは、前記多能性幹細胞を培養して分化させる工程が、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＢＭＰシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含み、
より好ましくは、該ＴＧＦβシグナル阻害剤が４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドであり、前記ＢＭＰシグナル阻害剤がｎｏｇｇｉｎである、
〔２２〕～〔２７〕のいずれか１項記載の方法。
〔２９〕好ましくは、前記多能性幹細胞がヒト由来多能性幹細胞である、〔２２〕～〔２８〕のいずれか１項記載の方法。
〔３０〕好ましくは、前記多能性幹細胞の培養がフィーダー細胞を用いることなく行われる、〔２２〕～〔２９〕のいずれか１項記載の方法。
〔３１〕好ましくは、前記多能性幹細胞の培養が異種由来成分の非存在下で行われる、〔２２〕～〔３０〕のいずれか１項記載の方法。
〔３２〕ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
足場材。
〔３３〕パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
足場材。
〔３４〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくはインテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔３２〕又は〔３３〕記載の足場材。
〔３５〕前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種が、
好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントを含み、
より好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、
〔３２〕～〔３４〕のいずれか１項記載の足場材。
〔３６〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインＩ～IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインＩを含むフラグメントである、
〔３３〕～〔３５〕のいずれか１項記載の足場材。
〔３７〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有するコーティングを有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有するコーティング剤であるか、あるいは前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有する培地である、〔３２〕～〔３６〕のいずれか１項記載の足場材。
〔３８〕前記培養基材における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量が、該培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであるか、
前記培地における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量が、該培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇであるか、あるいは、
前記コーティング剤における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量が、該コーティング剤がコーティングする面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇである、
〔３７〕記載の足場材。
〔３９〕前記〔３２〕、〔３４〕～〔３８〕のいずれか１項記載の足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための培養基材。
〔４０〕前記〔３２〕、〔３４〕～〔３８〕のいずれか１項記載の足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
〔４１〕前記〔３３〕～〔３８〕のいずれか１項記載の足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための培養基材。
〔４２〕前記〔３３〕～〔３８〕のいずれか１項記載の足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
〔４３〕神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材の製造における、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
使用。
〔４４〕多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材の製造における、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
使用。
〔４５〕神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材としての、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
使用。
〔４６〕多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材としての、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である、
使用。
〔４７〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔４３〕～〔４６〕のいずれか１項記載の使用。
〔４８〕前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種が、
好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントを含み、
より好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、該ラミニン又はそのフラグメントである、
〔４３〕～〔４７〕のいずれか１項記載の使用。
〔４９〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインＩ～IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインＩを含むフラグメントである、
〔４４〕、〔４６〕～〔４８〕のいずれか１項記載の使用。
〔５０〕好ましくは、前記足場材が、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有するコーティングを有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有するコーティング剤であるか、あるいは前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含有する培地である、〔４３〕～〔４９〕いずれか１項記載の使用。
