WO2016060249A1 - オリーブ果実エキスを含有するＴｉｅ２活性化剤 - Google Patents

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fruit extract
olive fruit
active ingredient
vascular
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笠島　直樹
優 小南
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サントリーホールディングス株式会社
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    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/63—Oleaceae (Olive family), e.g. jasmine, lilac or ash tree

Definitions

  • the present invention relates to a Tie2 activator, and more particularly to a Tie2 activator containing an olive fruit extract as an active ingredient.
  • the present invention also includes an olive fruit extract as an active ingredient, a vascular permeability inhibitor, an angiogenesis inhibitor, a vascular maturation agent, a vascular normalization agent, a vascular stabilization agent, and a lymphatic vessel stabilization. Also related to agents.
  • the present invention also includes a vascular permeability inhibitor, a vascular maturation agent, a vascular normalization agent, comprising as an active ingredient one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein. It also relates to vascular stabilizers, lymphatic vessel stabilizers, and Tie2 activators. Furthermore, this invention relates also to the composition containing the said agent.
  • the blood vessels not only send oxygen and nutrients through the blood to the organs throughout the body, but also carry wastes from the tissues and excrete them outside the body, and are important for the human body to maintain vital activities.
  • aging of a blood vessel and failure of a function have a great influence on human health, as represented by arteriosclerosis, and lead to appearances such as wrinkles and swelling.
  • activation of the receptor tyrosine kinase Tie2 (Tyrosine kinase with Ig and ECF homology domain 2) has attracted attention for this aging of blood vessels.
  • Tie2 when Tie2 is activated by angiopoietin-1 from vascular wall cells, adhesion between vascular endothelial cells is induced and contributes to stabilization of vascular endothelial cells.
  • ingredients and foods having this Tie2 activating action have been found, used in supplements and beverages, and used for the purpose of beauty, swelling, and cooling properties.
  • Tie2 is Kiraya, twilight, ginkgo, oyster, turmeric, chrysanthemum, jujube, wolfberry, chamomile, butcher bloom, hawthorn, star fruit, ghetto, lotus, rooibos, indian date, karin, schigua guava , Hihatsu, siberian carrot, mango ginger, ginseng, akigumi, okajiki, scallop, ryebu, yabukanzo, japonica, honeybee, peony, mube, salamander, konara, kunugi, akinonogeshi, shiragamo, pokeweed, redwood
  • Patent Documents 1 to 7 its action has been found in extracts such as Sakoku, Ousei, Gokutiku, and Karonin Vulture.
  • JP 2012-236895 A Special table 2009-154237 JP 2011-201811 A JP 2011-102275 A JP 2011-102274 A JP 2011-102273 A JP 2009-263358 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-99777 JP 2013-241356 A JP 2011-102272 A
  • An object of the present invention is to provide a novel Tie2 activating action or the like that makes it possible to exert a blood vessel permeation suppressing effect by inducing adhesion between cells of vascular endothelium and stabilizing vascular endothelial cells.
  • the object is to provide ingredients.
  • a component obtained from olive more preferably from olive fruit, has Tie2 activation action and the like.
  • Hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein may also have vascular permeability-inhibiting effects, vascular maturation effects, vascular normalization effects, vascular stabilization effects, lymphatic vessel stabilization effects, and Tie2 activation effects.
  • aspects of the present invention include, but are not limited to, the following inventions.
  • a Tie2 activator containing olive fruit extract as an active ingredient. (2) The Tie2 activator according to (1), wherein the olive fruit extract is obtained from olive juice. (3) The Tie2 activator according to (1) or (2), wherein the olive fruit extract is soluble in an aqueous solvent.
  • the olive fruit extract contains one or more components selected from the group consisting of polyphenols, compounds containing these in the structure, and secoiridoids derived from the terpene part of these compounds, (1) to (3) Tie2 activator in any one of.
  • a composition comprising the Tie2 activator according to any one of (1) to (5).
  • a vascular permeability inhibitor containing olive fruit extract as an active ingredient.
  • a vascular maturation agent comprising olive fruit extract as an active ingredient.
  • a blood vessel normalizing agent comprising olive fruit extract as an active ingredient.
  • a lymphatic vessel stabilizer containing olive fruit extract as an active ingredient (12) A lymphatic vessel stabilizer containing olive fruit extract as an active ingredient. (13) A composition comprising the agent according to any one of (8) to (12). (14) Function exerted by suppressing vascular permeability, function exerted by vascular maturation, function exerted by normalization of blood vessel, function exerted by stabilizing blood vessel, and exerted by stabilizing lymphatic vessel The composition according to (13), which is labeled with one or more functions selected from the group consisting of functions. (15) A vascular permeability inhibitor comprising, as an active ingredient, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • a vascular maturation agent containing, as an active ingredient, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • a blood vessel normalizing agent comprising, as an active ingredient, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • a blood vessel stabilizer containing, as an active ingredient, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • a lymphatic vessel stabilizer comprising, as an active ingredient, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • a Tie2 activator containing, as an active ingredient, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • a composition comprising the agent according to any one of (15) to (20).
  • the Tie2 activator in the present invention induces adhesion between vascular endothelial cells by the excellent Tie2 activating action of olive fruit extract, stabilizes vascular endothelial cells, and suppresses vascular permeation, thereby inhibiting blood vessels and lymphatic vessels. It can improve and prevent symptoms caused by aging.
  • the adhesion of vascular endothelial cells by Tie2 activation leads to the tight connection of blood vessel cells, so that nourishment of the skin, improvement of skin firmness and texture, and prevention of wrinkles can be obtained.
  • the blood flow is improved by blocking the gap between the endothelial cells of the blood vessels and lymph vessels, the water and waste products from the tissue are collected, and various symptoms such as coldness, stiff shoulders, swelling, and bears are improved. Preventive effect is obtained.
  • the agent containing the olive fruit extract as an active ingredient in the present invention exerts vascular permeability inhibitory action, vascular maturation action, vascular normalization action, vascular stabilization action, and lymphatic vessel stabilization action. be able to.
  • the agent containing one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein in the present invention also has a vascular permeability inhibitory action, a vascular maturation action, a vascular normalization action, a vascular It can exert a stabilizing effect, a lymphatic vessel stabilizing effect, and a Tie2 activating effect.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting of activated Tie2 for each sample and a graph of the Tie2 activation rate compared to the control.
  • FIG. 2 shows the result of Miles assay for each sample and a graph of the inhibition rate of vascular permeability.
