CN111019896B - 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111019896B CN111019896B CN201911374781.XA CN201911374781A CN111019896B CN 111019896 B CN111019896 B CN 111019896B CN 201911374781 A CN201911374781 A CN 201911374781A CN 111019896 B CN111019896 B CN 111019896B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- inhibitor
- nucleus pulposus
- growth factor
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 49
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 44
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 44
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 41
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000012826 P38 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical group C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims abstract description 23
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims abstract description 22
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 20
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 229940125400 channel inhibitor Drugs 0.000 claims description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102100031478 C-type natriuretic peptide Human genes 0.000 abstract 2
- 101000796277 Homo sapiens C-type natriuretic peptide Proteins 0.000 abstract 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、FGF2、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成。通过混合各组分，再调节混合物pH和渗透压后灭菌处理制得。本发明培养基未使用动物源成分，可保持NPPCs的未分化、多能状态，培养基中动物血清的去除极大避免动物成分对髓核祖细胞培养的干扰及污染，能在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应发生，简化培养过程，增加实验结果的可信度，基本解决了持久培养NPPCs这一关键难题。制备方法简单、原料易得，适合髓核祖细胞在无饲养层细胞条件下的培养与扩增。
Description
技术领域
本发明涉及培养基领域，具体地，涉及髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用。
背景技术
在胚胎发育中，髓核细胞起源于胚胎期的脊索。脊索被椎体包围的部分将完全退化消失，但在椎体间的部分却保留下来形成髓核，因此胚胎来源的髓核祖细胞(Nucleuspulposus progenitor cells,NPPCs)的纯度会明显高于成体来源的NPPCs。但是由于NPPCs可以稳定存在的时间非常短暂，很快就会继续向成体细胞分化下去，无法获得稳定传代的祖细胞系。因此在获取祖细胞的同时需要提供与胚胎期祖细胞所处的相同或相似的微环境，使其能够长期稳定地自我更新。Belmonte等人创新性地发明了能够使肾祖细胞稳定传代的3D培养体系，从小鼠和人胚胎中分别获得了长期稳定传代的鼠和人肾祖细胞系，并利用其开展了多向分化，体内移植，药物毒性筛选和疾病模型构建等广泛的应用。该研究为胚胎来源NPPCs的提取和培养提供了一种可靠有效的研究思路，申请人通过与Belmonte课题组合作，已开展了关于培养NPPCs的基础性工作。
NPPCs作为髓核细胞的前体细胞，由于其本身即存在于椎间盘组织内，因此它可以完美地适应椎间盘内恶劣的微环境。Sakai等人从鼠退变的椎间盘中分离提取了NPPCs并首次发现酪氨酸激酶受体(Tyrosine kinase receptor,Tie2)是NPPCs的标记基因，从退变的椎间盘髓核细胞中筛选得到了8.0±2.7％的NPPCs。后续研究表明从牛髓核中也筛选得到了Tie2+NPPCs，同时证明这类充分符合祖细胞标准的细胞，可以在成纤维细胞生长因子或低氧条件下稳定传代7天。Liu也分离获得了Tie2+NPPCs，并证实该细胞在体内向髓核样细胞分化并具备有效修复及再生退变椎间盘的能力。因此Tie2被认为是NPPCs的特异性标记基因，但是上述方法获得的NPPCs纯度非常低，仅能扩增3代，培养7天。再者，上述研究中的NPPCs培养条件未能充分模拟体内的椎间盘低氧低pH的微环境。因此，解决如何持久培养NPPCs这一关键难题成为需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种髓核祖细胞培养基，所述髓核祖细胞培养基由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成。