〔５１〕前記培養基材における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量が、該培養基材が培養物と接触する面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇであるか、
前記培地における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量が、該培地１ｍＬあたりの最終濃度として、好ましくは０．１～１００μｇ、より好ましくは０．２～２０μｇであるか、あるいは、
前記コーティング剤における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の含有量が、該コーティング剤がコーティングする面積１ｃｍ2あたり、好ましくは０．０５～５０μｇ、より好ましくは０．１～１０μｇである、
〔５０〕記載の使用。
〔５２〕神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材として用いるための、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種、ここで該ラミニンは、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である。
〔５３〕多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材として用いるための、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種、ここで該ラミニンは、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種である。
〔５４〕ｅｘ ｖｉｖｏ方法である、〔１〕～〔３１〕のいずれか１項記載の方法。
〔５５〕前記培養が生きたヒト又は動物の個体上又は個体内での培養を含まない、〔１〕～〔３１〕のいずれか１項記載の方法。
〔５６〕ｅｘ ｖｉｖｏにおける使用である、〔４３〕～〔５１〕のいずれか１項記載の使用。
〔５７〕前記使用が生きたヒト又は動物の個体上又は個体内での使用を含まない、〔４３〕～〔５１〕のいずれか１項記載の使用。
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
参考例１ ラミニンの調製
足場用のラミニンフラグメントとして、ラミニン１１１のＥ８フラグメント（ＬＭ１１１Ｅ８）、ラミニン１２１のＥ８フラグメント（ＬＭ１２１Ｅ８）、ラミニン３３２のＥ８フラグメント（ＬＭ３３２Ｅ８）、ラミニン４２１のＥ８フラグメント（ＬＭ４２１Ｅ８）、ラミニン５１１のＥ８フラグメント（ＬＭ５１１Ｅ８）、及びラミニン５２１のＥ８フラグメント（ＬＭ５２１Ｅ８）を国際公開公報第２０１４／１０３５３４号に記載の方法に従って調製した。
参考例２ パールカン修飾ラミニンの調製
（１）パールカン修飾ＬＭ５１１Ｅ８（Ｐ－ＬＭ５１１Ｅ８）の調製
ヒトパールカンのドメインＩ（Ｇｌｙ25－Ｐｒｏ196）（以下、Ｐｌｎ－Ｄ１ともいう）フラグメントがヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部に融合したラミニン５１１Ｅ８フラグメント（以下、パールカン修飾ＬＭ５１１Ｅ８、又はＰ－ＬＭ５１１Ｅ８ともいう）を、国際公開公報第２０１４／１９９７５４号に記載の方法に従って下記の手順で調製した。
（１－１）ヒトラミニンα５鎖、β１鎖、γ１鎖の各Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
最初に、クローニング用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を鋳型として、以下の３種類のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＶの５’側に６×Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）をコードするＤＮＡ配列、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）をコードするＤＮＡ配列、又はＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をコードするＤＮＡ配列が挿入された３種類のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）をそれぞれ作製した。
(i) ６×Ｈｉｓタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号１）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’（reverse、配列番号２）
(ii) ＨＡタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号３）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
(iii) ＦＬＡＧタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号５）
5’-GATGATGATAAGGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号６）
次に、ヒトラミニンα５鎖、β１鎖、γ１鎖の全長ヌクレオチド配列を含むプラスミド（The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279:10946-10954）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、α５鎖Ｅ８フラグメント（Ａｌａ2534－Ａｌａ3327）、β１鎖Ｅ８フラグメント（Ｌｅｕ1561－Ｌｅｕ1786）、及びγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ａｓｎ1362－Ｐｒｏ1609）に相当する領域を増幅した。
(iv) α５鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’（forward、配列番号７）
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’（reverse、配列番号８）
(v) β１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’（forward、配列番号９）
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’（reverse、配列番号１０）
(vi) γ１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’（forward、配列番号１１）
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’（reverse、配列番号１２）
増幅したＤＮＡ断片を、タグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶ部位に挿入した後、５’側のタグをコードする配列を含めて増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、マウスＩｇ－κ鎖Ｖ－Ｊ２－ＣシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を内在に有する）に挿入し、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、及びヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターをそれぞれ作製した。