  • Tie2 activator Activation of the receptor called Tie2 present in vascular endothelial cells plays an important role in the structural stabilization of capillaries. Tie2 has been shown to be present in vascular endothelial cells as well as lymphatic endothelial cells, activated by angiopoietin-1 released from mural cells, strengthening adhesion between endothelial cells and mural cells, Involved in stabilization.
  • the “Tie2 activator” refers to an agent having the ability to convert Tie2 into its active form (phosphorylated Tie2) by phosphorylating it. The Tie2 activator in the present invention activates Tie2.
  • polyphenols such as hydroxytyrosol and tyrosol as active ingredients, oleuropein, oleacein, acteoside, 3,4-DHPEA-EA, 3,4-DHPEA-EDA, hydroxy, which contain these in the structure
  • polyphenols such as hydroxytyrosol and tyrosol as active ingredients, oleuropein, oleacein, acteoside, 3,4-DHPEA-EA, 3,4-DHPEA-EDA, hydroxy, which contain these in the structure
  • examples include 4-Ep-coumaroylierioganoside having a tyrosol glycoside and p-coumaroyl acid in the structure.
  • many of these polyphenol derivatives have a compound derived from terpene in the molecule, and the terpene moiety is a secoiridoid.
  • the active ingredient in the Tie2 activator of the present invention is not particularly limited, but is selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, oleuropein, oleacein, acteoside, 3,4-DHPEA-EA, and 3,4-DHPEA-EDA.
  • One or more components are preferable, and in particular, one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein are more preferable.
  • the Tie2 activator in the present invention can prevent and improve aging of blood vessels and lymphatic vessels by the excellent Tie2 activating action of olive fruit extract.
  • the Tie2 activator in the present invention can stabilize vascular endothelial cells by exerting an excellent Tie2 activating action of olive fruit extract and exert a blood vessel permeation suppressing action.
  • the blood vessel cells are firmly connected, so that the skin can be nourished, the skin can be improved, and the beauty effects such as prevention of wrinkles can be obtained.
  • the blood flow is improved by blocking the gaps between the endothelial cells of the blood vessels and lymph vessels, the water and waste products from the tissue are collected, and various symptoms such as coldness, stiff shoulders, swelling and bears are improved. Preventive effect is obtained.
  • olive fruit extract refers to an extract obtained by extraction from olive fruit. Tie2 activity action, vascular permeability inhibition action, vascular maturation action, vascular normalization action, vascular stabilization The component which has an effect
  • “olive fruit juice” refers to an extract obtained from an aqueous layer obtained by separating a liquid phase obtained from olive fruit into an oil layer and an aqueous layer. Olive fruit extract is, for example, a water-soluble component, and can be extracted from olive using an aqueous solvent.
  • aqueous solvent examples include water and alcohols (for example, ethanol).
  • alcohols for example, ethanol.
  • olive fruit extract olive juice or an aqueous solvent extract may be used as they are, or an extract obtained by filtering and concentrating polyphenols in an adsorption column and spray-drying them may be used.
  • the content of the olive fruit extract contained in the Tie2 activator is 0.01 wt% to 50 wt%, preferably 0.1 wt% to 40 wt%, more preferably based on the total amount of the Tie2 activator. 1% to 30% by weight.
  • the dose of the Tie2 activator in the present invention can be determined as appropriate according to the content of the olive fruit extract contained in the Tie2 activator, and can be determined as appropriate based on the age, weight, health status, etc. of the subject. However, for example, the daily intake of a human adult is 0.1 mg to 400 mg, preferably 1 mg to 200 mg, more preferably 10 mg to 100 mg, which can be taken and administered in a single dose or divided into multiple doses.
  • the component of the olive fruit extract in the present invention contains, in addition to polyphenols, one or more components selected from compounds containing these in the structure and sequoridoids derived from the terpene portion of these compounds.
  • polyphenols include polyphenols such as hydroxytyrosol and tyrosol, as well as oleuropein, oleacein, acteoside, 3,4-DHPEA-EA, 3,4-DHPEA-EDA, and hydroxytyrosol glycosides containing these in the structure.
  • 4-Ep-coumaroyl aparoganoside having p-coumaroyl acid in the structure.
  • polyphenol derivatives have a compound derived from terpene in the molecule, and the terpene moiety is a secoiridoid.
  • Other components include elenolic acid and terpene glycosides such as rengiosides and oleosides.
  • the active ingredient in the present invention is not particularly limited, but one or more ingredients selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, oleuropein, oleacein, acteoside, 3,4-DHPEA-EA, and 3,4-DHPEA-EDA
  • one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein are more preferable.
  • Olive which is a raw material of olive fruit extract
  • olive oil collected from olive fruits is widely used as an edible oil.
  • olive fruit extract is one of the industrial wastes produced when squeezing olives.
  • health foods and supplement materials have been developed and sold.
  • Olive fruit can be used as the main ingredient of the olive fruit extract, but leaves, seeds, leaves, stems and the like may be mixed.
  • olive fruit When using olive fruit as a raw material, it may be used as it is or may be dried by freeze-drying or the like.
  • the residue after squeezing oil from olive fruit can be used as it is or in a dried state. It is preferable to use only olive juice, which is an aqueous layer obtained by separating a liquid phase obtained from olive fruit into an oil layer and an aqueous layer.
  • Varieties of olives are not particularly limited, and for example, varieties such as Manzanillo, Lucca, Nevadillo Blanco, Mission, Picual, Arbequina, Ohiblanca, Cornicabra, Gordal, Moloioro, Frantoio, Colatina, Retino, etc. can be suitably used.
  • the olive fruit extract can be obtained through a separation process and a purification process.
  • Separatation process The olive fruit that is the raw material is squeezed and separated into oil and fruit juice by centrifugation to obtain olive juice. Squeezing and centrifugation can be performed using methods known to those skilled in the art.
  • Purification process An extract obtained by filtering and concentrating the olive juice obtained in the separation step may be used as the olive fruit extract in the present invention.
  • the filtrate obtained by filtering olive juice is loaded onto a column packed with an adsorption resin, and after removing non-adsorbed components such as sugars, minerals, and organic acids, an aqueous solvent (for example, water, ethanol, Alternatively, a fraction containing abundant components such as olive-derived Tie2 activation can be obtained by elution using a mixture thereof. A fraction containing abundant components such as Tie2 activating action may be used as the olive fruit extract in the present invention.
  • Those skilled in the art can appropriately set the conditions for the type of the adsorbing resin and the column elution solvent according to the variety, form, etc. of the olive used.
  • vascular permeability inhibitors include angiogenesis inhibitors, vascular maturation agents, vascular normalizers, vascular stabilizers, lymphatic vessel stabilizers, and the like.
