JP7285520B2 - 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 - Google Patents
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Description
を含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
方法、を提供する。
別の態様において、本発明は、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
足場材、を提供する。
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で、多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
方法、を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
足場材、を提供する。
該ラミニンとそのフラグメントは、いずれか一方を用いてもよく、又は両方を組み合わせて用いてもよい。したがって、該SKPsへの分化誘導培養に利用可能なラミニン及び/又はそのフラグメントとは、好ましくは、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種であり得、より好ましくは、ラミニン111、ラミニン332、ラミニン421、及びラミニン511、ならびにそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種であり得る。
該ラミニンフラグメントの例としては、上記に挙げたラミニン種の全長タンパク質と同様の細胞接着活性を有するラミニンのフラグメントであればよく、その分子量及び構造は特に限定されない。該SKPsへの分化誘導培養に利用可能なラミニンフラグメントの好ましい例としては、インテグリン結合活性を有する、上記に挙げたラミニン種のフラグメントが挙げられ、より好ましい例としては、上記に挙げたラミニン種のE8フラグメントを含むフラグメントが挙げられ、さらに好ましい例としては、上記に挙げたラミニン種のE8フラグメントが挙げられる。
さらに別の一態様において、本発明は、該本発明の足場材を含有する、多能性幹細胞からNCS細胞への分化誘導培養のための培養基材を提供する。また本発明は、該本発明の足場材を含有する、多能性幹細胞からNCS細胞への分化誘導培養のための細胞培養キットを提供する。好ましい実施形態において、該多能性幹細胞からNCS細胞への分化誘導培養のための培養基材又は細胞培養キットにおける、本発明の足場材に含まれるラミニン及び/又はそのフラグメントは、上述したパールカン修飾-ラミニン/フラグメントである。
好ましい実施形態において、該本発明の培養基材は、該ラミニン及び/又はそのフラグメントを含有するコーティングを有する培養基材(例えばプレート、メッシュ、ディッシュ等)であり、より好ましくは、該ラミニン及び/又はそのフラグメントを含むコーティング剤によりコートされることで該ラミニン及び/又はそのフラグメントが吸着している培養基材である。好ましい実施形態において、該本発明の細胞培養キットは、該ラミニン及び/又はそのフラグメントに加えて、必要に応じて、培養基材、多能性幹細胞からNCS細胞への分化誘導もしくはNCS細胞からSKPsへの分化誘導のための分化培地やその添加剤、多能性幹細胞の維持培養のための培地やその添加剤、などを含んでいてもよい。該本発明の細胞培養キットに含まれる該ラミニン及び/又はそのフラグメントは、培養基材にコーティングされていてもよく、又は培養基材をコーティングするためのコーティング剤もしくは培地に含有されていてもよい。
神経堤幹細胞を、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で培養して皮膚由来多能性前駆細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
方法。
〔2〕好ましくは、前記神経堤幹細胞を作製する工程をさらに含み、
該工程は、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させることを含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
〔1〕記載の方法。
〔3〕好ましくは、予めラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で前記多能性幹細胞を維持培養することをさらに含む、〔2〕記載の方法。
〔4〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンE8フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔1〕~〔3〕のいずれか1項記載の方法。
〔5〕前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種が、
好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントを含み、
より好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、
〔1〕~〔4〕のいずれか1項記載の方法。
〔6〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインI~IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインIを含むフラグメントである、
〔5〕記載の方法。
〔7〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下での神経堤幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培地で該細胞を培養することを含む、〔1〕~〔6〕のいずれか1項記載の方法。
〔8〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下での多能性幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培地で該細胞を培養することを含む、〔2〕~〔7〕のいずれか1項記載の方法。
〔9〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の使用量は、前記培養基材が培養物と接触する面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgであるか、又は、前記培地1mLあたりの最終濃度として、好ましくは0.1~100μg、より好ましくは0.2~20μgである、あるいは、
前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を前記培養基材のコーティング剤に添加して使用する場合、該コーティング剤における該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量は、コーティングする面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgである、
