JP5863639B2 - 椎間板の状態に関する指標を得る方法、椎間板障害の治療または予防方法、および髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法 - Google Patents
椎間板の状態に関する指標を得る方法、椎間板障害の治療または予防方法、および髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法 Download PDFInfo
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Description
GD2の少なくとも一方が陽性であることを特徴とする、椎間板髄核細胞(ないし当該細胞を含む細胞集団)を提供する。
本発明の対象となる椎間板髄核細胞は、脊椎動物の椎間板髄核から単離された、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性のものであり、幹細胞および前駆細胞が包含される。なお、Tie2およびGD2がともに陰性であるものは、分化を終えた、成熟した椎間板髄核細胞である。
本発明の椎間板髄核幹/前駆細胞ないしそれらの細胞を含む細胞集団は、代表的には、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団またはそれを培養して得られた細胞集団から、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性であるもの、すなわち、表面マーカーが少なくともTie2陽性である椎間板髄核幹細胞および/またはTie2陰性かつGD2陽性である椎間板髄核前駆細胞を単離することを含む培養方法により培養し、作製することができる。
本発明の細胞組成物は、前述したような椎間板髄核幹および/または前駆細胞を含有するものである。このような細胞組成物は、特に椎間板障害(腰痛、椎間板変性疾患等)の治療用または予防用のものとして好適である。
本発明による椎間板障害の治療または予防方法は、一つの態様において、前述したような椎間板髄核幹および/または前駆細胞、あるいは細胞組成物を、椎間板に移植することを含むものである。移植に用いる椎間板髄核幹/前駆細胞の数や純度、あるいは細胞組成物の成分やその割合は、治療または予防の態様に応じて適宜調整することができる。
[1]マウス
P0-Cre/Floxed-EGFPマウスおよびWnt-Cre/Floxed-EGFPマウスの入手は、先の論文で述べた方法に従って入手した14.移植実験のレシピエントとして使用する糖尿病性重症免疫不全マウス(NOD/SCID)マウスは、クレアジャパンより購入した。これらのマウスは、東海大学医学部実験動物部門のアイソレーター内にて飼育され、実験に供された。また、こられのマウスを用いた動物実験は、東海大学動物実験委員会の承認を得て行った。
マウスNP組織は、尾部椎間板から外科手術用顕微鏡下にて採取した。簡単には尾部表皮および柔部組織を除去した後、終末板頭部および椎間板の間に切り込みを入れ椎間板を採取した。その後、ゼラチン様のNP組織のみを精密なスプーン器具により採取した。
今回の研究を行う上で、ヒトサンプルの使用においては東海大学病院、医の倫理委員会の承認を得て行った。また、髄核組織の提供を受けるに当たり、十分な説明と同意を患者から得た上で実験に供した。症例の内訳は、椎骨の破裂骨折が10例、腰椎間板ヘルニアが8例、脊椎分離症が2例の合計20例である。患者の年齢は18才から70才まで、また、個々の症例における椎間板の変性度合いは、トンプソンらの判定法16に基づいて判定を行った。髄核組織は、外科手術における腰椎間板摘出後、繊維輪を注意深く避けて髄核組織の分離を行った。椎骨の破裂骨折の症例においては、椎骨の上部終末板頭部が骨折し、下部終末板頭部が健常な場合に、健常な終末板頭部側から椎間板は基本的に健常部位と想定し、NP組織を採取した。しかしながら、変性の強い椎間板の場合においては、NP組織と内部繊維輪との識別は困難であり、したがって髄核組織内部の領域のみを髄核組織として採取した。患者骨髄液の採取は、十分な説明と同意得た後、椎間板の手術中に行った。RT-PCR解析用の患者骨髄由来間葉系細胞の誘導は、採取された骨髄液から標準的な方法にて行った36。