  • These agents contain olive fruit extract, which is also an active ingredient of the Tie2 activator, as an active ingredient.
  • These agents have one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, oleuropein, oleacein, acteoside, 3,4-DHPEA-EA, and 3,4-DHPEA-EDA as active ingredients. It may be contained, and more preferably contains one or more components selected from the group consisting of hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein as an active ingredient.
  • vascular permeability inhibitor refers to an agent having an inhibitory action on the enhancement of vascular permeability caused by VEGF (vascular endothelial growth factor).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Angiogenesis inhibitor refers to an agent having an action of suppressing a network of new blood vessels formed from existing blood vessels.
  • Bood maturation agent induces adhesion between vascular endothelial cells and vascular wall cells, and forms adhesion spots between vascular endothelial cells so that intravascular environmental factors do not easily leak out of blood vessels. An agent with a maturation action.
  • “Blood vessel normalizing agent” refers to an increase in adhesion between vascular endothelial cells and promotes the backing of vascular wall cells to vascular endothelial cells, leading to disordered growth of blood vessels and blood vessels with broken vascular permeability. An agent having a normalizing action for making such an abnormal blood vessel into a normal state.
  • “Blood vessel stabilizer” refers to an action that suppresses damage to existing blood vessels, detachment between vascular endothelial cells, and detachment between vascular endothelial cells and vascular wall cells, and stabilization that suppresses cell death of vascular endothelial cells. An agent having an action.
  • the “lymphatic vessel stabilizer” refers to an agent having an action of stabilizing a lymphatic vessel so that lymphatic endothelial cells are appropriately arranged and lined, and maintaining a function of quickly collecting interstitial fluid.
  • vascular permeability inhibitors angiogenesis inhibitors
  • vascular maturation agents vascular normalization agents
  • vascular stabilization agents vascular stabilization agents
  • lymphatic vessel stabilization agents activated by Tie2.
  • the contents described for the agent can be applied as they are.
  • composition As one aspect of the present invention, from the above Tie2 activator, vascular permeability inhibitor, angiogenesis inhibitor, vascular maturation agent, vascular normalizer, vascular stabilizer, lymphatic vessel stabilizer And a composition containing one or more agents selected from the group consisting of:
  • the composition can be blended with known additives used in cosmetics, pharmaceuticals, and the like.
  • an additive is not specifically limited,
  • additives such as an excipient
  • an excipient such as an excipient
  • flavor such as L-ascorbic acid, catechin, dextrin, cyclodextrin, calcium carbonate, trehalose and the like can be used.
  • the composition may be used in combination with a known component having a Tie2 activation action or the like, or may be used in combination with a known component that is effective in preventing aging of blood vessels and beauty.
  • the form of the composition can be appropriately determined according to the purpose of use, but can be used in the form of a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, or the like. In addition to pharmaceuticals and quasi-drugs, pharmaceutical compositions do not belong to these under the Pharmaceutical Affairs Law. Also included are compositions that are purchased and compositions that explicitly or implicitly appeal for preventive / improving effects of the Tie2 activator of the present invention.
  • the dosage form of the composition is not particularly limited, but is typically an oral preparation such as a granule, a tablet, a capsule or a liquid, and a capsule is preferred.
  • the indication of the function exerted by suppressing vascular permeability, vascular maturation, vascular normalization, vascular stabilization, lymphatic vessel stabilization, or Tie2 activation is provided.
  • the present invention relates to a composition containing the agent of the present invention.
  • Such display or function display is not particularly limited. For example, “suppresses increase in vascular permeability”, “suppresses leakage of intravascular factors to the outside of blood vessels”, “improves blood vessels to a normal state”.
  • indications such as the indication and the function indication may be attached to the composition itself, or may be attached to a container or packaging of the composition.
  • the Tie2 activator is 0.01% to 99% by weight, preferably 0.1% to 50% by weight, more preferably, based on the total amount of the composition. 1% to 30% by weight, even more preferably 10% to 30% by weight, and the olive fruit extract is 0.05% to 50% by weight, preferably 0%, based on the total amount of the composition. 5 to 25% by weight, more preferably 5 to 20% by weight.
  • the dose of the composition which is an embodiment of the present invention varies depending on the content of the olive fruit extract contained in the Tie2 activator and can be appropriately determined based on the age, weight, health status, etc. of the subject.
  • the daily intake of a human adult is 0.1 mg to 400 mg, preferably 1 mg to 300 mg, more preferably 10 mg to 200 mg, and can be ingested and administered in a single dose or divided into multiple doses.
  • a composition comprising the vascular permeability inhibitor, the angiogenesis inhibitor, the vascular maturation agent, the vascular normalization agent, the vascular stabilization agent, or the lymphatic vessel stabilization agent.
  • the types, forms, dosage forms, doses, and the like of the components of these compositions can be applied as they are with respect to the compositions containing the Tie2 activator.
  • Example 1 Evaluation of Tie2 activating action of olive fruit extract
  • Tie2 activating action was evaluated using olive fruit extract.
  • the obtained olive fruit extract was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 50 ⁇ g / mL and 100 ⁇ g / mL to prepare a test sample.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a test sample in which Angiopoietin-1 was dissolved in DMSO to a concentration of 500 ng / mL was prepared and used as a positive control.
  • ⁇ Test method> Normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured to confluence were seeded in a 96-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / 0.1 mL / well, and a medium for low serum vascular endothelial cell proliferation (Kurashiki Spinning Co., Ltd., Cultured overnight using Humedia-EG2).
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HUVEC after overnight culture was replaced with 0.1 mL of vascular endothelial cell basal medium (Humedia-EB2 manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) 3 hours before cell stimulation (addition of test sample), and then cultured again It was. Thereafter, 0.1 mL of the test sample dissolved in Humedia-EB2 was added to the well and incubated for 20 minutes. After incubation, the amount of phosphorylated (active) Tie2 in the cell was measured using an immunoassay kit (manufactured by R & D Systems, Human Phospho-Tie2 (Y992) Immunoassay) according to the protocol.
  • an immunoassay kit manufactured by R & D Systems, Human Phospho-Tie2 (Y992) Immunoassay
  • phosphorylated Tie2 was similarly measured for DMSO used for dissolving the test sample as a negative control.
  • Tie2 activation rate was calculated according to the following formula, and phosphorylation action was evaluated.
  • Tie2 activation rate (%) [(Measured value of phosphorylated Tie2 when test sample is added) / (Measured value of phosphorylated Tie2 in negative control)] ⁇ 100 ⁇ Result>
  • the results are shown in Table 1. As shown in Table 1, Tie2 activation action was confirmed in the olive fruit extract.
