WO2021220997A1

WO2021220997A1 - 軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団の培養方法およびその利用

Info

Publication number: WO2021220997A1
Application number: PCT/JP2021/016563
Authority: WO
Inventors: 大輔酒井; 嘉彦中村; 枝利香松下
Original assignee: 学校法人東海大学; 日本臓器製薬株式会社
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2021-11-04
Also published as: AU2021264726A1; EP4144835A1; US20230167409A1; CA3176522A1; JPWO2021220997A1; CN115461448A; KR20230004559A; EP4144835A4

Abstract

本発明は、II型コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生する機能的な軟骨細胞を豊富に含む細胞集団を、効率的に調製するための手段を提供する。本発明の培養方法は、軟骨に由来するＴｉｅ２の発現が陽性である細胞（軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞）を含む細胞集団の培養方法であって、少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤（例えばニッケイ属等の植物由来の抽出物）が添加された培地中で、当該軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養することを含む。この培養方法は、好ましくは、コーティング剤（例えばポリリジンを含有するもの）が塗布された培養表面を有する培養容器で行われる。

Description

軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団の培養方法およびその利用

　本発明は、軟骨に含まれている、細胞表面マーカーＴｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である細胞（本明細書において「軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団の培養方法等に関する。より詳しくは、本発明は、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から成熟した機能的な軟骨細胞、例えばＣｏｌ２（II型コラーゲン）発現軟骨細胞へと分化誘導する工程において利用することのできる、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団の培養方法等に関する。

　関節軟骨は、骨の端を覆い、腕や膝を曲げた時などにかかる衝撃を吸収する組織である。正常な関節軟骨は「硝子軟骨」と呼ばれ、細胞の周辺に主にII型コラーゲンおよびXI型コラーゲンからなる細胞外マトリックス（Extracellular Matrix；ＥＣＭ）が形成されているという特長がある。硝子軟骨は、加齢によって摩耗したり、スポーツや交通事故などの怪我により損傷を受けたりすると、線維軟骨に変性してしまうことがある。一度、軟骨が線維化すると元に戻ることはなく、関節をスムーズに動かすことが難しくなり、痛みや炎症が起こることもある。

　関節軟骨は、血管、神経、リンパ管を欠く組織であるため、軟骨損傷が生じると他の組織のような損傷治癒が働きにくいため、自己修復能が著しく乏しい。そのため、同種（自家または他家）の軟骨細胞を患部に移植し、軟骨を再生（修復）する方法が期待されており、その移植に用いるための軟骨細胞およびＥＣＭ等を含有する細胞製剤の研究開発が進められている。そのような細胞製剤の製造のためには、ある程度まとまった量の同種軟骨細胞が必要となる。自家移植については、例えば膝関節の軟骨が損傷している患者において、その患者の健全な関節軟骨から軟骨細胞を単離して利用することもある。しかしながら、移植時の手術に加えて軟骨採取時の手術も必要となり、健全な軟骨を損傷してしまうため、患者の負担が重いという問題がある。一方、他家移植については、例えば、乳幼児の多指症の患者から手術により切除される軟骨組織を軟骨細胞の供給源として利用することができるが、そのようにして採取できる軟骨細胞数は少ない。かといって、軟骨細胞数を確保するために複数の多指症等の患者（ドナー）に由来する軟骨細胞を混合して用いることは、ウイルス感染症のリスクを完全に否定することはできないため避けることが望ましい。自家移植および他家移植のどちらにしても、少量の軟骨組織に含まれている、成熟した軟骨細胞を含む細胞集団を培養し、治療のために十分な数の軟骨細胞を含む細胞集団を調製することが重要となる。

　上記のように、採取された組織に含まれる軟骨細胞を培養して増殖することに関係する問題を解決するために、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といった多能性幹細胞、または体性幹細胞を分化誘導することによって得られた軟骨細胞を用いる方法が提案されている。例えば、特許文献１には、（i）多能性幹細胞をＢＭＰ２、ＴＧＦβおよびＧＤＦ５から成る群より選択される１以上の物質ならびにＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含む培養液中で接着条件で培養する工程、および（ii）前記工程（i）で得られた細胞をＢＭＰ２、ＴＧＦβおよびＧＤＦ５から成る群より選択される１以上の物質ならびにＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含む培養液中で浮遊条件で培養する工程、を含む多能性幹細胞から軟骨細胞を製造する方法が記載されている。

　また、特許文献２には、軟骨様組織として形質発現している細胞混合物からなる細胞移植治療用スフェロイドおよびその製造方法が記載されている。特許文献２の実施例では、軟骨組織に含まれる軟骨細胞と、滑膜組織に含まれる滑膜由来細胞とを別々に培養皿で継代培養し、得られたそれぞれの継代細胞を所定の割合で混合した細胞混合物をさらに振盪培養することによって、細胞移植治療用スフェロイドを製造する方法が記載されている。

　一方、特許文献３および非特許文献１には、椎間板組織（髄核）に含まれている細胞のうち、細胞表面マーカーとしてＴｉｅ２および／またはＧＤ２が陽性である細胞が、髄核細胞の幹細胞または前駆細胞というべき細胞であること、特にＴｉｅ２およびＧＤ２の両方が陽性である細胞（活性状態にある髄核幹細胞）が、球状コロニーを形成し、一連の分化カスケードを経て最終的に成熟した髄核細胞への分化能を有する（他にも脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および神経細胞への分化能も有する）こと、さらに髄核幹／前駆細胞を椎間板（髄核）に移植することによって、組織中でII型コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生させることができ、椎間板組織の維持または再構築や、椎間板変性症の予防または治療ができる可能性があることなどが記載されている。より具体的な実施形態として、特許文献３および非特許文献１には、椎間板組織（髄核）に含まれていた細胞集団をメチルセルロース培地にて浮遊培養することにより（付着型コロニーと共に）球状コロニーが形成されたこと、そのような球状コロニーは上述したＴｉｅ２陽性（かつＧＤ２陽性）細胞から導出されること、球状コロニー（その一部の細胞）ではII型コラーゲンおよびプロテオグリカンが発現していることなどが記載されている（例えば、特許文献３の実施例、段落００６７、００７０等参照）。

　しかしながら、特許文献１～３および非特許文献１には、軟骨中にＴｉｅ２陽性細胞が含まれていることや、特定の条件下でそのＴｉｅ２陽性細胞を効率的に増殖させたり軟骨細胞に分化誘導したりすることができることについて、記載も示唆もされていない。

　なお、特許文献３および非特許文献１には、Ｔｉｅ２陽性髄核細胞（椎間板髄核幹／前駆細胞）を維持するためには、Ｔｉｅ２（受容体）とＡｎｇ－１（アンジオポエチン－１、リガンド）との間のシグナル伝達機構が必要であり、Ａｎｇ－１の存在下で培養する（Ａｎｇ－１を強制発現させたＡＨＥＳＳ５と共培養する）ことによりＴｉｅ２陽性細胞を増幅できること、したがってＡｎｇ－１は髄核細胞の分化ヒエラルキーを制御するニッチ因子と考えられること、などが記載されている（実施例：段落００４９、００６９、００７５等）。

　ところで、Ｔｉｅ２は血管内皮細胞にも発現しており、Ｔｉｅ２を活性化することにより、血管の成熟化、正常化または安定化がもたらされること、例えば腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などで観察される無秩序な血管の増幅（血管新生）を抑制したり、しわを防止、改善したりできることなどが知られている。そのような作用を有するＴｉｅ２活性化剤としては、例えば、ニッケイ（Cinnamomum）属植物由来の抽出物（いわゆるシナモンパウダー、特許文献４）、オリーブ果実エキス（特許文献５）、その他にもキラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニン、ハゲキテンなど（特許文献６～１０）、様々な動植物由来抽出物が提案されている。さらに、Ｔｉｅ２活性化作用をもたらす成分としては、例えば、ウルソール酸、コロソリン酸、３－Ｏ－ガロイルプロシアニジンＢ－１、リノレン酸、１３－ヒドロキシ－９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ－オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ－２、エピカテキン－（４β－６）－エピカテキン（４β－８）－エピカテキン、プロシアニジンＣ－１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ、３’－Ｏ－メチルガロカテキン、ピペルノナリン、シリンガレシノール、２－メトキシケイヒアルデヒド、エレウテロシドＥ、エレウテロシドＥ１、セサミン、ユーデスミン、シルバテスミン、ピノレジノール、ヤンガンビン、フォルシチノール、クマリンなどが提案されている（特許文献７、１２～１４）。