採取されたヒトないしはマウス髄核組織は、はさみなどを利用して小片へと細切した。ヒト髄核組織は、タンパク消化酵素であるトリプルエクスプレス(TrypLE Express)(ギブコ)による1時間の消化、および0.25mg/mlコラゲナーゼP(ロッシュ)による2時間の消化を行い、その後、α-MEM培地(ギブコ)により2回洗浄し、3000〜5000細胞/cm2の細胞密度にて播種した。マウス髄核細胞は、上記消化酵素による消化時間をそれぞれ30分とした以外は、ヒト髄核組織と同様の処理を行った。消化、分散および洗浄を経て分離されたヒトおよびマウス髄核細胞はそれぞれ、10%FBS(セルカルチャーバイオサインス)添加同培地にて37℃5%CO2および5%O2条件下にて培養を開始した。さらに髄核細胞の骨、軟骨および脂肪細胞などへの生体外多分化能の実験法は、後記[13]「髄核細胞の多分化能」の項を参照されたし。
10%FBS添加αMEM培地にて4日間の単層状態で初代培養の終了した髄核細胞を混合培養へ利用した。培養は底部に0.4μmのポアサイズを持つポリエチレンテレフタレート膜がはられた6穴培養皿用セルカルチャーインサート(BD バイオサイエンス)および6穴培養皿を利用した。具体的には1.0x104のNP細胞を、単層飽和状態のAHESS-5細胞が膜の裏側に存在するセルカルチャーインサートの中に入れ、髄核細胞およびAHESS-5細胞との膜を隔てた細胞と細胞の接触培養を行った。AHESS-5細胞とは、造血幹細胞を支持する能力のあるマウス骨髄間葉系細胞を、遺伝子工学的手法によってヒトアンジオポエチンIを産生するようにした細胞である42, 43, 44。また、可溶性アンジオポエチンI(500ng/ml)もAHESS-5の変わりに使用した。また、AHESS-5由来のアンジオポエチンIの影響を検証する目的にて、10μg/mlの濃度にてヤギ由来の抗Tie2ポリクローナル中和抗体またはコントロールとしてヤギ由来の正常血清Ig(R&Dシステム)を利用した。7日間の混合培養の後、NP細胞はトリプルエクスプレスによって分散、コロニーアッセイおよびフローサイトメトリー法による解析に供した。
一定個数のヒトないしはマウスの細胞をメソカルトH4230メチルセルロース培地(ステムテクノロジー、増殖因子無添加)に浮遊させた後、35mm直径の培養皿に入れ、37℃5%CO2および5%O2条件下にて10日間の培養を行い、コロニーを形成させた。形成されたコロニーは、倒立位相差顕微を用いてその数を計測した。なおコロニーは10以上の細胞から成るものをコロニーとした。
髄核細胞は、FACSキャリバーフローサイトメーター(BDバイオサインス)を用いて細胞表面抗原の解析、またFACSバンテージ細胞分離装置(BDバイオサインス)を用いて細胞分離を行った。
髄核組織などの免疫蛍光染色は、先の論文で記載された方法37にて行った。
髄核細胞の遺伝子標識には、EGFPレポーター遺伝子をコードする高力価レンチウイルスを利用して行った。MOI 条件は10に設定、24時間の感染培養後、髄核細胞をα-MEM培地にて2回洗浄し、さらに24時間の培養を行い、実験に供した。
マウス皮下移植;PBS100μlに浮遊した純化ヒト髄核細胞浮遊液を、レシピエントNOD/SCIDマウスの腹部皮下に注射し移植を行った40。移殖8週間後、腹部皮下に形成された髄核細胞シストは、レシピエントマウスを麻酔にかけて摘出した。摘出されたシストは、4%パラフォルムアルデヒド(和光純薬)により固定後、各種組織学的検討に使用した。
ヒト髄核細胞のアポトーシス測定は、ヤギ由来ポロクローナル抗ヒトTie2中和抗体の添加培養により行った。また、コントロールとしてヤギコントロールIgを利用した。抗体添加48時間後、細胞はPIおよびFITC標識抗アネキシンV抗体により染色後(ベックマンコールター)、FACSキャリバーを用いたフローサイトメトリーにより解析した。
目的髄核細胞は溶解緩衝液で溶解後、RNアクエアス-マイクロスケール RNA 分離キット(アンビオン社)を利用して、RNAを分離した。分離されたmRNAは、高効率 RNA to DNA キット(アプライドバイオサイエンス)を利用して、逆転写してcDNAを作製した。