〔7〕又は〔8〕記載の方法。
〔10〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養が、Wntシグナルアゴニストを含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、〔1〕~〔9〕のいずれか1項記載の方法。
〔11〕前記Wntシグナルアゴニストが、
好ましくは、β-カテニン経路を活性化する因子であり、
より好ましくは、β-カテニンのリン酸化酵素阻害剤であり、
さらに好ましくは、GSK-3阻害剤であり、
さらに好ましくは、アミノピリミジン化合物、ビス-インドロ(インジルビン)化合物(BIO)又はそのアセトキシム化合物、チアジアゾリジン(TDZD)化合物、オキソチアジアゾリジン-3-チオン化合物、チエニルα-クロロメチルケトン化合物、フェニルαブロモメチルケトン化合物、チアゾール含有尿素化合物、1H-ピラゾロ[3,4-b]キノキサリン-3-アミン、(2,4ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ビロール-2,5-ジオン、3-[(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ]-4-(2-ニトロフェニル)-1H-ビロール-2,5-ジオン、GSK-3β inhibitor XII、及びGSK-3βペプチド阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種であり、
さらに好ましくは、GSK-3 Inhibitor XVI、(2’Z,3’E)-6-ブロモインジルビン-3’-オキシム(CAS 667463-62-9)、1H-ピラゾロ[3,4-b]キノキサリン-3-アミン、(2,4ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ビロール-2,5-ジオン、3-[(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ]-4-(2-ニトロフェニル)-1H-ビロール-2,5-ジオン、及びGSK-3β inhibitor XIIからなる群より選択される少なくとも1種であり、
さらに好ましくはGSK-3 Inhibitor XVIである、
〔10〕記載の方法。
〔12〕前記分化培地における前記Wntシグナルアゴニストの濃度が、好ましくは0.5~5μM、より好ましくは2~4μMである、〔10〕又は〔11〕記載の方法。
〔13〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養が、栄養因子を含有する分化培地で該細胞を培養することを含み、
該栄養因子が、
好ましくは血清代替物、EGF、及びbFGFからなる群より選ばれる少なくとも1種であり、
より好ましくは血清代替物、EGF及びbFGFである、
〔1〕~〔12〕のいずれか1項記載の方法。
〔14〕前記分化培地における前記血清代替物の濃度が、好ましくは0.5~20質量%、より好ましくは1~5質量%であり、
前記分化培地における前記EGF及びbFGFの濃度が、それぞれ、好ましくは1~100ng/mL、より好ましくは10~50ng/mLである、
〔13〕記載の方法。
〔15〕好ましくは、前記多能性幹細胞を培養して分化させる工程が、TGFβシグナル阻害剤及びBMPシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、〔2〕~〔14〕のいずれか1項記載の方法。
〔16〕好ましくは、前記TGFβシグナル阻害剤が4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドであり、前記BMPシグナル阻害剤がnogginである、〔15〕記載の方法。
〔17〕好ましくは、前記皮膚由来多能性前駆細胞がネスチン及びフィブロネクチンを共発現する、〔1〕~〔16〕のいずれか1項のいずれか1項記載の方法。
〔18〕好ましくは、前記神経堤幹細胞がヒト由来神経堤幹細胞である、〔1〕~〔17〕のいずれか1項記載の方法。
〔19〕好ましくは、前記神経堤幹細胞が多能性幹細胞に由来する神経堤幹細胞である、〔1〕~〔18〕のいずれか1項記載の方法。
〔20〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養がフィーダー細胞を用いることなく行われる、〔1〕~〔19〕のいずれか1項記載の方法。
〔21〕好ましくは、前記神経堤幹細胞の培養が異種由来成分の非存在下で行われる、〔1〕~〔20〕のいずれか1項記載の方法。
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で、多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
方法。
〔23〕好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で、前記多能性幹細胞を予め維持培養することをさらに含む、〔22〕記載の方法。
〔24〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンE8フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔22〕又は〔23〕記載の方法。
〔25〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインI~IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインIを含むフラグメントである、
〔22〕~〔24〕のいずれか1項記載の方法。
〔26〕好ましくは、前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下での細胞の培養が、該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培地で該細胞を培養することを含む、〔22〕~〔25〕のいずれか1項記載の方法。
〔27〕好ましくは、前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の使用量は、前記培養基材が培養物と接触する面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgであるか、又は、前記培地1mLあたりの最終濃度として、好ましくは0.1~100μg、より好ましくは0.2~20μgである、
あるいは、
前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を前記培養基材のコーティング剤に添加して使用する場合、該コーティング剤における該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量は、コーティングする面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgである、