  • Example 2 Tie2 activation action of olive fruit extract
  • the Tie2 activation action was examined using Western blotting.
  • ⁇ Test method> Cells overexpressing human Tie2 in mouse pro-B cells (Ba / F3) (Ba / F3-human Tie2) were used for Tie2 phosphorylation analysis. Stimulation of Ba / F3-human Tie2 with the test sample was performed by adding RPMI-1640 medium without FBS and the test sample, washing the cells with PBS 10 minutes later, and then using PhosphoSafe TM Extraction Reagent (Novagen) The cell extract was collected. This was electrophoresed on a 7.5% SDS gel and transferred to a PVDF membrane.
  • a phosphorylated Tie2 band was detected using an anti-phosphorylated Tie2 antibody (Cell Signaling Technology) and an HRP-labeled secondary antibody.
  • the DMSO used to dissolve the test sample as a negative control was similarly evaluated for phosphorylated Tie2, and as a positive control, the sample containing Angiopoietin-1 at a concentration of 0.4 ⁇ g / mL in DMSO.
  • phosphorylated Tie2 was evaluated. Band detection and analysis were performed with an imaging device ChemiDoc XRS Plus (Bio-Rad Laboratories) and Image Lab Software version 2.0 (Bio-Rad Laboratories), and Tie2 activation action was evaluated according to the following formula.
  • Tie2 activation rate (%) [(Band intensity of phosphorylated Tie2 when test sample is added) / (Band intensity of phosphorylated Tie2 in negative control)] ⁇ 100 ⁇ Result>
  • the results of Western blotting are shown in FIG.
  • the band intensity of the negative control was taken as 100%, and the relative value was shown in a graph. From the results shown in FIG. 1, the olive fruit extract was confirmed to have a Tie2 activation effect.
  • Example 3 Inhibition of vascular permeability of olive fruit extract
  • a sample containing the olive fruit extract prepared in Example 1 in DMSO at a concentration of 25 ⁇ g / mL and 100 ⁇ g / mL was used. The inhibitory effect on the increase in vascular permeability caused by growth factor was evaluated.
  • mice under anesthesia with pentobarbital were intravenously injected with 100 ⁇ L of 1% Evans Blue dye prepared in physiological saline, and 15 minutes later, vascular endothelial growth factor (VEGF 300 ng / mL final) and each test sample were added.
  • VEGF 300 ng / mL final vascular endothelial growth factor 300 ng / mL final
  • An equal volume was mixed, and 20 ⁇ L thereof was administered into the back skin using a 30 G needle. After 40 minutes, the back skin was peeled off, the dye leaking into the skin was observed and photographed, the skin tissue was cut out, the dye was extracted using formamide, and OD 620 was measured with an absorptiometer.
  • each mouse was simultaneously provided with a test sample and a section to which VEGF was not administered (control only with PBS (-)) and a section to which only VEGF was administered, and the vascular permeability inhibitory action of the test sample was evaluated.
  • the measurement results were tested for significance by Tukey's multiple comparison test.
  • Example 4 Evaluation of Tie2 activating action of hydroxytyrosol, tyrosol and oleuropein derived from olive fruit extract Hydroxytyrosol, tyrosol and oleuropein contained in olive fruit extract were separated and purified, and Tie2 activating action of these components was confirmed. evaluated.
  • ⁇ Test method> Normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured to confluence were seeded in a 96-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells / 0.1 mL / well, and a medium for low serum vascular endothelial cell proliferation (Kurashiki Spinning Co., Ltd., Cultured overnight using Humedia-EG2).
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HUVEC after overnight culture was replaced with 0.1 mL of vascular endothelial cell basal medium (Humedia-EB2 manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) 3 hours before cell stimulation (addition of test sample), and then cultured again It was. Thereafter, 0.1 mL of the test sample dissolved in Humedia-EB2 was added to the well and incubated for 20 minutes. After incubation, the amount of phosphorylated (active) Tie2 in the cell was measured using an immunoassay kit (H & R®Phospho-Tie2 (Y992) Immunoassay, manufactured by R & D®Systems) according to the protocol.
  • H & R®Phospho-Tie2 (Y992) Immunoassay, manufactured by R & D®Systems) according to the protocol.
  • phosphorylated Tie2 was similarly measured for DMSO used for dissolving the test sample as a negative control.
  • Tie2 activation rate was calculated according to the following formula, and phosphorylation action was evaluated.
  • Tie2 activation rate (%) [(Measured value of phosphorylated Tie2 when test sample is added) / (Measured value of phosphorylated Tie2 in negative control)] ⁇ 100 ⁇ Result>
  • the results are shown in Table 3. As shown in Table 1, Tie2 activation action was confirmed in hydroxytyrosol, tyrosol, and oleuropein.
  • Production Example 1 Capsules Olive fruit extract and additives having the formulations shown in Table 4 below were weighed and mixed uniformly to prepare a mixture. The resulting mixture was a soft capsule prepared with the formulation shown in Table 5 The capsule was filled in a conventional manner to obtain a soft capsule.
  • the Tie2 activator and the like in the present invention induces adhesion between vascular endothelial cells and stabilizes vascular endothelial cells and suppresses vascular permeation through excellent Tie2 activating action of olive fruit extract, etc. Symptoms due to aging of lymphatic vessels can be improved and prevented.