　例えば、特許文献４では、「Ｔｉｅ２活性化剤」に関する試験（実施例）として、ケイヒ熱水抽出物を添加した培地中で「Ｔｉｅ２を強制発現した血球系Ｂａｆ３細胞」または「正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）」を培養した場合、それらの細胞で発現したＴｉｅ２タンパク質はリン酸化されたものがコントロールに比べて多いことを、ウェスタンブロッティング法により確認している（段落００２４～００２７、図１～３等）。

　しかしながら、特許文献４～１４には、血液細胞（血球）や血管内皮細胞ではなく、軟骨から得られる細胞集団に含まれるＴｉｅ２陽性細胞の培養において、Ｔｉｅ２活性化剤を利用することや、それによりどのような作用効果がもたらされるかについては記載も示唆もされていない。

ＷＯ２０１６／１３３２０８特開２０１１－４１４７２号公報特許第５８６３６３９号公報（ＷＯ２０１１／１２２６０１対応）ＷＯ２００９／１２３２１１ＷＯ２０１６／０６０２４９ＷＯ２０１２／０７３６２７特開２０１２－２３６７９５号公報特開２０１１－２０１８１１号公報特開２０１１－１０２２７５号公報特開２０１１－１０２２７４号公報特開２０１１－１０２２７３号公報特開２０１４－９７９７７号公報特開２０１３－２４１３５６号公報特開２０１１－１０２２７２号公報

Sakai D et al., Nat Commun.2012;3:1264

　関節軟骨損傷の治療等に用いるための同種（自家または他家）の軟骨細胞を含む細胞製剤を製造するためには、II型コラーゲン、プロテオグリカン等の細胞外マトリックスを産生する機能的な軟骨細胞が、ある程度まとまった量で必要となる。特に、患者に細胞製剤を投与したときの治療効果を高めるためには、II型コラーゲン等の細胞外マトリックスの産生量の多い機能的な軟骨細胞を豊富に含む細胞集団を、なるべく効率的に調製することが重要である。さらに、硝子軟骨から採取された軟骨細胞であっても、培養によって繊維芽細胞様に変質しやすいという問題がある。そのような繊維芽細胞様の軟骨細胞を移植すると、修復された組織中に線維軟骨が形成されてしまい、硝子軟骨によって損傷した部位を治療できないおそれがある。

　本発明は、II型コラーゲン等の細胞外マトリックスを産生する機能的な軟骨細胞を豊富に含む細胞集団を、効率的に調製するための手段を提供することを課題とする。

　本発明者らは、軟骨にもＴｉｅ２陽性細胞が含まれており、そこに軟骨細胞への分化能を有する幹／前駆細胞が含まれていることを見出した。その上で本発明者らは、そのような軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞（軟骨幹／前駆細胞）を含む細胞集団を培養する際の、培養に供する細胞集団の状態や培養条件に注目して研究を進めた結果、上記の課題の解決に寄与しうる、下記のような特長的な技術的事項を見出した。

　本発明による軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団の培養方法は、少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養することを含む。

　造血幹細胞のようなＴｉｅ２陽性細胞は元来、Ｔｉｅ２（受容体チロシンキナーゼ）のリガンドであるアンジオポエチン－１（Ａｎｇ－１）が結合することによって、Ｔｉｅ２の活性化（リン酸化）が亢進することは知られており、Ａｎｇ－１を添加した培地中でＴｉｅ２陽性細胞を培養する（Ｔｉｅ２の発現を増強する）方法は従来技術（先行技術文献３等）によって公知となっている。また、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）も同様に、Ｔｉｅ２の発現を増強する作用を有する増殖因子として知られており、ＦＧＦ２を添加した培地中でＴｉｅ２陽性細胞を培養する方法も公知となっている。

　しかしながら本発明者らは、Ａｎｇ－１、ＦＧＦ２等の増殖因子とは異なる種類のＴｉｅ２発現増強剤、例えばシナモンパウダーの抽出液のような動植物由来抽出物であるＴｉｅ２発現増強剤を、これまで報告のなかった軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団の培養に利用した場合、特に植物由来抽出物であるＴｉｅ２発現増強剤をＦＧＦ２等の増殖因子と併用した場合、培養によって得られる細胞集団中には、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した機能的な軟骨細胞が豊富に含まれていると共に、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性幹／前駆細胞自体も従来法より高い比率で含まれていることを見出した。つまり、Ｔｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養すると、意外なことに、その軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強し、幼若性（増殖能および軟骨細胞への分化能や、スフェロイド形成能）を備えたＴｉｅ２陽性細胞を細胞集団中に維持しつつ、II型コラーゲン（Ｃｏｌ２）などを発現する機能的な軟骨細胞への分化を促進し、細胞集団中のＣｏｌ２陽性細胞を増加させるという、相反する目的をバランス良く達成できる。

　好ましい実施形態において、上述したような本発明による軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞（軟骨幹／前駆細胞）を含む細胞集団の培養方法は、細胞外マトリックスまたはその他の生体関連分子、例えばポリリジンを含有するコーティング剤が塗布された培養表面を有する培養容器を用いて、二次元培養（平面培養）的な環境下で行われる。ゲルや多孔材などの足場材料を用いた三次元培養や、非接着性培養容器などを用いた浮遊培養をさらに行うこともできる。

　上記の各培養方法に基づき、本発明者らは、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞（軟骨幹／前駆細胞等）を含む細胞集団から、当該幹／前駆細胞から分化した軟骨細胞を含む細胞集団を調製するための好ましい方法を構築した。すなわち、本発明による細胞集団の調製方法は、上述したような本発明の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞の培養方法に従って、細胞集団中の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強して幼若性を維持しつつ、Ｃｏｌ２等を発現する機能的な軟骨細胞へと分化させるための培養段階（分化培養段階）を少なくとも含む。このような細胞集団の調製方法は、従来公知の調製方法に比べて、機能的な軟骨細胞、特にＣｏｌ２等の細胞マーカーが陽性の軟骨細胞の絶対的な数または細胞集団に占める比率が飛躍的に向上した細胞集団を最終的に調製することができる。上記のような分化培養段階では、Ｃｏｌ２陽性細胞等の数または比率が一定水準に達した段階であっても、Ｔｉｅ２陽性細胞は完全にはなくなっておらず、一定水準の数または比率を留めた細胞集団を得ることができる。そのような細胞集団は、投与後も機能的な軟骨細胞を産生する能力を有する軟骨幹／前駆細胞を一定程度含んでいることで、治療または予防の効果がより優れたものになると考えられる。

　上述した技術思想を、詳細は後述する（好ましい）実施形態と組み合わせて具体化すれば、本発明は例えば、少なくとも下記の事項を包含する発明として表現することができる。

［１］
　軟骨に由来する、Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である細胞（以下「軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団の培養方法であって、
　少なくとも１種の、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する植物由来抽出物が添加された培地中で、当該軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養することを含む、培養方法。
［２］
　前記植物が、ニッケイ（Cinnamomum）属の植物である、項１に記載の培養方法。
［３］
　細胞外マトリックスおよび／またはポリアミノ酸を含有するコーティング剤が塗布された培養表面を有する培養容器で行われる、項１または２に記載の培養方法。
［４］
　前記細胞外マトリックスがIV型コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンである、項３に記載の培養方法。
［５］
　前記ポリアミノ酸がポリリジンである、項３または４に記載の培養方法。
［６］
　軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した軟骨細胞を含む細胞集団の調製方法であって、
　項１～５のいずれか一項に記載の培養方法を実施する工程を含む、細胞集団中の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、軟骨細胞へと分化誘導するための培養段階（以下「分化培養段階」と呼ぶ。）
　を含む、調製方法。
［７］
　前記軟骨細胞が、Ｃｏｌ２（II型コラーゲン）の発現が陽性である細胞を含む、項６に記載の調製方法。
［８］
　前記分化培養段階が、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）およびＡｎｇ－１（アンジオポエチン－１）からなる群より選ばれる少なくとも１種の増殖因子が添加された培地中で軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、項６または７に記載の調製方法。
［９］
　前記分化培養段階の前に、
　軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を増殖するための培養段階（以下「増殖培養段階」と呼ぶ。）
　を含む、項６～８のいずれか一項に記載の調製方法。
［１０］
　前記分化培養段階によって、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞も残存している細胞集団を得る、項６～９のいずれか一項に記載の調製方法。
［１１］
　項１～５のいずれか一項に記載の培養方法によって得られた細胞集団。
［１２］
　項１～５のいずれか一項に記載の培養方法における培地と、当該培養方法に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
［１３］
　項６～１０のいずれか一項に記載の調製方法における、分化培養段階によって得られた細胞集団。
［１４］
　項６～１０のいずれか一項に記載の調製方法における、分化培養段階用培地と、当該分化培養段階に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
［１５］
　項１０または１３に記載の細胞集団を含有する、細胞治療用組成物。
［１６］
　軟骨における障害、症状または疾患に対する治療または予防用である、項１５に記載の細胞治療用組成物。