〔26〕記載の方法。
〔28〕好ましくは、前記多能性幹細胞を培養して分化させる工程が、TGFβシグナル阻害剤及びBMPシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含み、
より好ましくは、該TGFβシグナル阻害剤が4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドであり、前記BMPシグナル阻害剤がnogginである、
〔22〕~〔27〕のいずれか1項記載の方法。
〔29〕好ましくは、前記多能性幹細胞がヒト由来多能性幹細胞である、〔22〕~〔28〕のいずれか1項記載の方法。
〔30〕好ましくは、前記多能性幹細胞の培養がフィーダー細胞を用いることなく行われる、〔22〕~〔29〕のいずれか1項記載の方法。
〔31〕好ましくは、前記多能性幹細胞の培養が異種由来成分の非存在下で行われる、〔22〕~〔30〕のいずれか1項記載の方法。
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
足場材。
〔33〕パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
足場材。
〔34〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくはインテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンE8フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔32〕又は〔33〕記載の足場材。
〔35〕前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種が、
好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントを含み、
より好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、
〔32〕~〔34〕のいずれか1項記載の足場材。
〔36〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインI~IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインIを含むフラグメントである、
〔33〕~〔35〕のいずれか1項記載の足場材。
〔37〕好ましくは、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有するコーティングを有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有するコーティング剤であるか、あるいは前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有する培地である、〔32〕~〔36〕のいずれか1項記載の足場材。
〔38〕前記培養基材における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量が、該培養基材が培養物と接触する面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgであるか、
前記培地における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量が、該培地1mLあたりの最終濃度として、好ましくは0.1~100μg、より好ましくは0.2~20μgであるか、あるいは、
前記コーティング剤における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量が、該コーティング剤がコーティングする面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgである、
〔37〕記載の足場材。
〔39〕前記〔32〕、〔34〕~〔38〕のいずれか1項記載の足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための培養基材。
〔40〕前記〔32〕、〔34〕~〔38〕のいずれか1項記載の足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
〔41〕前記〔33〕~〔38〕のいずれか1項記載の足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための培養基材。
〔42〕前記〔33〕~〔38〕のいずれか1項記載の足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
使用。
〔44〕多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材の製造における、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
使用。
〔45〕神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材としての、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
使用。
〔46〕多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材としての、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の使用であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である、
使用。
〔47〕前記ラミニンフラグメントが、
好ましくは、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントであり、
より好ましくは、ラミニンE8フラグメントを含むラミニンフラグメントである、
〔43〕~〔46〕のいずれか1項記載の使用。
〔48〕前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種が、
好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントを含み、
より好ましくは、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、該ラミニン又はそのフラグメントである、
〔43〕~〔47〕のいずれか1項記載の使用。
〔49〕前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが、
好ましくは、パールカンのドメインI~IIIのいずれかを含むフラグメントであり、
より好ましくは、パールカンのドメインIを含むフラグメントである、
〔44〕、〔46〕~〔48〕のいずれか1項記載の使用。
〔50〕好ましくは、前記足場材が、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有するコーティングを有する培養基材であるか、前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有するコーティング剤であるか、あるいは前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含有する培地である、〔43〕~〔49〕いずれか1項記載の使用。
〔51〕前記培養基材における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量が、該培養基材が培養物と接触する面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgであるか、
前記培地における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量が、該培地1mLあたりの最終濃度として、好ましくは0.1~100μg、より好ましくは0.2~20μgであるか、あるいは、
前記コーティング剤における前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の含有量が、該コーティング剤がコーティングする面積1cm2あたり、好ましくは0.05~50μg、より好ましくは0.1~10μgである、
〔50〕記載の使用。
〔52〕神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材として用いるための、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種、ここで該ラミニンは、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である。
〔53〕多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材として用いるための、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種、ここで該ラミニンは、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1種である。
〔54〕ex vivo方法である、〔1〕~〔31〕のいずれか1項記載の方法。
〔55〕前記培養が生きたヒト又は動物の個体上又は個体内での培養を含まない、〔1〕~〔31〕のいずれか1項記載の方法。
〔56〕ex vivoにおける使用である、〔43〕~〔51〕のいずれか1項記載の使用。
〔57〕前記使用が生きたヒト又は動物の個体上又は個体内での使用を含まない、〔43〕~〔51〕のいずれか1項記載の使用。
足場用のラミニンフラグメントとして、ラミニン111のE8フラグメント(LM111E8)、ラミニン121のE8フラグメント(LM121E8)、ラミニン332のE8フラグメント(LM332E8)、ラミニン421のE8フラグメント(LM421E8)、ラミニン511のE8フラグメント(LM511E8)、及びラミニン521のE8フラグメント(LM521E8)を国際公開公報第2014/103534号に記載の方法に従って調製した。
(1)パールカン修飾LM511E8(P-LM511E8)の調製
ヒトパールカンのドメインI(Gly25-Pro196)(以下、Pln-D1ともいう)フラグメントがヒトラミニンα5鎖E8フラグメントのC末端部に融合したラミニン511E8フラグメント(以下、パールカン修飾LM511E8、又はP-LM511E8ともいう)を、国際公開公報第2014/199754号に記載の方法に従って下記の手順で調製した。
最初に、クローニング用プラスミドpBluescript KS(+)(Stratagene)を鋳型として、以下の3種類のプライマーセットを用いてPCRを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のEcoRVの5’側に6×Hisタグ(HHHHHH)をコードするDNA配列、HA(ヘマグルチニン)タグ(YPYDVPDYA)をコードするDNA配列、又はFLAGタグ(DYKDDDDK)をコードするDNA配列が挿入された3種類のpBluescript KS(+)をそれぞれ作製した。
(i) 6×Hisタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号1)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’(reverse、配列番号2)
(ii) HAタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号3)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号4)
(iii) FLAGタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号5)
5’-GATGATGATAAGGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号6)
(iv) α5鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’(forward、配列番号7)
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’(reverse、配列番号8)
(v) β1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’(forward、配列番号9)
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’(reverse、配列番号10)
(vi) γ1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’(forward、配列番号11)
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’(reverse、配列番号12)
(vii) リンカー配列導入のための増幅用プライマー
5’-CCTCAAGCGGCTGAACACGACAGGCG-3’(forward、配列番号14)
5’-ATATGGATCCTGGAAAAGCCCGGGGCTCTGGCAAGAGCTTGCTGTCCTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGG-3’
(reverse、配列番号15、制限酵素BamHI認識配列が含まれている)
得られたDNA断片を制限酵素AscI(この制限酵素の認識配列はヒトラミニンα5鎖E8フラグメントのC末端部分をコードするDNA配列内に存在する)とBamHIで消化し、DNA断片1とした。
(viii) Pln-D1配列増幅用プライマー
5’-ATATATATGGATCCGGGCTGAGGGCATACGATGGCTTGTCTCTG-3’
(forward、配列番号16、制限酵素BamHI認識配列が含まれている)
5’-ATATATATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGTGGGAACTGGGGCACTGTGCCCAG-3’
(reverse、配列番号17、制限酵素NotI認識配列が含まれている)
得られたDNA断片を制限酵素BamHIとNotIで消化し、DNA断片2とした。
Pln-D1融合ヒトラミニンα5鎖E8フラグメント発現ベクターを、ヒトβ1鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)発現ベクター及びヒトγ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)発現ベクターと混合して、ヒト腎臓由来293F細胞にトランスフェクトし、72時間培養を行った後、培養液を回収し、Ni-NTA agaroseとANTI-FLAG M2 affinity Gel(シグマ)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、Pln-D1が融合したラミニン511のE8フラグメント(P-LM511E8)を精製した。
α5鎖E8をα1鎖E8に変更した以外は(1)と同様の手順で、Pln-D1が融合したラミニン111のE8フラグメント(P-LM111E8)を調製した。
α5鎖E8をα1鎖E8に、及びβ1鎖E8をβ2鎖E8に変更した以外は(1)と同様の手順で、Pln-D1が融合したラミニン121のE8フラグメント(P-LM121E8)を調製した。
α鎖、β鎖及びγ鎖にα3鎖、β3鎖及びγ2鎖を用いた以外は(1)と同様の手順で、Pln-D1が融合したラミニン332のE8フラグメント(P-LM332E8)を調製した。
α鎖、β鎖及びγ鎖にα4鎖、β2鎖及びγ1鎖を用いた以外は(1)と同様の手順で、Pln-D1が融合したラミニン421のE8フラグメント(P-LM421E8)を調製した。
β1鎖E8をβ2鎖E8に変更した以外は(1)と同様の手順で、Pln-D1が融合したラミニン521のE8フラグメント(P-LM521E8)を調製した。
(1)ラミニン足場の構築
参考例1で準備した各種ラミニン又は参考例2で調製したパールカン修飾ラミニンは、予め培養基材にコーティングするか、又は細胞と同時に培地に添加した。予めコーティングする場合は、Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)(Life Technologies社製、カタログ番号:14190-250)に各種ラミニンを溶解させ、得られたラミニン溶液(ラミニン2.5μg/mL含有)を培養基材(35mm径ディッシュ)の表面に広げ(ラミニン最終濃度:約0.5μg/コーティング面積cm2)、37℃で1時間静置した後、DPBSで洗浄し、該培養基材にコーティングを形成した。培地に添加する場合は、培地中の最終濃度が1.25μg/mLの範囲になるように、培地への各種ラミニンの添加量を調整した。これらのラミニン足場を含む培養環境下で、以下の実施例での細胞培養を行った。
(1)iPS細胞の培養
多能性幹細胞として、ヒト由来のiPS細胞(クローン名:1231A3、京都大学iPS研究所CiRAより購入)を用いた。なお、1231A3株は、African Americanの女性の末梢血単核球にエピソーマルベクターを用いてpCE-hOCT3/4、pCE-hSK、pCE-hUL、pCE-mp53DD及びpCXB-EBNA1 を導入して得られたiPS細胞である。iPS細胞は入手機関が推奨する培養方法に従って維持培養した。すなわち、ヒトiPS細胞用培地としてStemFit(登録商標)(AK02N、味の素(株))を用いて、37℃、5%CO2のインキュベーターで、Sci. Rep, 4, 2014, 3594; DOI:10.1038/srep03594に記載の方法に従って、細胞を培養した。足場用のラミニンフラグメントとしては、LM111E8、LM121E8、LM332E8、LM421E8、LM511E8、及びLM521E8(実施例1記載の手順で事前にディッシュにコーティングした)を用いた。
Nature Protocols, 2010, 5:688-701、又はCell Reports, 2013, 3:1140-1152に記載の方法に基づいて、(1)で培養したiPS細胞をNCS細胞へと分化させた。該iPS細胞を、noggin(R&D Systems社製、カタログ番号:6057-NG-100/CF、500ng/mL)及び/又はSB431542(TOCRIS社製、カタログ番号:1614、10μM)を含むStemFit(登録商標)AK02N(添加剤C無添加)培地で5日間~2週間培養することにより、NCS細胞への分化を誘導した。なお、分化誘導培養における足場としては、iPS細胞からNCS細胞への分化誘導時には継代しないことから、iPS細胞培養時にコーティングしたラミニンフラグメントがそのまま存在している。
B-27(商標)サプリメント(Life Technologies社製、カタログ番号:17504-044、2質量%)、EGF(R&D Systems社製、カタログ番号:336-EG-200、20ng/mL)、bFGF(Wako社製、カタログ番号:064-04541、40ng/mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製、カタログ番号:15140-122、50U、50μg/mL)、及びCHIR99021(Cayman社製、カタログ番号:13122、3μM)を含むDMEM/F12培地(Life Technologies社製、カタログ番号:10565-018)により、(2)で調製したNCS細胞を3~5日間培養して、NCS細胞からSKPsへの分化を誘導した。なお、分化誘導培養における足場としては、NCS細胞からSKPsへの分化誘導時には継代しないことから、iPS細胞培養時にコーティングしたラミニンフラグメントがそのまま存在している。次いで、SKPsへ分化した細胞を培養細胞分離/分散溶液(商品名:Accutase、BD Biosciences社製、カタログ番号:561527)を用いて、ラミニンフラグメント足場なしで継代培養し、次いでB-27(商標)サプリメント(2質量%)、EGF(20ng/mL)、bFGF(40ng/mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製、カタログ番号:15140-122、50U、50μg/mL)を含むDMEM/F12培地でさらに培養した。
(3)で分化誘導された細胞におけるマーカータンパク質の発現を調べた。ラミニン存在下で分化誘導した継代培養後の細胞(iPS-SKPs P1)について、SKPsに特有のマーカータンパク質(ネスチン及びフィブロネクチン)の発現を免疫組織蛍光染色により調べた。細胞をD-PBS(-)で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。固定した細胞をD-PBS(-)で洗浄後、Triton X-100(0.5質量%)のPBS溶液で5分間処理し、再びD-PBS(-)で洗浄後、10%ヤギ血清(ニチレイ社製、カタログ番号:426041)にて室温で1時間ブロッキングした。その後、表2に示す1次抗体(室温、2時間)及び2次抗体(室温、1時間)で細胞を処理し、Hoechst33258(同仁化学研究所製、カタログ番号:H341)で核を染色後、フルオロマウントG(Southern Biotech社製、カタログ番号:0100-01)に包埋し、マーカータンパク質の発現を蛍光顕微鏡下で観察した。
NCS細胞からSKPsへの分化の誘導を示す顕微鏡写真を図1に示す。iPS-NCS(図1、1段目)は分化誘導の開始直前の細胞の顕微鏡写真を示し、iPS-SKPs P0(図1、2段目)は分化誘導4日後(継代前)の細胞の顕微鏡写真を示し、iPS-SKPs P1(図1、3段目)は継代培養後の細胞の顕微鏡写真を示す(全て倍率:40倍)。また、得られた細胞におけるSKPsのマーカータンパク質(ネスチン、及びフィブロネクチン)の発現が蛍光顕微鏡下で観察された。なお同時に行ったHoechst染色により、マーカー発現が観察された位置に生細胞が存在することが確認された(図1、4段目)(全て倍率:50倍)。図1に示すように、ラミニン111、121、332、421、511及び521のフラグメントを含む培養環境下では、NSCからSKPsへの分化が観察された。特にラミニン111、332、421及び511のフラグメントの存在下で高効率にSKPsへの分化が誘導された。
(1)SKPsの作製
実施例2の(1)~(3)と同様の手順で、iPS細胞からNCS細胞を調製し、得られたNCS細胞からSKPsを分化誘導した。SKPsへの分化誘導培地におけるCHIR99021の濃度は3μMとした。SKPsへの分化誘導の培養期間は4日間とした。iPS細胞の維持培養、NCS細胞への分化誘導、及びSKPsへの分化誘導における足場用のラミニンフラグメントとしては、LM111E8、LM121E8、LM332E8、LM421E8、LM511E8、及びLM521E8、ならびにパールカン修飾ラミニンフラグメント P-LM111E8、P-LM121E8、P-LM332E8、P-LM421E8、P-LM511E8、及びP-LM521E8(いずれも実施例1記載の手順で事前にディッシュにコーティングした)を用いた。分化誘導したSKPsは、ラミニンフラグメント足場なしで継代培養した。iPS細胞からSKPsを得るまでの培養の総日数は9日間であった。
(1)で分化誘導された細胞におけるマーカー遺伝子の発現を調べた。パールカン修飾ラミニンフラグメント(P-LM111E8)存在下で分化誘導した細胞について、分化誘導後かつ継代培養前(iPS-SKPs P0)、及び継代培養後(iPS-SKPs P1)における表3に示すマーカー遺伝子の発現をPCR法により調べた。表3に示すマーカーのうち、Nestin遺伝子、Slug遺伝子、Sox9遺伝子、Dermo-1遺伝子、BMP-4遺伝子、及びWnt-5a遺伝子はSKPsマーカーであり(Nat Cell Biol, 2004, 6:1082-1093, Stem Cell, 2005, 23,:727-737)、Versican遺伝子及びCD133遺伝子は毛乳頭細胞マーカーである(J Dermatol Sci,39, 2005, 147-154)。GAPDH遺伝子はコントロールとして用いた。
(1)で分化誘導された細胞におけるマーカータンパク質の発現を調べた。パールカン修飾ラミニンフラグメント(P-LM111E8)存在下で分化誘導した継代培養後の細胞(iPS-SKPs P1)について、実施例2(4)と同様の手順で、SKPsに特有のマーカータンパク質(ネスチン、フィブロネクチン及びαSMA)の発現を免疫組織蛍光染色により調べた。用いた1次抗体及び2次抗体は表4のとおりであった。
実施例3で得られたパールカン修飾ラミニンフラグメント(P-LM111E8)存在下で分化誘導した継代培養後のSKPsについて、組織細胞への分化誘導能を調べた。
継代培養後のSKPsを、3×105cellsで35mm径ディッシュに播種した。24時間培養後、3-イソブチル-1-メチルキサンチン(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:I7018、0.45nM)、インスリン(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:I3536、2.07μM)、デキサメタゾン(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:D4902、100nM)、ウサギ血清(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:R4505、15%)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製、カタログ番号:15140-122、100U、100μg/mL)を含むMEM培地(Life Technologies社製、カタログ番号:42360-032)に交換し、さらに2週間培養した。その後、Oil Red O staining Kit(ScienCell Research Laboratories社製、カタログ番号:0843)を用い、添付のプロトコールに従って、細胞のOil Red O染色を行った。
継代培養後のSKPsを3×105cellsで35mm径ディッシュに播種した。24時間培養後、デキサメタゾン(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:D4902、100nM)、β-glycerophosphate(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:G9422、10mM)、L-Ascorbic acid-2-phosphate(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:A8960、50μM)、ウシ血清(Hyclone社製、カタログ番号:SH30070.03、10質量%)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製、カタログ番号:15140-122、100U、100μg/mL)を含むMEM培地(Life Technologies社製、カタログ番号:42360-032)に交換し、さらに2週間培養した。その後、Alkaline Phosphatasee Substrate Kit(Vector Laboratories社製、カタログ番号:SK-5300)を用い、添付のプロトコールに従って、細胞のアルカリフォスファターゼ染色を行った。
継代培養後のSKPsを、SKPs培養用培地〔2% B-27(商標)サプリメント(Life Technologies社製、カタログ番号:17504-044)、20ng/mL EGF(R&D Systems社製、カタログ番号:336-EG-200)、40ng/mL bFGF(Wako社製、カタログ番号:064-04541)、50Uペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン(Life Technologies社製、カタログ番号:15140-122)を含むDMEM/F12培地(Life Technologies社製、カタログ番号:10565-018)〕を用い、予め25倍希釈したラミニン111(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:L4544)及び0.1mg/mL Poly-L-lysine(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:P4707)でコーティングした培養皿(35mm径ディッシュ)に、4.8×104cellsで播種した。24時間培養後、5μM Forskoline(Sigma Aldrich社製、カタログ番号:F3917)、50ng/mL Heregulin-1β(Peprotech社製、カタログ番号:100-03)、2% N2サプリメント(Life Technologies社製、カタログ番号:17502-048)、1%ウシ血清(Hyclone社製、カタログ番号:SH30070.03E)を含むDMEM/F12培地(Life Technologies社製、カタログ番号:10565-018)に交換し、さらに2~3週間培養した。培養中、培地は2~3日に1回交換した。得られた細胞をD-PBS(-)で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。固定した細胞をD-PBS(-)で洗浄後、0.5% Triton X-100のPBS溶液で5分間処理し、再びD-PBS(-)で洗浄後、10%ヤギ血清(ニチレイ社製、カタログ番号:426041)にて室温で1時間ブロッキングした。次いで、1次抗体(抗S100β抗体、Sigma Aldrich社製、カタログ番号:S2532、室温、2時間)、及び2次抗体(Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(H+L)、Life Technologies社製、カタログ番号:A11029、室温、1時間)で細胞を処理した。その後、DAPI(DOJINDO社製、カタログ番号:FK045)で核を染色後、フルオロマウントG(Southern Biotech社製、カタログ番号:0100-01)に包埋し、シュワン細胞に特有のマーカータンパク質(S100β)の発現を蛍光顕微鏡下で観察した。
染色した細胞の顕微鏡観察像を図5に示す。図5(A)では、細胞中に染色された脂質が観察され、SKPsが脂肪細胞に分化したことが示された。図5(B)では、アルカリフォスファターゼ陽性細胞が認められ、SKPsが骨細胞に分化したことが示された。図5(C)では、S100β陽性細胞が認められ、SKPsがシュワン細胞に分化したことが示された。したがって、実施例3で得られた細胞が、脂肪細胞、骨細胞、及びシュワン細胞などのグリア細胞に分化可能なSKPsであることが確認された。
実施例2の(1)~(3)と同様の手順のゼノフリー条件下で、iPS細胞からNCS細胞を調製し、得られたNCS細胞からSKPsを分化誘導した。ゼノフリー試薬としては、noggin(SIGMA社製、カタログ番号:H66416-10UG、500ng/mL)、B-27(商標)サプリメント XenoFree CTS(Life Technologies社製、カタログ番号:A14867-01、2質量%)、EGF(ヒゲタ醤油社製、カタログ番号:REG100UG、20ng/mL)、bFGF(ReproCell社製、カタログ番号:RCHEOT005,006、40ng/mL)を用いた。SKPsへの分化誘導培地におけるCHIR99021の濃度は3μMとした。SKPsへの分化誘導の培養期間は4日間とした。iPS細胞の維持培養、NCS細胞への分化誘導、及びSKPsへの分化誘導における足場用のラミニンフラグメントとしては、LM111E8、LM511E8、ならびにパールカン修飾ラミニンフラグメント P-LM111E8、及びP-LM511E8(いずれも実施例1記載の手順で事前にディッシュにコーティングした)を用いた。
実施例2の(1)~(2)の手順で得られたラミニンフラグメント及びパールカン修飾ラミニンフラグメント(LM111E8及びP-LM111E8)存在下で分化誘導したNCSの性質を調べた。実施例2(2)の手順によるNCS細胞への分化培養の直前(分化0日、0d)から8日培養後(8d)までの細胞を用いて、実施例3(2)と同様の手順で、cDNAサンプル2μLを鋳型とし、表5に示すプライマー及びプローブを用いて、20μLの系でPCR反応を行った。PCRにはTaqman Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems社製、カタログ番号:4352042)を用いた。NCSへの分化の指標としては神経成長因子受容体(Nerve Growth Factor Receptor:p75)の遺伝子発現を検出した。内部標準としてRPLP0を用いた。遺伝子発現の変化は、内部標準で標準化した発現量に基づいて、分化0日(0d)での各遺伝子の発現量を1とした場合の相対的な発現量として示した。
実施例3(1)と同様の手順でSKPsを分化誘導した。足場用のラミニンフラグメントとしては、ラミニンフラグメントとして、LM111E8、LM121E8、LM332E8、LM421E8、LM511E8、及びLM521E8、ならびに、パールカン修飾ラミニンフラグメントとして、P-LM111E8、P-LM121E8、P-LM332E8、P-LM421E8、P-LM511E8、及びP-LM521E8を用いた。分化誘導したSKPs(継代培養前:iPS-SKPs P0)を、同希釈率で48ウェルプレートに継代した(iPS-SKPs P1)。継代培養は、ラミニンフラグメント足場なしで行った。継代3日後の培養物の細胞数を、Cell Counting Kit-8(DOJINDO LABORATORIES、カタログ番号:347-07621)を用いて測定した。培養物にキットの試薬溶液を加え、37℃、5%CO2のインキュベーターで一定時間(1~3時間)培養した後、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定することで、培養物の呼吸活性(生細胞数)を評価した。
Claims (22)
- 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法であって、
神経堤幹細胞を、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で培養して皮膚由来多能性前駆細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種であり、
該ラミニンのフラグメントが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521から選択されるラミニンのE8フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種である、
方法。 - 前記神経堤幹細胞を作製する工程をさらに含み、
該工程は、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させることを含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種であり、
該ラミニンのフラグメントが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521から選択されるラミニンのE8フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種である、
請求項1記載の方法。 - 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種が、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、請求項1又は2記載の方法。
- 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下での神経堤幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培地で該細胞を培養することを含む、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
- 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下での多能性幹細胞の培養が、該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培地で該細胞を培養することを含む、請求項2~4のいずれか1項記載の方法。
- 前記神経堤幹細胞の培養が、Wntシグナルアゴニストを含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。
- 前記多能性幹細胞の培養が、TGFβシグナル阻害剤及びBMPシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、請求項2~6のいずれか1項記載の方法。
- 前記皮膚由来多能性前駆細胞がネスチン及びフィブロネクチンを共発現する、請求項1~7のいずれか1項記載の方法。
- 前記神経堤幹細胞がヒト由来神経堤幹細胞である、請求項1~8のいずれか1項記載の方法。
- 神経堤幹細胞の作製方法であって、
パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で、多能性幹細胞を培養して神経堤幹細胞へと分化させること、
を含み、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種であり、
該ラミニンのフラグメントが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521から選択されるラミニンのE8フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種である、
方法。 - 前記パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種の存在下での細胞の培養が、該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培養基材上で該細胞を培養するか、又は該パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合したラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を含む培地で該細胞を培養することを含む、請求項10記載の方法。
- 前記多能性幹細胞の培養が、TGFβシグナル阻害剤及びBMPシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する分化培地で該細胞を培養することを含む、請求項10又は11記載の方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト由来多能性幹細胞である、請求項10~12のいずれか1項記載の方法。
- 前記細胞の培養がフィーダー細胞を用いることなく行われる、請求項1~13のいずれか1項記載の方法。
- 前記細胞の培養が異種由来成分の非存在下で行われる、請求項1~14のいずれか1項記載の方法。
- ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種であり、
該ラミニンのフラグメントが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521から選択されるラミニンのE8フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種である、
足場材。 - 前記ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種が、パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、前記ラミニン又はそのフラグメントである、請求項16記載の足場材。
- パールカンもしくはその増殖因子結合部位を含むフラグメントが結合した、ラミニン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1種を有効成分とする、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材であって、
該ラミニンが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種であり、
該ラミニンのフラグメントが、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、及びラミニン521から選択されるラミニンのE8フラグメントを含むラミニンフラグメント、ならびにこれらのいずれかに対して1~10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり且つインテグリン結合活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも1種である、
足場材。 - 請求項16又は17記載の、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための培養基材。
- 請求項16又は17記載の、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、神経堤幹細胞の皮膚由来多能性前駆細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
- 請求項18記載の、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための培養基材。
- 請求項18記載の、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための足場材を含有する、多能性幹細胞の神経堤幹細胞への分化誘導培養のための細胞培養キット。
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