ヒト髄核細胞の体外での多分化能を調べる目的にて、先に論文に報告した方法によって、骨、脂肪細胞および軟骨細胞への分化誘導を行った1。また、神経方向への分化を調べる方法として、1.0 x 104/ml 濃度のTie2+GD2+ 髄核細胞をインシュリン(25 mg/ml), トランスフェリン(100 mg/ml), プロゲステロン (20 nM), 亜セレン酸ナトリウム(30 nM), プトレッシン-2HCL (60 nM) (全てシグマアルドリチより購入), 遺伝子組み換え型ヒトEGF(100ng/ml) (ペプロテック), ヒト塩基性FGF (100 ng/ml) (ペプロテック),そしてB27 (20 ng/ml) (ギブコ) 2を添加した DMEM/F12 (1:1) (ギブコ)無血清培地に浮遊し、37℃, 5% CO2 、5% O2条件下にて14日間の培養を行った。培養終了後、細胞はトリプシン分散し、1.0 x 103 の細胞をメチルセルロース培地であるメソカルトH4230倍地(ステムセルテクノロジー、増殖因子は含まず)に浮遊後、35mm培養皿に撒きさらに37℃, 5% CO2 、5% O2条件下にて7日間の培養を行った。
それぞれの結果は、平均値±標準偏差にて示す。また、統計学的有意差は、スチューデントのT検定を利用した。リアルタイムPCR法において、マンウィットニーのU試験を利用した。有意差は、p値が0.05以下の時を有意とした。相関関係は、ピアソン相関係数を利用して算出した。
(1)球状コロニー形成髄核細胞のクローン形成能
クローン形成能と球状コロニー形成能は造血幹細胞、神経幹細胞、ES細胞の特徴である11, 12, 13。このような特徴を持つ細胞集団が椎間板髄核内に存在するか否かを検証するため、C57BL/6マウス尾椎椎間板より採取したNP細胞をメチルセルロース上で培養したところ複数の付着型と球状型コロニーの導出を認めた。10日間の培養で大多数のコロニーが付着型であり、付着型:球状型の比率は3.5:1であった(図1a)。我々はこの球状型コロニーをCFU-NPと命名した。球状型コロニーを構成する細胞集団を特定するために数多くの表面マーカーにつきフローサイトメトリーを用いて検討したところ、Disialoganglioside GD2とTie2と呼ばれるマーカーを発現する少数の細胞集団に細胞増殖能が高いことが判明した。これまでglycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor protein CD24が分化型NP細胞のマーカーとして報告されている13。GD2がCD24陽性細胞の一部に発現し、GD2+CD24+から球状型コロニーの導出を確認、GD2-CD24+細胞からの導出は認められなかった(図1b)。さらに3-4%の少数のNP細胞がtyrosine kinase receptor Tie2陽性であり、のちにGD2+細胞へと分化した。フローサイトメトリーの結果をまとめるとTie2+GD2- 細胞が10.2±2.9% (n=3) のTie2+GD2+細胞を導出し、やがて Tie2-GD2-CD24+ cellsへと最終分化するという分化傾向にヒエラルキーが存在することが判明した(図1b,cおよび図8)。
マウスNP細胞での傾向がヒト椎間板においても認められるか否かを手術時に採取されたヒト椎間板細胞を用いて検証した(図3a,b)。ヒト椎間板組織は採取時にその変性変化を評価し、比較的変性変化が軽度なThompson grade IからIIIを用いた16。免疫組織染色による評価ではごく少数のTie2+がNP中心部とAFとの境界領域に認められたが、GD2+細胞は複数の細胞からなる細胞塊に認められることが多く、NP全体的に散って存在していた(図3c,d)。フローサイトメトリーによる解析の結果、表面マーカーで分離できる細胞の分化傾向はマウスのそれと同様のパターンであった(図9〜12)。Tie2は神経、血管、造血などの未分化細胞に発現することが報告されている17。造血幹細胞ではTie2と結合するAngiopoietin-1(Ang-1)を分泌し、造血幹細胞を骨髄内ニッチにおいて分化停止状態で保存するといった役割を担っている18。このような制御機構がTie2+NP細胞にも存在するのか否かを検証するためにNP組織中のAng-1の発現を免疫組織化学的に評価した。Ang-1蛋白は椎間板組織を構成する殆どすべての細胞に濃密に発現しており、Tie2+細胞やGD2+細胞にも発現していた(図3e,f)。