　本発明の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞の培養方法により、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強し、幼若性を維持するとともに、その細胞から機能的な（Ｃｏｌ２等の所定の細胞マーカーが陽性の）軟骨細胞への分化を促進することが可能となる。さらに、このような本発明の培養方法を行う工程を含む分化培養段階により、機能的な軟骨細胞を豊富に含む細胞集団を調製することができる。そのような本発明の培養方法および調製方法に基づいて得られた細胞集団を利用することにより、軟骨における障害、症状または疾患の治療または予防のために効果的な細胞製剤を効率的に製造することが可能となる。

　本発明の代表的な実施形態によれば、少量しか採取することのできない軟骨を用いて、そこに含まれているＴｉｅ２陽性細胞（軟骨幹／前駆細胞）を効率的に増殖および分化させることにより、移植したときに高い治療効果が期待できる、II型コラーゲン等の細胞外マトリックスの産生能の高い機能的な軟骨細胞を豊富に含む（また多少のＴｉｅ２陽性細胞も残存している）細胞集団を、簡単に、再現性よく、大量に得ることができる。従来は、そのような好適な細胞集団の作製は困難であったが、本発明により効率的に作製できるようになるため、細胞集団（を含有する細胞製剤）の投与による関節等の軟骨の再生療法が飛躍的に行いやすくなり、産業化が現実的なものとなる。

図１は、実施例１において測定した、分化培養段階（分化培養第１工程）において本発明の培養方法（2%シナモン）を行った場合と、対照（比較例）としての培養方法（10ng/ml bFGF）を行った場合それぞれについて、市販膝関節軟骨細胞（NHAC2）から最終的に（分化培養第２工程後に）得られた細胞集団のＴｉｅ２陽性率を表すグラフである。図２は、実施例２において測定した、市販膝関節軟骨細胞（NHAC2）に含まれているＴｉｅ２陽性細胞（Tie2+）およびＴｉｅ２陰性細胞（Tie2-）それぞれについての、分化培養第２工程後の、球状コロニー形成単位（CFU-S）および繊維芽細胞状コロニー形成単位（CFU-F）を表すグラフである。図３は、［ａ］実施例３において測定した、分化培養段階において本発明の培養方法に従った分化培養工程（cinnamon 2%）を行った場合と、対照（比較例）としての分化培養工程（cinnamon0%）を行った場合それぞれについての、球状コロニー形成単位（CFU-S）および繊維芽細胞状コロニー形成単位（CFU-F）を表すグラフ、ならびに［ｂ］球状コロニー（スフェロイド）の光学顕微鏡写真である。図４は、実施例４において測定した、分化培養段階において本発明の培養方法に従った分化培養工程（2% cinnamon）を行った場合と、対照（比較例）としての分化培養工程（10ng/mlbFGF）を行った場合それぞれについて、市販膝関節軟骨細胞（NHAC2）から最終的に得られた細胞集団の、プロテオグリカン（PG）、I型コラーゲン（Type1 col）およびII型コラーゲン（Type2.col.）それぞれの陽性率を表すグラフである。

－用語－
　「幹細胞」は、自己複製能および分化能（全能性（totipotent）、多能性（pluripotent）、複能性（multipotent）または単能性（unipotent））を有する細胞を指す用語である。「前駆細胞」は、最終的にはすべて終末分化した細胞になるため厳密な意味での自己複製能を有さないが、比較的活発に増殖しながら所定の細胞へと分化してゆく分化能を有する細胞を指す用語である。当業者によって一般的に「幹細胞」または「前駆細胞」を含む名称で理解されている（特定されている）細胞は、本明細書における「幹細胞」または「前駆細胞」に該当する。

　本明細書において、「幹細胞および／または前駆細胞」は、幹細胞、前駆細胞またはその両方を包含する表記であり、「幹／前駆細胞」と表記することもある。また、本明細書において、幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団を「幹／前駆細胞集団」と表記し、幹細胞および／または前駆細胞から分化し成熟した細胞（終末分化細胞）を含む細胞集団を「成熟細胞集団」と表記することがある。

　「幹細胞」および「前駆細胞」は、一般的には、１種または２種以上の特定の遺伝子（マーカー遺伝子、細胞マーカー）の発現が陽性または陰性であることをもって、他の細胞と区別することができる。すなわち、前述したような自己複製能および／または分化能を有する「幹細胞」および「前駆細胞」は、それぞれ特定のマーカー遺伝子の発現が陽性または陰性である細胞を指す用語として定義することもできる。

　マーカー遺伝子（細胞マーカー）の発現が「陽性」であるか「陰性」であるかは、一般的な手法にしたがって、その遺伝子（ゲノム）から転写されるｍＲＮＡ、またはそのｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の発現量を定量的または定性的に測定し、その発現量が一定水準以上である（または一定水準を超える）場合に陽性、一定水準以下である（または一定水準に満たない）場合に陰性、と判定することができる。タンパク質の発現量は、例えば、フローサイトメトリー、免疫染色、ＥＬＩＳＡといった、当該タンパク質に特異的な抗体および標識剤などを用いた免疫学的アッセイにより、定量的または定性的に測定することができる。なお、Ｔｉｅ２タンパク質は細胞表面に発現するタンパク質であり、Ｃｏｌ２は細胞内部に発現するタンパク質であり、それぞれ細胞表面および細胞内部に存在するタンパク質を検出する手法（免疫蛍光染色法等）として適切なものを用いればよい。ｍＲＮＡの発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップといった、当該ｍＲＮＡに特異的な（相補的な）核酸および標識剤や核酸増幅方法（手段）などを用いたアッセイにより、定量的または定性的に測定することができる。細胞集団中の、所定のマーカー遺伝子（細胞マーカー）の発現が陽性または陰性である細胞の比率（陽性率または陰性率）は、細胞集団中の全細胞の数と、上記のような方法により陽性または陰性であると判定された細胞の数をそれぞれ、上記のような各種の方法により、例えばフローサイトメトリーにおける計測により、算出することができる。

　本明細書において、「Ｔｉｅ２の発現が陽性である幹細胞および／または前駆細胞」すなわち「Ｔｉｅ２陽性細胞」は、細胞マーカーの一つとして知られているＴｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性であると判定される、例えばフローサイトメトリーによりタンパク質としての発現が陽性であると判定される細胞を指す。本発明におけるＴｉｅ２陽性細胞は、「軟骨に由来する」Ｔｉｅ２陽性細胞、すなわち軟骨中に存在する（軟骨から採取可能な）Ｔｉｅ２陽性細胞またはそのＴｉｅ２陽性細胞を継代して得られるＴｉｅ２陽性細胞であり、以下に述べる「軟骨幹／前駆細胞」に相当する（含んでいると推定される）細胞である。

　本発明において「軟骨細胞」は、軟骨に含まれる細胞集団の多数を占める、成熟して終末分化に達した細胞、またはそれと同等の形質を有する培養細胞を指す。軟骨細胞は、好ましくは、細胞マーカーとして、細胞外マトリックスのうち少なくともII型コラーゲン（Ｃｏｌ２）が陽性であり、さらに通常はプロテオグリカン（アグリカン）も陽性である、機能的な軟骨細胞である。例えば、フローサイトメトリーにより、細胞マーカー（好ましくはタンパク質）として、Ｃｏｌ２が陽性（かつアグリカン等も陽性）であると判定される細胞は、本発明における機能的な軟骨細胞に相当する。なお、Ｃｏｌ２、アグリカン等の細胞外マトリックスについては、それらのタンパク質の産生量をフローサイトメトリーにより測定すると共に、またはその代替として、それらのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ等により測定してもよい。本発明では、上記のような軟骨細胞、特にＣｏｌ２やアグリカンなどの所定のマーカーが陽性である軟骨細胞が、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から所定の分化誘導（分化培養段階）によって得られる、用途に応じた機能性を有する細胞、すなわち目的細胞となる。軟骨細胞については、その他にもＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＧＤ２が陽性であることが知られており、これらの１種または２種以上をさらに軟骨細胞の細胞マーカーとして上記のＣｏｌ２等と併用してもよい。