上述原料的含量可以在一定的范围内选择，在本发明的一种优选的实施方式中，为了使得细胞在培养过程中能够具有更为稳定的培养环境，所述DMEM培养基与所述F12培养基的含量的体积比为1：0.5-2；且以实际所需所述培养基的总体积为基准，所述维生素C的浓度为50-200μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为1-150ng/mL，所述FGF2的浓度为1-150ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-30uM，所述转铁蛋白的浓度为5-100μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为1-50uM，所述p38抑制剂的浓度为1-20uM，所述脯氨酸的浓度为0-10mM，所述丙酮酸钠的浓度为1-15mM。
本发明的另一个目的是提供所述一种髓核祖细胞培养基的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；
(2)将混合物M1调节pH和渗透压，得到混合物M2；
(3)将混合物M2进行灭菌处理，制得髓核祖细胞培养基。
上述中的信号通路抑制剂可以选自本领域技术人员能够理解和使用的类型，当然在我们的实施方式中，为了使其具有良好的调控效果，转化生长因子β信号通路抑制剂选自牌号为A83-01的转化生长因子β信号通路抑制剂，所述ROCK抑制剂选自牌号为Y27632的ROCK抑制剂，所述p38抑制剂为选自牌号为SB202190的p38抑制剂。
步骤2)中调节pH的操作可以采用本领域技术人员能够理解的方式进行操作，例如，可以采用加入酸碱调节剂进行调节，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤2)中为加入碱调节pH值。这里的碱可以选自本领域技术人员能够理解和使用的类型，例如，一种更为优选的实施方式中，所述碱选自氢氧化钠。
当然，调节后的pH值可以在一定的范围内选择，例如，一种优选的实施方式中，为了进一步保证培养环境的稳定性，混合物M2的pH值为7.3-7.5。
进一步优选的实施方式中，混合物M2的渗透压为330-360mOsm/kg。
步骤3)中灭菌处理能够采用本领域技术人员所能够理解的方式进行操作，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤3)中灭菌处理选自射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和滤膜过滤灭菌中的至少一种。
进一步优选的实施方式中，灭菌处理采用湿热灭菌。
更为优选的实施方式中，灭菌处理为通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。
本发明的再一个目的是提供所述一种髓核祖细胞培养基在培养人髓核祖细胞向多种细胞分化中的应用。本发明培养基通过各个组分协同作用以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，使得培养细胞具有优异的自我更新能力，可保持NPPCs的未分化、多能状态，培养的细胞代次多，增殖能力强，能培养到40代左右，完全适合髓核祖细胞在无饲养层细胞条件下的培养与扩增。
本发明提供的细胞培养基通过DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂的协同作用以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，使得培养细胞具有优异的自我更新能力。现有的髓核祖细胞培养过程中使用的培养基不具备特异性，从而仅能扩增3代并培养7天这一问题。而本发明提供的是一种不含有动物源成分，并且能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时制备方法步骤简单、原料易得，且培养的细胞代次多，能培养到40代左右，增殖能力强，状态好的髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用。
本发明培养基中未使用动物源成分，进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。另外，本发明细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得，不含血清，专门用于髓核祖细胞在无饲养层细胞条件下的培养与扩增。本发明培养基可保持NPPCs的未分化、多能状态。培养基中动物血清的去除可以大大避免动物成分对髓核祖细胞培养的干扰，简化培养过程，增加实验结果的可信度，基本解决了持久培养NPPCs这一关键难题。
附图说明
图1是原代的小鼠髓核祖细胞的光镜结果图。
图2是扩增第10代时的小鼠髓核祖细胞的光镜结果图。
图3是扩增第20代时的小鼠髓核祖细胞的光镜结果图。
图4是扩增第20代时的几种特定标志物在小鼠髓核祖细胞、小鼠胚胎干细胞、小鼠间充质干细胞中表达水平的流式结果图。图中“△”所标处为髓核祖细胞，“#”所标处为小鼠胚胎干细胞，“*”所标处为小鼠间充质干细胞。
图5是原代的人髓核祖细胞的光镜结果图。
图6是扩增第10代时的人髓核祖细胞的光镜结果图。
图7是扩增第20代时的人髓核祖细胞的光镜结果图。