さらに無血清培地下にメチルセルロース上で培養したNP細胞に分泌型Ang-1を添加したところ導出される球状型コロニー数が増加し、逆にAng-1をブロックする抗体を添加したところ減少した(図3g)。またヒトAng-1を強制発現させたAHESS5細胞と共培養したところ球状型コロニーは同様に増加した(図13)。一方Ang-1ブロッキング抗体存在下ではTie2+NP細胞はアポトーシスに向かうことなども判明し(図3h,i)、Tie2+NP細胞を維持するためにはTie2/Ang-1シグナル伝達機構が必須であることが示唆され、AHESS5を用いた共培養系によりTie2+細胞を増幅できることが明らかとなった。
単細胞からの自己複製能は幹細胞形質の重要な因子である。我々はヒトTie2+GD2+NP細胞の単細胞培養からでも球状型コロニーが導出され(図4a)、二次コロニーも導出できることを証明した(図4b)。NP細胞の主要な役割は主に2型コラーゲンとプロテオグリカンで構成されるECMの産生である。Tie2+GD2+細胞から導出した球状型コロニーの免疫染色を行った結果、球状型コロニーは2型コラーゲンとプロテオグリカンに加えて(図4c)神経幹細胞のマーカーであるnestin陽性であり(図4d)、Tie2+GD2+NP細胞の未分化性を示唆した。
Tie2+GD2+NP細胞が椎間板組織の維持及び再構築能力を有するか否かを調べる目的でまず免疫不全マウスの皮下に細胞を注入した(図5a)。すると8週間で皮下に軟骨基質で染色される組織構築をTie2+GD2+NP細胞を注入した群にのみ認めた(図5b)。さらにEGFPにより遺伝的にマーキングしたTie2+GD2+細胞とTie2-GD2-CD24+細胞を椎間板に傷害を加えた免疫不全マウス尾椎椎間板に移植し(図5c)、Bioluminescence imagingを用いて評価した19, 20。その結果、Tie2+GD2+細胞を移植した群においてのみ12週間経ても組織内に認め、移植細胞が2型コラーゲンを産生し、組織維持、再構築する能力の高さを証明した(図5d)。
In VitroにおいてTie2+GD2+NP細胞は脂肪、骨、軟骨への分化能力を示した(図6a)。RT-PCRの結果、Tie2+GD2+細胞は骨髄間質細胞に比べNanog, Oct3/4, Nestin, Musashi-1などの未分化マーカーを強く発現(図6b)、蛋白レベルにおいてはOct3/4, Nanog, cMyc, Sox2, klf4などのES細胞マーカーも他の細胞集団に比べて高く発現していた(図6c)。NestinとMusashi-1は神経幹細胞のマーカーと知られている為21、神経分化能力も検証した。その結果Tie2+GD2+NP細胞は特別な誘導をかけずにニューロン、グリア系のマーカーを複数発現し神経方向への分化能力も合わせ持っていることが判明(図6d)、Tie2+GD2+細胞の多分化能力の高さを証明した。
脊索由来NP細胞が成人になると殆ど消失するといわれる6ヒト椎間板手術検体においてTie2+細胞の割合をフローサイトメトリーで検証した。その結果20代を境に著明にTie2+細胞が減少し(図7a,b)、ドナーの年齢と負の相関関係を示した(図7c)。さらに球状型コロニーの導出数も年齢と負の相関関係を示しており、Tie2+NP細胞の椎間板変性における病態生理と診断における有用性を示した。
今回、in vitro並びにin vivo 研究において我々は初めて椎間板髄核内に球状型コロニーを形成し、自己複製能、多分化能などの幹細胞性質を有するTie2陽性集団をマウスおよびヒトで同定した。そしてこの細胞集団は脊索より派生していた。またAngiopoietin-1が抗アポトーシス、この細胞集団のメンテナンスに重要な役割を担っていることも判明、Angiopoietin-1によるニッチ環境の存在とAngiopoietin-1を用いた治療法開発の可能性を示した。そして最後にこの細胞集団がヒト椎間板において20代という比較的早期に減衰することを突き止め、椎間板における老化、変性と密接な相関関係にあることを示した。
Claims (7)
- 脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団中の、表面マーカーのTie2が陽性である細胞(以下「Tie2陽性細胞」と称する。)の割合を測定することを含む、椎間板の状態に関する指標を得る方法であって、