　本発明において「軟骨幹／前駆細胞」は、軟骨に含まれる細胞集団の一部を占める、少なくとも軟骨細胞（好ましくはＣｏｌ２が陽性である機能的な軟骨細胞）への分化能を有する前駆細胞（軟骨前駆細胞）および当該前駆細胞への分化能と自己複製能とを有する幹細胞（軟骨幹細胞）、またはそれと同等の形質を有する培養細胞を総称する。軟骨幹／前駆細胞は、具体的には、マーカー遺伝子として、少なくともＴｉｅ２が陽性である細胞に含まれている。例えば、フローサイトメトリーにより、タンパク質（細胞マーカー）として、Ｔｉｅ２が陽性であると判定される細胞は、本発明における軟骨幹／前駆細胞に相当する（含んでいると推定される）。本発明の一実施形態において、Ｔｉｅ２陽性細胞を実質的に（その多くを）軟骨幹／前駆細胞とみなすこと、例えば本明細書の記載において「Ｔｉｅ２陽性細胞」を「Ｔｉｅ２陽性軟骨幹／前駆細胞」と読み替えることもできる。

　本発明において「球状コロニー」は、幹細胞および／または前駆細胞を含み、さらにそれらから分化した細胞を含んでいてもよい、球状の細胞集合体である。「球状コロニー」は、当業者から一般的に「スフェロイド」などと呼ばれることもある物体である。

　本発明において「Ｔｉｅ２の発現が増強されている」（Ｔｉｅ２発現増強）とは、個々のＴｉｅ２陽性細胞において、Ｔｉｅ２遺伝子の発現が増強されている、すなわち通常よりも発現が亢進し、ｍＲＮＡまたはタンパク質としての発現量が増加していることをいう。通常であればＴｉｅ２遺伝子の発現がほとんど消失してしまうような条件下であっても、発現が消失せず一定水準の発現量を保つこと、つまりＴｉｅ２の発現が維持されることも、「Ｔｉｅ２の発現が増強されている」ことに該当する。また、個々のＴｉｅ２陽性細胞においてそのようにＴｉｅ２の発現が増強された結果、細胞集団中における、Ｔｉｅ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が陽性であると判定される（発現量が一定水準を超える）細胞数が増加すること、すなわち細胞集団中のＴｉｅ２陽性細胞の比率が通常よりも高くなることも、「Ｔｉｅ２発現増強」の表れであると解することができる。

　より具体的には、例えば、Ｔｉｅ２発現増強処理を施した細胞集団（Ｔｉｅ２発現増強処理群）と施していない細胞集団（コントロール群）に対して、細胞表面のＴｉｅ２タンパク質を蛍光標識する処理を施し、フローサイトメトリーでの測定により、コントロール群に比べてＴｉｅ２発現増強処理群の方が、所定の水準より蛍光強度が高く発現が陽性であると判定される細胞の比率が高い、および／または細胞１個あたりの平均蛍光強度が高い場合は、Ｔｉｅ２発現増強処理群の細胞集団（に含まれるＴｉｅ２陽性細胞）は、Ｔｉｅ２の発現が増強されている（換言すれば、Ｔｉｅ２発現増強処理は所定の役割を果たしている）といえる。

　本発明において、上記のような「Ｔｉｅ２発現増強」の作用効果を奏する剤を本発明では「Ｔｉｅ２発現増強剤」と呼ぶ。なお、一部の増殖因子（ＦＧＦ２等）は、Ｔｉｅ２発現増強作用を有し、「Ｔｉｅ２発現増強剤」の一種に該当するともいえるので、そのような増殖因子を除く場合は「増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤」と呼ぶ。

－培養方法－
　本発明による、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団の培養方法は、少なくとも１種の、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤が添加された培地中で、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養することを含むものである。本明細書において、上記の培養方法を単に「本発明の培養方法」と呼ぶことがある。

　本発明の培養方法は、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強し、軟骨幹／前駆細胞としての幼若性、すなわち複製能および（少なくとも）髄核細胞への分化能を維持することができると同時に、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から軟骨細胞、特にＣｏｌ２等の発現が陽性の機能的な軟骨細胞への分化を促進することができる。本発明の培養方法では、幼若性が維持された軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を細胞集団中により多く、より長い期間保持する（従来の培養方法と比較して、Ｔｉｅ２陽性細胞の数および／または比率を向上させる）ことができ、それにより多量の軟骨細胞（特に後述するような機能的な軟骨細胞）を産生させることができる。そのようなことを目的として、下記の本発明の調製方法の分化培養段階において本発明の培養方法を実施する工程を「本発明の分化培養工程」と呼ぶことがある。

－調製方法（培養工程）－
　本発明による、Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した軟骨細胞を含む細胞集団の調製方法は、少なくとも、本発明の分化培養工程を含む、細胞集団中の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、軟骨細胞へと分化誘導するための培養段階（以下「分化培養段階」と呼ぶ。）を含む。本明細書において、上記の調製方法を単に「本発明の調製方法」と呼ぶことがある。

　分化培養段階は、単独の分化培養工程からなるものであってもよいし、複数の分化培養工程を含むものであってもよい。また、分化培養工程は、継代を含まない工程とすることができるが、必要に応じて１回または２回以上の継代を含む工程であってもよい。

　分化培養段階は、所定の条件に従った培養により、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を軟骨細胞に、本発明においては特にＣｏｌ２等が陽性の機能的な軟骨細胞に分化させることを主な目的とし、そのための作用効果が奏される段階を意味する。つまり、軟骨細胞（特に機能的な軟骨細胞）の細胞数および／または比率が、培養前細胞集団よりも培養後細胞集団の方が高くなっていれば、その培養段階は分化培養段階ということができる。

　また、分化培養段階で行われる分化培養工程では、上記の効果と共に、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞の細胞数および／または比率が向上する、維持される、あるいは細胞数および／または比率の減少が緩やかになるという効果も認められる。

　分化培養段階は、必要に応じて、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を軟骨細胞（特に機能的な軟骨細胞）に分化させるという当該段階の主な目的に合致した、本発明の分化培養工程以外の工程（本発明の分化培養工程とは異なる培養条件に従う培養工程）をさらに含んでいてもよい。そのような工程としては、例えば、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤（動植物由来抽出物等、好ましくは植物由来抽出物）が添加されていない培地中で、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程（本明細書において「追加分化培養工程」と称する。）が挙げられる。追加分化培養工程における培地に添加することができる増殖因子としては、例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦおよびＡｎｇ－１からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。追加分化培養工程は、本発明の分化培養工程の前または後に行うことができるが、後に行うことが好ましい。追加分化培養工程は、継代を含まない工程とすることができるが、必要に応じて１回または２回以上の継代を含む工程であってもよい。

　本発明の調製方法は、必要に応じて、分化培養段階以外の培養段階をさらに含んでいてもよい。本発明の調製方法が含むことができるさらなる培養段階としては、例えば、分化培養段階の前に行われる、分化培養段階に供される細胞集団（そこに含まれる軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞、それから分化した軟骨細胞等）をあらかじめ増殖するための培養段階が挙げられる。本発明において、そのようなことを目的とする培養段階を「増殖培養段階」と呼び、増殖培養段階において行われる工程（方法）を「増殖培養工程（方法）」と呼ぶことがある。

　なお、増殖培養段階（工程、方法）においても、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から他の細胞（軟骨細胞）への分化が起きることは許容されるが、培地中に増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤（動植物由来抽出物等）は添加されていない点で、本発明の分化培養段階（工程、方法）とは区別される。一方で、増殖培養段階（工程、方法）においても、ＦＧＦ等の増殖因子は、必要に応じてさらに添加することが好ましい。増殖培養工程は、継代を含まない工程とすることができるが、必要に応じて１回または２回以上の継代を含む工程であってもよい。

＜細胞集団＞
　本発明の培養方法、または本発明の調製方法（各培養段階）に含まれる各培養工程に供される細胞集団（本明細書において「培養前細胞集団」と総称する。）において、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞と、それ以外の細胞、本発明においては特に軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した（機能的な）軟骨細胞等、それぞれの比率および／または数は基本的に任意である。また、培養前細胞集団におけるＴｉｅ２陽性細胞に含まれる、幹／前駆細胞とそれ以外の細胞の比率、および幹細胞と前駆細胞の比率も基本的に任意である。培養前細胞集団の組成は、発明の実施形態に応じて、各培養方法または各培養工程における作用効果などを考慮しながら、適宜調節することができる。