图8是扩增第20代时的几种特定标志物在人髓核祖细胞、髓核细胞中表达水平的流式结果图，图中“△”所标处为髓核祖细胞，“*”所标处为人髓核细胞)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，DMEM培养基为ThermoFisher Scientific公司的市售品、F12培养基为Thermo Fisher Scientific公司的市售品、脯氨酸为为Sigma ALdrich公司的市售品、丙酮酸钠为Sigma ALdrich公司的市售品、维生素C为Sigma ALdrich公司的市售品、胰岛素生长因子为Thermo Fisher Scientific公司的市售品、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)为perprotech公司的市售品、转铁蛋白为Sigma ALdrich公司的市售品、ROCK抑制剂为MedChemExpress公司的市售品、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂为MedChemExpress公司的市售品。
实施例1
本发明提供了一种髓核祖细胞培养基，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成。其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1，维生素C的浓度为100μg/mL，胰岛素生长因子的浓度为100ng/mL，FGF2的浓度为100ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为2uM，所述转铁蛋白的浓度为50μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为10uM，所述p38抑制剂的浓度为2.5uM，所述脯氨酸的浓度为0.35mM，所述丙酮酸钠的浓度为1mM。具体通过以下方法制备：
1)在25℃下，将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至340mOsm/kg，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A1。
实施例2
一种髓核祖细胞培养基，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成。其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：2，维生素C的浓度为200μg/mL，胰岛素生长因子的浓度为150ng/mL，FGF2的浓度为10ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为30uM，所述转铁蛋白的浓度为100μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为50uM，所述p38抑制剂的浓度为20uM，所述脯氨酸的浓度为10mM，所述丙酮酸钠的浓度为15mM。具体通过以下方法制备：
1)在25℃下，将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至360mOsm/kg，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A2。
实施例3
一种髓核祖细胞培养基，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成。其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：0.5，维生素C的浓度为80μg/mL，胰岛素生长因子的浓度为80ng/mL，FGF2的浓度为50ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为20uM，所述转铁蛋白的浓度为80μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为30uM，所述p38抑制剂的浓度为1uM，所述脯氨酸的浓度为4mM，所述丙酮酸钠的浓度为4mM。具体通过以下方法制备：
1)在25℃下，将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至340mOsm/kg，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A3。
实施例4
一种髓核祖细胞培养基，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成。其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1.5，维生素C的浓度为150μg/mL，胰岛素生长因子的浓度为5ng/mL，FGF2的浓度为20ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为20uM，所述转铁蛋白的浓度为10μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为1uM，所述p38抑制剂的浓度为10uM，所述脯氨酸的浓度为0mM，所述丙酮酸钠的浓度为10mM。具体通过以下方法制备：
1)在25℃下，将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至340mOsm/kg，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A4。
实施例5
按照实施例1的方法进行，不同的是，步骤1)中未使用维生素C，制得细胞培养基D1。
实施例6
按照实施例1的方法进行，不同的是，步骤1)中未使用胰岛素生长因子，制得细胞培养基D2。
实施例7
按照实施例1的方法进行，不同的是，步骤1)中未使用FGF2，制得细胞培养基D3。
实施例8
按照实施例1的方法进行，不同的是，步骤1)中未使用转化生长因子β信号通路抑制剂，制得细胞培养基D4。
实施例9
按照实施例1的方法进行，不同的是，步骤1)中未使用ROCK抑制剂，制得细胞培养基D5。