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Abstract

　本発明の課題は、血管内皮の細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化することで血管透過抑制効果を発揮させるための、Tie2活性剤等を提供することを目的とする。　有効成分としてオリーブ果実エキスを含有させることにより、Tie2活性化剤等を提供することができる。

Description

オリーブ果実エキスを含有するＴｉｅ２活性化剤
　本発明は、Tie2活性化剤に関し、より詳細にはオリーブ果実エキスを有効成分として含有するTie2活性化剤に関する。また、本発明は、オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、およびリンパ管安定化剤にも関する。また、本発明は、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管透過性抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤、およびTie2活性化剤にも関する。さらに、本発明は、前記剤を含有する組成物にも関する。
　血管は、血液を通して全身の臓器に酸素や栄養素を送るだけでなく、組織中からの老廃物を運び体外へ排泄する役割を担っており、人体が生命活動を維持するにあたって重要な組織である。一般的に血管の老化や機能の破綻は、動脈硬化に代表されるような人体の健康に大きな影響があるものから、しわやむくみなど外見的な所見にも繋がる。近年、この血管の老化に対して、受容体型チロシンキナーゼTie2（Tyrosine kinase with Ig and ECF homology domain 2）の活性化が着目されている。血管の壁細胞からのアンジオポエチン-1によってTie2が活性化を受けると血管内皮の細胞間の接着が誘導され、血管内皮細胞の安定化に寄与することが知られている。近年、このTie2活性化作用を有する成分や食品が見出されており、サプリメントや飲料等で利用され、美容やむくみ、冷え性を目的に用いられている。
　具体的に、このTie2活性化は、キラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ニッケイ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニンハゲキテなどの抽出物にその作用が見出されている（特許文献１～７）。
　一方、成分としてはウルソール酸、コロソリン酸、３－Ｏ－ガロイルプロシアニジンＢ－１、リノレン酸、１３－ヒドロキシ－９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ－オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ－２、エピカテキン－（４β－６）－エピカテキン（４β－８）－エピカテキン、プロシアニジンＣ－１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ、３’－Ｏ－メチルガロカテキン、ピペルノナリン、シリンガレシノール、エレウテロシドＥ、エレウテロシドＥ１、セサミン、ユーデスミン、シルバテスミン、ピノレジノール、ヤンガンビン、フォルシチノール、クマリンなどに有効性が確認されている（特許文献８～１０）。
特開２０１２－２３６７９５号公報 特表２００９－１５４２３７号公報 特開２０１１－２０１８１１号公報 特開２０１１－１０２２７５号公報 特開２０１１－１０２２７４号公報 特開２０１１－１０２２７３号公報 特開２００９－２６３３５８号公報 特開２０１４－９７９７７号公報 特開２０１３－２４１３５６号公報 特開２０１１－１０２２７２号公報
　本発明の課題は、血管内皮の細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化することで血管透過抑制効果を発揮させることを可能とする、優れたTie2活性化作用等を有する新たな成分を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、オリーブから、より好ましくはオリーブ果実から得られる成分がTie2活性化作用等を有することを新たに見出した。また、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインが血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、リンパ管安定化作用、およびTie2活性化作用を有することも見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の態様には、これらに限定されるわけではないが、以下の発明が含まれる。
（１）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、Tie2活性化剤。
（２）オリーブ果実エキスが、オリーブ果汁から得られることを特徴とする、（１）に記載のTie2活性化剤。
（３）オリーブ果実エキスが、水性溶剤に可溶である、（１）または（２）に記載のTie2活性化剤。
（４）オリーブ果実エキスが、ポリフェノール類、これらを構造中に含む化合物、およびこれら化合物のテルペン部に由来するセコイリドイド類からなる群から選択される１以上の成分を含有する、（１）～（３）のいずれかに記載のTie2活性化剤。
（５）オリーブ果実エキスが、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を含有する、（１）～（４）のいずれかに記載のTie2活性化剤。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載のTie2活性化剤を含有する、組成物。
（７）Tie2を活性化することにより発揮される機能の表示を付した、（６）に記載の組成物。
（８）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
（９）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の成熟化剤。
（１０）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の正常化剤。
（１１）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の安定化剤。
（１２）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、リンパ管安定化剤。
（１３）（８）～（１２）のいずれかに記載の剤を含有する、組成物。
（１４）血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、およびリンパ管安定化により発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、（１３）に記載の組成物。
（１５）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
（１６）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の成熟化剤。
（１７）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の正常化剤。
（１８）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の安定化剤。
（１９）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、リンパ管安定化剤。
（２０）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、Tie2活性化剤。
（２１）（１５）～（２０）のいずれか１項に記載の剤を含有する、組成物。
（２２）血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、リンパ管安定化により発揮される機能、およびTie2を活性化することにより発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、（２１）に記載の組成物。
　本発明におけるTie2活性化剤は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用により血管内皮細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化し、血管透過を抑制することで、血管やリンパ管の老化による症状を改善し、これを予防することができる。例えば、Tie2活性化による血管内皮細胞の接着誘導により血管の細胞がしっかりと結びついて肌に栄養がいきわたり、肌のハリ・キメの改善、しわ防止などの美容効果が得られる。また、血管・リンパ管の内皮細胞の隙間がふさがれることにより血流が改善し、組織中からの水分・老廃物が回収されて、冷え・肩こり・むくみ・クマなどの諸症状を改善し、予防する効果が得られる。
　また、本発明におけるオリーブ果実エキスを有効成分として含有する剤は、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、およびリンパ管安定化作用を発揮することができる。さらに、本発明におけるヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を含有する剤も、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、リンパ管安定化作用、およびTie2活性化作用を発揮することができる。
図１は、各試料の活性化型Tie2のウエスタンブロッティングの結果、および対照と比較したTie2活性化率のグラフを示す。 図２は、各試料のマイルスアッセイの結果、および血管透過性抑制率のグラフを示す。
　以下に、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　Tie2活性化剤
　毛細血管の構造的な安定化には血管内皮細胞に存在するTie2と呼ばれる受容体の活性化が重要な役割を果たしている。このTie2は血管内皮細胞のほかリンパ管内皮細胞にも存在が示され、壁細胞から放出されるアンジオポエチン-1によって活性化され、内皮細胞同士の接着や壁細胞との接着を強め、血管構造の安定化に関与している。本発明において「Tie2活性化剤」とは、Tie2をリン酸化することでその活性体（リン酸化Tie2）に変換できる能力を有する剤をいい、本発明におけるTie2活性化剤はTie2を活性化するオリーブ果実エキスであり、有効成分としてヒドロキシチロソールやチロソールなどのポリフェノール類のほか、これらを構造中に含むオレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＡ、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＤＡ、ヒドロキシチロソール配糖体、ｐ－クマロイル酸を構造内に持つ４－Ｅ－ｐ－クマロイルセコロガノサイドが挙げられる。さらにこれらポリフェノール誘導体の多くはその分子内にテルペンに由来する化合物を有しており、そのテルペン部はセコイリドイド類である。そのほかの成分としてエレノール酸やテルペン配糖体であるレンギオサイド類やオレオサイド類などが挙げられる。本発明のTie2活性化剤における有効成分は特に限定されないが、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＡ、および３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＤＡからなる群から選択される１以上の成分であることが好ましく、特にヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分であることがより好ましい。
　このTie2の活性は、例えば年齢と共に低下するという知見も報告され、それに伴い血管やリンパ管も老化することが明らかとなっている。したがって、本発明におけるTie2活性化剤は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用により血管やリンパ管の老化を予防し、改善することができる。
　また、血管の老化によって血管構造が不安定になると、血管から血漿成分などの栄養成分が漏出し、必要な個所に必要な成分が運ばれなくなる。その結果、肌状態の低下等、様々なトラブルが生じることが考えられる。したがって、本発明におけるTie2活性化剤は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用により血管内皮細胞を安定化し、血管透過抑制作用を発揮することができる。そして血管の細胞がしっかりと結びつくことにより肌に栄養がいきわたり、肌のハリ・キメの改善、しわ防止などの美容効果が得られる。さらに、血管・リンパ管の内皮細胞の隙間がふさがれることにより血流が改善し、組織中からの水分・老廃物が回収されて、冷え・肩こり・むくみ・クマなどの諸症状を改善し、予防する効果が得られる。
　＜有効成分（オリーブ果実エキス）＞
　本発明において「オリーブ果実エキス」とは、オリーブ果実から抽出されて得られる抽出物をいい、Tie2活性作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、リンパ管安定化作用を有する成分をいう。より好ましくはオリーブ果汁から得られる成分群である。ここで、本発明において「オリーブ果汁」とは、オリーブ果実から得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層から得られるエキスをいう。オリーブ果実エキスは、例えば水溶性成分であり、オリーブから水性溶剤を用いて抽出することもできる。水性溶剤としては、水、アルコール類（例えばエタノール）が挙げられる。オリーブ果実エキスは、オリーブ果汁や水性溶剤抽出物をそのまま用いてもよく、これらをろ過後、吸着カラムにてポリフェノールを濃縮して噴霧乾燥させて得られる抽出物を用いてもよい。
　Tie2活性化剤に含まれるオリーブ果実エキスの含有量は、Tie2活性化剤全体量に対して、０．０１重量％～５０重量％、好ましくは０．１重量％～４０重量％、より好ましくは１重量％～３０重量％である。本発明におけるTie2活性化剤の用量は、Tie2活性化剤に含まれるオリーブ果実エキスの含有量によって適宜決定することができ、また対象の年齢、体重、健康状況等に基づき適宜決定することができるが、例えば、ヒト成人の１日摂取量は、０．１mg～４００mg、好ましくは１mg～２００mg、より好ましくは１０mg～１００mgであり、単回あるいは複数回に分けて摂取・投与することができる。
　本発明におけるオリーブ果実エキスの成分としては、ポリフェノール類のほか、これらを構造中に含む化合物や、これら化合物のテルペン部に由来するセコイリドイド類から選択される１以上の成分を含有する。ポリフェノール類としては、ヒドロキシチロソールやチロソールなどのポリフェノール類のほか、これらを構造中に含むオレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＡ、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＤＡ、ヒドロキシチロソール配糖体、ｐ－クマロイル酸を構造内に持つ４－Ｅ－ｐ－クマロイルセコロガノサイドが挙げられる。さらにこれらポリフェノール誘導体の多くはその分子内にテルペンに由来する化合物を有しており、そのテルペン部はセコイリドイド類である。そのほかの成分としてエレノール酸やテルペン配糖体であるレンギオサイド類やオレオサイド類などが挙げられる。本発明における有効成分は特に限定されないが、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＡ、および３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＤＡからなる群から選択される１以上の成分であることが好ましく、特にヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分であることがより好ましい。
　＜オリーブ果実エキスの原料＞
　オリーブ果実エキスの原料であるオリーブはモクセイ科の植物であり、オリーブの果実から採取されるオリーブオイルが食用油等として広く用いられている。一方で、オリーブの果実エキスはオリーブを搾油する際にでる産業廃棄物のひとつであり、近年これを加工した健康食品やサプリメント用の素材が開発、販売されている。オリーブ果実エキスの主原料として、オリーブの果実を用いることができるが、葉、種子、葉、茎等が混在していてもよい。オリーブ果実を原料として用いる場合、生のままで用いてもよいし、凍結乾燥等によって乾燥したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から油を搾った後の残滓も、そのまま、あるいは乾燥した状態で用いることができる。オリーブ果実から得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層であるオリーブ果汁のみを原料とすることが好ましい。
　オリーブの品種は特に限定されないが、例えばマンザニロ、ルッカ、ネバディロ・ブランコ、ミッション、ピクアル、アルベキナ、オヒブランカ、コルニカブラ、ゴルダル、モロイオロ、フラントイオ、コラティーナ、レッチーノ等の品種を好適に使用することができる。
　＜オリーブ果実エキスの調製方法＞
　オリーブ果実エキスは、分離工程および精製工程を経て得ることができる。
（分離工程）
　原料であるオリーブ果実を圧搾し、遠心分離によって油分と果汁に分離し、オリーブ果汁を得る。圧搾、遠心分離は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。
（精製工程）
　分離工程で得たオリーブ果汁をろ過し濃縮することにより得られるエキスを、本発明におけるオリーブ果実エキスとして用いてもよい。また、オリーブ果汁のろ過により得られたろ液を吸着樹脂を充填したカラムに負荷し、糖類やミネラル、有機酸など吸着樹脂に非吸着な成分を除いた後、水性溶剤（例えば、水、エタノール、またはこれらの混合物）を用いて溶出することにより、オリーブ由来のTie2活性化作用等のある成分を豊富に含有する画分を得ることができる。このTie2活性化作用等のある成分を豊富に含有する画分を、本発明におけるオリーブ果実エキスとして用いてもよい。吸着樹脂の種類やカラムの溶出溶媒は、使用するオリーブの品種、形態等に応じて、当業者は適宜その条件を設定することができる。
　その他の剤
　本発明の別の態様として、血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤などが挙げられる。これらの剤は、上記Tie2活性化剤の有効成分でもあるオリーブ果実エキスを有効成分として含有する。また、これらの剤は、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＡ、および３，４－ＤＨＰＥＡ－ＥＤＡからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有するものであってもよく、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含むものであることがより好ましい。
　本発明において、「血管透過性抑制剤」とは、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）によって引き起こされる血管透過性の亢進に対する抑制作用を備える剤をいう。「血管新生抑制剤」とは、既存の血管から形成される新たな血管のネットワークを抑制する作用を備える剤をいう。「血管の成熟化剤」とは、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管内環境因子が容易には血管外に漏出しないような血管内皮細胞間の接着斑を形成する成熟化作用を備える剤をいう。「血管の正常化剤」とは、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の血管内皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、正常な状態にする正常化作用を備える剤をいう。「血管の安定化剤」とは、既存の血管に対する傷害、血管内皮細胞同士の乖離、および血管内皮細胞と血管壁細胞の乖離を抑制する作用、および血管内皮細胞の細胞死を抑制する安定化作用を備える剤をいう。「リンパ管安定化剤」とは、リンパ管内皮細胞が適切に配置して裏打ちさるようリンパ管を安定化し、組織間液の速やかな回収機能を保持する作用を備える剤をいう。
　血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤に用いる成分の種類、用量、製造方法などは、Tie2活性化剤に関して記載した内容をそのまま適用することができる。
　組成物
　本発明の一態様として、上記Tie2活性化剤、血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤からなる群から選択される１以上の剤を含有する組成物が挙げられる。
　組成物には、Tie2活性化剤等のほか、化粧品、医薬品等に使用される公知の添加物を配合することができる。添加物は特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、酸化防止剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料等の添加物を使用できる。例えば、Ｌ－アスコルビン酸、カテキン、デキストリン、シクロデキストリン、炭酸カルシウム、トレハロースなどを使用することができる。また、組成物には、Tie2活性化作用等を有する公知の成分を併用してもよく、血管の加齢防止や美容に有効であることが公知の成分を併用してもよい。例えば、Tie2活性化作用が報告されているキラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ニッケイ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニンハゲキテの抽出物や血管内皮改善に効果があるプロシアニジンを含有するブドウ種子や松樹皮、ピーナッツ種皮、ライチ種皮などの抽出物やL-シトルリン、L-アルギニンなどのアミノ酸を使用することができる。
　組成物の形態は、使用目的に応じて適宜決定することができるが、化粧品組成物、および医薬組成物等の形態で用いることができる。医薬組成物には医薬品および医薬部外品のほか、薬事法上はこれらに属さないが、医薬品や医薬部外品と同様に本発明のTie2活性化剤等による予防・改善効果を期待して購入される組成物や、本発明のTie2活性化剤等による予防・改善効果を明示的または暗示的に訴求する組成物も含まれる。組成物の剤型も特に限定されないが、典型的には、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の経口用製剤であり、カプセル剤が好ましい。
　本発明は、別の側面では、血管透過性抑制、血管の成熟化、血管の正常化、血管の安定化、リンパ管安定化、またはTie2活性化により発揮される機能の表示を付した、前記本発明の剤を含有する組成物に関する。このような表示又は機能表示は特に限定されないが、例えば、「血管透過性亢進を抑制する」、「血管内因子の血管外への漏出を抑制する」、「血管を正常な状態に改善する」、「血管を正常な状態に維持する」、「血管内皮細胞同士の乖離を抑制する」、「血管内皮細胞の細胞死を抑制する」、又は「組織間液の速やかな回収機能を保持する」等が挙げられる。本発明において、当該表示及び機能表示のような表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
　本発明の一態様である組成物は、Tie2活性化剤を、組成物全体量に対して、０．０１重量％～９９重量％、好ましくは０．１重量％～５０重量％、より好ましくは１重量％～３０重量％含有し、さらにより好ましくは１０重量％～３０重量％含有し、オリーブ果実エキスを、組成物全体量に対して、０．０５重量％～５０重量％、好ましくは０．５重量％～２５重量％、より好ましくは５重量％～２０重量％含有する。本発明の一態様である組成物の用量は、Tie2活性化剤に含まれるオリーブ果実エキスの含有量によって異なり、また対象の年齢、体重、健康状況等に基づき適宜決定することができるが、例えば、ヒト成人の１日摂取量は、０．１mg～４００mg、好ましくは１mg～３００mg、より好ましくは１０mg～２００mgであり、単回あるいは複数回に分けて摂取・投与することができる。
　また、本発明の一態様として、上記血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、またはリンパ管安定化剤を含有する組成物が挙げられる。これら組成物の成分の種類、形態、剤型、用量などは、Tie2活性化剤を含有する組成物に関して記載した内容をそのまま適用することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例１：オリーブ果実エキスのTie2活性化作用の評価
　オリーブ果実エキスを用いて、Tie2活性化作用を評価した。
＜試料（オリーブ果実エキス）の調製＞
　オリーブ果実を圧搾し、遠心分離し、油分と果汁に分離する。ここで得られた果汁をろ過後、吸着系のカラムにて糖類やミネラル、有機酸など吸着樹脂に非吸着な成分を除いた後、Tie2活性化に作用のあるオリーブ成分を濃縮し、それを噴霧乾燥させたものをオリーブ果実エキスとして用いた。得られたオリーブ果実エキスを、50μg/mL、100μg/mLの濃度となるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、被験試料を調製した。また、アンジオポエチン-1を500ng/mLの濃度となるようにDMSOに溶解させた被験試料を調製し、陽性コントロールとして用いた。
＜試験方法＞
　コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、96ウェルプレートへ2.0x104細胞／0.1mL／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EG2）を用いて一晩培養した。次に、一晩培養後のHUVECを、細胞刺激（被験試料添加）の3時間前に0.1mLの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EB2）に置換し、再度培養を行った。その後ウェル内に、Humedia-EB2で溶解し被験試料を0.1mL添加し、20分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（R&D Systems社製、Human Phospho-Tie2（Y992）Immunoassay）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型（活性型）Tie2量を測定した。
　また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたDMSOについても、同様にリン酸化型Tie2を測定した。
　そして、下記式に従いTie2活性化率を計算し、リン酸化作用を評価した。
　Tie2活性化率（%）＝
　　　［（被験試料添加時のリン酸化型Tie2の測定値）／（陰性コントロールでのリン酸化型Tie2の測定値）］×100
＜結果＞
　結果を表１に示す。表１に示されるように、オリーブ果実エキスにTie2活性化作用が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　実施例２：オリーブ果実エキスのTie2活性化作用
　被験試料として、実施例１において調製したオリーブ果実エキスをDMSO中に3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mLの濃度で含有する試料を用い、Tie2活性化作用をウエスタンブロッティング法を用いて検討した。
　＜試験方法＞
　マウスpro-B細胞（Ba/F3）においてhuman Tie2を過剰発現させた細胞（Ba/F3-human Tie2）をTie2リン酸化解析に用いた。被験試料によるBa/F3-human Tie2の刺激は、FBSを含まないRPMI-1640培地および被験試料を添加して10分後に細胞をPBSで洗浄した後、PhosphoSafe（商標） Extraction Reagent（Novagen社）にて細胞抽出液を回収することで実施した。これを7.5% SDSゲルにて電気泳動し、PVDF膜に転写した。ブロッキングone-P（ナカライテスク）で60 分間非特異的タンパクをブロックした後、抗リン酸化Tie2抗体（Cell Signaling Technology社）およびHRP標識2次抗体を用いてリン酸化型Tie2のバンドを検出した。また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたDMSOについても、同様にリン酸化型Tie2を評価し、また、陽性コントロールとして、アンジオポエチン-1をDMSO中に0.4 μg/mLの濃度で含有する試料についても、同様にリン酸化型Tie2を評価した。バンドの検出および解析は、画像撮影装置ChemiDoc XRS Plus（Bio-Rad Laboratories）およびImage Lab Software version 2.0（Bio-Rad Laboratories）にて行い、下記式に従いTie2活性化作用を評価した。