　培養前細胞集団は、常法に従って調製または準備することができる。例えば、体内から採取された軟骨に含まれている細胞集団を培養前細胞集団として用いる場合は、まず手術用の曲刃等の器具を使って軟骨を適切なサイズに細切（チョッピング）し、続いてコラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素で処理して細胞を分散させ、必要に応じて濾過、遠心分離、洗浄等の処理を行うことで、軟骨に含まれていた細胞集団を単離し回収することができる。軟骨は、関節（膝、肘等）軟骨、肋軟骨、気管軟骨、鼻中隔軟骨等の硝子軟骨；耳介軟骨等の弾性軟骨；半月板等の線維軟骨など、軟骨を含む様々な組織から採取することができ、本発明の作用効果が奏されるものであればどの組織に由来するものであるかは特に限定されないが、例えば関節軟骨等の硝子軟骨であることが好ましい。このようにして得られる細胞集団（軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団）を、本発明の培養方法、あるいは分化培養段階の工程（本発明の分化培養工程または任意で行われる追加分化培養工程等）、さらに必要に応じて行われる分化培養段階以外の段階（増殖培養段階等）の工程のための培養前細胞集団として利用することができる。このようにして、関節軟骨（膝）またはその他の組織から調製される細胞集団（初代細胞または継代細胞）は製品（必要に応じて培地、指示書、試薬等を含むキット）としても販売されており、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む、本発明における培養前細胞集団として利用することもできる。

　上記のように調製された、軟骨から分離された細胞集団、または軟骨中に含まれた状態の細胞集団（細胞集団を含んだ状態の軟骨）は、次の培養方法または培養工程に供されるまで、常法に従って凍結保存することができる。凍結保存された細胞集団または軟骨は、次の培養方法または培養工程を始める際に、常法に従って解凍をすることができる。凍結保存および解凍の際には、細胞集団または軟骨にとって好ましい処理を組み合わせてもよい。例えば、凍結保存の際に凍結保護剤（ＤＭＳＯ等）を添加してもよく、その場合は解凍の際に適切な条件で凍結保護剤を除去すればよい。

　本発明の培養方法、または本発明の調製方法（各培養段階）に含まれる各培養工程により得られる細胞集団（本明細書において「培養後細胞集団」と総称する。）において、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞と、それ以外の細胞、本発明においては特に軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した（機能的な）軟骨細胞等、それぞれの比率および／または数は基本的に任意である。また、培養後細胞集団におけるＴｉｅ２陽性細胞に含まれる、幹／前駆細胞とそれ以外の細胞の比率、および幹細胞と前駆細胞の比率も基本的に任意である。培養後細胞集団の組成は、発明の実施形態に応じて、各培養方法または各培養工程によって得られる細胞集団の用途などを考慮しながら、適宜調節することができる。

　培養後細胞集団は、常法に従って培地中から回収し、次の培養方法または培養工程に供する、あるいは細胞製剤の調製などその他の方法または工程に供することができる。

　本発明の培養方法、または本発明の調製方法（各培養段階）に含まれる各培養工程の途中の細胞集団（本明細書において「培養中細胞集団」と総称する。）において、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞と、それ以外の細胞、本発明においては特に軟骨Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した（機能的な）軟骨細胞等、それぞれの比率および／または数は基本的に任意である。また、培養中細胞集団におけるＴｉｅ２陽性細胞に含まれる、幹／前駆細胞とそれ以外の細胞の比率、および幹細胞と前駆細胞の比率も基本的に任意である。培養中細胞集団の組成は、培養前細胞集団から培養後細胞集団へ移行する途中の組成であり、例えば培養中細胞集団の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞の比率（本明細書において単に「Ｔｉｅ２陽性率」と称する。）は、通常は、培養前細胞集団のＴｉｅ２陽性率と培養後細胞集団のＴｉｅ２陽性率によって挟まれる範囲に含まれる数値であるが、一時的に当該範囲から外れる数値となることも許容される。培養中細胞集団の組成は、発明の実施形態に応じて、また本発明の培養方法または各培養工程における日数や継代の回数などによって変動する。

　上記の各細胞集団が由来する「ヒトまたはその他の動物」（ドナー）は、本発明の培養方法または本発明の調製方法によって最終的に得られる細胞集団の用途、または本発明の調製方法（各培養段階）に含まれる各培養工程によって得られる細胞集団の用途などを考慮して選択することができる。本発明の典型的な実施形態において、所定の疾患、症状等の予防用または治療用の細胞製剤を製造するための細胞集団を調製する場合は、「ヒトまたはその他の動物」は、その細胞製剤の投与対象（レシピエント）と同種の生物であり、好ましくはヒトである。また、ドナーとレシピエントは、同一の個体（自家）であってもよいし、他の個体（他家）であってもよい。

　・分化培養段階に関する細胞集団
　本発明の培養方法に供される細胞集団、あるいは本発明の分化培養段階に含まれる工程（本発明の分化培養工程または任意で行われる追加分化培養工程等）に供される細胞集団（本明細書において「分化培養前細胞集団」と称する。）は、ヒトまたはその他の動物に由来する初代培養細胞集団または継代培養細胞集団、例えば市販されている軟骨由来の継代培養細胞集団である。例えば、ヒトまたはその他の動物の体内から採取された軟骨に含まれている細胞集団や、そのような細胞集団を継代して得られた（株化した）細胞集団を分化培養前細胞集団として用いることができ、そのような細胞集団は市販もされている。

　分化培養段階前細胞集団におけるＴｉｅ２陽性率は、由来する軟骨の個体差などによっても変動し、特に限定されるものではないが、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞の比率および／または細胞数はなるべく高いことが好ましい。例えば、軟骨中のニッチが良好であるドナー（若年の個体など）に由来する細胞集団は、そのような好ましい細胞集団となり得る。

　本発明の分化培養段階に含まれる各工程よって得られる細胞集団（本明細書において「分化培養後細胞集団」と総称する。）の用途は特に限定されるものではない。分化培養後細胞集団の組成、例えばＣｏｌ２陽性（軟骨）細胞の比率（本明細書において「Ｃｏｌ２陽性率」と称する。）およびＴｉｅ２陽性細胞の比率（Ｔｉｅ２陽性率）や、それらの細胞の数は、分化培養前細胞集団やそれが由来する軟骨の個体差などによっても変動するが、用途に応じて適宜調節することができる。例えば、移植用の細胞製剤を製造するために使用される細胞集団については、移植による治療または予防効果を奏する上で有用な機能性を有する軟骨細胞（例えばII型コラーゲンを産生する軟骨細胞：Ｃｏｌ２陽性軟骨細胞）をなるべく多く含むと同時に、そのような軟骨細胞の産生能が残されている軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞も多少含む細胞集団であることが好ましい。

　・分化培養段階以外の段階に関する細胞集団
　本発明において必要に応じて分化培養段階以外の段階を行う場合、その段階に含まれる工程に供される細胞集団、およびその段階に含まれる工程によって得られた細胞集団についても、上記の分化培養前細胞集団および分化培養後細胞集団と同様のことがいえる。例えば、例えば増殖培養工程に供される細胞集団としては、上記の分化培養前細胞集団と同様の細胞集団を用いることができる。増殖培養工程によって得られた細胞集団は、分化培養段階の実施形態（培養容器の種類やサイズ等）に応じて適当な細胞数となるよう分割した上で用いることができる。

＜培地＞
　本発明の培養方法、または本発明の調製方法（各培養工程）で用いる培地は、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞およびそれから分化する軟骨細胞の培養に適したものであればよく、培養方法または培養工程の目的なども考慮しながら、適切な基礎培地および添加成分を選択することができる。本発明の培養方法用、または本発明の分化培養工程用の培地に対しては、主な目的である軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から軟骨細胞への分化誘導に適した添加成分を選択し、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤と共に用いればよい。本発明において必要に応じて行われる、追加分化培養工程や、分化培養段階以外の段階に含まれる工程（例えば増殖培養工程）の培地も、工程の目的に応じて、適切な基礎培地および添加成分を選択して調製することができる。

　本発明の代表的な実施形態において、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞および／またはそれから分化した軟骨細胞（それらが混合した細胞集団）を培養するための、分化培養段階およびその他の培養段階の各工程用の培地、例えば本発明の分化培養工程用や、追加分化培養工程用、増殖培養工程用の培地はそれぞれ、例えば次のような基礎培地、添加成分、増殖因子、その他の成分を、それぞれ適量用いることにより調製することができる。