实施例10
按照实施例1的方法进行，不同的是，不加入转铁蛋白，制得细胞培养基D6。
实施例11
按照实施例1的方法进行，不同的是，不加入p38抑制剂，制得细胞培养基D7。
实施例12
按照实施例1的方法进行，不同的是，不加入转化生长因子β信号通路抑制剂，制得细胞培养基D8。
实施例13
按照实施例1的方法进行，不同的是，不加入脯氨酸，制得细胞培养基D9。
实施例14
按照实施例1的方法进行，不同的是，不加入丙酮酸钠，制得细胞培养基D10。
实施例15(应用例1)
1)将培养皿用MatrigeL基质胶进行包被(当然，使用玻璃连粘蛋白Vitronection亦可)2h；然后在37℃的水浴中复苏冻存的小鼠髓核祖细胞，并将该细胞接种至上述A1培养基中，在37℃、5％CO2下进行培养，并且每天更换培养基，直至髓核祖细胞增殖到80％融合度(confLuency)时，接着以0.5mmol/L的EDTA(PH＝8.0，渗透压(OsmoLarity)＝340mOsm)进行消化传代以保持小鼠髓核祖细胞细胞团的状态。当需要单细胞传代时，应用Trypsin酶(当然TrypLE Express酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为Y-27632的Rock抑制剂(工作浓度为10μmol/L，提高细胞的存活率)培养24h。
2)去除培养基，以PBS缓冲溶液清洗3次，接着以0.5mmol/L的EDTA(PH＝8.0，渗透压(OsmoLarity)＝340mOsm)消化5min，吸去EDTA，加入A1培养基轻轻吹打3到5次，以保持小鼠髓核祖细胞细胞团的状态，以面积比1：8传至新的用MatrigeL基质胶或者Vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基A1在37℃、5％CO2下培养，每天更换培养基，当细胞融合度达到80％时，得到细胞B1。
实施例16(检测例1)
首先，用0.5mmol/L的EDTA(PH＝8.0，渗透压(OsmoLarity)＝340mOsm)消化上述细胞B1至细胞团状态，计数，取一部分往下传代(即扩增)。传代20次。结果见图1-图3。
其中：图1、2、3是小鼠髓核祖细胞用该培养基培养后的形态图。图1是扩增第0代，图2是扩增第10代，图3是扩增第20代。
图4为通过本发明所提供的细胞培养基培养20代后的各种特定标识物在小鼠髓核祖细胞(NPPCs)、小鼠胚胎干细胞和间充质干细胞的表达水平，证明了在本发明提供的细胞培养基这一培养体系下，小鼠髓核祖细胞维持着髓核祖细胞所特有的表面分子表达。
同时，如图4-A所示，CD44在小鼠髓核祖细胞中的表达水平高于胚胎干细胞和间充质干细胞。
如图4-B所示，CD29在三种细胞中的表达水平由高到低依次是小鼠间充质干细胞、胚胎干细胞、髓核祖细胞。
如图4-C所示，CD105在小鼠间充质干细胞及小鼠胚胎干细胞中的表达水平略高于小鼠髓核祖细胞。
如图4-D所示，CD24在小鼠髓核祖细胞中的表达水平略高于小鼠胚胎干细胞和间充质干细胞。
如图4-E所示，CD73在小鼠间充质干细胞中的表达水平显著高于胚胎干细胞和髓核祖细胞。
实施例17(检测例2)
根据应用例1以及检测例1的方法，显示培养基A2、A3和A4也能稳定的培养小鼠髓核祖细胞。
实施例18(检测例3)
按照应用例1和检测例1的方法进行操作，不同的是，将细胞培养基分别替换为D1-D10，结果显示，细胞培养基D1-D10无法成功培养小鼠髓核祖细胞。
实施例19(应用例2)
1)将培养皿用MatrigeL基质胶进行包被(当然，使用玻璃连粘蛋白Vitronection亦可)2h；然后在37℃的水浴中复苏冻存的人髓核祖细胞，并将该细胞接种至上述A1培养基中，在37℃、5％CO2下进行培养，并且每天更换培养基，直至髓核祖细胞增殖到80％融合度(confLuency)时，接着以0.5mmol/L的EDTA(PH＝8.0，渗透压(OsmoLarity)＝340mOsm)进行消化传代以保持人髓核祖细胞细胞团的状态。当需要单细胞传代时，应用Trypsin酶(当然TrypLE Express酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为Y-27632的Rock抑制剂(工作浓度为10μmol/L，提高细胞的存活率)培养24h。
2)去除培养基，以PBS缓冲溶液清洗3次，接着以0.5mmol/L的EDTA(PH＝8.0，渗透压(OsmoLarity)＝340mOsm)消化5min，吸去EDTA，加入A1培养基轻轻吹打3到5次，以保持小鼠髓核祖细胞细胞团的状态，以面积比1：8传至新的用MatrigeL基质胶或者Vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基A1在37℃、5％CO2下培养，每天更换培养基，当细胞融合度达到80％时，得到细胞B1。
实施例20(检测例4)
首先，用0.5mmol/L的EDTA(PH＝8.0，渗透压(OsmoLarity)＝340mOsm)消化上述细胞B1至细胞团状态，计数，取一部分往下传代(即扩增)。传代20次。结果见图5到图7。
其中：图5、6、7是小鼠髓核祖细胞用该培养基培养后的形态图。图5是扩增第0代，图6是扩增第10代，图7是扩增第20代。
图8为通过本发明所提供的细胞培养基培养20代后的各种特定标识物在人髓核祖细胞(NPPCs)、髓核细胞的表达水平，证明了在本发明提供的细胞培养基这一培养体系下，人髓核祖细胞维持着维持着髓核祖细胞所特有的表面分子表达。
同时，如图8-A所示，CD24在人髓核祖细胞中的表达水平高于髓核细胞。
如图8-B所示，CD133在人髓核祖细胞中的表达水平高于髓核细胞。
如图8-C所示，CD9在人髓核祖细胞和髓核细胞中的表达水平无明显差异。
如图8-D所示，CD73在人髓核祖细胞和髓核细胞中的表达水平无明显差异。
如图8-E所示，CD105在人髓核祖细胞中的表达水平高于髓核细胞。
实施例21(检测例5)
