TWI679985B

TWI679985B - 含有橄欖果實萃取物的Ｔｉｅ２活化劑

Info

Publication number: TWI679985B
Application number: TW104134184A
Authority: TW
Inventors: 笠島直樹; Naoki Kasajima; 小南優; Masaru KOMINAMI
Original assignee: 日商三得利控股股份有限公司; Suntory Holdings Limited
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2019-12-21
Also published as: JP2020033374A; WO2016060249A1; JP6640730B2; JPWO2016060249A1; TW201628637A; CN106794213A

Abstract

本發明之課題係以提供藉由誘導血管內皮之細胞間的黏著，來穩定血管內皮細胞而發揮血管滲透抑制效果的Tie2活化劑等為目的。

解決手段為，透過使其含有橄欖果實萃取物作為有效成分，可提供Tie2活化劑等。

Description

含有橄欖果實萃取物的Tie2活化劑

本發明係有關於Tie2活化劑，更詳而言之係有關於含有橄欖果實萃取物作為有效成分的Tie2活化劑。又，本發明亦有關於含有橄欖果實萃取物作為有效成分的血管滲透性抑制劑、血管新生抑制劑、血管之成熟化劑、血管之正常化劑、血管之穩定化劑、及淋巴管穩定化劑。又，本發明亦有關於含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分的血管滲透性抑制劑、血管之成熟化劑、血管之正常化劑、血管之穩定化劑、淋巴管穩定化劑、及Tie2活化劑。再者，本發明又有關於含有前述藥劑的組成物。

血管不僅擔負通過血液將氧氣或營養素傳送至全身器官的作用，還擔負運送來自組織中之新陳代謝廢物予以排泄至體外的作用，是人體在維持生命活動時極為重要的組織。一般而言，由於血管的老化或機能的失效，會如動脈硬化所代表者，對人體的健康造成嚴重的影響，因此，也與皺紋或水腫等外在的症狀息息相關。近年來，針對此血管的老化，受體型酪胺酸激酶Tie2(Tyrosine kinase with Ig and ECF homology domain 2)的活化備受矚目。若藉由來自血管之壁細胞的血管生長素使Tie2受到活化，則可誘導血管內皮之細胞間的黏著，已知此有助於血管內皮細胞的穩定化。近年來，具此Tie2活化作用的成分或食品經大量開發，以補充食品或飲料等利用，以美容或改善水腫、手腳冰冷為目的而使用。

具體而言，此Tie2活化可於皂樹皮、黃杞、銀杏、牡蠣、薑黃、菊、棗、枸杞、洋甘菊、金雀花、山楂、楊桃、月桃、蓮、南非紅灌木茶、酸豆、花梨、芭樂、蓽拔、刺五加、芒果薑、人參、牛奶子、無翅豬毛菜、刺楸、珍珠菜、萱草、大野芋、省沽油、海州常山、七里藤、小赤車、枹櫟、麻櫟、鵝仔草、星蘋果、車前、薤白、楊梅、肉桂、皂角刺、黃精、玉竹、瓜呂仁、巴戟天等的萃取物中發現其作用(專利文獻1~7)。

另一方面，作為成分，熊果酸、科羅索酸、3-O-沒食子醯前花青素B-1、亞麻酸、13-羥基-9Z,11E,15E-十八碳三烯酸、前花青素B-2、表兒茶素-(4β-6)-表兒茶素(4β-8)-表兒茶素、前花青素C-1、黃耆皂苷VIII、大豆皂苷I、3’-O-甲基沒食子兒茶素、Pipernonaline、紫丁香樹脂酚、Eleutheroside E、Eleutheroside E1、芝麻素、Eudesmine、Sylvatesmin、松脂醇、Yangambin、Forsythinol、香豆素等經確認具有有效性(專利文獻8~10)。

〔先前技術文獻〕〔專利文獻〕

〔專利文獻1〕日本特開2012-236795號公報

〔專利文獻2〕日本特表2009-154237號公報

〔專利文獻3〕日本特開2011-201811號公報

〔專利文獻4〕日本特開2011-102275號公報

〔專利文獻5〕日本特開2011-102274號公報

〔專利文獻6〕日本特開2011-102273號公報

〔專利文獻7〕日本特開2009-263358號公報

〔專利文獻8〕日本特開2014-97977號公報

〔專利文獻9］日本特開2013-241356號公報

〔專利文獻10〕日本特開2011-102272號公報

本發明之課題係以提供一種可藉由誘導血管內皮之細胞間的黏著，來穩定血管內皮細胞而發揮血管滲透抑制效果之具有優良的Tie2活化作用等的新穎成分為目的。

為解決上述課題，本案發明人等致力進行研究的結果新發現出由橄欖，更佳為橄欖果實取得的成分具有Tie2活化作用等。又，亦發現水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷具有血管滲透性抑制作用、血管的成熟化作用、血管的正常化作用、血管的穩定化作用、淋巴管穩定化作用、及Tie2活化作用，終至完成本發明。

亦即，本發明之態樣係包含以下之發明，惟並非限定於此等。

(1)一種Tie2活化劑，其係含有橄欖果實萃取物作為有效成分。

(2)如(1)之Tie2活化劑，其中橄欖果實萃取物係由橄欖果汁取得。

(3)如(1)或(2)之Tie2活化劑，其中橄欖果實萃取物係可溶於水性溶劑。

(4)如(1)~(3)中任一項之Tie2活化劑，其中橄欖果實萃取物係含有選自由多酚類、結構中含此等之化合物、及來自此等化合物之萜烯部的裂環烯醚萜類所成之群中的1種以上之成分。

(5)如(1)~(4)中任一項之Tie2活化劑，其中橄欖果實萃取物係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分。

(6)一種組成物，其係含有如(1)~(5)中任一項之Tie2活化劑。

(7)如(6)之組成物，其係附加有藉由將Tie2活化而發揮之機能的標示。

(8)一種血管滲透性抑制劑，其係含有橄欖果實萃取物作為有效成分。

(9)一種血管之成熟化劑，其係含有橄欖果實萃取物作為有效成分。

(10)一種血管之正常化劑，其係含有橄欖果實萃取物作為有效成分。

(11)一種血管之穩定化劑，其係含有橄欖果實萃取物作為有效成分。

(12)一種淋巴管穩定化劑，其係含有橄欖果實萃取物作為有效成分。

(13)一種組成物，其係含有如(8)~(12)中任一項之藥劑。

(14)如(13)之組成物，其係附加有選自由藉由血管滲透性抑制而發揮之機能、藉由血管的成熟化而發揮之機能、藉由血管的正常化而發揮之機能、藉由血管的穩定化而發揮之機能、及藉由淋巴管穩定化而發揮之機能所成之群中的1種以上之機能的標示。

(15)一種血管滲透性抑制劑，其係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

(16)一種血管之成熟化劑，其係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

(17)一種血管之正常化劑，其係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

(18)一種血管之穩定化劑，其係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

(19)一種淋巴管穩定化劑，其係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

(20)一種Tie2活化劑，其係含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

(21)一種組成物，其係含有如(15)~(20)中任一項之藥劑。

(22)如(21)之組成物，其係附加有選自由藉由血管滲透性抑制而發揮之機能、藉由血管的成熟化而發揮之機能、藉由血管的正常化而發揮之機能、藉由血管的穩定化而發揮之機能、藉由淋巴管穩定化而發揮之機能、及藉由將Tie2活化而發揮之機能所成之群中的1種以上之機能的標示。

本發明之Tie2活化劑，藉由橄欖果實萃取物優良的Tie2活化作用，誘導血管內皮細胞間的黏著而穩定血管內皮細胞，抑制血管滲透，由此可改善血管或淋巴管的老化所引起的症狀，並加以預防。例如，透過由Tie2活化所產生之血管內皮細胞的黏著誘導，使血管的細胞緊密地黏結，而讓營養遍及於肌膚中，可獲得肌膚之張力‧肌理的改善、皺紋防止等的美容效果。又，藉由填滿血管‧淋巴管之內皮細胞的間隙，可改善血液循環，而回收來自組織中的水分‧新陳代謝廢物，可獲得改善、預防手腳冰冷‧肩膀僵硬‧水腫‧黑眼圈等的各症狀之效果。