　Tie2活性化率（%）＝
　　　［（被験試料添加時のリン酸化型Tie2のバンド強度）／（陰性コントロールでのリン酸化型Tie2のバンド強度）］×100
　＜結果＞
　ウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。陰性コントロールのバンド強度を100%とし、相対値をグラフで示した。図１の結果から、オリーブ果実エキスにTie2活性化作用が確認された。
　実施例３：オリーブ果実エキスの血管透過性抑制作用
　被験試料として、実施例１において調製したオリーブ果実エキスをDMSO中に25μg/mL、100μg/mLの濃度で含有する試料を用い、VEGF（vascular endothelial growth factor）によって引き起こされる血管透過性の亢進に対する抑制作用を評価した。
　＜試験方法＞
　6週齢のICRマウスを清水実験材料（株）より購入し、1週間以上の予備飼育を行った。試験3日前にマウス背部の剃毛を行い、目視にて背部に傷の無いマウスを実験に使用した。また、マウスには1匹あたり8つの投与区画を設定（背部正中線を挟んで左右4か所ずつ）し、n=4で評価した。
　ペントバルビタール麻酔下のマウスに生理食塩水にて調製した1%エバンスブルー色素100μLを静脈注射し、15分後に血管透過性因子である血管内皮成長因子（VEGF 300ng/mL final）および各被験試料を等量混合し、その20μLを背部皮内に30G注射針を用いて投与した。40分後、背部皮膚を剥がし、皮内に漏れ出した色素を観察、写真撮影した後、皮膚組織を切り出しホルムアミドを用いて色素を抽出し、吸光度計でOD620を測定した。なお、各マウスには被験試料もVEGFも投与しない区画（PBS(-)のみのコントロール）およびVEGFのみ投与の区画も同時に設け、被験試料による血管透過性抑制作用を評価した。測定結果はTukeyの多重比較検定により有意差検定を実施した。
　＜結果＞
　各被験試料におけるマイルスアッセイの結果を図２に示す。グラフ横軸は被験試料および濃度、縦軸は血管から漏出したエバンスブルーの色素量を表している。また、その時の背部皮膚における色素の漏れの様子を写真に示した。さらに、漏出したエバンスブルーの量から、被験試料による血管透過性抑制率を求め、表２に示す。表２に示されるように、オリーブ果実エキスに濃度依存的な血管からの透過性抑制作用が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　実施例４：オリーブ果実エキス由来のヒドロキシチロソール、チロソールおよびオレウロペインのTie2活性化作用の評価
　オリーブ果実エキスに含まれるヒドロキシチロソール、チロソールおよびオレウロペインを分離精製し、それらの成分のTie2活性化作用を評価した。
　＜ヒドロキシチロソール、チロソールおよびオレウロペインの分離精製＞
　実施例１で調製されたオリーブ果実エキスを吸着カラムクロマト（Dia ion HP-20、三菱化学社製）に供した後に、Tie2活性が集約した画分について、分取HPLC（ODS）による分離精製をおこないヒドロキチシロソール、チロソールおよびオレウロペインを単離した。単離した３つの化合物は、HPLCにおける標品との保持時間の一致をもって同定した。
　＜試験方法＞
　コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、96ウェルプレートへ2.0x104細胞／0.1mL／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EG2）を用いて一晩培養した。
　次に、一晩培養後のHUVECを、細胞刺激（被験試料添加）の3時間前に0.1mLの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EB2）に置換し、再度培養を行った。その後ウェル内に、Humedia-EB2で溶解し被験試料を0.1mL添加し、20分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（R&D Systems社製、Human Phospho-Tie2（Y992）Immunoassay）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型（活性型）Tie2量を測定した。
　また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたDMSOについても、同様にリン酸化型Tie2を測定した。
　そして、下記式に従いTie2活性化率を計算し、リン酸化作用を評価した。
　Tie2活性化率（%）＝
　　　［（被験試料添加時のリン酸化型Tie2の測定値）／（陰性コントロールでのリン酸化型Tie2の測定値）］×100
　＜結果＞
　結果を表３に示す。表１に示されるように、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペインにTie2活性化作用が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　製造例１：カプセル剤
　下記表４に示す配合のオリーブ果実エキスおよび添加剤を秤量し、均一になるよう混合して混合物を調製し、得られた混合物を、表５に示す配合で調製したソフトカプセル剤皮の中に常法により充填し、ソフトカプセルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
   
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
   　 
産業上利用性
　本発明におけるTie2活性化剤等は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用等により、血管内皮細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化し、血管透過を抑制することで、血管やリンパ管の老化による症状を改善し、これを予防することができる。

Claims (22)

  1. 　オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、Tie2活性化剤。
  2. 　オリーブ果実エキスが、オリーブ果汁から得られることを特徴とする、請求項１に記載のTie2活性化剤。
  3. 　オリーブ果実エキスが、水性溶剤に可溶である、請求項１または２に記載のTie2活性化剤。
  4. 　オリーブ果実エキスが、ポリフェノール類、これらを構造中に含む化合物、およびこれら化合物のテルペン部に由来するセコイリドイド類からなる群から選択される１以上の成分を含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のTie2活性化剤。
  5. 　オリーブ果実エキスが、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のTie2活性化剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のTie2活性化剤を含有する、組成物。
  7. 　Tie2を活性化することにより発揮される機能の表示を付した、請求項６に記載の組成物。
  8. 　オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
  9. 　オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の成熟化剤。
  10. 　オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の正常化剤。
  11. 　オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の安定化剤。
  12. 　オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、リンパ管安定化剤。
  13. 　請求項８～１２のいずれか１項に記載の剤を含有する、組成物。
  14. 　血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、およびリンパ管安定化により発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、請求項１３に記載の組成物。
  15. 　ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
  16. 　ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の成熟化剤。
  17. 　ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の正常化剤。
  18. 　ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の安定化剤。
  19. 　ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、リンパ管安定化剤。
  20. 　ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、Tie2活性化剤。
  21. 　請求項１５～２０のいずれか１項に記載の剤を含有する、組成物。
  22. 　血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、リンパ管安定化により発揮される機能、およびTie2を活性化することにより発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、請求項２１に記載の組成物。
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