按照应用例2和检测例4的方法进行操作，不同的是，将细胞培养基分别替换为D1-D10，结果显示，细胞培养基D1-D10无法成功培养人髓核祖细胞。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (3)
1.一种髓核祖细胞培养基，其特征在于，由DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂组成，其中，所述DMEM培养基与F12培养基的含量体积比为1：0.5-2；
以所述培养基的总体积为基准，所述维生素C的浓度为50-200μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为1-150ng /mL，所述碱性成纤维细胞生长因子2的浓度为1-150ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-30uM，所述转铁蛋白的浓度为5-100μg/mL，所述ROCK抑制剂的浓度为1-50uM，所述p38抑制剂的浓度为1-20uM，所述脯氨酸的浓度为0.35-10mM，所述丙酮酸钠的浓度为1-15mM；
所述转化生长因子β信号通路抑制剂选自牌号为A83-01的转化生长因子β信号通路抑制剂，所述ROCK抑制剂选自牌号为Y27632的ROCK抑制剂，所述p38抑制剂选自牌号为SB202190的p38抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种髓核祖细胞培养基的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2、转铁蛋白、ROCK抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；
（2）将混合物M1调节pH和渗透压，得到混合物M2；其中加入碱调节pH值，所述碱选自氢氧化钠，混合物M2的pH值为7.3-7.5，混合物M2的渗透压为330-360mOsm/kg。
（3）将混合物M2进行灭菌处理，制得髓核祖细胞培养基，其中灭菌处理选自射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和滤膜过滤灭菌中的至少一种，灭菌处理为通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。
3.权利要求1所述的培养基在培养人髓核祖细胞向多种细胞分化中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911374781.XA CN111019896B (zh) | 2019-12-27 | 2019-12-27 | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
| PCT/CN2020/119101 WO2021129030A1 (zh) | 2019-12-27 | 2020-09-29 | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911374781.XA CN111019896B (zh) | 2019-12-27 | 2019-12-27 | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111019896A CN111019896A (zh) | 2020-04-17 |
| CN111019896B true CN111019896B (zh) | 2021-08-03 |
Family
ID=70194431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911374781.XA Active CN111019896B (zh) | 2019-12-27 | 2019-12-27 | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111019896B (zh) |
| WO (1) | WO2021129030A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111019896B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-08-03 | 浙江大学 | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130078222A1 (en) * | 2010-03-30 | 2013-03-28 | Tokai University Educational System | Intervertebral Disc Nucleus Pulposus Stem Cell/Progenitor Cell, The Cultivation Method And Intended Use Thereof |
| JPWO2017170849A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2019-05-16 | 協和発酵バイオ株式会社 | ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地および多能性幹細胞の培養方法 |
| US20180055887A1 (en) * | 2016-08-23 | 2018-03-01 | Academia Sinica | Method for preparing induced mesenchymal stem cells and improving mesenchymal stem cell's characters and its applications |