又，本發明之含有橄欖果實萃取物作為有效成分的藥劑，可發揮血管滲透性抑制作用、血管的成熟化作用、血管的正常化作用、血管的穩定化作用、及淋巴管穩定化作用。再者，本發明之含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分的藥劑，亦可發揮血管滲透性抑制作用、血管的成熟化作用、血管的正常化作用、血管的穩定化作用、淋巴管穩定化作用、及Tie2活化作用。

圖1係標示各試料之活化型Tie2之西方印漬法的結果、及與對照組比較的Tie2活化率的圖表。

圖2係標示各試料之邁爾斯分析法的結果、及血管滲透性抑制率的圖表。

以下，就本發明之實施形態詳細加以說明。

Tie2活化劑

毛細血管之結構上的穩定化對存在於血管內皮細胞之稱作Tie2的受體的活化發揮重要的作用。此Tie2顯示出除血管內皮細胞外，亦存在於淋巴管內皮細胞，經壁細胞所釋出的血管生長素活化，可增強內皮細胞彼此的黏著或與壁細胞的黏著，與血管結構的穩定化有關。本發明中所稱「Tie2活化劑」，係指具有可藉由將Tie2磷酸化而轉換成其活化體(磷酸化Tie2)之能力的藥劑，本發明之Tie2活化劑係為可將Tie2活化的橄欖果實萃取物，作為有效成分，除水合酪胺醇或酪醇等的多酚類外，尚可舉出結構中含此等的橄欖苦苷、Oreasein、洋丁香酚苷、3,4-DHPEA-EA、3,4-DHPEA-EDA、水合酪胺醇配醣體、結構內具有對香豆醯基酸的4-E-p-coumaroylsecologanoside。再者，此等多酚衍生物大多數在其分子內具有萜烯所衍生的化合物，其萜烯部為裂環烯醚萜類。作為其他的成分可舉出水合酪胺酸或屬萜烯配醣體的rengioside類或oleoside類等。本發明之Tie2活化劑中的有效成分不特別限定，較佳為選自由水合酪胺醇、酪醇、橄欖苦苷、Oreasein、洋丁香酚苷、3,4-DHPEA-EA、及3,4-DHPEA-EDA所成之群中的1種以上之成分，尤以選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分為更佳。

另外有人提出此Tie2的活性，例如會隨著年齡增長而降低之見解；可知血管或淋巴管也會隨此而逐漸老化。從而，本發明之Tie2活化劑可藉由橄欖果實萃取物優良的Tie2活化作用而預防、改善血管或淋巴管的老化。

此外，若是因血管的老化而使血管構造變得不穩定的話，則血漿成分等的營養成分會由血管漏出，使得所需要的成分無法被運送至所需要的部位。其結果，被認為會發生肌膚狀態的劣化等各種的問題。因此，本發明之Tie2活化劑可藉由橄欖果實萃取物優良的Tie2活化作用，穩定血管內皮細胞，而發揮血管滲透抑制作用。而且，藉由血管的細胞緊密地黏結，而讓營養遍及於肌膚中，可獲得肌膚之張力‧肌理的改善、皺紋防止等的美容效果。再者，藉由填滿血管‧淋巴管之內皮細胞的間隙，可改善血液循環，而回收來自組織中的水分‧新陳代謝廢物，可獲得改善、預防手腳冰冷‧肩膀僵硬‧水腫‧黑眼圈等的各症狀之效果。

<有效成分(橄欖果實萃取物)>

本發明中「橄欖果實萃取物」指的是由橄欖果實萃取出來而取得的萃取物，係指具有Tie2活性作用、血管滲透性抑制作用、血管的成熟化作用、血管的正常化作用、血管的穩定化作用、淋巴管穩定化作用的成分。更佳為由橄欖果汁所取得的成分群。於此，本發明中所稱「橄欖果汁」，係指從將由橄欖果實取得的液相分離成油層與水層而得到的水層中所得之萃取物。橄欖果實萃取物為例如水溶性成分，亦可由橄欖中使用水性溶劑予以萃取出來。作為水性溶劑，可舉出水、醇類(例如乙醇)。橄欖果實萃取物可直接使用橄欖果汁或水性溶劑萃取物，亦可使用將這些物質過濾後，以吸附管柱濃縮多酚並進行噴霧乾燥而得到的萃取物。

Tie2活化劑所含之橄欖果實萃取物的含量，相對於Tie2活化劑總量，係為0.01重量%~50重量%，較佳為0.1重量%~40重量%，更佳為1重量%~30重量%。本發明之Tie2活化劑的用量可根據Tie2活化劑所含之橄欖果實萃取物的含量來適當決定，又可基於使用對象的年齡、體重、健康狀況等來適當決定，例如，人類成人的1日攝取量為0.1mg~400mg，較佳為1mg~200mg，更佳為10mg~100mg，能以單次或者分成多次攝取‧投予。

作為本發明之橄欖果實萃取物的成分，除多酚類外，尚含有選自結構中含此等的化合物、或此等化合物之萜烯部所衍生的裂環烯醚萜類中的1種以上之成分。作為多酚類，除水合酪胺醇或酪醇等的多酚類外，尚可舉出結構中含此等的橄欖苦苷、Oreasein、洋丁香酚苷、3,4-DHPEA-EA、3,4-DHPEA-EDA、水合酪胺醇配醣體、結構內具有對香豆醯基酸的4-E-p-coumaroylsecologanoside。再者，此等多酚衍生物大多數在其分子內具有萜烯所衍生的化合物，其萜烯部為裂環烯醚萜類。作為其他的成分可舉出水合酪胺酸或屬萜烯配醣體的rengioside類或oleoside類等。本發明中的有效成分不特別限定，較佳為選自由水合酪胺醇、酪醇、橄欖苦苷、Oreasein、洋丁香酚苷、3,4-DHPEA-EA、及3,4-DHPEA-EDA所成之群中的1種以上之成分，尤以選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分為更佳。

<橄欖果實萃取物的原料>

作為橄欖果實萃取物之原料的橄欖為木樨科植物，自橄欖的果實採取出來的橄欖油係廣泛使用於作為食用油等。另一方面，橄欖的果實萃取物係將橄欖進行搾油時所產生的產業廢棄物之一，近年來已有人開發或販售將其加工而成的健康食品或補充食品用之素材。作為橄欖果實萃取物的主原料，可使用橄欖的果實，惟其中亦可混有葉、種子、葉、莖等。使用橄欖果實作為原料時，能以生的狀態使用，亦可藉由冷凍乾燥等加以乾燥後使用。又，自橄欖果實搾油後的殘渣亦可直接，或者以乾燥的狀態使用。較佳僅以將由橄欖果實取得的液相分離成油層與水層而得到的水層，即橄欖果汁作為原料。

橄欖的品種不特別限定，可適用例如Manzanillo、Lucca、Nevadillo blanco、Mission、Picual、Arbechina、Hojiblanca、Cornicabra、Gordal、Moraiolo、Frantoio、Coratina、Leccino等品種。

<橄欖果實萃取物的調製方法>

橄欖果實萃取物可經由分離步驟及精製步驟而得。

(分離步驟)

壓搾作為原料的橄欖果實，藉由離心分離分離成油分與果汁，得到橄欖果汁。壓搾、離心分離可採用本領域具有通常知識者所熟知的方法來進行。

(精製步驟)

亦可將藉由過濾濃縮分離步驟中所得之橄欖果汁而得到的萃取物，作為本發明之橄欖果實萃取物使用。又，透過將橄欖果汁之藉由過濾而得到的濾液加載於填充有吸附樹脂的管柱，去除糖類或礦物質、有機酸等不會吸附於吸附樹脂的成分後，使用水性溶劑(例如水、乙醇、或此等的混合物)予以溶出，可取得富含具有來自橄欖之Tie2活化作用等的成分的溶出份。亦可將此富含具有Tie2活化作用等的成分的溶出份作為本發明之橄欖果實萃取物使用。吸附樹脂的種類或管柱的溶出溶媒，本領域具有通常知識者可依據所使用之橄欖的品種、形態等適當設定其條件。

其他的藥劑

作為本發明另一態樣，可舉出血管滲透性抑制劑、血管新生抑制劑、血管之成熟化劑、血管之正常化劑、血管之穩定化劑、淋巴管穩定化劑等。此等藥劑係含有亦屬上述Tie2活化劑之有效成分的橄欖果實萃取物作為有效成分。又，此等藥劑亦可含有選自由水合酪胺醇、酪醇、橄欖苦苷、Oreasein、洋丁香酚苷、3,4-DHPEA-EA、及3,4-DHPEA-EDA所成之群中的1種以上之成分作為有效成分，更佳含有選自由水合酪胺醇、酪醇、及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分作為有效成分。

本發明中，「血管滲透性抑制劑」係指具備對由VEGF(血管內皮細胞生長因子)所引起之血管滲透性的亢進之抑制作用的藥劑。「血管新生抑制劑」係指具備抑制由既有之血管所形成之新的血管網絡之作用的藥劑。「血管之成熟化劑」係指具備可誘導血管內皮細胞與血管壁細胞的黏著，形成防止血管內環境因子容易地朝血管外漏出之血管內皮細胞間的黏著不均之成熟化作用的藥劑。「血管之正常化劑」係指具備藉由提高血管內皮細胞彼此的黏著，促進血管壁細胞對血管內皮細胞的補強，而使如血管滲透性失效之血管或發生血管雜亂增長的異常之血管成為正常的狀態之正常化作用的藥劑。「血管之穩定化劑」係指具備抑制對既有之血管的傷害、血管內皮細胞彼此的疏離、及血管內皮細胞與血管壁細胞的疏離之作用、及抑制血管內皮細胞之細胞死亡之穩定化作用的藥劑。「淋巴管穩定化劑」係指具備穩定淋巴管，使淋巴管內皮細胞適當地配置而進行補強，從而保持組織間液之迅速的回收機能之作用的藥劑。

血管滲透性抑制劑、血管新生抑制劑、血管之成熟化劑、血管之正常化劑、血管之穩定化劑、淋巴管穩定化劑所使用之成分的種類、用量、製造方法等可直接應用與Tie2活化劑有關所記載的內容。

組成物

作為本發明一態樣，可舉出含有選自由上述Tie2活化劑、血管滲透性抑制劑、血管新生抑制劑、血管之成熟化劑、血管之正常化劑、血管之穩定化劑、淋巴管穩定化劑所成之群中的1種以上之藥劑的組成物。

組成物中除Tie2活化劑等以外，亦可摻混化妝品、醫藥品等所使用的周知之添加物。添加物不特別限定，可使用例如賦形劑、結合劑、崩解佐劑、潤滑劑、抗氧化劑、防腐劑、矯味藥、矯臭劑、著色劑、香料等的添加物。可使用例如L-抗壞血酸、兒茶素、糊精、環糊精、碳酸鈣、海藻糖等。又，組成物亦可併用具有Tie2活化作用等地周知之成分，也可併用周知對血管的老化防止或美容屬有效的成分。可使用例如經報導有Tie2活化作用的皂樹皮、黃杞、銀杏、牡蠣、薑黃、菊、棗、枸杞、洋甘菊、金雀花、山楂、楊桃、月桃、蓮、南非紅灌木茶、酸豆、花梨、芭樂、蓽拔、刺五加、芒果薑、人參、牛奶子、無翅豬毛菜、刺楸、珍珠菜、萱草、大野芋、省沽油、海州常山、七里藤、小赤車、枹櫟、麻櫟、鵝仔草、星蘋果、車前、薤白、楊梅、肉桂、皂角刺、黃精、玉竹、瓜呂仁、巴戟天的萃取物或含有對血管內皮改善屬有效的前花青素的葡萄種子或松樹皮、花生種皮、荔枝種皮等的萃取物或L-瓜胺酸、L-精胺酸等的胺基酸。

組成物的形態可視使用目的適當決定，能以化妝品組成物及醫藥組成物等形態使用。醫藥組成物，除醫藥品及準醫藥品外，在藥事法上雖不屬於此等，但仍包含與醫藥品或準醫藥品同樣地期望有本發明之Tie2活化劑等所產生之預防‧改善效果而購入的組成物、或者明示或暗示性地訴求本發明之Tie2活化劑等所產生之預防‧改善效果的組成物。組成物的劑型亦不特別限定，典型上為顆粒劑、錠劑、膠囊劑、液劑等的口服用製劑，較佳為膠囊劑。

本發明另一方面係有關於一種附加有藉由血管滲透性抑制、血管的成熟化、血管的正常化、血管的穩定化、淋巴管穩定化、或Tie2活化而發揮之機能的標示的含有前述本發明之藥劑的組成物。此種標示或機能標示不特別限定，可舉出例如「抑制血管滲透性亢進」、「抑制血管內因子朝血管外漏出」、「將血管改善成正常的狀態」、「將血管維持於正常的狀態」、「抑制血管內皮細胞彼此的疏離」、「抑制血管內皮細胞的細胞死亡」、或「保持組織間液之迅速的回收機能」等。本發明中，該標示及機能標示等的標示可附加於組成物本身，亦可附加於組成物的容器或包裝。

屬本發明一態樣的組成物係含有相對於組成物總量，為0.01重量%~99重量%，較佳為0.1重量%~50重量%，更佳為1重量%~30重量%，再更佳為10重量%~30重量%的Tie2活化劑，並含有相對於組成物總量，為0.05重量%~50重量%，較佳為0.5重量%~25重量%，更佳為5重量%~20重量%的橄欖果實萃取物。屬本發明一態樣的組成物的用量係隨Tie2活化劑所含之橄欖果實萃取物的含量而異，又可基於使用對象的年齡、體重、健康狀況等來適當決定，例如，人類成人的1日攝取量為0.1mg~400mg，較佳為1mg~300mg，更佳為10mg~200mg，能以單次或者分成多次攝取‧投予。

又，作為本發明一態樣，可舉出含有上述血管滲透性抑制劑、血管新生抑制劑、血管之成熟化劑、血管之正常化劑、血管之穩定化劑、或淋巴管穩定化劑的組成物。此等組成物之成分的種類、形態、劑型、用量等可直接應用與含有Tie2活化劑的組成物有關所記載的內容。

〔實施例〕

以下，基於實施例對本發明更具體地加以說明。此外，本發明不受此等實施例所限定。

實施例1：橄欖果實萃取物之Tie2活化作用的評定

使用橄欖果實萃取物來評定Tie2活化作用。

<試料(橄欖果實萃取物)的調製>

壓搾橄欖果實，進行離心分離，分離成油分與果汁。於此，係使用將所得果汁過濾後，以吸附系統的管柱去除糖類或礦物質、有機酸等不會吸附於吸附樹脂的成分之後，濃縮對Tie2活化具有作用的橄欖成分，再對其進行噴霧乾燥而得者作為橄欖果實萃取物。將所得橄欖果實萃取物溶解於二甲亞碸(DMSO)，使濃度成為50μg/mL、100μg/mL，調製成受驗試料。又，調製將血管生長素-1溶解於DMSO，使濃度成為500ng/mL的受驗試料，作為陽性對照組使用。

<試驗方法>

將培養至單層細胞的正常人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)朝96井盤播種，使其達2.0x10⁴細胞/0.1mL/井，並使用低血清血管內皮細胞生長用培養基(倉敷紡織股份有限公司製，Humedia-EG2)培養一夜。其次，將培養一夜後的HUVEC，在細胞刺激(添加受驗試料)的3小時前取代為0.1mL之血管內皮細胞基礎培養基(倉敷紡織股份有限公司製，Humedia-EB2)，再度進行培養。其後對井內添加0.1mL以Humedia-EB2溶解的受驗試料，進行20分鐘的培養。培養後，使用免疫測定組(R&D Systems公司製、Human Phospho-Tie2(Y992)Immunoassay)，按照實驗程序，測定細胞內的磷酸化型(活性型)Tie2量。

又，對作為陰性對照組使用於受驗試料之溶解的DMSO，亦同樣地測定磷酸化型Tie2。

其後，依下述式計算Tie2活化率，評定磷酸化作用。

Tie2活化率(%)=〔(受驗試料添加時之磷酸化型Tie2的測定值)/(陰性對照組中之磷酸化型Tie2的測定值)〕×100

<結果>

將結果示於表1。如表1所示，確認橄欖果實萃取物有Tie2活化作用。

實施例2：橄欖果實萃取物的Tie2活化作用

作為受驗試料，係使用在DMSO中以3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL的濃度含有實施例1中所調製之橄欖果實萃取物的試料，採用西方印漬法探討Tie2活化作用。

<試驗方法>

將小鼠pro-B細胞(Ba/F3)中過量顯現human Tie2的細胞(Ba/F3-human Tie2)使用於Tie2磷酸化解析。受驗試料所產生之Ba/F3-human Tie2的刺激係藉由在添加不含FBS的RPMI-1640培養基及受驗試料10分鐘後以PBS 洗淨細胞後，以PhosphoSafe(商標)，Extraction Reagent(Novagen公司)回收細胞萃取液來實施。對其以7.5% SDS凝膠進行電泳，予以轉印於PVDF膜。用Blocking one-P(Nacalai Tesque)以60分鐘將非特異性蛋白質封端後，使用抗磷酸化Tie2抗體(Cell Signaling Technology公司)及HRP標識2次抗體檢測出磷酸化型Tie2的譜帶。又，對作為陰性對照組使用於受驗試料之溶解的DMSO，亦同樣地評定磷酸化型Tie2，另外作為陽性對照組，對在DMSO中以0.4μg/mL的濃度含有血管生長素-1的試料亦同樣地評定磷酸化型Tie2。譜帶的檢測及解析係以影像拍攝裝置ChemiDoc XRS Plus(Bio-Rad Laboratories)及Image Lab Software version 2.0(Bio-Rad Laboratories)進行，依循下述式來評定Tie2活化作用。

Tie2活化率(%)=〔(受驗試料添加時之磷酸化型Tie2的譜帶強度)/(陰性對照組中之磷酸化型Tie2的譜帶強度)〕×100

<結果>

將西方印漬法的結果示於圖1。設陰性對照組的譜帶強度為100%，以圖表表示相對值。由圖1的結果可確認橄欖果實萃取物有Tie2活化作用。

實施例3：橄欖果實萃取物的血管滲透性抑制作用

作為受驗試料，係使用在DMSO中以25μg/mL、100μg/mL的濃度含有實施例1中所調製之橄欖果實萃取物的試料，評定對由VEGF(vascular endothelial growth factor)所引起之血管滲透性的亢進的抑制作用。

<試驗方法>

自清水實驗材料(股)購入6週大的ICR小鼠，進行1週以上的先期飼養。於試驗3日前進行小鼠背部的剃毛，將目視下背部無傷口的小鼠使用於實驗。又，對小鼠按每1隻設定8個投予區域(隔著背部正中線左右各4處)，以n=4進行評定。

對戊巴比妥麻醉下的小鼠注射以生理食鹽水調製的1%伊凡氏藍色素100μL至靜脈，15分鐘後等量混合屬血管滲透性因子的血管內皮成長因子(VEGF 300ng/mL final)及各受驗試料，取其20μL使用30G注射針投予至背部皮內。40分鐘後，剝下背部皮膚，觀察朝皮內漏出之色素並拍攝照片後，切出皮膚組織並使用甲醯胺萃取出色素，以吸光度計測定OD₆₂₀。此外，對各小鼠亦同時設置受驗試料與VEGF均未投予的區域(僅有PBS(-)的對照組)及僅投予VEGF的區域，評定受驗試料所產生的血管滲透性抑制作用。測定結果係依據Tukey的多重比較檢定實施顯著差異檢定。

<結果>

將各受驗試料之邁爾斯分析法的結果示於圖2。圖表橫軸係表示受驗試料及濃度，縱軸表示由血管漏出之伊凡氏藍的色素量。又，照片中示出當時的背部皮膚之色素漏洩的情形。再者，由漏出之伊凡氏藍的量，求取受驗試料的血管滲透性抑制率，示於表2。如表2所示，可確認橄欖果實萃取物有濃度依存性之來自血管的滲透性抑制作用。

實施例4：來自橄欖果實萃取物之水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷的Tie2活化作用的評定

分離精製橄欖果實萃取物所含的水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷，評定這些成分的Tie2活化作用。

<水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷的分離精製>

將實施例1中調製的橄欖果實萃取物供予至吸附管柱層析儀(Dia ion HP-20，三菱化學公司製)後，對積集 Tie2活性的溶出份，進行採用分取HPLC(ODS)的分離精製，離析出水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷。離析出來的3種化合物係以與HPLC之標準品的滯留時間一致的方式進行鑑定。

<試驗方法>

將培養至單層細胞的正常人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)朝96井盤播種，使其達2.0x10⁴細胞/0.1mL/井，並使用低血清血管內皮細胞生長用培養基(倉敷紡織股份有限公司製，Humedia-EG2)培養一夜。

其次，將培養一夜後的HUVEC，在細胞刺激(添加受驗試料)的3小時前取代為0.1mL之血管內皮細胞基礎培養基(倉敷紡織股份有限公司製，Humedia-EB2)，再度進行培養。其後對井內添加0.1mL以Humedia-EB2溶解的受驗試料，進行20分鐘的培養。培養後，使用免疫測定組(R&D Systems公司製、Human Phospho-Tie2(Y992)Immunoassay)，按照實驗程序，測定細胞內的磷酸化型(活性型)Tie2量。

其後，依下述式計算Tie2活化率，評定磷酸化作用。

<結果>

將結果示於表3。如表1所示，確認水合酪胺醇、酪醇、橄欖苦苷有Tie2活化作用。

製造例1：膠囊劑

稱量下述表4所示摻混量的橄欖果實萃取物及添加劑，混合至呈均勻而調製成混合物，將所得混合物，依常用方法填充於以表5所示摻混量調製而成的軟膠囊劑皮中，得到軟膠囊。

〔產業上利用性〕

本發明之Tie2活化劑等，藉由橄欖果實萃取物優良的Tie2活化作用等，誘導血管內皮細胞間的黏著而穩定血管內皮細胞，抑制血管滲透，由此可改善血管或淋巴管的老化所引起的症狀，並加以預防。

Claims

一種使用於製造Tie2活化劑之橄欖果實萃取物的用途，其特徵為橄欖果實萃取物的原料為橄欖果汁，且含有作為有效成分的選自由水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分。
如請求項1之用途，其中橄欖果實萃取物係可溶於水性溶劑。
如請求項1或2之用途，其中橄欖果實萃取物係含有選自由多酚類、結構中含此等之化合物及來自此等化合物之萜烯部的裂環烯醚萜類所成之群中的1種以上之成分。
一種使用於製造血管滲透性抑制劑之橄欖果實萃取物的用途，其特徵為橄欖果實萃取物的原料為橄欖果汁，且含有作為有效成分的選自由水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分。
一種使用於製造血管滲透性抑制劑之含有選自由水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分的用途。
一種使用於製造Tie2活化劑之選自由水合酪胺醇、酪醇及橄欖苦苷所成之群中的1種以上之成分的用途。