（１－２）パールカンドメイン融合ラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製 ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部分（Ｌｅｕ570－Ｐｒｏ772）とヒトラミニンα１鎖Ｇ３－Ｇ４ドメイン間リンカー配列（ＤＡＥＤＳＫＬＬＰＥＰＲＡＦＰ、配列番号１３）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
(vii) リンカー配列導入のための増幅用プライマー
5’-CCTCAAGCGGCTGAACACGACAGGCG-3’（forward、配列番号１４）
5’-ATATGGATCCTGGAAAAGCCCGGGGCTCTGGCAAGAGCTTGCTGTCCTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGG-3’
（reverse、配列番号１５、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれている）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｃＩ（この制限酵素の認識配列はヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列内に存在する）とＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡ断片１とした。
ヒトパールカン発現ベクター（Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(47):36645-36655）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒトパールカンのドメインＩ（Ｐｌｎ－Ｄ１）（Ｇｌｙ25－Ｐｒｏ196）にＨｉｓタグをＣ末端に付加した配列をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
(viii) Ｐｌｎ－Ｄ１配列増幅用プライマー
5’-ATATATATGGATCCGGGCTGAGGGCATACGATGGCTTGTCTCTG-3’
（forward、配列番号１６、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれている）
5’-ATATATATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGTGGGAACTGGGGCACTGTGCCCAG-3’
（reverse、配列番号１７、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列が含まれている）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡ断片２とした。
ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを制限酵素ＡｓｃＩとＮｏｔＩで消化して得られたヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＮ末端部分（Ｍｅｔ1－Ａｓｐ610）を含む発現ベクター断片に、上記のＤＮＡ断片１及び２を挿入し、Ｐｌｎ－Ｄ１融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを作製した。
（１－３）Ｐｌｎ－Ｄ１融合ラミニンフラグメントの発現及び精製
Ｐｌｎ－Ｄ１融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）発現ベクター及びヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）発現ベクターと混合して、ヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、７２時間培養を行った後、培養液を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（シグマ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、Ｐｌｎ－Ｄ１が融合したラミニン５１１のＥ８フラグメント（Ｐ－ＬＭ５１１Ｅ８）を精製した。
（２）パールカン修飾ＬＭ１１１Ｅ８（Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８）の調製
α５鎖Ｅ８をα１鎖Ｅ８に変更した以外は（１）と同様の手順で、Ｐｌｎ－Ｄ１が融合したラミニン１１１のＥ８フラグメント（Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８）を調製した。
（３）パールカン修飾ＬＭ１２１Ｅ８（Ｐ－ＬＭ１２１Ｅ８）の調製
α５鎖Ｅ８をα１鎖Ｅ８に、及びβ１鎖Ｅ８をβ２鎖Ｅ８に変更した以外は（１）と同様の手順で、Ｐｌｎ－Ｄ１が融合したラミニン１２１のＥ８フラグメント（Ｐ－ＬＭ１２１Ｅ８）を調製した。
（４）パールカン修飾ＬＭ３３２Ｅ８（Ｐ－ＬＭ３３２Ｅ８）の調製
α鎖、β鎖及びγ鎖にα３鎖、β３鎖及びγ２鎖を用いた以外は（１）と同様の手順で、Ｐｌｎ－Ｄ１が融合したラミニン３３２のＥ８フラグメント（Ｐ－ＬＭ３３２Ｅ８）を調製した。
（５）パールカン修飾ＬＭ４２１Ｅ８（Ｐ－ＬＭ４２１Ｅ８）の調製
α鎖、β鎖及びγ鎖にα４鎖、β２鎖及びγ１鎖を用いた以外は（１）と同様の手順で、Ｐｌｎ－Ｄ１が融合したラミニン４２１のＥ８フラグメント（Ｐ－ＬＭ４２１Ｅ８）を調製した。
（６）パールカン修飾ＬＭ５２１Ｅ８（Ｐ－ＬＭ５２１Ｅ８）の調製
β１鎖Ｅ８をβ２鎖Ｅ８に変更した以外は（１）と同様の手順で、Ｐｌｎ－Ｄ１が融合したラミニン５２１のＥ８フラグメント（Ｐ－ＬＭ５２１Ｅ８）を調製した。
実施例１ ラミニン足場の構築
（１）ラミニン足場の構築
参考例１で準備した各種ラミニン又は参考例２で調製したパールカン修飾ラミニンは、予め培養基材にコーティングするか、又は細胞と同時に培地に添加した。予めコーティングする場合は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１４１９０－２５０）に各種ラミニンを溶解させ、得られたラミニン溶液（ラミニン２．５μｇ／ｍＬ含有）を培養基材（３５ｍｍ径ディッシュ）の表面に広げ（ラミニン最終濃度：約０．５μｇ／コーティング面積ｃｍ2）、３７℃で１時間静置した後、ＤＰＢＳで洗浄し、該培養基材にコーティングを形成した。培地に添加する場合は、培地中の最終濃度が１．２５μｇ／ｍＬの範囲になるように、培地への各種ラミニンの添加量を調整した。これらのラミニン足場を含む培養環境下で、以下の実施例での細胞培養を行った。
実施例２ 皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）の作製
（１）ｉＰＳ細胞の培養
多能性幹細胞として、ヒト由来のｉＰＳ細胞（クローン名：１２３１Ａ３、京都大学ｉＰＳ研究所ＣｉＲＡより購入）を用いた。なお、１２３１Ａ３株は、Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎの女性の末梢血単核球にエピソーマルベクターを用いてｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬ、ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ及びｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１ を導入して得られたｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は入手機関が推奨する培養方法に従って維持培養した。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞用培地としてＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（ＡＫ０２Ｎ、味の素（株））を用いて、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで、Sci. Rep, 4, 2014, 3594; DOI:10.1038/srep03594に記載の方法に従って、細胞を培養した。足場用のラミニンフラグメントとしては、ＬＭ１１１Ｅ８、ＬＭ１２１Ｅ８、ＬＭ３３２Ｅ８、ＬＭ４２１Ｅ８、ＬＭ５１１Ｅ８、及びＬＭ５２１Ｅ８（実施例１記載の手順で事前にディッシュにコーティングした）を用いた。
（２）ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹（ＮＣＳ）細胞の調製
Nature Protocols, 2010, 5:688-701、又はCell Reports, 2013, 3:1140-1152に記載の方法に基づいて、（１）で培養したｉＰＳ細胞をＮＣＳ細胞へと分化させた。該ｉＰＳ細胞を、ｎｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：６０５７－ＮＧ－１００／ＣＦ、５００ｎｇ／ｍＬ）及び／又はＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ社製、カタログ番号：１６１４、１０μＭ）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（添加剤Ｃ無添加）培地で５日間～２週間培養することにより、ＮＣＳ細胞への分化を誘導した。なお、分化誘導培養における足場としては、ｉＰＳ細胞からＮＣＳ細胞への分化誘導時には継代しないことから、ｉＰＳ細胞培養時にコーティングしたラミニンフラグメントがそのまま存在している。
（３）ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導
Ｂ－２７（商標）サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１７５０４－０４４、２質量％）、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：３３６－ＥＧ－２００、２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製、カタログ番号：０６４－０４５４１、４０ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、５０Ｕ、５０μｇ／ｍＬ）、及びＣＨＩＲ９９０２１（Ｃａｙｍａｎ社製、カタログ番号：１３１２２、３μＭ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１０５６５－０１８）により、（２）で調製したＮＣＳ細胞を３～５日間培養して、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化を誘導した。なお、分化誘導培養における足場としては、ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導時には継代しないことから、ｉＰＳ細胞培養時にコーティングしたラミニンフラグメントがそのまま存在している。次いで、ＳＫＰｓへ分化した細胞を培養細胞分離／分散溶液（商品名：Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号：５６１５２７）を用いて、ラミニンフラグメント足場なしで継代培養し、次いでＢ－２７（商標）サプリメント（２質量％）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、５０Ｕ、５０μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でさらに培養した。
（４）マーカータンパク質の発現
（３）で分化誘導された細胞におけるマーカータンパク質の発現を調べた。ラミニン存在下で分化誘導した継代培養後の細胞（ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１）について、ＳＫＰｓに特有のマーカータンパク質（ネスチン及びフィブロネクチン）の発現を免疫組織蛍光染色により調べた。細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。固定した細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．５質量％）のＰＢＳ溶液で５分間処理し、再びＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄後、１０％ヤギ血清（ニチレイ社製、カタログ番号：４２６０４１）にて室温で１時間ブロッキングした。その後、表２に示す１次抗体（室温、２時間）及び２次抗体（室温、１時間）で細胞を処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（同仁化学研究所製、カタログ番号：Ｈ３４１）で核を染色後、フルオロマウントＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、カタログ番号：０１００－０１）に包埋し、マーカータンパク質の発現を蛍光顕微鏡下で観察した。
Figure 0007285520000002
（５）結果
ＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化の誘導を示す顕微鏡写真を図１に示す。ｉＰＳ－ＮＣＳ（図１、１段目）は分化誘導の開始直前の細胞の顕微鏡写真を示し、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０（図１、２段目）は分化誘導４日後（継代前）の細胞の顕微鏡写真を示し、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１（図１、３段目）は継代培養後の細胞の顕微鏡写真を示す（全て倍率：４０倍）。また、得られた細胞におけるＳＫＰｓのマーカータンパク質（ネスチン、及びフィブロネクチン）の発現が蛍光顕微鏡下で観察された。なお同時に行ったＨｏｅｃｈｓｔ染色により、マーカー発現が観察された位置に生細胞が存在することが確認された（図１、４段目）（全て倍率：５０倍）。図１に示すように、ラミニン１１１、１２１、３３２、４２１、５１１及び５２１のフラグメントを含む培養環境下では、ＮＳＣからＳＫＰｓへの分化が観察された。特にラミニン１１１、３３２、４２１及び５１１のフラグメントの存在下で高効率にＳＫＰｓへの分化が誘導された。
実施例３ 修飾ラミニンフラグメント存在下でのＳＫＰｓの作製
（１）ＳＫＰｓの作製
実施例２の（１）～（３）と同様の手順で、ｉＰＳ細胞からＮＣＳ細胞を調製し、得られたＮＣＳ細胞からＳＫＰｓを分化誘導した。ＳＫＰｓへの分化誘導培地におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は３μＭとした。ＳＫＰｓへの分化誘導の培養期間は４日間とした。ｉＰＳ細胞の維持培養、ＮＣＳ細胞への分化誘導、及びＳＫＰｓへの分化誘導における足場用のラミニンフラグメントとしては、ＬＭ１１１Ｅ８、ＬＭ１２１Ｅ８、ＬＭ３３２Ｅ８、ＬＭ４２１Ｅ８、ＬＭ５１１Ｅ８、及びＬＭ５２１Ｅ８、ならびにパールカン修飾ラミニンフラグメント Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ１２１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ３３２Ｅ８、Ｐ－ＬＭ４２１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ５１１Ｅ８、及びＰ－ＬＭ５２１Ｅ８（いずれも実施例１記載の手順で事前にディッシュにコーティングした）を用いた。分化誘導したＳＫＰｓは、ラミニンフラグメント足場なしで継代培養した。ｉＰＳ細胞からＳＫＰｓを得るまでの培養の総日数は９日間であった。
（１）の手順で得られたＳＫＰｓを示す顕微鏡写真を図２に示す。図２に示すように、パールカン修飾ラミニンフラグメントの存在下では、非修飾ラミニンフラグメント存在下での培養と比べて、ＮＳＣからＳＫＰｓへの分化誘導効率の上昇が認められた。
（２）マーカー遺伝子の発現
（１）で分化誘導された細胞におけるマーカー遺伝子の発現を調べた。パールカン修飾ラミニンフラグメント（Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８）存在下で分化誘導した細胞について、分化誘導後かつ継代培養前（ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０）、及び継代培養後（ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１）における表３に示すマーカー遺伝子の発現をＰＣＲ法により調べた。表３に示すマーカーのうち、Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子、Ｓｌｕｇ遺伝子、Ｓｏｘ９遺伝子、Ｄｅｒｍｏ－１遺伝子、ＢＭＰ－４遺伝子、及びＷｎｔ－５ａ遺伝子はＳＫＰｓマーカーであり（Nat Cell Biol, 2004, 6:1082-1093, Stem Cell, 2005, 23,:727-737）、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＣＤ１３３遺伝子は毛乳頭細胞マーカーである（J Dermatol Sci,39, 2005, 147-154）。ＧＡＰＤＨ遺伝子はコントロールとして用いた。
細胞サンプルからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号：７４１０４）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡの濃度を測定し、一定量の全ＲＮＡを用いてＨｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：４３８７４０６）により逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡサンプル１μＬを鋳型とし、表３に示すプライマーセットを用いて、５０μＬの系でＰＣＲ反応を行った。酵素はＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製、カタログ番号：ＫＯＤ－２１１）を用いた。ＰＣＲは［９４℃、２ｍｉｎ→（９８℃、１０秒；６３℃、３０秒；６８℃、３０秒）×２５～３５サイクル］の反応プロトコールで実施した。反応液５μＬを１．５％アガロースゲル（タカラバイオ社製、カタログ番号：５００７１）／ＴＢＥバッファー（関東化学社製、カタログ番号：４６５１０－７８）を用いて１００Ｖで電気泳動した。
Figure 0007285520000003
電気泳動の結果を図３に示す。図３に示すように、分化誘導後の細胞にＳＫＰｓマーカー遺伝子の発現が検出された。これらのＳＫＰｓマーカーのほとんどが、Ｐ０とＰ１で発現が変わらないか、又はＰ１で発現が増加していた。したがって、（１）で分化誘導された細胞がＳＫＰｓであることが確認された。
（３）マーカータンパク質の発現
（１）で分化誘導された細胞におけるマーカータンパク質の発現を調べた。パールカン修飾ラミニンフラグメント（Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８）存在下で分化誘導した継代培養後の細胞（ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１）について、実施例２（４）と同様の手順で、ＳＫＰｓに特有のマーカータンパク質（ネスチン、フィブロネクチン及びαＳＭＡ）の発現を免疫組織蛍光染色により調べた。用いた１次抗体及び２次抗体は表４のとおりであった。
Figure 0007285520000004
結果を図４に示す。ここで、図４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれネスチン、フィブロネクチン及びαＳＭＡの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図４に示すように、継代培養後の細胞のほぼ全てでＳＫＰｓに特有のマーカータンパク質の発現が認められた。したがって、（１）で分化誘導された細胞がＳＫＰｓであることが確認された。
実施例４ ＳＫＰｓから組織細胞への分化誘導
実施例３で得られたパールカン修飾ラミニンフラグメント（Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８）存在下で分化誘導した継代培養後のＳＫＰｓについて、組織細胞への分化誘導能を調べた。
（１）脂肪細胞への分化の誘導
継代培養後のＳＫＰｓを、３×１０5ｃｅｌｌｓで３５ｍｍ径ディッシュに播種した。２４時間培養後、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｉ７０１８、０．４５ｎＭ）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｉ３５３６、２．０７μＭ）、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｄ４９０２、１００ｎＭ）、ウサギ血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｒ４５０５、１５％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：４２３６０－０３２）に交換し、さらに２週間培養した。その後、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：０８４３）を用い、添付のプロトコールに従って、細胞のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行った。
（２）骨細胞への分化の誘導
継代培養後のＳＫＰｓを３×１０5ｃｅｌｌｓで３５ｍｍ径ディッシュに播種した。２４時間培養後、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｄ４９０２、１００ｎＭ）、β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｇ９４２２、１０ｍＭ）、Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ａ８９６０、５０μＭ）、ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製、カタログ番号：ＳＨ３００７０．０３、１０質量％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：４２３６０－０３２）に交換し、さらに２週間培養した。その後、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：ＳＫ－５３００）を用い、添付のプロトコールに従って、細胞のアルカリフォスファターゼ染色を行った。
（３）シュワン細胞への分化の誘導
継代培養後のＳＫＰｓを、ＳＫＰｓ培養用培地〔２％ Ｂ－２７（商標）サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１７５０４－０４４）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：３３６－ＥＧ－２００）、４０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製、カタログ番号：０６４－０４５４１）、５０Ｕペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１５１４０－１２２）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１０５６５－０１８）〕を用い、予め２５倍希釈したラミニン１１１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｌ４５４４）及び０．１ｍｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｐ４７０７）でコーティングした培養皿（３５ｍｍ径ディッシュ）に、４．８×１０4ｃｅｌｌｓで播種した。２４時間培養後、５μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｆ３９１７）、５０ｎｇ／ｍＬ Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ－１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、カタログ番号：１００－０３）、２％ Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１７５０２－０４８）、１％ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製、カタログ番号：ＳＨ３００７０．０３Ｅ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１０５６５－０１８）に交換し、さらに２～３週間培養した。培養中、培地は２～３日に１回交換した。得られた細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。固定した細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００のＰＢＳ溶液で５分間処理し、再びＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄後、１０％ヤギ血清（ニチレイ社製、カタログ番号：４２６０４１）にて室温で１時間ブロッキングした。次いで、１次抗体（抗Ｓ１００β抗体、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｓ２５３２、室温、２時間）、及び２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１１０２９、室温、１時間）で細胞を処理した。その後、ＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製、カタログ番号：ＦＫ０４５）で核を染色後、フルオロマウントＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、カタログ番号：０１００－０１）に包埋し、シュワン細胞に特有のマーカータンパク質（Ｓ１００β）の発現を蛍光顕微鏡下で観察した。
（４）顕微鏡観察
染色した細胞の顕微鏡観察像を図５に示す。図５（Ａ）では、細胞中に染色された脂質が観察され、ＳＫＰｓが脂肪細胞に分化したことが示された。図５（Ｂ）では、アルカリフォスファターゼ陽性細胞が認められ、ＳＫＰｓが骨細胞に分化したことが示された。図５（Ｃ）では、Ｓ１００β陽性細胞が認められ、ＳＫＰｓがシュワン細胞に分化したことが示された。したがって、実施例３で得られた細胞が、脂肪細胞、骨細胞、及びシュワン細胞などのグリア細胞に分化可能なＳＫＰｓであることが確認された。
実施例５ ゼノフリー条件でのＳＫＰｓの作製
実施例２の（１）～（３）と同様の手順のゼノフリー条件下で、ｉＰＳ細胞からＮＣＳ細胞を調製し、得られたＮＣＳ細胞からＳＫＰｓを分化誘導した。ゼノフリー試薬としては、ｎｏｇｇｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｈ６６４１６－１０ＵＧ、５００ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ－２７（商標）サプリメント ＸｅｎｏＦｒｅｅ ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１４８６７－０１、２質量％）、ＥＧＦ（ヒゲタ醤油社製、カタログ番号：ＲＥＧ１００ＵＧ、２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、カタログ番号：ＲＣＨＥＯＴ００５，００６、４０ｎｇ／ｍＬ）を用いた。ＳＫＰｓへの分化誘導培地におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は３μＭとした。ＳＫＰｓへの分化誘導の培養期間は４日間とした。ｉＰＳ細胞の維持培養、ＮＣＳ細胞への分化誘導、及びＳＫＰｓへの分化誘導における足場用のラミニンフラグメントとしては、ＬＭ１１１Ｅ８、ＬＭ５１１Ｅ８、ならびにパールカン修飾ラミニンフラグメント Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８、及びＰ－ＬＭ５１１Ｅ８（いずれも実施例１記載の手順で事前にディッシュにコーティングした）を用いた。
得られたＮＣＳ細胞からＳＫＰｓへの分化誘導を示す顕微鏡写真を図６に示す。ｉＰＳ－ＮＣＳ（図６上）は分化誘導の開始直後の細胞の顕微鏡写真を示し、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０（図６中）は分化誘導４日後（継代前）の細胞の顕微鏡写真を示し、ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１（図６下）は継代培養後の細胞の顕微鏡写真を示す（全て倍率：４０倍）。図６に示すように、ラミニンフラグメント及びパールカン修飾ラミニンフラグメントの存在下では、ゼノフリー条件においてもＳＫＰｓへの分化が可能であった。
実施例６ ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹（ＮＣＳ）細胞の同定
実施例２の（１）～（２）の手順で得られたラミニンフラグメント及びパールカン修飾ラミニンフラグメント（ＬＭ１１１Ｅ８及びＰ－ＬＭ１１１Ｅ８）存在下で分化誘導したＮＣＳの性質を調べた。実施例２（２）の手順によるＮＣＳ細胞への分化培養の直前（分化０日、０ｄ）から８日培養後（８ｄ）までの細胞を用いて、実施例３（２）と同様の手順で、ｃＤＮＡサンプル２μＬを鋳型とし、表５に示すプライマー及びプローブを用いて、２０μＬの系でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲにはＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：４３５２０４２）を用いた。ＮＣＳへの分化の指標としては神経成長因子受容体（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｐ７５）の遺伝子発現を検出した。内部標準としてＲＰＬＰ０を用いた。遺伝子発現の変化は、内部標準で標準化した発現量に基づいて、分化０日（０ｄ）での各遺伝子の発現量を１とした場合の相対的な発現量として示した。
Figure 0007285520000005
結果を図７に示す。分化誘導が進むに従い、ＮＣＳ細胞のマーカー遺伝子であるｐ７５の発現上昇が認められた。従って、ラミニンフラグメント及び修飾ラミニンフラグメント上においてＮＣＳ細胞への分化誘導が可能であることが分かった。
実施例７ ラミニンフラグメント存在下でのＳＫＰｓの分化誘導率
実施例３（１）と同様の手順でＳＫＰｓを分化誘導した。足場用のラミニンフラグメントとしては、ラミニンフラグメントとして、ＬＭ１１１Ｅ８、ＬＭ１２１Ｅ８、ＬＭ３３２Ｅ８、ＬＭ４２１Ｅ８、ＬＭ５１１Ｅ８、及びＬＭ５２１Ｅ８、ならびに、パールカン修飾ラミニンフラグメントとして、Ｐ－ＬＭ１１１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ１２１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ３３２Ｅ８、Ｐ－ＬＭ４２１Ｅ８、Ｐ－ＬＭ５１１Ｅ８、及びＰ－ＬＭ５２１Ｅ８を用いた。分化誘導したＳＫＰｓ（継代培養前：ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ０）を、同希釈率で４８ウェルプレートに継代した（ｉＰＳ－ＳＫＰｓ Ｐ１）。継代培養は、ラミニンフラグメント足場なしで行った。継代３日後の培養物の細胞数を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、カタログ番号：３４７－０７６２１）を用いて測定した。培養物にキットの試薬溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで一定時間（１～３時間）培養した後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することで、培養物の呼吸活性（生細胞数）を評価した。
結果を図８に示す。いずれの種類のラミニンフラグメントにおいても、非修飾フラグメントと比較して、パールカン修飾ラミニンフラグメントを用いた場合、分化誘導された細胞数が統計学的に有意に多かった（ｔ検定、P < 0.0005）。

Claims (22)

  1. 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法であって、
    神経堤幹細胞を、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で培養して皮膚由来多能性前駆細胞へと分化させること、
    を含み、
    該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    該ラミニンのフラグメントが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１から選択されるラミニンのＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種である、
    方法。
  2. 前記神経堤幹細胞を作製する工程をさらに含み、
    該工程は、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させることを含み、
    該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    該ラミニンのフラグメントが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１から選択されるラミニンのＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種である、
    請求項１記載の方法。
  3. 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種が、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下での神経堤幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培地で該細胞を培養することを含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下での多能性幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培地で該細胞を培養することを含む、請求項２～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 前記神経堤幹細胞の培養が、Ｗｎｔシグナルアゴニストを含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 前記多能性幹細胞の培養が、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＢＭＰシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、請求項２～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記皮膚由来多能性前駆細胞がネスチン及びフィブロネクチンを共発現する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 前記神経堤幹細胞がヒト由来神経堤幹細胞である、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 神経堤幹細胞の作製方法であって、
    パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下で、多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させること、
    を含み、
    該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    該ラミニンのフラグメントが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１から選択されるラミニンのＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種である、
    方法。
  11. 前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種の存在下での細胞の培養が、該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を含む培地で該細胞を培養することを含む、請求項１０記載の方法。
  12. 前記多能性幹細胞の培養が、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＢＭＰシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、請求項１０又は１１記載の方法。
  13. 前記多能性幹細胞がヒト由来多能性幹細胞である、請求項１０～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 前記細胞の培養がフィーダー細胞を用いることなく行われる、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 前記細胞の培養が異種由来成分の非存在下で行われる、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
    該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    該ラミニンのフラグメントが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１から選択されるラミニンのＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種である、
    足場材。
  17. 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種が、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、請求項１６記載の足場材。
  18. パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
    該ラミニンが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    該ラミニンのフラグメントが、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１から選択されるラミニンのＥ８フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種である、
    足場材。
  19. 請求項１６又は１７記載の、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための培養基材。
  20. 請求項１６又は１７記載の、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
  21. 請求項１８記載の、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための培養基材。
  22. 請求項１８記載の、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023106122A1 (ja) * 2021-12-06 2023-06-15 国立大学法人京都大学 間葉系譜への分化に特化した神経堤細胞の製造方法
KR20240125943A (ko) * 2021-12-27 2024-08-20 스미토모 파마 가부시키가이샤 신경능 세포의 배양 방법 및 제조 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012137970A1 (ja) 2011-04-08 2012-10-11 国立大学法人大阪大学 改変ラミニンおよびその利用
JP2015213495A (ja) 2014-04-21 2015-12-03 花王株式会社 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法
WO2018088501A1 (ja) 2016-11-11 2018-05-17 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5590646B2 (ja) 2009-10-08 2014-09-17 国立大学法人大阪大学 ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用
WO2014103534A1 (ja) 2012-12-28 2014-07-03 国立大学法人大阪大学 コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用
US10287541B2 (en) * 2013-06-12 2019-05-14 Osaka University Cell culture vessel coated with laminin fragment in dry state
CN106167790B (zh) * 2016-06-22 2019-11-19 中国人民解放军总医院 人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的方法
JP7078934B2 (ja) 2016-08-25 2022-06-02 国立大学法人京都大学 特定のラミニン上での多能性幹細胞の培養方法
WO2018143312A1 (ja) * 2017-01-31 2018-08-09 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞の分化制御方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012137970A1 (ja) 2011-04-08 2012-10-11 国立大学法人大阪大学 改変ラミニンおよびその利用
JP2015213495A (ja) 2014-04-21 2015-12-03 花王株式会社 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法
WO2018088501A1 (ja) 2016-11-11 2018-05-17 国立大学法人大阪大学 多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, G. et al., Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells, Nature Protocols, 2010, Vol.5, No.4, pp.688-701
谿口征雅他, 再生医療用細胞培養基質の開発, 生物工学, 2018, Vol.96, No.6, pp.328-332

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