　平面培養用の基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、グルコース添加なしまたはあり）、αＭＥＭ（イーグル最小必須培地α改変型）、Ｈａｍ’ｓＦ－１０培地、Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地、あるいはこれらの混合物（例えば、ＤＭＥＭとＦ－１０培地またはＦ－１２培地との混合培地）が挙げられる。また、浮遊培養（三次元培養）用の基礎培地としては、例えば、メチルセルロース培地（例：商品名「MethoCult」、STEMCELL Technologies社）が挙げられる。

　基礎培地への添加成分としては、例えば、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、Ｌ－アスコルビン酸（Ｌ－アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩等として）、亜セレン酸（インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム（ITS：Insulin-Transferrin-Selenium）等として）および２－メルカプトエタノールが挙げられる。必要に応じてさらに、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、その他の成分を培地に添加してもよい。

　増殖因子としては、例えば、ＦＧＦ（fibroblast growth factor：線維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor：上皮成長因子）、Ａｎｇ－１（アンジオポエチン－１）が挙げられる。本発明の一実施形態において、培地に添加する増殖因子は、少なくともＦＧＦを用いることが好ましく、ＦＧＦおよびＥＧＦの両方を用いることがより好ましく、必要に応じてそれらにＡｎｇ－１を追加して用いることも好ましい。

　ＦＧＦとしては、例えばｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor：塩基性線維芽細胞成長因子。ＦＧＦ－２と呼ばれることもある。）を用いることができる。培地中のＦＧＦの濃度は、通常１～５０ｎｇ／ｍＬの範囲、好ましくは５～１５ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば約１０ｎｇ／ｍＬとすることができる。

　Ａｎｇ－１は、無血清培地において添加することが好ましい。また、Ａｎｇ－１としては水に可溶化したもの（ソリュブルＡｎｇ－１、リコンビナントＡｎｇ－１）が好ましい。培地中のＡｎｇ－１（好ましくはソリュブルＡｎｇ－１）の濃度は、通常１００～１０００ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば約５００ｎｇ／ｍＬとすることができる。

　なお、上記のＦＧＦ、ＥＧＦ、Ａｎｇ－１等の増殖因子は「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」であり、広義の「Ｔｉｅ２発現増強剤」に該当すると解することもできるが、本発明におけるこれらの増殖因子の取扱い方については本明細書中に別途記載した通りである。すなわち、本発明の分化培養工程用の培地は、少なくとも「増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤」（動植物由来抽出物等、好ましくは植物由来抽出物）を含み、さらにＦＧＦ、ＥＧＦ、Ａｎｇ－１等の「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」を含んでいてもよい。一方で、追加分化培養工程用の培地は、「増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤」（動植物由来抽出物等）は含まず、ＦＧＦ、ＥＧＦ、Ａｎｇ－１等の「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」は含んでいてもよい（含んでいることが好ましい）。

　本発明の一実施形態において、本発明の分化培養工程用の培地として、ＤＭＥＭおよびＦ－１０培地の混合培地に、２－メルカプトエタノール、亜セレン酸、アスコルビン酸および３０％ＢＳＡを添加し、さらに使用直前に３０％ＦＢＳを添加したものを用いることができる。

　本発明の一実施形態において、追加分化培養工程は浮遊培養（三次元培養）により行われ、そのような追加分化培養工程用の培地として、メチルセルロース培地を用いることができる。

　本発明の一実施形態において、増殖培養工程用の培地として、２０％ＦＢＳが添加され、必要に応じてさらにＦＧＦ等の増殖因子が添加されていてもよい、αＭＥＭを用いることができる。

＜Ｔｉｅ２発現増強剤＞
　本発明の培養方法では、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子以外の少なくとも１種の「Ｔｉｅ２発現増強剤」を培地に添加する。本発明の培養方法は、分化培養段階の工程において（本発明の分化培養工程として）実施されるが、その際にＴｉｅ２発現増強剤を添加することで、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞の幼若性（増殖能および少なくとも軟骨細胞への分化能）を維持しながら、機能的な軟骨細胞へと分化する細胞の数または比率を増加させる作用効果などを有する。Ｔｉｅ２発現増強剤は、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、上記のようなＴｉｅ２活性作用が認められる量で培地に添加すればよい。

　「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」としては、例えば、アンジオポエチン－１（Ａｎｇ－１）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）などが挙げられる。本発明の培養方法では、そのような「Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子」以外の少なくとも１種の「Ｔｉｅ２発現増強剤」を用いるが、必要に応じて、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子も組み合わせて用いることもできる。本発明の培養方法は、分化培養段階の工程において（本発明の分化培養工程として）実施されるが、その際にＴｉｅ２発現増強作用を有する増殖因子と、それ以外のＴｉｅ２発現増強剤、例えば以下に説明するような動植物由来抽出物、好ましくは植物由来抽出物とを併用することにより、相乗効果を奏することが可能である。

　増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤としては、従来技術において「Ｔｉｅ２活性化剤」として知られている様々な動植物由来抽出物を用いることができる。そのような動植物由来抽出物としては、例えば、アキグミ、アキノノゲシ、インディアンデーツ、ウコン、黄杞、オウセイ、オオバコ、オカヒジキ、オリーブ果実、牡蠣、カミツレ、カリン、カロニン、ハゲキテン、菊、ギョクチク、キラヤ、銀杏、クサギ、クコ、クヌギ、ゲットウ、高麗ニンジン、コナラ、サンザシ、サンショウソウ、シジュウムグァバ、シベリアニンジン、スイショウガキ、スターフルーツ、ソウカクシ、ナツメ、ニッケイ、ノビル、ハス、ハスイモ、ハリギリ、ヒハツ、ブッチャーブルーム、マンゴージンジャー、ミツバウツギ、ムベ、ヤブカンゾウ、ヤマモモ、リョウブ、ルイボスなどの抽出物が挙げられる（前掲特許文献４～１０参照）。また、そのような抽出物に含まれている成分、例えば、ウルソール酸、コロソリン酸、３－Ｏ－ガロイルプロシアニジンＢ－１、リノレン酸、１３－ヒドロキシ－９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ－オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ－２、エピカテキン－（４β－６）－エピカテキン（４β－８）－エピカテキン、プロシアニジンＣ－１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ、３’－Ｏ－メチルガロカテキン、ピペルノナリン、シリンガレシノール、２－メトキシケイヒアルデヒド、エレウテロシドＥ、エレウテロシドＥ１、セサミン、ユーデスミン、シルバテスミン、ピノレジノール、ヤンガンビン、フォルシチノール、クマリンなどの化合物（前掲特許文献７、１２～１４参照）を、増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤として用いることもできる。各抽出物や成分について、Ｔｉｅ２発現増強作用が認められる使用量や、調製するために適切な動植物の部位（材料）および抽出方法、特定の成分の精製方法等も、当業者が適宜従来知られていた方法に基づいて設定することができる。

　産業的な観点からは、Ａｎｇ－１、ＦＧＦ２などの増殖因子よりも安価であり、好ましくはそれらの増殖因子よりもＴｉｅ２発現増強作用に優れ、さらに好ましくはそれらの増殖因子と併用したときに相乗効果を奏する、上記の動植物由来抽出物から選択される１種または２種以上、好ましくは上記の植物由来抽出物から選択される１種または２種以上を、本発明の分化培養工程においてＴｉｅ２発現増強剤として用いることが有利である。

　・ニッケイ属植物由来抽出物
　本発明の好ましい一実施形態において、Ｔｉｅ２発現増強剤として、ニッケイ属植物由来抽出物を用いることができる。ニッケイ属（Cinnamomum）には、ケイ（Cinnamomumcassia Blume）、クスノキ（C.camphora）、マルバニッケイ（C.daphnoides）、シバニッケイ（C.doederleinii）、ヤブニッケイ（C.japonicum）、オガサワラヤブニッケイ（C.pseudo-pedunculatum）、ニッケイ（C.sieboldii）、シバヤブニッケイセイロンニッケイ（C.verum）、シナモン（C.zeylanicum）など、３００以上の種が含まれる。例えば、ケイの若枝であるケイシ（桂枝）または樹皮であるケイヒ（桂皮）、あるいはそれらを粉末状に加工したシナモンパウダーとして製造販売されている製品の抽出物を、本発明におけるニッケイ属植物由来抽出物として用いることができる。

　ニッケイ属植物由来抽出物は常法により得ることができ、例えば原料となる植物体（例：シナモンパウダー）を抽出溶媒とともに常温または加熱して浸漬または加熱還流した後、上澄みを回収することにより、または濾液を濾過し、必要に応じて濃縮することにより、調製することができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒、例えば、水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、あるいは有機溶媒、例えばエタノール、プロピレングリコール、1,3ーブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、合水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として水が用いられる。上記溶媒で抽出して得られた抽出物は、そのまま抽出液の形態で用いてもよいが、利便性の面から、乾燥または凍結乾燥等により固形化（粉体化）して保存し、使用時に必要に応じて適切な溶媒により希釈または再溶解（再分散）して、さらに必要に応じて濾過等の処理をして、用いることができる。ニッケイ属植物由来抽出物は、必要に応じて、イオン交換樹脂（例えば、アンバーライトXAD-2のようなポーラスポリマー）を用いた吸着法などにより、不純物を除去したもの（精製物）であってもよい。

　培地中のニッケイ属植物由来抽出物の濃度は、用いる当該抽出物の性状に応じて、またＴｉｅ２発現増強剤としての作用効果の程度などを考慮しながら、適宜調節することができる。例えば、ニッケイ属植物由来抽出物として、シナモンパウダー１０ｍｇを水（蒸留水）１ｍＬで抽出して得られる抽出液を用いる場合、当該抽出液を培地に対して０．１～１０ｖ／ｖ％程度、例えば約２ｖ／ｖ％の量で添加することができる。抽出および添加の実施形態を変更する場合も、Ｔｉｅ２発現増強剤としての有効成分が上記の抽出および添加の実施形態と同程度になるようにすることができる。

　なお、上記のようにして得られるニッケイ属植物由来抽出物には様々な化合物が含まれており、本発明の作用効果にとって有効な化合物は特に限定されるものではないが、例えば、シリンガレシノール（フロフラン型リグナン類に分類される化合物の一種）は、本発明におけるＴｉｅ２発現増強作用を有する化合物の一つである可能性がある。

＜培養期間、その他の条件＞
　本発明の培養方法および本発明の調製方法（各培養段階）に含まれる各培養工程の期間およびその他の条件（例えばｐＨ、ＣＯ_２濃度、Ｏ_２濃度など）は基本的に、その培養工程（が含まれる培養段階）の目的に応じて、所望の細胞組成（種類および数・比率）を有する細胞集団が得られるよう、適宜調節することができる。ｐＨは、弱アルカリ性（例えば、約７．１５）とすることができる。ＣＯ_２濃度は、例えば約５％とすることができる。Ｏ_２濃度は、５％以下（例えば約２％）とすることができる。本発明の培養方法および各培養工程（段階）の期間中は必要に応じて適宜、所定の日数毎に培地を新鮮なものに交換したり、所定の日数の経過後に成分を追加するまたは成分の濃度やｐＨを増加もしくは減少させるなどして培地を変化させたり、雰囲気変化させたりしてもよい。

　本発明の分化培養段階における培養工程の期間（分化培養段階が複数の培養工程を含む場合、例えば本発明の分化培養工程と追加分化培養工程を含む場合は、各工程の培養期間）は、通常１～３週間程度であり、例えば本発明の分化培養工程は約１週間、追加分化培養工程は約２週間とすることができる。所望の分化培養後細胞集団が得られた時点で、分化培養段階を終了すればよい。

　本発明において、必要に応じて行われる増殖培養段階における培養工程の期間（増殖培養段階が複数の培養工程を含む場合は、各工程の培養期間）は、通常１～３週間程度であり、例えば約１週間とすることができる。所望の増殖培養後細胞集団が得られた時点で、増殖培養段階を終了すればよい。

＜培養容器＞
　本発明の培養方法および本発明の調製方法（各培養段階）に含まれる各培養工程で用いる培養容器、培養装置等は基本的に、その培養方法および培養工程（が含まれる培養段階）の目的に応じて、所望の細胞組成（種類および数・比率）を有する細胞集団が得られるよう、適宜選択することができる。

　培養容器は、フラスコ、ディッシュ、プレート、バッグなど、一般的な形状を有するものを用いることができ、細胞を収容できるウェルが形成されているものであってもよい。培養容器は、ガラス、プラスチック、樹脂など、一般的な材質で作製されているものを用いることができる。培養容器のサイズ（面積、容積）、また培養容器がウェルを備えているものであればそのウェルのサイズ（口径、深さ）および数なども、適宜選択することができる。

　本発明の培養方法および本発明の分化培養工程、また本発明において必要に応じて行われる増殖培養工程などは、典型的には、培養容器の培養表面に細胞を付着させる平面培養により行われる。このような平面培養は、好ましくは、所定のコーティング剤を用いてコーティング処理された培養容器を用いて行われるが、そのようなコーティング処理がされてない培養容器を用いるなど、その他の公知の平面培養のための手段を用いて行ってもよい。

　本発明において必要に応じて行われる追加分化培養工程は、典型的には、培地中に細胞を浮遊させる浮遊培養により行われる。このような浮遊培養は、例えば、培地として粘稠性のあるメチルセルロース培地を用いることにより、または低付着性処理がなされた（細胞の接着を防止するための物質が塗布された）培養表面を有する培養容器内で、必要に応じて培養用シェーカー等で振盪することにより、行うことができる。

　・コーティング剤
　本発明の培養方法および本発明の分化培養工程では、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはその他の生体関連分子を含有するコーティング剤を塗布する処理培養表面を有する培養容器（本明細書において単に「コーティング処理された培養容器」と呼ぶことがある。）を用いることが好ましい。なお、増殖培養工程においても同様に、コーティング処理された培養容器を用いてもよい。

　本発明におけるコーティング剤が含有するＥＣＭとしては、公知の様々なＥＣＭ、例えば、コラーゲン（I型、II型、IV型など）またはその熱処理物であるゼラチン、コンドロイチン硫酸Ａ、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、プロテオグリカン（アグリカン、ヘパリン硫酸プロテオグリカンなど）が挙げられる。また、ＥＣＭ以外の生体関連分子としては、ポリリジン（ポリ－Ｌ－リジンまたはポリ－Ｄ－リジン）等のポリアミノ酸が挙げられる。その他のコーティング剤としては、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸・グリコール酸共重合体）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリ－ε－カプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリ－メチルメタクリラート、ポリ－２－ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドンポリオルニチン等が挙げられる。細胞付着処理用のコーティング剤は、上記の物質のいずれか１種類を含有するものであってもよし、２種類以上を含有するものであってもよい。本発明の好ましい実施形態の一例において、コーティング剤は、ポリリジン（例えばポリ－Ｌ－リジン）等のポリアミノ酸を含有する。

－細胞治療用組成物－
　本発明の細胞治療用組成物は、上述したような本発明の培養方法または調製方法によって得られた細胞集団、すなわち軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した軟骨細胞（特に、Ｃｏｌ２陽性細胞などの機能的な軟骨細胞）を含み、好ましくは一定程度の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞も含む細胞集団を含有し、必要に応じてその他の製薬学的に許容される成分を含有することができる。

　本発明の典型的な実施形態において、細胞治療用組成物は、軟骨における傷害、症状または疾患を治療または予防するためのものである。当該実施形態における細胞治療用組成物の適用対象、つまり当該組成物を投与することにより予防または治療することのできる、軟骨における傷害、症状または疾患としては、例えば、軟骨損傷、骨軟骨損傷、半月板損傷、関節炎、関節症が挙げられる。

　本発明の細胞治療用組成物の剤型は、細胞集団を標的とする部位、例えば関節等の軟骨を含む組織に移植または送達できるものであればよいが、例えば注射剤、好ましくは軟骨またはその近傍への局所投与用の注射剤、あるいはターゲティングが可能である血管投与用注射剤とすることができる。

　製薬学的に許容される成分としては、例えば注射剤として調製する場合の注射用水もしくは生理食塩水、細胞集団用の培養液、その他の適切な溶媒・分散媒、その他の添加剤等が挙げられる。

　本発明の細胞治療用組成物は、所望の治療または予防効果を奏するために有効な量で投与すればよい。そのような有効量は、細胞治療用組成物の成分、剤形や、投与対象、投与経路、その他の実施形態などを勘案しながら、１回あたりの投与量、投与回数および投与間隔（一定期間内の投与回数）などによって適宜調整することができる。本発明の細胞治療用組成物は、ヒトおよびヒト以外の動物に対して投与することができる。

　以下の実施例では、本発明における「軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団」として、市販の膝関節軟骨細胞（正常成人の膝関節軟骨由来の、継代２代目の細胞集団）（以下「ＮＨＡＣ２」と呼ぶ。）を使用した。

　実施例における「増殖培養段階」の培養工程用の培地（以下の「増殖培養工程用培地」と呼ぶ。）として、αＭＥＭに、培地に対して２０％のＦＢＳを使用直前に添加した培地を調製して使用した。

　実施例における「分化培養段階」の第１の培養工程用の培地（以下「分化培養第１工程用培地」と呼ぶ。）として、ＤＭＥＭ（no Glucose）６０ｍＬおよびＦ－１０４０ｍＬの混合培地に、２－メルカプトエタノール１μＬ、亜セレン酸（０．０１％）６μＬ、アスコルビン酸（５ｍｇ／ｍＬ）１．５ｍＬおよび３０％ＢＳＡ５ｍＬを添加し、さらに使用直前に、培地に対して３０％のＦＢＳと、「２％シナモン」または「１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ」を添加した培地を調製して使用した。「２％シナモン」は、「市販のシナモン粉末１０ｍｇを蒸留水１ｍＬに懸濁して３７℃で一晩抽出し、得られた抽出液（シナモン抽出液）」を、培地に対して２％の量で添加したこと表す。

　実施例における「分化培養段階」の第２の培養工程用の培地（以下「分化培養第２工程用培地」と呼ぶ。）として、メチルセルロース培地（商品名「MethoCult H4230」、STEMCELL Technologies社、増殖因子無添加）を使用した。

［実施例１］
　ＮＨＡＣ２を増殖培養工程用培地に分散し、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）でコーティング処理された６穴培養皿上の１穴で平面培養を開始した（day0）。

　７日後（day7）、増殖培養工程後の細胞集団を回収し、分化培養第１工程用培地（「２％シナモン」または「１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ」のいずれかを添加）に分散し、ＰＬＬでコーティング処理された６穴培養皿上の１穴で平面培養を開始した。

　７日後（day14）、分化培養第１工程後の細胞集団を回収し、分化培養第２工程用培地に分散し、コーティング処理されていない６穴培養皿上の１穴で浮遊培養を開始した。１４日後（day28）、分化培養第２工程後の細胞集団を回収し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）法により、細胞表面のＴｉｅ２の発現が陽性である細胞の数を測定し、細胞集団全体の細胞数に対する比率（Ｔｉｅ２陽性率）を算出した。ＦＣＭ法では、抗ヒトＴｉｅ２抗体と蛍光色素アロフィコシアニンの複合体である蛍光標識剤（Ｒ＆Ｄ社、Anti-Tie-2, Human, Mouse-Mono(87315), Allophicocyanin、カタログ番号ＦＡＢ３１３１Ａ）を用いた。上記の培養および測定は３反復行った。

　Ｔｉｅ２陽性率（平均値±標準誤差、ｎ＝３）の結果を図１に示す。分化培養工程において「２％シナモン」を添加した場合は、「１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ」を添加した場合に比べて、得られた細胞集団におけるＴｉｅ２陽性率が有意に高く（ｐ＜０．０５）、本発明の分化培養工程によるＴｉｅ２発現増強効果が認められた。

［実施例２］
　ＮＨＡＣ２を、ＦＣＭ法によりＴｉｅ２の発現が陽性である細胞と陰性である細胞に分離した。Ｔｉｅ２陽性細胞、Ｔｉｅ２陰性細胞それぞれを、実施例１と同様の方法（増殖培養工程、分化培養第１工程および分化培養第２工程）により培養した。Ｔｉｅ２陽性細胞、Ｔｉｅ２陰性細胞それぞれについて、分化培養第２工程後の細胞集団における、球状（スフェロイド）コロニー形成単位（CFU-S）および繊維芽細胞状コロニー形成単位（CFU-F）を測定した。上記の培養および測定は３反復行った。

　１０００細胞あたりのコロニー数（平均値±標準誤差、ｎ＝３）の結果を図２に示す。球状コロニー形成単位（CFU-S）は、Ｔｉｅ２陽性細胞の方がＴｉｅ２陰性細胞よりも有意に高く（ｐ＜０．０５）、軟骨に由来するＴｉｅ２陽性細胞は球状コロニーを形成する幹／前駆細胞としての性質をより強く備えていると考えられる。

［実施例３］
　実施例１と同様の方法（増殖培養工程、分化培養第１工程および分化培養第２工程）により培養した場合の、分化培養第２工程後の細胞集団における、球状（スフェロイド）コロニー形成単位（CFU-S）および繊維芽細胞状コロニー形成単位（CFU-F）を測定し、分化培養第１工程における培地への添加成分の違い（「２％シナモン」および「１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ」）により比較した。上記の培養および測定は３反復行った。

　１０００細胞あたりのコロニー数（平均値±標準誤差、ｎ＝３）の結果を図３［ａ］に示す。また、「２％シナモン」を添加した場合に形成されたコロニーの光学顕微鏡写真を図３［ｂ］に示す。球状コロニー形成単位（CFU-S）は、「２％シナモン」を添加した場合の方が「１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ」を添加した場合よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。以上の結果から、本発明における「増殖因子以外のＴｉｅ２発現増強剤」（その一例としてのシナモン）を用いることにより、細胞集団のＴｉｅ２陽性率の向上、またはＴｉｅ２陽性細胞における発現の亢進により、球状コロニーを形成する幹／前駆細胞としての性質をより強く備えている細胞を含む細胞集団が得られるようになると考えられる。

［実施例４］
　実施例１と同様の方法（増殖培養工程、分化培養第１工程および分化培養第２工程）により培養した。分化培養第２工程後の細胞集団を回収し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）法により、細胞表面のプロテオグリカン、I型コラーゲン、II型コラーゲンそれぞれの発現が陽性である細胞の数を測定し、細胞集団全体の細胞数に対する比率（陽性率）を算出した。

　プロテオグリカン（ＰＧ）、I型コラーゲン（Type1 col）、II型コラーゲン（Type2 col）それぞれの陽性率（平均値±標準誤差、ｎ＝３）の結果を図４に示す。II型コラーゲンについて、分化培養第１工程において「２％シナモン」を添加した場合は、「１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ」を添加した場合に比べて、得られた細胞集団における陽性率が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。本発明の培養方法に基づく分化培養工程（分化培養第１工程）を行うことにより、II型コラーゲンの発現が陽性である機能的な軟骨細胞を豊富に含む細胞集団を調製できることが示された。

Claims

　軟骨に由来する、Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）の発現が陽性である細胞（以下「軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞」と呼ぶ。）を含む細胞集団の培養方法であって、
　少なくとも１種の、Ｔｉｅ２発現増強作用を有する植物由来抽出物が添加された培地中で、当該軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養することを含む、培養方法。
　前記植物が、ニッケイ（Cinnamomum）属の植物である、請求項１に記載の培養方法。
　細胞外マトリックスおよび／またはポリアミノ酸を含有するコーティング剤が塗布された培養表面を有する培養容器で行われる、請求項１または２に記載の培養方法。
　前記細胞外マトリックスがIV型コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンである、請求項３に記載の培養方法。
　前記ポリアミノ酸がポリリジンである、請求項３または４に記載の培養方法。
　軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞から分化した軟骨細胞を含む細胞集団の調製方法であって、
　請求項１～５のいずれか一項に記載の培養方法を実施する工程を含む、細胞集団中の軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞のＴｉｅ２の発現を増強するとともに、軟骨細胞へと分化誘導するための培養段階（以下「分化培養段階」と呼ぶ。）
　を含む、調製方法。
　前記軟骨細胞が、Ｃｏｌ２（II型コラーゲン）の発現が陽性である細胞を含む、請求項６に記載の調製方法。
　前記分化培養段階が、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）およびＡｎｇ－１（アンジオポエチン－１）からなる群より選ばれる少なくとも１種の増殖因子が添加された培地中で軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、請求項６または７に記載の調製方法。
　前記分化培養段階の前に、
　軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞を含む細胞集団を増殖するための培養段階（以下「増殖培養段階」と呼ぶ。）
　を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の調製方法。
　前記分化培養段階によって、軟骨由来Ｔｉｅ２陽性細胞も残存している細胞集団を得る、請求項６～９のいずれか一項に記載の調製方法。
　請求項１～５のいずれか一項に記載の培養方法によって得られた細胞集団。
　請求項１～５のいずれか一項に記載の培養方法における培地と、当該培養方法に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
　請求項６～１０のいずれか一項に記載の調製方法における、分化培養段階によって得られた細胞集団。
　請求項６～１０のいずれか一項に記載の調製方法における、分化培養段階用培地と、当該分化培養段階に供される、培養されているまたは得られた細胞集団とを含有する培養物。
　請求項１０または１３に記載の細胞集団を含有する、細胞治療用組成物。
　軟骨における障害、症状または疾患に対する治療または予防用である、請求項１５に記載の細胞治療用組成物。