椎間板の変性の程度に関する基準値ないし年齢層ごとの平均値および標準偏差をあらかじめ決定しておき、あるサンプルについて測定された前記椎間板髄核幹細胞の割合と前記基準値ないし平均値および標準偏差との対比により、椎間板の変性の程度ないしその年齢層の椎間板の状態として正常な範囲かどうかを把握することを含み、
前記椎間板の変性の程度に関する基準値は、椎間板の変性が進行するほど前記Tie2陽性細胞の割合が減少する傾向を示すものであり、
前記年齢層ごとの平均値は、年齢層が高いほど前記Tie2陽性細胞の割合が減少する傾向を示し、特に二十代において著しい減少を示すものであることを特徴とする、椎間板の状態に関する指標を得る方法。 - さらに、前記髄核細胞集団中の、下記(i)〜(v)の表面マーカーの発現パターンを示す少なくとも1種の細胞の割合を測定することを含み、下記(i)〜(v)の表面マーカーの発現パターンは、(i)から(v)に進むにつれて、細胞が分化または老化していることを表すものである、請求項1に記載の椎間板の状態に関する指標を得る方法。
(i)Tie2陽性/GD2陰性/CD24陰性
(ii)Tie2陽性/GD2陽性/CD24陰性
(iii)Tie2陰性/GD2陽性/CD24陰性
(iv)Tie2陰性/GD2陽性/CD24陽性
(v)Tie2陰性/GD2陰性/CD24陽性 - 脊椎動物(ヒトを除く)について、請求項1または2に記載の方法によって椎間板の状態に関する指標を得る工程、および
当該工程によって得られた指標に基づいて、細胞集団またはそれを含有する細胞組成物を前記脊椎動物(ヒトを除く)の椎間板に移植する工程を含む、椎間板障害の治療または予防方法であって、
前記細胞集団は、脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団または培養された髄核細胞集団に由来する、表面マーカーのTie2およびGD2の少なくとも一方が陽性である椎間板髄核細胞を含む細胞集団であることを特徴とする、椎間板障害の治療または予防方法。 - さらに、椎間板にある椎間板髄核幹細胞に対してAng-1を投与する工程を含む、請求項3に記載の椎間板障害の治療または予防方法。
- 前記細胞集団が、表面マーカーのTie2が陽性である椎間板髄核細胞を90%以上の純度で含むものである、請求項3または4に記載の椎間板障害の治療または予防方法。
- 前記細胞集団が、下記(i)〜(iv)の表面マーカーの発現パターンを示す少なくとも1種の椎間板髄核細胞を含むものである、請求項3または4に記載の椎間板障害の治療または予防方法。
(i)Tie2陽性/GD2陰性/CD24陰性
(ii)Tie2陽性/GD2陽性/CD24陰性
(iii)Tie2陰性/GD2陽性/CD24陰性
(iv)Tie2陰性/GD2陽性/CD24陽性 - 脊椎動物の椎間板髄核から採取された髄核細胞集団または培養された髄核細胞集団あるいはそれらから調製される髄核細胞集団に含まれる細胞について、表面マーカーの発現パターンを、Tie2が陽性であるか陰性であるか、GD2が陽性であるか陰性であるか、およびCD24が陽性であるか陰性であるかによって8通りに分類したとき、それぞれに分類される細胞の割合を求めることを含む、髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法であって、
前記髄核細胞集団中の、下記(i)〜(v)の表面マーカーの発現パターンを示す少なくとも1種の細胞の割合を測定することを含み、下記(i)〜(v)の表面マーカーの発現パターンは、(i)から(v)に進むにつれて、細胞が分化または老化していることを表すものである、髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法。
(i)Tie2陽性/GD2陰性/CD24陰性
(ii)Tie2陽性/GD2陽性/CD24陰性
(iii)Tie2陰性/GD2陽性/CD24陰性
(iv)Tie2陰性/GD2陽性/CD24陽性
(v)Tie2陰性/GD2陰性/CD24陽性
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