| CN109988744A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-07-09 | 宁波医诺生物技术有限公司 | 人多能干细胞培养基及其制备方法和应用 |
| CN111019896B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-08-03 | 浙江大学 | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-12-27 CN CN201911374781.XA patent/CN111019896B/zh active Active
-
2020
- 2020-09-29 WO PCT/CN2020/119101 patent/WO2021129030A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111019896A (zh) | 2020-04-17 |
| WO2021129030A1 (zh) | 2021-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ogura et al. | Human adipose tissue possesses a unique population of pluripotent stem cells with nontumorigenic and low telomerase activities: potential implications in regenerative medicine | |
| EP2366021B1 (en) | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers | |
| Tarle et al. | Development of a serum‐free system to expand dental‐derived stem cells: PDLSCs and SHEDs | |
| KR20130100221A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양 | |
| US9605244B2 (en) | Method of differentiating mammalian progenitor cells into insulin producing pancreatic islet cells | |
| JP5252411B2 (ja) | 細胞培養担体および細胞の培養方法 | |
| CN116194572A (zh) | 用于产生间充质干细胞的培养基和方法 | |
| CN111019896B (zh) | 一种髓核祖细胞培养基及其制备方法和应用 | |
| CN107372466B (zh) | 一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法 | |
| CN112391340A (zh) | 一种间充质干细胞培养基 | |
| Su et al. | Effect of chitosan conduit under a dynamic culture on the proliferation and neural differentiation of human exfoliated deciduous teeth stem cells | |
| Knöspel et al. | Periodic harvesting of embryonic stem cells from a hollow‐fiber membrane based four‐compartment bioreactor | |
| CN114451402A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞保存液及其制备方法和应用 | |
| CA3160433A1 (en) | Method for preparation of mesenchymal stem cell from human pluripotent stem cell and mesenchymal stem cells prepared thereby | |
| CN111057677B (zh) | 一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用 | |
| WO2020151418A1 (zh) | 一种扩增培养人肝祖细胞的培养基及其应用 | |
| CN110938584A (zh) | 一种人胚胎干细胞向内皮细胞诱导分化的方法 | |
| WO2019144606A1 (zh) | 一种筛选分化hPSCs向MSCs的方法 | |
| CN112342187A (zh) | 一种软骨细胞培养基及其制备方法 | |
| CN118028229B (zh) | 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 | |
| CN114891737B (zh) | 一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用 | |
| WO2021227573A1 (zh) | 无异源培养基及使用其扩增间充质干细胞的方法 | |
| WO2009024748A1 (en) | Stem cell derived neurotrophic factors | |
| KR101798217B1 (ko) | 만능줄기세포로부터 유래된 중간엽줄기세포를 선별하는 방법 | |
| CN116083349A (zh) | 人或恒河猴的多能干细胞诱导分化骨骼肌前体细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |