CN116194572A - 用于产生间充质干细胞的培养基和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生的培养基。公开一种将PSCs分化为MSCs的方法。进一步公开一种在不分化的情况下增生MSCs的方法。

Description

用于产生间充质干细胞的培养基和方法

相关申请

本申请主张于2020年06月23日提交的美国专利临时申请案申请号为63/042,634的优先权，其公开内容通过引用并入本文作为参考。

技术领域及背景技术

本发明在其一些实施例中是有关于一种用于培养多能干细胞的培养基，更具体地但不限于是有关于一种可用于将多能干细胞分化为间充质干细胞(MSCs)的新型培养基，以及可将MSCs维持在增殖、多能和未分化状态的新型培养培养基。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多潜能和自我复制能力的干细胞。MSCs可以分化为多种细胞，包括属于间质的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞，以及神经细胞和肝细胞。此外，已知MSCs通过自身产生的体液因子具有旁分泌作用和细胞粘附相互作用。基于这些作用，MSCs发挥修复和再生目标组织和细胞的能力以及控制免疫反应的能力，例如在抗炎方面，从而对各种疾病提供治疗效果。MSCs可以来源于各种成人或胎儿组织(例如骨髓、胚胎卵黄囊、胎盘、脐带组织、脐带血、羊水和脂肪组织)。或者，可以分别从多能干细胞(PSCs)、胚胎干细胞(ESCs)或诱导干细胞(iPS细胞)中产生无限且可复制的胎儿或成人MSCs。

人胚胎干细胞(hESCs)可作为产生高质量人MSCs的可靠来源。hESC是增殖的、未分化的干细胞，能够分化为所有三个胚胎生殖层的细胞。此外，人胚胎干细胞可以无限期地在体外繁殖和扩增，为人类治疗提供了可能取之不尽、用之不竭的细胞来源。

人类iPS细胞是通过将基因(例如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，或Oct4，Sox2、Nanog和Lin28)导入体细胞而获得的诱导多能干细胞[高桥K，细胞期刊(2007)131:861-872；和Yu J等人，科学期刊(2007)318:1917-1920]。iPS细胞具有与人胚胎干细胞相似的特性，可以在特定的诱导条件下在体外和体内分化为三个胚胎生殖层的代表性组织。iPS细胞衍生方法的改进包括使用质粒代替病毒载体或不与基因组整合的衍生，这可能简化iPS细胞在临床应用中的使用[Yu J等人，科学期刊(2009)324:797-801]。

有多种方法可以将人类ESC和iPS细胞分化为MSC。

美国专利公告号US 10351825提供了从iPS细胞产生MSCs的方法，其中iPS细胞在含有7至8vol.％的CO₂的大气中在TGF-β抑制剂(例如SB431542)的存在下培养20至35天。然后将细胞转移到具有亲水表面的培养皿中，并将细胞在含有TGF-β抑制剂的培养基中培养一时间段以足以产生MSC。

美国专利申请号US 20170290864提供了在ESCs或iPS细胞通过滋养层细胞的中间分化而发育的条件下将ESCs或iPS细胞分化为MSCs的方法。具体而言，多能干细胞在包含骨形态发生蛋白-4(BMP-4)和任选的TGF-β抑制剂(例如SB431542、A83-01或ALK5抑制剂)的培养基中培养，并且通过在含有LIF、bFGF、PDGF或其组合的MSC生长培养基中在明胶、玻璃纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶或胶原涂层皿中培养滋养层细胞，滋养层进一步分化为MSC衍生细胞。

PCT公开号WO/2011/091475提供了从多能干细胞产生MSCs的方法，所述方法包括(i)在内源性激活素和TGFβ信号传导抑制剂(例如SB431542)存在下分化附着在培养容器表面的ESC或iPS细胞，和(ii)在MSC培养基存在下传代所得细胞，从而产生MSCs。

其他背景技术包括美国专利公告号US 10214722和Schubert和Smitz：“人类原始卵泡的体外培养”，在“生育冷冻”中，Ri-Cheng Chian和Patrick Quinn编辑，剑桥大学出版社出版，联合大学出版社(2020)第200-212页。

发明内容

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，其包括基础培养基和有效量的敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或支持MSCs的扩增。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.4至2.3之间，其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度至少0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少为5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少为0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)以及浓度至少25微克/毫升的L-抗坏血酸，其中所述培养基不含血清，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM HG、浓度至少为5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少为0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、浓度至少25微克/毫升的L-抗坏血酸以及浓度至少为25微克/毫升的丙酮酸钠，其中所述培养基不含血清，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，其中所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.6至1.5之间；浓度至少为3％的基因敲除血清替代物(KoSR)；浓度至少为0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，以及浓度至少为5％的血清，并且其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种无分化扩增间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在本发明一些实施例的培养基中培养MSCs，从而在允许MSCs无分化扩增的培养条件下培养MSCs。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在适于PSCs分化为MSCs的培养条件下，在本发明一些实施例的培养基中的悬浮培养物中培养PSCs，从而生成MSCs。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在包含含有MEMα、血清和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的基础培养基的培养基中的悬浮培养物中培养PSCs,在适合PSCs分化为MSCs的培养条件下,从而产生MSCs。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在适合于PSCs分化为MSCs的培养条件下，在包括一基础培养基的一培养基中以一悬浮培养物培养PSCs，所述基础培养基包括MEMα、浓度至少5％的血清和浓度至少1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，从而产生所述MSCs。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种悬浮培养物中分离的间充质干细胞(MSCs)群，其根据本发明的一些实施例的方法产生的。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种包括MSCs的细胞培养物和本发明的某些实施例的培养基。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种包括PSCs的细胞培养物和本发明一些实施例的培养基。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种包括PSCs的细胞培养物和包括具有MEMα、血清和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的基础培养基的培养基。

根据本发明的一些实施例的一个目的，提供一种包括PSCs的细胞培养物和包含基础培养基的培养基，基础培养基包含MEMα、浓度至少为5％的血清和浓度至少为1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据本发明的一些实施例，基础培养基包括DMEM/F12。

根据本发明的一些实施例，基础培养基包括DMEM高葡萄糖(DMEM HG)。

根据本发明的一些实施例，所述DMEM/F12与所述MEMα的所述体积比为DMEM/F12比MEMα在0.6至1.5之间。

根据本发明的一些实施例，5所述培养基进一步包括敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，KoSR的浓度至少为2.5％。

根据本发明的一些实施例，KoSR的浓度最多为15％。

根据本发明的一些实施例，KoSR的浓度为2.5至15％。

根据本发明的一些实施例，KoSR的浓度为5至15％。

根据本发明的一些实施例，ITS的浓度至少为0.1％。

根据本发明的一些实施例，ITS的浓度最多为3％。

根据本发明的一些实施例，TS的浓度为0.1％至3％。

根据本发明的一些实施例，TS的浓度为0.5％至3％。

根据本发明的一些实施例，培养基进一步包括葡萄糖、L-抗坏血酸和丙酮酸钠中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，葡萄糖的浓度至少为1克/升。

根据本发明的一些实施例，葡萄糖的浓度最多为5克/升。

根据本发明的一些实施例，所述葡萄糖的浓度为1克/升至5克/升。

根据本发明的一些实施例，所述L-抗坏血酸的浓度至少为20微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述L-抗坏血酸的浓度最多为200微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述L-抗坏血酸的浓度为20微克/毫升至200微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，丙酮酸钠的浓度至少为20微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，丙酮酸钠的浓度最多为20微克/毫升

根据本发明的一些实施例，所述丙酮酸钠的浓度为20微克/毫升至200微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基进一步包括血清。

根据本发明的一些实施例，血清浓度至少为3％。

根据本发明的一些实施例，血清浓度最多为30％。

根据本发明的一些实施例，血清浓度为3-30％。

根据本发明的一些实施例，血清浓度为5-30％。

根据本发明的一些实施例，培养基还包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

根据本发明的一些实施例，所述bFGF包括FGF2或FGF4。

根据本发明的一些实施例，所述bFGF包括FGF2及FGF4。

根据本发明的一些实施例，所述FGF2的浓度至少为1纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述FGF2的浓度最多为100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述FGF2的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述FGF4的浓度至少为1纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述FGF4的浓度最多为100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述FGF4的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述培养基进一步包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)和WNT-3a中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述PDGF包括PDGF-BB。

根据本发明的一些实施例，所述PDGF浓度至少为5纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述PDGF浓度最多为100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述PDGF浓度为5纳克/毫升至100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述TGFβ包括TGFβ1或TGFβ3。

根据本发明的一些实施例，所述TGFβ的浓度至少为5纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述TGFβ的浓度最多为50纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述TGFβ的浓度为5纳克/毫升至50纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，EGF的浓度为至少1纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，EGF的浓度为最多100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，EGF的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述WNT-3a的浓度为至少10纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述WNT-3a的浓度为至多200纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述WNT-3a的浓度为10纳克/毫升至200纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，所述培养包括2D培养。

根据本发明的一些实施例，所述培养包括悬浮(3D)培养。

根据本发明的一些实施例，所述培养至少进行5代。

根据本发明的一些实施例，所述培养最多进行25代。

根据本发明的一些实施例，所述MSCs分化为脂肪生成谱系、成骨细胞谱系和软骨生成谱系中的任何一种。

根据本发明的一些实施例，所述培养在没有基质粘附的培养条件下进行。

根据本发明的一些实施例，PSCs的悬浮培养物由团块组成。

根据本发明的一些实施例，包含所述团块的所述悬浮培养物包括含有超过约250个多能干细胞的细胞团。

根据本发明的一些实施例，所述PSCs的所述悬浮培养物不含团块。

根据本发明的一些实施例，不含所述团块的所述悬浮培养物包含单个细胞或小细胞团，每个所述小细胞团包括不超过约200个多能干细胞。

根据本发明的一些实施例，培养持续3-14天。

根据本发明的一些实施例，至少40％的MSsC具有CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-表达特征。

根据本发明的一些实施例，MSCs包括人MSC。

根据本发明的一些实施例，MSCs包括成体MSC。

根据本发明的一些实施例，MSCs包括胎儿MSC。

根据本发明的一些实施例，MSCs包括PSC衍生的MSC。

根据本发明的一些实施例，PSCs包括人PSC。

根据本发明的一些实施例，PSCs包含胚胎干细胞(ESC)。

根据本发明的一些实施例，PSC包含诱导多能干细胞(iPS)。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明实施例的实施或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料，下面描述的方法及/或材料为例示性的。如果发生矛盾，专利说明书包括其定义，将受到限制。另外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并非用以限制。

附图说明

这里仅通过举例的方式参考附加的图式来描述本发明的一些实施例。现在具体参照附图详细说明，需强调的是，所示出的细节是作为例示并且出于对本发明实施例的说明性讨论的目的。就这一点而言，对于本领域技术人员而言，利用附图进行的描述对于可以如何实践本发明的实施例是显而易见的。

在附图中：

图1A至图1D描绘了间充质分化过程中hESC的形态。图1A至图1B说明了细胞聚集体；图1C至图1D说明了单个细胞；图1A和图1C说明了在悬浮培养中分化7天后聚集体和多个单细胞的细胞形态；图1B和图1D说明了将细胞重新接种回贴壁培养后的细胞形态。比例尺：100微米。

图2A至图2E描述了hESCs(I3)向MSCs分化的代表性FACS分析。将hESCs作为聚集体或单个细胞在悬浮液中培养7天。蓝色直方图-表示特异性抗体，红色直方图-表示匹配的同种型对照。图2A说明了CD146和CD73表达的结果；图2B显示了CD105表达的结果；图2C说明了CD90表达的结果；图2D显示了CD45表达的结果；图2E显示了CD31表达的结果。值得注意的是，超过95％的细胞对CD146、CD73、CD105和CD90的表达呈阳性(图2A至图2C)，对CD31和CD45的表达呈阴性(图2D至图2E)。

图3A至图3C描述了hESC-MSCs体外分化为中胚层衍生物。在3D悬浮培养物中进行间充质分化后，将细胞重新铺板在2D贴壁培养物中，并进行脂肪形成、成骨和软骨形成分化。多室脂肪细胞油红染色呈阳性(图3A)，成骨细胞对茜素红染色呈阳性(图3B)，软骨细胞对阿尔新蓝染色呈阳性(图3C)。

图4描绘了在包含不同浓度bFGF的MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12培养基)中扩增的MSC的累积细胞计数。

图5描绘了在包含不同浓度bFGF的MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12培养基)中扩增的MSCs的代表性形态。

图6A至图6C描绘了在包含不同浓度和组合的PDGF-BB、EGF和bFGF的MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12培养基)中扩增的脐带MSCs(MSC-UCs)中的细胞计数(在整个培养期间)。图6A说明了每天的倍数增加；图6B说明了群体倍增时间(PDT)；以及图6C说明了细胞计数的累积结果。在大约60天的过程中对细胞进行计数。平行线表示对细胞进行计数的天数。(*)P<0.5，(**)P<0.01，(***)P<0.001。

图7描绘了在包含不同浓度和组合的PDGF-BB、EGF和bFGF的MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12培养基)中扩增的MSC-UCs的代表性形态(在整个培养期间)。

图8描绘了在包含不同浓度和组合的bFGF、PDGF-BB、TGFβ1和WNT-3a的MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12培养基)中扩增的成人脐带MSCs(ahMSC-UCs)的相对增殖(在整个培养期间)。ahUC-MSC在添加不同浓度生长因子和细胞因子的DMEM/F12基础培养基中传代3次后的样品结果。对照组仅补充了50纳克/毫升的bFGF。

图9A至图9G描绘了在包含不同浓度和组合的bFGF、PDGF-BB、TGFβ1和WNT-3a(整个培养期)的MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12培养基)中扩增的ahMSC-UCs的代表性形态。在DMEM/F12基础培养基的示例结果中生长的ahMSC-UCs的代表性光学显微镜图像(x10放大倍数)。

图10描绘了在包含不同浓度和组合的bFGF、FGF4、TGFβ3和WNT-3a的高葡萄糖DMEM培养基(MSC-Diff 0-HG)中扩增的成人脐带MSCs(ahMSC-UCs)的相对增殖(在整个培养期间)。ahMSC-UCs在补充有不同浓度生长因子和细胞因子的DMEM HG基础培养基中传代3次后的样品结果。对照组仅补充50纳克/毫升的bFGF。

图11A至图11J描绘了在包含不同浓度和组合的bFGF、FGF4、TGFβ3和WNT-3a(整个培养期)的高葡萄糖DMEM培养基(MSC-Diff 0-HG)中扩增的ahMSC-UCs的代表性形态。在DMEM HG基底的示例结果中生长的ahMSC-UC的代表性光学显微镜图像(x10放大倍数)。

图12A至图12E描绘了MSC-Diff 51中的ahMSC-UC细胞密度。在MSC-Diff51培养基中生长的不同传代(第1代至第11代)中的ahMSC-UC的代表性光学显微镜图像(x10放大倍数)。值得注意的是，在指定的培养基中长期培养后，ahMSC-UC保持了它们的形态。

图12F描绘了在MSC-Diff 51培养基中生长的hUC-MSC的累积细胞数。ahMSC-UC在MSC-Diff 51培养基中生长72天后(10代)的累积细胞数。值得注意的是，hUC-MSCs在所示培养基中长期培养期间表现出显着的增殖。

图13描述了在3种不同的MSC-分化培养基中人诱导的多能干细胞(hiPSC)的FACS分析。iPSC、HiPSC(Dyr0100)用指定的培养基培养，在分化后第7天或第8天和第14天对细胞进行CD90染色。红色直方图表示针对指定标记染色的细胞；蓝色直方图代表未染色的细胞。值得注意的是，MSC标记物在分化7-8天后首次出现，并且通过在所有测试的分化培养基中的分化观察到间充质标记物CD90的广泛表达。

图14描绘了在分化培养基中8天后iPSC衍生的MSCs的标记物百分比变化(样品结果)。与第0天相比，MSC-Diff 36、37和38中8天后iPSC衍生的MSCs标记物的百分比变化。值得注意的是，间充质标记物的表达：CD73、CD105和CD146增加，而CD45(造血细胞标记物)减少。

图15描绘了在指定的分化培养基中2周后iPSC衍生的MSCs细胞中的OCT4表达水平。iPSC在3种不同的MSC-Diff培养基中培养，并针对关键多能性标记物OCT4进行染色。随着间充质分化的进行，在MSC-Diff 36、37和38中培养的细胞中的OCT4表达水平显着降低。

图16A至图16H描绘了iPSC衍生的MSCs的成骨潜力(在间充质分化培养基中7天和14天后诱导)，如钙沉积物的茜素红S染色所示。代表成骨潜力的茜素红S染色的代表性光学显微镜图像(x10放大倍数)。iPSC衍生的MSCs(由3D培养中7或14天的间充质分化产生)分别进一步分化为骨细胞30天或16天。值得注意的是，细胞用茜素红染色呈阳性，表明成骨。图16A和图16E-人脐带来源的MSC(用作阳性对照)。图16B和图16F-3D培养中的iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 36诱导)。图16C和图16G：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 37诱导)。图16D和图16H：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 38诱导)。

图17A至图17D描绘了iPSC衍生的MSCs的脂肪形成潜力，如油红O染色所示。油红O染色的代表性光学显微镜图像(x20倍)表明脂肪生成潜力。值得注意的是，iPSC衍生的MSCs(由3D培养中的间充质诱导产生)被油红染色阳性，表明脂肪生成。图17A-人脐带来源的MSCs(用作阳性对照)。图17B：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 36诱导)。图17C：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 37诱导)。图17D-3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 38诱导)。

图18A至图18B描绘了在2D细胞粘附测定(样品结果)之后，针对2种不同MSC分化培养基中的MSC标记物的hiPSC衍生的MSCs的FACS分析。通过将细胞接种在塑料组织培养板中，测试hiPSC衍生的MSCs(在3D培养中诱导间充质分化)的塑料粘附性。将细胞在指定培养基中进一步培养15天，并分析MSC标记物的表达：CD73、CD105、CD146(图18A)和CD90(图18B)。红色直方图表示针对指定标记染色的细胞；蓝色直方图代表未染色的细胞。值得注意的是，hiPSC衍生的MSCs(来自3D培养)在2D培养中也保持间充质标记物的高表达。

图19描绘了在2D细胞粘附测定中15天后iPSC衍生的MSCs(来自3D培养)的标记物的百分比变化(样品结果)。通过将细胞接种在塑料组织培养板中，测试hiPSC衍生的MSCs(在3D培养中诱导间充质分化)的塑料粘附性。将细胞在指定的培养基中进一步培养15天，并分析MSC标记物CD73、CD105、CD146以及造血标记物CD45的百分比变化。

图20A至图20C描述了粘附测定后从iPSC衍生的MSCs分化的骨细胞中的钙沉积物的茜素红S染色(样品结果)。茜素红S染色阳性的代表性光镜图像(x10倍放大)表明粘附试验后iPSC衍生MSCs的成骨潜力。将iPSC衍生的MSCs(在指定培养基中的3D培养中产生)接种在塑料组织培养板中，并用成骨培养基进一步培养16天。图20A-ahUC MSCs(阳性对照)。图20B：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 37诱导)。图20C：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 38诱导)。

图21A至图21C描绘了在粘附测定后对从iPSC衍生的MSCs分化的脂肪细胞中的脂滴进行的油红O染色(样品结果)。油红O染色的代表性光学显微镜图像(x20放大倍数)表明hiPSC衍生的MSCs在粘附试验后的脂肪形成潜力。将hiPSC衍生的MSCs(在指定培养基中的3D培养中产生)接种在塑料组织培养板中，并用成骨培养基进一步培养23天。图21A-ahUCMSCs(阳性对照)。图21B：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 37诱导)。图21C：3D培养中iPSC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 38诱导)。

图22A至图22B描绘了在指定培养基中8天后ESC衍生的MSCs细胞中的OCT4和Nanog表达水平。在3D培养中，人胚胎干细胞在3种不同的MSC-Diff培养基中培养8天。分析细胞的OCT4(图22A)和Nanog(图22B)表达。值得注意的是，OCT4和Nanog表达水平在间充质分化过程中显着下降。

图23A至图23D描绘了ESC衍生的MSCs的成骨潜力(在间充质分化培养基中7天后诱导)，如通过对钙沉积物的阳性茜素红S染色所证实的。茜素红S染色的代表性光学显微镜图像(放大x10倍)显示成骨潜力。ESC衍生的MSCs(在3D培养中间充质分化7天后产生)在30天进一步分化为骨细胞。图23A-ahUC MSCs(阳性对照)。图23B：3D培养中ESC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 36诱导)。图23C：3D培养中ESC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 37诱导)。图23D：3D培养中ESC衍生的MSCs(来自MSC-Diff 38诱导)。

具体实施方式

在本发明的一些实施例中，本发明涉及用于培养多能干细胞的培养基，更具体地，但不限于涉及可用于将多能干细胞分化为间充质干细胞(MSCs)的新型培养基，以及可将MSCs维持在增殖、多能和未分化状态的新型培养培养基。

参考附图和随附的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明的应用不一定限于以下描述中阐述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例或者能够以各种方式实践或执行。此外，应当理解的是，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，不应被视为限制。

间充质干细胞(MSC)是多能细胞，可来源于各种成人或胎儿组织，并可在体外进一步分化为中胚层衍生物，例如：脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞，以及(较小程度)转化为外胚层或内胚层衍生物；分别是神经元或肝细胞。MSCs传统上在2D贴壁培养中培养。人类多能干细胞(hPSCs)，无论是胚胎的还是诱导的，都可以提供替代的、无限的和可复制的成人或胎儿MSCs来源。

由于MSCs具有自我更新和多谱系分化的能力，因此在治疗应用中的使用是可取的。然而，在传统的细胞培养条件下，例如在组织培养塑料上培养时，MSC往往会失去其干细胞特性。

在将本发明简化为实践的同时，本发明人发现了用于在非粘附、无载体悬浮培养物(作为细胞聚集体或单个细胞)中将hPSCs定向分化为MSCs的新颖、特异和有效的培养基。在分化培养基中经过几天(例如3-10天)后，目前描述的方案生成了真正的MSCs，并在体外对成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞进行了高速率分化。此外，本发明人揭示了用于在2D粘附培养(有或无涂层)或悬浮(3D)培养中培养成人、胎儿和PSC衍生的MSCs的新型培养基。培养基使MSCs能够长时间扩增(例如20-25代)，同时保持其未分化状态。总而言之，本文鉴定的新型培养基可用于从PSCs中高效和快速地产生MSCs，以及用于将MSCs长期扩增和维持在未分化状态。此外，由所述方案产生的MSCs可以用作各种基于细胞的治疗的增殖性、多潜能、未分化的间充质干细胞的无限来源。

因此，根据本发明的一个目的，提供了一种成分确定的培养基，其包含基础培养基和有效量的敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中培养基是无血清的，并且进一步其中培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的扩增。

根据本发明的一个目的，提供了一种培养基，其包含基础培养基，所述基础培养基包含DMEM/F12和MEMα，DMEM/F12与MEMα的体积比在0.4至2.3之间，其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的扩增。

如本文所用术语“多能干细胞”或“PSC”是指能够分化成所有三个胚胎胚层(即，内胚层、外胚层和中胚层)的细胞的细胞。术语“多能干细胞”一词可以理解为胚胎干细胞(ESC)和/或诱导多能干细胞(iPS细胞)。

如本文所用术语“胚胎干细胞”或“ESC”是指从妊娠后形成的胚胎组织(例如胚泡)在植入前获得的细胞(即植入前胚泡)；从着床后/原肠胚形成前阶段囊胚获得的扩展囊胚细胞(EBC)(参见WO2006/040763]；和/或在妊娠期间的任何时间，优选在妊娠10周之前从胎儿的生殖组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。

根据本发明的一些实施例，本发明的多能干细胞是胚胎干细胞，例如来自人类或灵长类动物(例如猴子)的来源。

本发明的胚胎干细胞可以使用公知的细胞培养方法获得。例如，人胚胎干细胞可以从人胚泡中分离出来。人囊胚通常获自人体内植入前胚胎或体外受精(IVF)胚胎。或者，单细胞人类胚胎可以扩展到囊胚阶段。为了分离人ES细胞，从囊胚中去除透明带，通过免疫外科分离内细胞团(ICM)，其中滋养外胚层细胞被裂解，并通过轻轻移液从完整的ICM中去除。然后将ICM置于含有适当培养基的组织培养瓶中，以使其生长。9到15天后，ICM衍生的生长物通过机械分离或酶促降解分离成团块，然后将细胞重新接种到新鲜组织培养基上。显示未分化形态的菌落通过微量移液管单独选择，机械分离成团块，然后重新接种。然后，每4-7天常规分离产生的ES细胞。有关人类ES细胞制备方法的更多详细信息，请参见Thomson等人，[美国专利号US5843780；科学期刊282:11451998；当前最高开发生物38:133，1998；美国国家科学院院刊92:78441995]；Bongso等人，[Hum Reprod 4:7061989]；和Gardner等人，[Fertil.Steril.69:1998]。

应当理解，市售干细胞也可以用于本发明的这一方面。人类ES细胞可从NIH人类胚胎干细胞登记处(www.//escr(.(NIH).)gov)购买。市售胚胎干细胞系的非限制性实例是BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE04和TE06。

扩大囊胚细胞(EBC)可从受精后至少9天的囊胚中获得，这个囊胚处于原肠胚形成之前的阶段。在培养囊胚之前，透明带被消化[例如通过Tyrode的酸性溶液(SigmaAldrich，圣刘易斯，MO，美国)]，以暴露内部细胞团。然后使用标准的胚胎干细胞培养方法在体外将囊胚作为完整胚胎培养至少9天且不超过14天(即，在原肠胚形成之前)。

胚胎生殖(EG)细胞是使用本领域技术人员已知的实验室技术由从怀孕约8-11周的胎儿(在人类胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞制备的。生殖脊被分离并切成小块，然后通过机械分离分解成细胞。然后EG细胞在具有适当培养基的组织培养瓶中生长。每天更换培养基培养细胞，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4代后。有关制备人类EG细胞方法的更多详细信息，请参见Shamblott等人，[美国国家科学院院刊95:137261998年]和美国专利号US 6090622。

本文中使用的术语“诱导多能干(iPS)细胞”(或胚胎样干细胞)是指通过体细胞(例如，成年体细胞)的去分化获得的增殖性多能干细胞。

根据本发明的一些实施例，iPS细胞的特征在于增殖能力，其与ESC的增殖能力相似，因此可以在培养物中维持和扩增几乎无限的时间。

IPS细胞可以通过基因操作被赋予多能性，所述基因操作重新编程细胞以获得胚胎干细胞特征。例如，本发明的iPS细胞可以通过在体细胞中诱导Oct-4、Sox2、Kfl4和c-Myc的表达而从体细胞产生，基本上如Takahashi和Yamanaka cell(2006)126:663-676中所述；高桥等人，细胞期刊(2007)131(5):861-72；Meissner等人，国家生物技术期刊，(2007)25(10):11177-81；和Okita等人，自然期刊(2007)448:313-318。附加地或替代地，本发明的iPS细胞可以通过诱导Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达从体细胞产生，基本上如Yu等人，科学期刊(2007)318:1917-20中所述；和Nakagawa等人，国家生物技术期刊(2008)26(1):101-6。应当注意的是，体细胞的遗传操纵(重新编程)可以使用任何已知的方法进行，例如使用质粒或病毒载体，或者通过不与基因组整合的衍生[Yu等人，科学期刊(2009)324:797-801]。

本发明的iPS细胞可通过诱导胚胎成纤维细胞的去分化而获得[Takahashi和Yamanaka(2006)，同上；Meissner等人(2007)，同上]，由hESCs形成的成纤维细胞[Park等人，自然期刊(2008)10；451(7175):141-6]，胎儿成纤维细胞[Yu等人，(2007)同上；Park等人，成人皮肤和皮肤组织[Hanna等人，《科学》(2007)318:1920–1923；Lowry等人，《美国国家科学院院刊》(2008)105(8)：2883-8]，B淋巴细胞[Hanna等(2007)，上文]以及成人肝和胃细胞[Aoi等人，科学(2008)321(5889)：699-702]。

IPS细胞系也可通过诸如WiCell库的细胞库获得。市售iPS细胞系的非限制性实例包括iPS包皮克隆1[WiCell目录号iPS(包皮)-1-DL-1]、iPSIMR90克隆1[WiCell目录编号iPS(IMR90)-1-DL-1]和iPSIMR9克隆4[WiCell目录号iPS(IMR9)-4-DL-1]。

根据本发明的一些实施例，诱导多能干细胞是人诱导多能干细胞。

如本文所用术语“间充质干细胞”或“MSC”是指源自通常归类为间充质的任何组织的干细胞。分类为间充质的组织包括骨髓、胎盘、脂肪组织和真皮组织。源自这些组织的间充质干细胞的实例包括，例如，源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)、源自胎盘的间充质干细胞、源自脐带血的间充质干细胞(CB-MSC)，源自脂肪组织的间充质干细胞，源自真皮的间充质干细胞和牙髓间充质干细胞。

根据一个实施例，MSCs是胎儿来源的(例如CB-MSC、胎盘来源的MSC)。

根据一个实施例，MSCs是成人来源的(即胎儿后，即从新生儿阶段到生命末期的生物体，并且包括例如从骨髓或脂肪组织获得的MSCs)。

MSCs通常能够在多个间充质谱系中产生分化细胞，包括例如成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、成软骨细胞和成纤维细胞。通常，间充质干细胞还具有以下一种或多种特性：进行异步或不对称复制的能力，即分裂后的两个子细胞可以具有不同的表型；广泛的自我更新能力；它们存在的组织的克隆再生，例如，骨髓的非造血细胞。

MSCs的特征可以是某些细胞表面标志物的存在和某些细胞表面标志物的不存在，如下文所讨论的。MSCs也可以通过体外和体内功能测定来鉴定，特别是与干细胞产生多重分化后代的能力相关的测定、对典型WNT信号转导的反应性测定等。

人MSCs的特征在于多种细胞表面蛋白的表达，包括但不限于CD54、CD9、CD29、CD44、CD56、CD61、CD63、CD71、CD73、CD90、CD97、CD98、CD99、CD105、CD106、CD112、CD146、CD155、CD166、CD276和CD304。人MSCs的特征可以是缺乏标记物(例如造血标记物)的细胞表面表达，包括但不限于CD31、CD34、CD20、CD19、CD14和CD45。根据一个实施例，人MSCs的特征在于不存在CD14和/或CD11b的细胞表面表达；CD19和/或CD79a；或HLA-DR。应当理解，所有标记物都可以在单个MSC细胞上表达，或者备选地，标记物可以在不同的MSC细胞上表达(例如，在相同的培养物中)。

根据特定实施例，人MSCs的特征在于CD105、CD146、CD90、CD44的细胞表面表达，以及CD31、CD34和CD45的细胞表面不表达(即CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-细胞)。

可以使用本领域已知的任何方法获得MSCs。例如，可以使用标准程序从骨髓中获得MSCs。例如，可以从供体(例如健康供体)收集骨髓抽吸物或活组织检查，并且可以从中分离MSCs(参见，例如，Aggarwal和Pittenger,血液期刊(2005)105:1815-1822)。通常，单核细胞通常通过梯度离心从骨髓吸出物中分离，然后接种到含有MSC培养基的烧瓶中，如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)-添加有10mM的L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FCS)的低葡萄糖，并在37℃下在湿润的5％的CO₂气氛下生长。非粘附细胞通常在24小时后被去除(例如通过用PBS-HSA溶液洗涤)。培养基每4天更换一次，2周后培养物应基本汇合。使用胰蛋白酶回收MSCs，并作为第1代细胞重新铺板。细胞可以在培养物中保存至少8代，并定期测试是否存在MSC相关表面分子。类似地，MSCs可以从脂肪组织、脐带血和脐带获得，如在www(dot)irvinesci(dot)com/protocol-for-mesenchymal-stem-cell-isola tion中详细讨论的，通过引用并入本文。

市售的间充质干细胞也可用于本发明的这一方面。人MSCs可从例如ATCC(美国典型培养物保藏中心-www.ATCC.org)购买。市售MSCs的非限制性实例包括脂肪来源的间充质干细胞，例如

PCS-210-010^TM，/>

PCS-500-011^TM；骨髓间充质干细胞，例如

PCS-500-012^TM；脐带间充质干细胞，例如/>

PCS-500-010^TM。

根据一个实施例，MSCs获自PSCs(即PSC衍生的MSCs)，例如从ESC(例如hESC)或iPS细胞分化而来，如下文进一步讨论的。

根据一个实施例，本发明的多能干细胞(PSCs)和/或间充质干细胞(MSCs)是哺乳动物细胞，包括但不限于人、灵长类动物、狗、马、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔来源的细胞。根据特定实施例，PSCs或MSCs来自人类。

如本文所用术语“培养基”是指用于支持细胞生长的液体物质。根据一些实施例，本发明使用的培养基可以是水基培养基，其包括诸如盐、营养素、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质诸如细胞因子、生长因子和激素的组合，所有这些都是细胞增殖和/或分化所必需的。

例如，根据本发明一些实施例的一个目的的培养基可以是合成组织培养基，其包括基础培养基，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，例如可从Gibco-英杰公司产品,Grand Island,NY,USA获得)、DMEM/F12(例如可从生物工业,Beit HaEmek,Israel获得)、DMEM高葡萄糖(DMEM HG、MEMα(例如可从以色列Beit HaEmek的生物工业获得)、Ham's F-12(例如可从Invitrogen/Thermo Fisher Scientific公司获得)、Ko-DMEM(可从例如以色列Beit HaEmek获得)例如来自Gibco-英杰公司产品,Grand Island,NY,USA)，Eagle'sMinimum Essential Medium(EMEM,可例如来自Gibco-英杰公司产品,Grand Island,NY,USA)，补充必要的添加剂，如下文进一步描述的。基础培养基的浓度取决于其他培养基成分的浓度，例如下文讨论的血清替代物。

根据本发明的一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12。

根据本发明的一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM高葡萄糖(DMEM HG)。

根据本发明的一个实施例，培养基包含基础培养基MEMα。

根据本发明的一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12和MEMα。

根据本发明的一个实施例，DMEM/F12与MEMα的体积比在DMEM/F12与MEMα介于0.1到9之间(例如10％DMEM/F12和90％MEMα到90％DMEM/F12和10％MEMα的体积)。

根据本发明的一个实施例，DMEM/F12与MEMα的体积比在DMEM/F12比MEMα介于0.25到4之间(例如20％DMEM/F12和80％MEMα到80％DMEM/F12和20％MEMα的体积)。

根据本发明的一个实施例，DMEM/F12与MEMα的体积比在DMEM/F12比MEMα介于0.4到2.3之间(例如30％DMEM/F12和70％MEMα到70％DMEM/F12和30％MEMα的体积)。

根据本发明的一个实施例，DMEM/F12与MEMα的体积比在DMEM/F12比MEMα介于0.6到1.5之间(例如40％DMEM/F12和60％MEMα到60％DMEM/F12和40％MEMα的体积)。

根据本发明的一个实施例，DMEM/F12与MEMα的体积比为DMEM/F12比MEMα为1比1(例如50％DMEM/F12和50％MEMα的体积)。

根据一个实施例，培养基是成分确定的。“成分确定的”培养基是指由特定浓度的已知成分制成的化学成分确定的培养基。例如，成分确定的培养基是非条件培养基。

“条件培养基”是指一种培养基，其中已经培养了特定细胞或细胞群，然后将其去除。当细胞在培养基中培养时，它们可能会分泌细胞因子，为其他细胞提供营养支持。此类因子包括但不限于生长因子、炎症介质和其他细胞外蛋白，包括例如激素、细胞因子、抗体、细胞外基质(ECM)、囊泡和颗粒。含有细胞因子的培养基是条件培养基(例如饲养细胞(例如成纤维细胞)在其中生长的生长培养基)。

根据一个实施例，培养基是非条件培养基。

根据一个实施例，培养基不包括条件培养基的成分。

根据一个实施例，培养基是无血清的。

如本文所用术语“无血清”是指没有人或动物血清。

应该注意的是，血清在培养方案中的作用是为培养的细胞提供类似于体内存在的环境(即，在细胞来源的生物体内)。然而，来自动物来源(例如牛血清)或人类来源(人血清)的血清的使用受到供体个体(从中获得血清)之间血清组分的显着差异和具有异种污染物的风险(在使用动物血清的情况下)的限制。

根据本发明的一些实施例，无血清培养基不包含血清或其部分。

根据本发明的一些实施例，无血清培养基不含血清白蛋白(例如，从人血清或动物血清纯化的白蛋白)。

根据本发明的一些实施例，培养基包括血清替代物。

如本文所用术语“血清替代物”是指一种定义的制剂，其通过为多能干细胞或间充质干细胞提供生长和生存所需的成分来替代血清的功能。

各种血清替代制剂在本领域中是已知的，并且是市售的。

例如，GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR，Gibco英杰公司，格兰德岛，NY USA，目录号10828-028)是一种定义的无血清制剂，优化以在培养物中生长和维持细胞。应该注意的是，GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物的配方包括来自动物来源的白蛋白(富含脂质的牛血清白蛋白)(Price、P.J.等人的专利合作条约专利公开号WO 98/30679)。然而，Crook等人最近发表的一篇文章，2007(Crook JM.,et al.,2007,细胞干细胞,1:490-494)描述了使用FDA批准的临床级包皮成纤维细胞在cGMP制造的Knockout^TM血清替代物(InvitrogenCorporation，美国，目录号04-0095)。

根据本发明的一些实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度范围为约0.5％[体积/体积(v/v)]至约50％(v/v)，约1％[体积/体积(v/v)]至约50％(v/v)，例如从约1％(v/v)至约5％(v/v)，例如，从约1％(v/v)至约10％(v/v)，例如，从约3％(v/v))至约5％(v/v)，例如约3％(v/v)至约10％(v/v)，例如约3％(v/v)至约15％(v/v)，例如约5％(v/v)至约10％(v/v)，例如约5％(v/v)至约15％(v/v)，例如约5％(v/v)至约30％(v/v)，例如约5％(v/v)至约40％(v/v)，例如约10％(v/v)至约15％(v/v)，例如约10％(v/v)至约20％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度至少为例如约0.5％(v/v)，至少例如约1％(v/v)，至少例如约1.5％(v/v)，至少例如约2％(v/v)，至少例如约2.5％(v/v)，至少例如约3％(v/v)，例如至少约3.5％(v/v)，例如至少约4％(v/v)，例如至少约5％(v/v)，例如至少约6％(v/v)，例如至少约7％(v/v)，例如至少约8％(v/v)，例如至少约9％(v/v)，例如至少约10％(v/v)，例如至少约11％(v/v)，例如至少约12％(v/v)，例如至少约13％(v/v)，例如至少约14％(v/v)，例如至少约15％(v/v)，例如至少约20％(v/v)，例如至少约30％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度至多为例如约10％(v/v)，例如约11％(v/v)，例如约12％(v/v)，例如约13％(v/v)，例如约14％(v/v)，例如约15％(v/v)，例如约20％(v/v)，例如约30％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为2.5％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为3％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为3.75％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为5％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为7.5％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为10％(v/v)。

根据具体实施例，培养基中GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)的浓度约为15％(v/v)。

另一种市售的血清替代物是不含维生素A的B27补充剂，其可从例如GibcoInvitrogen，Corporation，Grand Island，NY USA，目录号12587-010获得。B27补充剂是一种无血清制剂，其中包括d-生物素、无脂肪酸级分V牛血清白蛋白(BSA)、过氧化氢酶、左旋肉碱盐酸盐、皮质酮、乙醇胺盐酸盐、D-半乳糖(无水)、谷胱甘肽(还原型)、重组人胰岛素、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺-2-HCl、亚硒酸钠、超氧化物歧化酶、T-3/白蛋白复合物、DLα-生育酚和DLα-生育酚乙酸酯。然而，B27补充剂的使用受到限制，因为它包含来自动物来源的白蛋白。

根据本发明的一些实施例，血清替代物是无异源的。

术语“xeno”是基于希腊语单词“Xenos”的前缀，即陌生人。如本文所用术语“无异种”是指不含任何源自异种(即不同的异种)物种的成分。此类成分可以是污染物，例如与异种物种相关(例如，感染)的病原体、异种物种的细胞成分或异种物种的非细胞成分(例如，流体)。

例如，无异种血清替代物可包括胰岛素、转铁蛋白和硒的组合。此外或备选地，无异种血清替代物可包括人或重组产生的白蛋白、转铁蛋白和胰岛素。

市售的无异种血清替代组合物的非限制性实例包括可从例如Invitrogen公司(ITS，Invitrogn，目录号51500-056或Gibco目录号41400-045)获得的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和血清替代物3(可从例如Sigma，目录号S2640获得)的预混合物，并且不含生长因子、类固醇激素、糖皮质激素、细胞粘附因子、可检测的Ig和有丝分裂原。

根据本发明的一些实施例，培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度在约0.01％[体积/体积(v/v)]至约10％(v/v)的范围内，例如，约0.01％(v/v)至约0.05％(v/v)，例如约0.01％(v/v)至约0.1％(v/v)，如约0.01％(v/v)至0.5％(v/v)，例如，约0.01％(v/u)至约1％(v/w)，例如，约0.01(v/v)至约3％(v/v)，例如，约0.01％(v/v)至约5％(v/v)，例如，约0.1％(v/v)至约0.5％(v/v)，例如，约0.1％(v/v)至约0.8％(v/v)，例如约0.1％(v/v)至约1.0％(v/v)，例如约0.1％(v/v)至约1.5％(v/v)，例如约0.1％(v/v)至约2％(v/v)，例如约0.1％(v/v)至约3％(v/v)，例如约0.1％(v/v)至约5％(v/v)，例如，约0.2％(v/v)至约0.3％(v/v)，例如约0.2％(v/v)至约0.4％(v/v)，例如，约0.2％(v/v)/v)至约0.5％(v/v)，例如约0.5％(v/v)至约1％(v/v)，例如约0.5％(v/v)至约1.5％(v/v)，例如，约0.5％(v/v)至约2％(v/v)，例如，约0.5％(v/v)至约3％(v/v)，例如约0.5％(v/v)至约5％(v/v)，例如约0.5％(v/v)至约10％(v/v)，例如约1％(v/v)至约2％(v/v)，例如约1％(v/v)至约3％(v/v)，例如约1％(v/v)至约5％(v/v)，例如约1％(v/v)至约10％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度至少为例如约0.01％(v/v)，至少例如约0.05％(v/v)，至少例如约0.1％(v/v)，至少例如约0.2％(v/v)，至少例如约0.3％(v/v)，至少例如约0.4％(v/v)，至少例如约0.5％(v/v)，至少例如约0.6％(v/v)，至少例如约0.7％(v/v)，至少例如约0.8％(v/v)，至少例如约0.9％(v/v)，至少例如约1％(v/v)，至少例如约1.5％(v/v)，至少例如约2％(v/v)，至少例如约2.5％(v/v)，至少例如约3％(v/v)，至少例如约3.5％(v/v)，至少例如约4％(v/v)，至少例如约5％(v/v)，至少例如约6％(v/v)，至少例如约7％(v/v)，至少例如约8％(v/v)，至少例如约9％(v/v)，至少例如约10％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度最多为例如约0.2％，例如约0.3％，例如约0.5％(v/v)，例如约1％(v/v)，例如约1.5％(v/v)，例如约2％(v/v)，例如约2.5％(v/v)，例如约3％(v/v)，例如约4％(v/v)，例如约5％(v/v)，例如约6％(v/v)，例如约7％(v/v)，例如约8％(v/v)，例如约9％(v/v)，例如约10％(v/v)。

根据具体实施例，所述培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度为约0.1％(v/v)。

根据具体实施例，所述培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度为约0.25％(v/v)。

根据具体实施例，所述培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度为约0.5％(v/v)。

根据具体实施例，所述培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度为约1％(v/v)。

根据具体实施例，所述培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度为约2％(v/v)。

根据具体实施例，所述培养基中ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的浓度为约3％(v/v)。

根据一个实施例，所述培养基包含GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据一个实施例，所述培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据一个实施例，所述培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，所述培养基是无血清的。

根据一个实施例，所述培养基包括基础培养基DMEM/F12和MEMα、GIBCO^TMKnockout^TM血清替代物和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据一个实施例，所述培养基包含基础培养基MEMα和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据一个实施例，培养基包含血清，即不同可溶性蛋白质和生长因子的不确定混合物，其支持细胞的存活和增殖。多种血清制剂是本领域已知的并且是可商购的。例如，胎牛血清(FBS,Biological Industries,Beit HaEmek,Israel,Cat no.04-007-1A)、人AB血清、猪血清、马血清、兔血清和山羊血清，所有这些都可从例如以色列贝特哈埃梅克的生物工业购得。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)在约1％[体积/体积(v/v)]至约50％(v/v)的范围内，例如约1％(v/v)至约5％(v/v)，例如约1％(v/v)至约10％(v/v)，例如约1％(v/v)至约20％(v/v)，例如约1％(v/v)至约30％(v/v)，例如约3％(v/v)至约30％(v/v),例如，约5％(v/v)至约10％(v/v)，例如，约5％(v/v)至约15％(v/v)，例如，约5％(v/v)至约20％(v/v)，例如约5％(v/v)至约30％(v/v)，例如约5％(v/v)至约40％(v/v)，例如约10％(v/v)至约20％(v/v)，例如约10％(v/v)至约30％(v/v)，例如约10％(v/v)至约40％(v/v)，例如约10％(v/v)至约50％(v/v)，例如约20％(v/v)至约30％(v/v)，例如约20％(v/v)至约40％(v/v)，例如约20％(v/v)至约50％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)例如至少约1％(v/v)，例如至少约2％(v/v)，例如至少约3％(v/v)，例如至少约4％(v/v)，例如至少约5％(v/v)，例如至少约6％(v/v)，例如至少约7％(v/v)，例如至少约8％(v/v)，例如至少约9％(v/v)，例如至少约10％(v/v)，例如至少约15％(v/v)，例如至少约20％(v/v)，例如至少约25％(v/v)，例如至少约30％(v/v)，例如至少约35％(v/v)，例如至少约40％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)至多为例如约5％(v/v)，例如约10％(v/v)，例如约15％(v/v)，例如约20％(v/v)，例如约25％(v/v)，例如约30％(v/v)，例如约35％(v/v)，例如约40％(v/v)，例如约50％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)约为3％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)约为5％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)约为10％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)约为20％(v/v)。

根据本发明的一些实施例，培养基中的血清(例如FBS)约为30％(v/v)。

根据一实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12和MEMα、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和血清。

根据一实施例，培养基包含基础培养基MEMα、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和血清。

根据一实施例，培养基包含葡萄糖。葡萄糖可以从各种供应商处获得，例如但不限于Sigma-Aldrich。

培养基中葡萄糖的浓度可以为约0.5克/升至5克/升，例如，1克/升至5gr/升，例如，1克/升至4.5克/升；例如，1克/升至4克/升，如1克/升至3.5gr/L；例如，1克/升至3克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的葡萄糖至少是例如约0.5克/升，例如约1克/升，例如约1.5克/升，例如约2克/升，例如约2.5克/升，例如约3克/升，例如约3.5克/升，例如约4克/升，例如约4.5克/升，例如约5克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的葡萄糖至多例如约5克/升，例如约4.5克/升，例如约4克/升，例如约3.5克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的葡萄糖约为3.5克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的葡萄糖约为4克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的葡萄糖约为4.5克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的葡萄糖约为5克/升。

根据本发明的一些实施例，培养基包含L-抗坏血酸。L-抗坏血酸可从各种供应商获得，例如但不限于Sigma-Aldrich。

培养基中L-抗坏血酸的浓度可为约20微克/毫升至200微克/毫升，例如20微克/毫升至100微克/毫升，例如20微克/毫升至60微克/毫升，例如50微克/毫升至200微克/毫升，例如50微克/毫升至150微克/毫升，例如50微克/毫升至100微克/毫升，例如50微克/毫升至75微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的L-抗坏血酸至少是例如约20微克/毫升，例如约30微克/毫升，例如约40微克/毫升，例如约50微克/毫升，例如约60微克/毫升，例如约70微克/毫升，例如约80微克/毫升，例如约90微克/毫升，例如约100微克/毫升，例如约120微克/毫升，例如约140微克/毫升，例如约160微克/毫升，例如约180微克/毫升，例如约200微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的L-抗坏血酸至多例如约200微克/毫升，例如约175微克/毫升，例如约150微克/毫升，例如约100微克/毫升，例如约75微克/毫升，例如约50微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的L-抗坏血酸为约25微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的L-抗坏血酸为约50微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的L-抗坏血酸为约75微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的L-抗坏血酸为约100微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基包括丙酮酸钠。丙酮酸钠可从各种供应商获得，例如但不限于以色列Beit HaEmek的生物工业。

丙酮酸钠在培养基中的浓度可以为约20微克/毫升至200微克/毫升，例如20微克/毫升至100微克/毫升，例如20微克/毫升至60微克/毫升，例如50微克/毫升至200微克/毫升，例如50微克/毫升至150微克/毫升，例如50微克/毫升至100微克/毫升，例如50微克/毫升至75微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的丙酮酸钠至少是例如约20微克/毫升，例如约30微克/毫升，例如约40微克/毫升，例如约50微克/毫升，例如约60微克/毫升，例如约70微克/毫升，例如约80微克/毫升，例如约90微克/毫升，例如约100微克/毫升，例如约120微克/毫升，例如约140微克/毫升，例如约160微克/毫升，例如约180微克/毫升，例如约200微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的丙酮酸钠至多例如为约200微克/毫升，例如约175微克/毫升，例如约150微克/毫升，例如约100微克/毫升，例如约75微克/毫升，例如约50微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的丙酮酸钠为约25微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的丙酮酸钠为约50微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的丙酮酸钠为约70微克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中的丙酮酸钠为约100微克/毫升。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、KoSR、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和L-抗坏血酸。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、KoSR、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、L-抗坏血酸和丙酮酸钠。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、KoSR、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、葡萄糖、L-抗坏血酸和丙酮酸钠。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM高葡萄糖(DMEM HG)、KoSR、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、L-抗坏血酸和丙酮酸钠。

如以下实施例部分的实施例1和2所示，本发明人使用了各种培养基，其包括例如1-50纳克/毫升范围内的bFGF(如下表2和表3中所示)以成功将PSCs分化为MSCs，并成功培养MSCs并将它们维持在增殖、多能和未分化状态(如下文进一步讨论)。

根据本发明的一些实施例，培养基包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

如本文所用术语“碱性成纤维细胞生长因子”或“bFGF”是指成纤维细胞生长因子(FGF)家族的多肽，其结合肝素并具有广泛的促有丝分裂和血管生成活性。bFGF基因的mRNA包含多个多聚腺苷酸化位点，并且交替地从非AUG(CUG)和AUG起始密码子翻译而来，从而产生具有不同性质的五种不同亚型。CUG启动的亚型位于细胞核中并负责内分泌作用，而AUG启动的亚型主要是细胞溶质的并且负责这个FGF的旁分泌和自分泌作用。

根据本发明的一些实施例，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)包括FGF2或FGF4。

FGF2，通常也称为碱性成纤维细胞生长因子(FGF basic、bFGF或FGF-β)，是成纤维细胞生长因子家族的一员。在本发明的一些实施例的培养基中使用的FGF2可以是纯化的、合成的或重组表达的FGF2蛋白(例如，人bFGF多肽基因库登录号NP_001997.5；例如，人bFGF多核苷酸基因库登录号NM_002006)。

FGF4是成纤维细胞生长因子家族的成员。本发明一些实施例的培养基中使用的FGF4可以是纯化的、合成的或重组表达的FGF4蛋白(例如，人bFGF多肽基因库登录号NP_001998.1；例如，人bFGF多核苷酸基因库登录号NM_002007)。

根据一个具体实施例，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)包括由具有符号FGF2或FGF4的基因编码的蛋白质。

应当注意，为了制备无异源培养基，bFGF(例如FGF2和/或FGF4)优选从人来源纯化或重组表达，如下文进一步描述。bFGF(例如FGF2和/或FGF4)可以从各种商业来源获得，例如从Biological Industries(Beit HaEmek，Israel)，BioLegend，San Diego，CA，USA(目录号分别为710304/8和710404)获得。根据一个实施例，bFGF(即FGF2)从R&D Systems(分类号：233-FB)获得，FGF4从R&D Systems，分类号：235-F4/CF，或从Peprotech，分类号100-31获得。

根据一些实施例，培养基中bFGF(例如FGF2和/或FGF4)的浓度在约0.01纳克/毫升至约10微克/毫升的范围内，例如约0.1纳克/毫升至约10微克/毫升，例如约1纳克/毫升至1微克/毫升，例如约1纳克/毫升至约10纳克/毫升，例如约1纳克/毫升至大约50纳克/毫升，例如约1纳克/毫升至大约100纳克/毫升，例如约1纳克/毫升至约500纳克/毫升，例如约2纳克/毫升至约200纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约100纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约150纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约200纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约250纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约500纳克/毫升，例如约10纳克/毫升至大约100纳克/毫升，例如约10纳克/毫升至大约150纳克/毫升，例如约10纳克/毫升至大约200纳克/毫升，例如约10纳克/毫升至约250纳克/毫升，例如约10纳克/毫升至约500纳克/毫升，例如约50纳克/毫升至大约100纳克/毫升，例如约50纳克/毫升至大约150纳克/毫升，例如约50纳克/毫升至大约200纳克/毫升，例如约50纳克/毫升至大约250纳克/毫升、例如约50纳克/毫升至大约500纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中bFGF(例如FGF2和/或FGF4)的浓度为例如至少约0.01纳克/毫升，例如至少约0.1纳克/毫升，例如至少约0.5纳克/毫升，例如至少约1纳克/毫升，例如至少约1.5纳克/毫升，例如至少约2纳克/毫升，例如至少约2.5纳克/毫升，例如至少约3纳克/毫升，例如至少约4纳克/毫升，例如至少约5纳克/毫升，例如至少约7.5纳克/毫升，例如至少约10纳克/毫升，例如至少约15纳克/毫升，例如至少约20纳克/毫升，例如至少约25纳克/毫升，例如至少约30纳克/毫升，例如至少约40纳克/毫升，例如至少约50纳克/毫升，例如至少约60纳克/毫升，例如至少约70纳克/毫升，例如至少约80纳克/毫升，例如至少约90纳克/毫升，例如至少约100纳克/毫升，例如至少约120纳克/毫升，例如至少约130纳克/毫升，例如至少约140纳克/毫升，例如至少约150纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中bFGF(例如FGF2和/或FGF4)的浓度为至多约5纳克/毫升、至多约10纳克/毫升、至多约15纳克/毫升、至多约20纳克/毫升、至多约30纳克/毫升、至多约40纳克/毫升、至多约50纳克/毫升、至多约60纳克/毫升、至多约100纳克/毫升、至多约200纳克/毫升、至多约500纳克/毫升。

根据一个实施例，培养基包括FGF2。

根据一个实施例，培养基包括FGF4。

根据一个实施例，培养基包括FGF2和FGF4。

根据一特定实施例，培养基中FGF2的浓度为约1纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF2的浓度为约5纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF2的浓度为约10纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF2的浓度为约20纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF2的浓度为约50纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF4的浓度为约1纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF4的浓度为约5纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF4的浓度为约10纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF4的浓度为约20纳克/毫升。

根据一特定实施例，培养基中FGF4的浓度为约50纳克/毫升。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM 血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和FGF2。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM 血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和FGF4。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、FGF2和FGF4。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12和MEMα、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和FGF2。根据具体实施例，所述培养基包含血清。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12和MEMα、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和FGF4。根据具体实施例，所述培养基包含血清。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12和MEMα、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、FGF2和FGF4。根据具体实施例，所述培养基包含血清。

根据本发明的一些实施例，培养基包含转化生长因子β(TGFβ)。

如本文所用术语“转化生长因子β”或“TGFβ”是指转化生长因子beta(β)的任何同种型，其通过相同的受体信号系统在许多细胞类型中控制增殖、分化和其他功能。TGFβ在诱导转化中起作用，同时也是一种负的自分泌生长因子。

根据本发明的一些实施例，TGFβ包括TGFβ1和/或TGFβ3。

转化生长因子β-1(TGFβ1)是细胞因子转化生长因子β超家族的多肽成员。TGFβ1通常参与许多细胞类型的细胞生长、增殖、分化和凋亡的控制。

在本发明的一些实施例的培养基中使用的TGFβ1可以是纯化的、合成的或重组表达的TGFβ1蛋白(例如人TGFβ1多肽基因库登录号NP_000651.3；例如人TGFβ1多核苷酸基因库登录编号NM_000660)。TGFβ1可从各种商业来源获得，如RayBiotech、BioLegend和ProSciProteins。根据一个具体实施例，TGFβ1从研发系统Cat编号：240-B/CF获得，或来自Peprotech，目录号：100-21。

转化生长因子β-3(TGFβ3)是细胞因子转化生长因子β超家族的多肽成员。TGFβ3通常参与许多细胞类型的增殖、分化和其他功能的控制，在诱导转化和作为负性自分泌生长因子方面发挥作用。

在本发明的一些实施例的培养基中使用的TGFβ3可以是纯化的、合成的或重组表达的TGFβ3蛋白(例如，人TGFβ3多肽基因库登录号NP_003230.1；例如，人TGFβ3多核苷酸基因库登录号NM_003239)。TGFβ3可以从各种商业来源获得，例如Abcam Proteins、BioLegend和ProSci Proteins。根据一个具体实施例，TGFβ3获自R&D systems,Cat.编号：243-B3，或来自Peprotech，目录号：100-36E。

根据具体实施例，转化生长因子β包含由包含符号TGFB1或TGFB3的基因编码的蛋白质。

应当注意，为了制备无异源培养基，TGFβ(例如TGFβ1和/或TGFβ3)优选从人来源纯化或重组表达，如下文进一步描述。

根据本发明的一些实施例，培养基中TGFβ1和/或TGFβ3的浓度在约0.05纳克/毫升至约1微克/毫升的范围内，例如从约0.1纳克/毫升到约1微克/毫升，例如从约0.5纳克/毫升到约100纳克/毫升，例如从约1纳克/毫升到约100纳克/毫升，例如从约1纳克/毫升到约50纳克/毫升，例如从约5纳克/毫升到约50纳克/毫升，例如从约5纳克/毫升到约10纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中TGFβ1和/或TGFβ3的浓度至少为例如约0.1纳克/毫升，至少例如约0.3纳克/毫升，至少例如约0.5纳克/毫升，至少例如约0.7纳克/毫升，至少例如约1纳克/毫升，至少例如约1.2纳克/毫升，至少例如约1.4纳克/毫升，至少例如约1.6纳克/毫升，至少例如约1.8纳克/毫升，至少例如约2纳克/毫升，至少例如约2.5纳克/毫升，至少例如约3纳克/毫升，至少例如约3.5纳克/毫升，至少例如约4纳克/毫升，至少例如约5纳克/毫升，至少例如约6纳克/毫升，至少例如约7纳克/毫升，至少例如约8纳克/毫升，至少例如约9纳克/毫升，至少例如约10纳克/毫升，至少例如约11纳克/毫升，至少例如约12纳克/毫升，至少例如约13纳克/毫升，至少例如约14纳克/毫升，至少例如约15纳克/毫升，至少例如约20纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中TGFβ1和/或TGFβ3的浓度为至多例如约0.5纳克/毫升、至多例如约1纳克/毫升、最多例如约1.5纳克/毫升、最多例如约2纳克/毫升、最多例如约3纳克/毫升、至多例如大约4纳克/毫升、至多例如约5纳克/毫升、至多例如约6纳克/毫升、至多例如约7纳克/毫升、至多例如约10纳克/毫升、至多例如约15纳克/毫升、最多例如约20纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ1的浓度为约1纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ1的浓度为约5纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ1的浓度为约10纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ1的浓度为约20纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ3的浓度为约1纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ3的浓度为约5纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ3的浓度为约10纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中TGFβ3的浓度为约20纳克/毫升。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCOTMKnockoutTM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF4。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2和FGF4。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和TGFβ3。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和TGFβ3。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF4。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和TGFβ3。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2和FGF4。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、TGFβ1和TGFβ3。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、TGFβ1和TGFβ3。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF4。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、TGFβ1和TGFβ3。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2和FGF4。

根据本发明的一些实施例，培养基包含WNT-3a。

如本文所用术语“WNT-3a”是指WNT基因家族的成员。WNT基因家族由编码分泌信号蛋白的结构相关基因组成。这些蛋白质与肿瘤发生和几个发育过程有关，包括胚胎发生过程中细胞命运和模式的调节。

在本发明的一些实施例的培养基中使用的WNT-3a可以是纯化的、合成的或重组表达的WNT-3a蛋白，例如GenBank登录号NP_149122.1，或WNT-3a多核苷酸，例如GenBank登录号NM_033131.3)。WNT-3a多肽可以从各种制造商获得，例如R&D SYSTEMS(例如，目录号5036-WN-010、5036-WN/CF)。

根据具体实施例，WNT-3A包含由包含符号WNT3A的基因编码的蛋白质。

根据本发明的一些实施例，培养基还包含WNT-3A的稳定剂，即抑制蛋白酶并稳定多肽WNT-3A的试剂。稳定剂的实例包括但不限于脂质体、胶束等，例如二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(l)'-rac-甘油))(DMPG)和胆固醇，例如在DMPC：DMPG：胆固醇比例为10：1：10的情况下。

根据本发明的一些实施例，培养基中WNT-3A的浓度在约0.1纳克/毫升至约1微克/毫升的范围内，例如约0.1纳克/毫升至约10微克/毫升，例如约0.5纳克/毫升至100纳克/毫升，例如约1纳克/毫升至约100纳克/毫升、例如约10纳克/毫升至200纳克/毫升，如约10纳克/毫升至100纳克/毫升、例如约50纳克/毫升至200纳克/毫升、例如约50纳克/毫升至150纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中WNT-3A的浓度至少为例如约0.5纳克/毫升，例如至少约1纳克/毫升，例如至少约5纳克/毫升，例如至少约10纳克/毫升，例如至少约15纳克/毫升，例如至少约20纳克/毫升，例如至少约25纳克/毫升，例如至少约30纳克/毫升，例如至少约40纳克/毫升，例如至少约50纳克/毫升，例如至少约60纳克/毫升，例如至少约70纳克/毫升，例如至少约80纳克/毫升，例如至少约90纳克/毫升，例如至少约100纳克/毫升，例如至少约120纳克/毫升，例如至少约140纳克/毫升，例如至少约160纳克/毫升，例如至少约180纳克/毫升，例如至少约200纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中WNT-3A的浓度至多例如最多约10纳克/毫升，例如最多约25纳克/毫升，例如最多约50纳克/毫升，例如最多约75纳克/毫升，例如最多约100纳克/毫升，例如最多约125纳克/毫升，例如最多约150纳克/毫升，例如最多约175纳克/毫升，例如最多约200纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中WNT-3A的浓度为约10纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中WNT-3A的浓度为约20纳克/毫升。

根据特定实施例，培养基中WNT-3A的浓度为约200纳克/毫升。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和WNT-3A。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和WNT-3A。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2及/或FGF4。

根据本发明的一些实施例，培养基包含血小板衍生生长因子(PDGF)。

如本文所用术语“血小板衍生生长因子”或“PDGF”是指通过两种不同受体激活细胞反应的PDGF的四种不同亚型中的任何一种。这些亚型包括A(被观察为命名为PDGF-AA的同源二聚体，并且作为与B亚型命名为PDGF-AB的异二聚体的一部分)、B(被观察作为命名为PDGF-BB的同源二聚体，并且被观察作为与A亚型命名的PDGF-AB的异二聚体)、C(被观察到作为命名为PD GF-CC的同源二聚体)和D(被观察成为命名为PDF-DD的同源二聚体)。

根据特定实施例，用于本发明一些实施例的培养基中的PDGF是PDGF-BB。

用于本发明一些实施例的培养基中的PDGF可以是纯化的、合成的或重组表达的PDGF蛋白(例如，人PDGF B亚基多肽GenBank登录号NP_148937.1或NP_002599.1；例如人PDGF B亚基多核苷酸GenBank登录号NM_002608或NM_033016；例如人PDGF亚基A多肽GenBank登录号NP_002598.4或NP_148983.1；例如，人PDGF亚基A多核苷酸GenBank登录号NM_033023)。PDGF可以从各种商业来源获得，例如RayBiotech、Abcam Proteins和ProSciProteins。根据一个实施例，PDGF获自Peprotech(目录号：100-14B)。

根据具体实施例，血小板衍生生长因子包含由包含符号PDGFB的基因编码的蛋白质。

应当注意，为了制备无异源培养基，PDGF优选从人来源纯化或重组表达，如下文进一步描述。

根据本发明的一些实施例，培养基中PDGF的浓度在约0.05纳克/毫升至约1微克/毫升的范围内，例如约0.1纳克/毫升至约1微克/毫升，例如约0.5纳克/毫升至约100纳克/毫升，例如约1纳克/毫升至约100纳克/毫升，例如约1纳克/毫升至约50纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约50纳克/毫升，例如约5纳克/毫升至约100纳克/毫升，例如约10纳克/毫升至约50纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中PDGF的浓度至少是例如约0.5纳克/毫升，例如至少约1纳克/毫升，例如至少约2.5纳克/毫升，例如至少约5纳克/毫升，例如至少约7.5纳克/毫升，例如至少约10纳克/毫升，例如至少约15纳克/毫升，例如至少约20纳克/毫升，例如至少约25纳克/毫升，例如至少约30纳克/毫升，例如至少约40纳克/毫升，例如至少约50纳克/毫升，例如至少约60纳克/毫升，例如至少约70纳克/毫升，例如至少约80纳克/毫升，例如至少约90纳克/毫升，例如至少约100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中PDGF的浓度最多为例如约1纳克/毫升，最多为例如约5纳克/毫升，最多为例如约10纳克/毫升，最多为例如约15纳克/毫升，最多为例如约20纳克/毫升，最多为例如约25纳克/毫升，最多为例如约50纳克/毫升，最多为例如约75纳克/毫升，最多为例如约100纳克/毫升。

根据具体实施例，培养基中PDGF(例如PDGF-BB)的浓度为约5纳克/毫升。

根据具体实施例，培养基中PDGF(例如PDGF-BB)的浓度为约10纳克/毫升。

根据具体实施例，培养基中PDGF(例如PDGF-BB)的浓度为约25纳克/毫升。

根据具体实施例，培养基中PDGF(例如PDGF-BB)的浓度为约50纳克/毫升。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和PDGF(例如PDGF-BB)。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2。根据一个具体实施例，所述培养基包含TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基包含TGFβ3。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和PDGF(例如PDGF-BB)。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF4。根据一个具体实施例，所述培养基包含TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基包含TGFβ3。

根据一个实施例，培养基包含基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和PDGF(例如PDGF-BB)。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包含FGF2和FGF4。根据一个具体实施例，所述培养基包含TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基包含TGFβ3。

根据本发明的一些实施例，培养基包含表皮生长因子(EGF)。

如本文所用术语“表皮生长因子”或“EGF”是指刺激细胞生长和分化的表皮生长因子(EGF)蛋白家族或其变体的任何多肽。通常，EGF通过结合表皮生长因子受体发挥其活性。

因此，维持其生物活性的EGF分子的任何变体；例如C末端截短分子(Calnan等人，Gut 2000，47:622-627)；或N末端截短的分子(Svodoca等人，Biochim.Biophys.Acta19941206:35-41；Shin等人，Peptides 199516:205-210)可根据本揭示的教示使用。

用于本发明一些实施例的培养基中的EGF可以是纯化的、合成的或重组表达的EGF蛋白(例如，人EGF多肽GenBank登录号NP_001954.2、NP_001171602.1、NP_001343950.1或NP_001171601.1；例如，人EGF多核苷酸GenBank登录号NM_001963NM_001963)。EGF可以从各种商业来源获得，例如RayBiotech、Abcam Proteins和ProSci Proteins。根据一种实施例，EGF获自Peprotech(Cat：AF-100-15)。

根据一个具体实施例，表皮生长因子包含由包含符号EGF的基因编码的蛋白质。

应当注意，为了制备无异源培养基，EGF优选从人来源纯化或重组表达，如下文进一步描述的。

根据本发明的一些实施例，培养基中EGF的浓度在约0.05纳克/毫升至约1微克/毫升的范围内，例如从约0.1纳克/毫升至约1微克/毫升，例如从约0.5纳克/毫升至约100纳克/毫升，例如从约1纳克/毫升至约100纳克/毫升，例如从约1纳克/毫升至约50纳克/毫升，例如从约5纳克/毫升至约50纳克/毫升，例如从约10纳克/毫升至约50纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中EGF的浓度至少为例如约0.5纳克/毫升，至少为例如约1纳克/毫升，至少为例如约2.5纳克/毫升，至少为例如约5纳克/毫升，至少为例如约7.5纳克/毫升，至少为例如约10纳克/毫升，至少为例如约15纳克/毫升，至少为例如约20纳克/毫升，至少为例如约25纳克/毫升，至少为例如约30纳克/毫升，至少为例如约40纳克/毫升，至少为例如约50纳克/毫升，至少为例如约60纳克/毫升，至少为例如约70纳克/毫升，至少为例如约80纳克/毫升，至少为例如约90纳克/毫升，至少为例如约100纳克/毫升。

根据本发明的一些实施例，培养基中EGF的浓度至多为例如约1纳克/毫升，至多为例如约5纳克/毫升，至多为例如约10纳克/毫升，至多为例如约15纳克/毫升，至多为例如约20纳克/毫升，至多为例如约25纳克/毫升，至多为例如约50纳克/毫升，至多为例如约75纳克/毫升，至多为例如约100纳克/毫升。

根据一个具体实施例，培养基中EGF的浓度为约1纳克/毫升。

根据一个具体实施例，培养基中EGF的浓度为约10纳克/毫升。

根据一个具体实施例，培养基中EGF的浓度为约25纳克/毫升。

根据一个具体实施例，培养基中EGF的浓度为约50纳克/毫升。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCOTMKnockoutTM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和EGF。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包括FGF2。根据一个具体实施例，所述培养基包括TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基包括TGFβ3。根据一个具体实施方案，所述培养基包括PDGF(例如PDGF-BB)。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和EGF。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包括FGF4。根据一个具体实施例，所述培养基包括TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基包括TGFβ3。根据一个具体实施方案，所述培养基包括PDGF(例如PDGF-BB)。

根据一个实施例，培养基包括基础培养基DMEM/F12、GIBCO^TM Knockout^TM血清替代物(KoSR)、ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和EGF。根据一个具体实施例，所述培养基是无血清的。根据一个具体实施例，所述培养基包括FGF2和FGF4。根据一个具体实施例，所述培养基包括TGFβ1。根据一个具体实施例，所述培养基包括TGFβ3。根据一个具体实施方案，所述培养基包括PDGF(例如PDGF-BB)。

根据本发明的一些实施例，培养基还包括L-谷氨酰胺。培养基中L-谷氨酰胺的浓度可以为约0.5毫摩尔(mM)至约10毫摩尔，例如约0.1至5毫摩尔，例如约1至5毫摩尔，例如约2至5毫摩尔，例如1毫摩尔，例如2毫米。L-谷氨酰胺可以从不同的供应商处获得，例如Biological Industries,Beit HaEmek,Israel。

根据本发明的一些实施例，培养基还包括非必需氨基酸(NEAA)。非必需氨基酸可作为10毫摩尔的储备液从各种供应商处获得，例如Invitrogen Corporation products,Grand Island NY,USA。培养基中非必需氨基酸的浓度可为约0.1至10％，例如约0.2至5％，例如约0.5至2％，例如约1％，例如约0.5％。

根据本发明的一些实施例，培养基进一步包括浓度范围在约0.01-1之间，例如0.05毫摩尔，例如0.1毫摩尔的还原剂，例如β-巯基乙醇(β-巯基乙醇)。β-巯基乙醇可从各种供应商处获得，例如Gibco。

根据本发明的一些实施例，培养基进一步包括抗生素以控制细菌和真菌污染物的生长。根据一个实施例，青霉素-链霉素溶液可以例如从Life Technologies或MilliporeSigma获得。培养基中青霉素的浓度可为约5至100单位/毫升，例如10至75单位/毫升，如50单位/毫升。培养基中链霉素的浓度可为约0.01至1毫克/毫升，例如0.01至0.1毫克/毫升，如0.05毫克/毫升。

根据具体实施例，培养基是如下表1A中所列的MSC-Diff 0-F12。

根据具体实施例，培养基是如下表1B中所列的MSC-Diff 0-HG。

根据具体实施方案，培养基是如下表2中所列的MSC-Diff 1-15。

根据一个具体的实施例，培养基是MSC-Diff 16-34或MSC-Diff 40-50，如下表3所示。

根据一个具体实施例，培养基是如下表5A中所列的MSC-Diff 35。

根据一个具体实施例，培养基是如下表5B中所列的MSC-Diff 51。

根据一个具体实施例，培养基是如下表5C中所列的MSC-Diff 52。

根据一个具体实施例，培养基是如下表6中所列的MSC-Diff 36。

根据一个具体实施例，培养基是如下表7中所列的MSC-Diff 37。

根据一个具体实施例，培养基是如下表8中所列的MSC-Diff 38。

根据一个具体实施例，培养基是如下表9中所列的MSC-Diff 39。

根据一个具体实施例，培养基如下表11A所示。

根据一个具体实施例，如表11A中所列的培养基进一步包含表11B中所列组分中的至少一种组分。

根据一个具体实施例，培养基如下表12A至12B中所列。

表11A：培养基

表11B：培养基组分

葡萄糖	1-5克/升
		L-抗坏血酸	20-200微克/毫升
丙酮酸钠	20-200微克/毫升

表12A：培养基

表12B：培养基

根据一个具体实施例，所述培养基是成分确定的培养基，其包括基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度为至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度为至少大约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。根据一个具体实施例，所述培养基进一步包含浓度至少约1纳克/毫升的bFGF(例如FGF2)。

根据一个具体实施例，所述培养基是成分确定的培养基，其包括基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度为至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度为至少大约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和浓度至少为25微克/毫升的L-抗坏血酸，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据一个具体实施例，所述培养基是成分确定的培养基，其包括基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度为至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度为至少大约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、浓度至少为25微克/毫升的L-抗坏血酸以及浓度至少为25微克/毫升的丙酮酸钠，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据一个具体实施例，所述培养基是成分确定的培养基，其包括基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度为至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度为至少大约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、浓度至少为4克/升的葡萄糖、浓度至少为25微克/毫升的L-抗坏血酸以及浓度至少为25微克/毫升的丙酮酸钠，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据一个具体实施例，所述培养基是成分确定的培养基，其包括基础培养基，所述基础培养基包括DMEM HG(高葡萄糖)、浓度为至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度为至少大约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)浓度至少为25微克/毫升的L-抗坏血酸以及浓度至少为25微克/毫升的丙酮酸钠，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据一个具体实施例，所述培养基包括基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，所述DMEM/F12与MEMα的体积比在在0.6至1.5之间；浓度为至少约3％的敲除血清替代物(KoSR)；浓度为大约0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和浓度为至少大约5％的血清；并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

根据一个具体实施例，所述培养基包括基础培养基，所述基础培养基包括浓度至少为约0.1％的MEMαITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和浓度至少约5％的血清，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)。

根据一个具体实施例，所述培养基包括基础培养基，所述基础培养基包括浓度至少为约0.1％的MEMαITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和浓度至少约20％的血清，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)。

如上所述，本发明培养基中使用的任何蛋白质因子[例如，bFGF(例如FGF2、FGF4)、EGF、PDGF(例如PDGF-BB)、TGFβ1、TGFα3、WNT-3A、胰岛素、硒、白蛋白、转铁蛋白)都可以重组表达或生物化学合成。此外，天然存在的蛋白质因子(例如bFGF、EGF、PDGF、WNT-3A和TGFβ)可以使用本领域公知的方法从生物样品(例如，从人血清、细胞培养物)中纯化。应该注意的是，为了制备无动物污染物的培养基，蛋白质因子优选从人来源纯化或重组表达。

可以使用标准固相技术进行本发明蛋白质因子的生化合成。这些方法包括专有固相合成法、部分固相合成法、片段缩合法和经典溶液合成法。

本发明蛋白质因子的重组表达可使用重组技术产生，如Bitter等人(1987)Methods in Enzymol 153:516-544；Studier等人(1990)《酶学方法》185:60-89；Brisson等人(1984)自然期刊310:511-514；Takamatsu等人(1987)EMBO J.6:307-311；Coruzzi等人(1984)胚胎学期刊J.3:1671-1680；Brogli等人，(1984)科学期刊224:838-843；Gurley等人(1986)分子生物学6:559-565；和Weissbach和Weissbach，1988，植物分子生物学方法，学术出版社，纽约，第八节，第421-463页所述，通过引用将其全部并入本文。

如上所述，本发明的一些实施例的培养基能够促进MSCs的增生。

根据一个目的，本发明提供了一种在无分化的情况下增生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在本发明的一些实施例的培养基中培养MSCs，从而在允许MSCs无分化扩增的培养条件下培养MSCs(即分化为特殊类型的细胞，例如脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞)。

如本文所用，术语“扩增”或“增生”是指在培养期间增加MSCs的数量(至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多)。应当理解，可以从单个MSC获得的MSCs的数量取决于MSC的增殖能力。一个MSC的增殖能力可以通过细胞的倍增时间(即细胞在培养物中进行有丝分裂所需的时间)和间充质干细胞培养物可以维持在未分化状态的时间来计算(这相当于传代次数乘以每次传代之间的天数)。

根据一些实施例，本发明的方法使得单个MSC(例如，BM衍生的MSC、UC衍生的MSC和PSC衍生的MSC)能够在2D培养中在7-15天内扩增至少约5-50倍(例如15-20倍)(如下文进一步讨论的)。

根据一些实施例，本发明的方法使得单个MSC(例如，BM衍生MSC、UC衍生MSC、PSC衍生MSC)能够在15-25天(例如，20天)内在3D培养中扩增至少约100-1000倍(例如，500-700倍)(如下文进一步讨论的)。

例如，如以下实施例部分所述，当在2D贴壁培养(有或没有涂层)或悬浮(3D)培养中培养时，在MSC培养基(例如在下面表1-3中描述的MSC-Diff 0-35或MSC-Diff 40-42培养基中的每一个中)的存在下，MSCs可以保持在增殖、多能和未分化状态至少5-25代。鉴于每次传代每3-7天发生一次，MSCs可以维持约125-175天(即约3000-4200小时)。假定MSC倍增时间为25至250小时，在这些条件下培养的单个MSC可扩增至6x10⁷至1.2x10⁸个MSCs。

根据一个实施例，MSCs可以在二维(2D)培养中培养。

本文所用术语“二维培养”或“2D培养”是指细胞在通常由塑料制成的平皿(例如聚苯乙烯细胞培养板)上生长。

2D培养可以包括细胞可以粘附和扩散的涂覆表面。用于涂覆适合于MSCs扩增的2D培养表面的示例性材料包括但不限于细胞外基质(ECM)蛋白或其他市售细胞粘附因子，例如粘附蛋白，例如纤连蛋白(FN)或玻连蛋白(VN)，以及其他涂覆蛋白，例如层粘连蛋白(LN)、I型胶原(COL I)、IV型胶原(COL IV)和明胶。在Cimino等人的干细胞国际期刊(2017)文章ID 6597815中讨论了用于MSCs的2D培养物的其他涂覆策略，所述文章通过引用并入本文。根据一个实施例，2D培养物没有被涂覆。

根据一个实施例，在2D培养物中培养MSCs受到将MSCs接种在培养板中的细胞密度的影响，所述细胞密度促进细胞存活和增殖但限制分化。通常，使用约4x10³个细胞/厘米平方至约2x10⁴个细胞/厘米平方的铺板密度(或接种密度)。为了在2D培养中为MSCs提供充足和持续的营养和生长因子供应，可以每天更换培养基，或者按照预定的时间表，例如每2-7天(例如2-3天)。例如，当细胞在2D培养中生长并粘附在平板上时，可以通过从培养皿中吸取培养基并添加新鲜培养基来更换培养基。

根据一个实施例，可以在三维(3D)培养中培养MSCs。

本文所用术语“三维培养”或“3D培养”是指细胞在三个维度(即宽度、深度和高度)上相对于彼此定位的细胞培养。

根据一个实施例，3D培养是悬浮培养。

如本文所用术语“悬浮培养”是指细胞悬浮在培养基中而不是粘附在表面上的培养。

根据本发明的一些实施例，用于在悬浮液中培养间充质干细胞的条件是没有基质粘附，例如没有粘附到外部基质，例如细胞外基质、玻璃微载体或珠(例如无载体悬浮培养)的组分。

根据本发明的一些实施例，悬浮培养物中的至少一些MSCs(例如成体MSCs)粘附到容器表面。

根据本发明的一些实施例的方法在悬浮培养物中培养MSCs受到在培养容器中以促进细胞存活和增殖但限制分化的细胞密度接种MSCs的影响。通常，使用约1x10⁵个细胞/毫升至约3x10⁶个细胞/毫升的铺板密度(或接种密度)。当使用生物反应器时，使用类似的浓度(如下所述)。

为了在悬浮培养中为MSCs提供充足和恒定的营养素和生长因子供应，培养基可以每天更换，或者以预定的时间表更换，例如每2-7天(例如2-3天)更换一次。例如，可以通过使MSC悬浮培养物在300-400g下离心约3分钟并将形成的MSC颗粒再悬浮在新鲜培养基中来进行培养基的更换。附加地或替代地，可以使用培养基经受恒定过滤或透析以向MSCs提供恒定的营养或生长因子供应的培养系统。

根据本发明一些实施例的方法，用于悬浮培养MSCs的培养容器可以是任何组织培养容器(例如，具有适合培养MSCs的纯度等级)。优选地，为了获得可增生的培养物，使用受控的培养系统(优选地计算机控制的培养系统)进行根据本发明的一些实施例的培养，其中使用合适的设备自动调节培养参数，例如温度、搅拌、pH和pO₂。一旦记录了培养参数，系统被设置为根据多能干细胞增生的需要自动调节培养参数。

根据本发明的一些实施例，培养在包括动态悬浮培养的条件下进行。

本文所用术语“动态悬浮培养”是指细胞在悬浮培养中不断运动的条件。下面将进一步讨论这些条件。

根据一个实施例，动态悬浮培养利用波动反应器、搅拌反应器或转瓶(例如玻璃转瓶)。

根据本发明的一些实施例，培养在包括静态(即非动态)悬浮培养的条件下进行。

本文所用术语“静态悬浮培养”是指细胞在悬浮培养中处于静止状态的条件。下文将进一步讨论此类条件。

根据一个实施例，静态悬浮培养使用烧瓶(例如锥形瓶)或培养皿(可从例如德国弗里肯豪森的格赖纳获得)。

如本文所用术语“传代”或“代”是指将培养容器中的细胞分到2个或更多个培养容器中，通常包括添加新鲜培养基。当细胞在培养物中达到一定密度时，通常会进行传代。

根据本发明的一些实施例，当细胞浓度增加至约2或3倍(例如，浓度约为2x10⁶–3x10⁶细胞/毫升)，但不超过约4倍(例如浓度约为4x10⁶细胞/毫升)时，在2D培养系统下以约1x10⁶细胞/毫升的浓度接种的MSC培养的传代被进行。

根据本发明的一些实施例，当细胞浓度增加至约2或3倍(例如，浓度约为2x10⁶–3x10⁶细胞/毫升)，但不超过约4倍(例如浓度约为4x10⁶细胞/毫升)时，在静态3D培养系统(即非动态)下以约1x10⁶细胞/毫升的浓度接种的MSC培养的传代被进行。

根据本发明的一些实施例，当细胞浓度增加约20至40倍(例如，浓度约为20x10⁶–40x10⁶细胞/毫升)，但不超过约50倍(例如浓度约为50x10⁶细胞/毫升)时，在动态3D培养系统(例如，在旋转瓶中)下进行以约1x10⁶细胞/毫升的浓度被接种的MSC培养的传代。

根据本发明的一些实施例，培养基能够维持MSCs处于增殖、多能和未分化状态至少约2代、至少约5代、至少约10代、至少约15代、至少约20代、至少约25代、至少约30代、至少约35代、至少约40代、至少约45代、至少约50代及更多代。

根据具体实施例，培养基能够维持MSCs处于增殖、多能和未分化状态2-50代，例如5-40代，例如5-30代，例如5-25代，例如5-20代，例如5-15代，例如5-10代，例如10-30代，例如10-20代，例如10-15代，例如15-30代，例如15-25代，例如15-20代，例如20-40代，例如20-30代，例如20-25代，例如30-40代，例如40-50代。

根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施方式的细胞培养中包含的MSCs在培养期间表现出稳定的核型(染色体稳定性)，例如至少2代，例如至少4代，例如至少8代，例如至少15代，例如至少20代，例如至少25代，例如至少30代，例如至少35代，例如至少40代，例如至少45代，例如至少50代。

根据本发明的一些实施例，MSCs培养不超过约10代、约15代、约20代、约25代、约30代或约35代。

根据本发明的一些实施例，本发明的细胞培养物将MSCs维持在非致瘤性、遗传稳定状态。

根据本发明的一些实施例，本发明的细胞培养物的特征在于具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％，例如至少70％，例如至少80％例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的未分化多能间充质干细胞。

根据本发明的一些实施例，根据所述方法扩增的MSCs能够分化成脂肪形成谱系、成骨细胞谱系和软骨形成谱系中的任何一种。

如上所述，本发明一些实施例的培养基能够促进PSCs分化为MSCs。

本文所用术语“分化”或“正在分化”是一个相对术语，指的是细胞(例如多能干细胞)在发育途径中进一步发展的发育过程。因此，在一些实施方案中，多能干细胞(PSC)可以分化成多能间充质干细胞。

根据一个目的，本发明提供了一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在适合的培养条件下在本发明的一些实施例的培养基中在适合于将PSCs分化为MSCs的培养条件下培养PSCs，从而产生MSCs。

根据一个目的，本发明提供了一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在适合PSCs分化为MSCs的培养条件下，在包含基础培养基的培养基中以悬浮培养物培养PSCs，所述基础培养基包含MEMα、血清和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，从而产生MSCs。

根据一个目的，本发明提供了一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，所述方法包括在适合PSCs分化为MSCs的培养条件下，在培养基中以悬浮培养物培养PSCs，培养基包含基础培养基，基础培养基包含MEMα、浓度至少为5％的血清和浓度至少为1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，从而产生MSCs。

根据一个实施例，PSCs的培养在悬浮培养(即3D培养，如上所述)中受到影响。

根据本发明的一些实施例，悬浮培养多能干细胞的条件没有基质粘附，例如，没有粘附到外部基质，例如细胞外基质的组分、玻璃微载体或珠子。

应该注意的是，培养多能干细胞(如hESCs和iPS细胞)的一些方案包括在半透水性水凝胶膜内对细胞进行微胶囊化，这允许与胶囊周围的散装培养基交换营养物质、气体和代谢产物(有关详细信息，请参见比尔兹利等人的美国专利申请号US20090029462)。

根据本发明的一些实施例，在悬浮培养物中培养的多能干细胞没有细胞包囊。

根据本发明的一些实施例，培养基和/或用于在悬浮液中培养多能干细胞的环境下不具有蛋白质载体，即不具有一种蛋白质，其作用是将蛋白质或营养物质转移到培养物中的细胞。这样的蛋白质载体可以是例如白蛋白(例如，牛血清白蛋白)、白蛋白(富含脂质的白蛋白)或血浆(人血浆分离的蛋白质)。由于这些载体源自人类或动物来源，因此它们在人类iPS细胞培养物的hESC中的使用受到批次特异性差异和/或暴露于病原体的限制。因此，不含蛋白质载体(例如，白蛋白)的培养基是非常有利的，因为它能够实现真正成分确定的培养基，所述培养基可以由重组或合成材料制造。

根据本发明的一些实施例的方法在悬浮培养物中培养PSCs受到以促进细胞分化的细胞密度将多能干细胞铺板在培养容器中的影响。通常，使用约1x10⁵个细胞/毫升至约3x10⁶个细胞/毫升的铺板密度(或接种密度)。当使用生物反应器时使用类似的浓度。应当理解，虽然通常接种干细胞的单细胞悬液，但是也可以使用小的细胞团如10-200个细胞。

为了给悬浮培养的多能干细胞提供充足和持续的营养和生长因子供应，培养基可以每天更换，或者按照预先确定的时间表，例如每2-3天更换一次。例如，培养基的更换可以通过将多能干细胞悬浮培养物以300-400g离心约3分钟，并将形成的多能干细胞沉淀物再悬浮于新鲜培养基中来进行。附加地或替代地，可以使用培养基经受恒定过滤或透析以向多能干细胞提供恒定的营养或生长因子供应的培养系统。

根据本发明的一些实施例的方法，用于悬浮培养多能干细胞的培养容器可以是任何组织培养容器(例如，具有适合培养多能干细胞的纯度等级)，其内表面被设计成使得其中培养的多能干细胞不能粘附或附着到这样的表面上(例如，非组织培养处理，以防止细胞附着或附着到表面上)。优选地，为了获得可增生的培养物，根据本发明的一些实施例的培养使用受控培养系统(优选计算机控制的培养系统)进行，其中培养参数例如温度、搅拌、pH和pO2是自动调节的。使用合适的设备进行。一旦培养参数被记录下来，系统就会设置为根据多能干细胞扩增的需要自动调整培养参数。

根据本发明的一些实施例，培养在包括静态(即非动态)悬浮培养的条件下进行。

对于多能干细胞的非动态培养，多能干细胞可以在无涂层的58毫米皮氏培养皿(Greiner，Frickenhausen，Germany)中培养。例如，为了在58毫米培养皿上启动悬浮培养，多能干细胞以1x10⁶–5x10⁶个细胞/培养皿的细胞密度接种。

根据本发明的一些实施例，培养在包括动态悬浮培养的条件下进行(例如，使用波浪反应器或搅拌反应器)。对于多能干细胞的动态培养，多能干细胞可在旋转烧瓶中培养[例如，200毫升至1000毫升，例如250毫升，可从德国弗恩瓦尔德Integra Biosciences的CellSpin获得；100毫升，可从新泽西州Vineland的Bellco获得；或125毫升Erlenmeyer(Corning Incorporated，Corning NY，USA)]，其可连接到控制单元并因此呈现受控培养系统。连续摇动培养容器(例如旋转烧瓶、锥形瓶)。根据本发明的一些实施例，使用磁性板以40-110转/分钟(rpm)摇动培养容器并将其放置在培养箱中。

此外，或备选地，可以使用摇床(S3.02.10L，ELMI ltd，Riga，Latvia)摇动培养皿。根据本发明的一些实施例，培养基每1-3天更换一次，例如每天更换一次。根据本发明的一些实施例，通过叶轮搅拌培养基并可用于在培养基中动态培养多能干细胞的其他合适的受控生物反应器包括

Aplus细胞培养物(Sartorius North America，Edgewood，New York，USA)，Cell Optimizer控制的生物反应器(Wheaton Science Products，Millville，NJ，USA)，配有Cell Lift叶轮(Infors HT，Rittergasse，Switzerland)、Informs HT Multifors搅拌反应器(Informs GA，CH-4103 Bottomingen Switzerland.)。

另外或替代地，多能干细胞的动态培养可以使用受控生物反应器实现，其中细胞的动态通过波浪状运动实现，例如

Cultibag RM(Sartorius North America，Edgewood，New York，USA)(2个波浪，1个波浪)。反应器参数可以包括倾斜速度：10-16转/分钟(rpm)；角度7°；温度：37℃，PH:7-7.4，O2浓度：50％。另一种合适的生物反应器是WavePod系统20/50EH5Wave bioreactor(GE Healthcare，USA)，其在使用相同参数的同时，能够在12天内增加70倍。另外合适的生物反应器是55ml RWV/STLV生物反应器，其允许反应器内的最小剪切力(Synthecon Incorporated，Houston，TX，USA)。

例如，为了在动态条件下启动悬浮培养，以约10⁴-10⁶个细胞/毫升的浓度接种多能干细胞。

在动态悬浮培养中，多能干细胞可以通过分离细胞团(如下所述)每5-7天传代一次。由于生物反应器具有大容量，因此细胞培养不需要进一步分裂成额外的培养容器，并且每3-10天只能用新鲜培养基添加和/或替换培养基。

根据本发明的一些实施例，PSCs的悬浮培养物包括团块。

如本文所用术语“团块”是指悬浮液中相互粘附的细胞簇。

根据本发明的一些实施例，当悬浮培养的培养基发生变化(例如，增加、减少或更换)时，细胞团块保持完整，而无需对团块进行任何机械或酶促分解。

根据本发明的一些实施例，每个多能干细胞团块包含至少约250个细胞(例如约250个)，例如至少约500个细胞(例如约500个)，至少约600个细胞(例如约600个)，至少约700个细胞(例如约700个)、至少约800个细胞(例如约800个)、至少约900个细胞(例如约900个)、至少约1000个细胞(例如约1000个)、至少约1100个细胞(例如约1100个)，至少约1200个细胞(例如约1200个)，至少约1300个细胞(例如约1300个)，至少约1400个细胞(例如约1400个)，至少约1500个细胞(例如约1500个)，至少约5x10³个细胞(例如约5x10³个)，至少约1x10⁴个细胞(例如，约1x10⁴个)，至少约5x10⁴个细胞(例如约5x10⁴个)，至少约1x10⁵个细胞(例如约1x10⁵个)或更多。

根据本发明的一些实施例，当细胞浓度增加至约2或3倍(例如，浓度约为2x10⁶–3x10⁶细胞/毫升)，但不超过约4倍(例如浓度约为4x10⁶细胞/毫升)时，在静态3D培养系统(即非动态)下以约1x10⁶细胞/毫升的浓度接种的细胞培养的传代被进行。

根据本发明的一些实施例，当细胞浓度增加约20至40倍(例如，浓度约为20x10⁶–40x10⁶细胞/毫升)，但不超过约50倍(例如浓度约为50x10⁶细胞/毫升)时，在动态3D培养系统(例如，在旋转瓶中)下进行以约1x10⁶细胞/毫升的浓度被接种的细胞培养的传代。

根据本发明的一些实施例，传代不一定需要细胞培养物中细胞团的分离。

根据本发明的一些实施例，悬浮培养物不含团块。

根据本发明的一些实施例，悬浮培养物包含多个单细胞。

如本文所用术语“单细胞”是指多能干细胞在悬浮培养物中不形成细胞簇(即每个单细胞簇包含多于约250个多能干细胞)的状态。

根据本发明的一些实施例，多能干细胞不形成细胞簇，每个单细胞簇包含不超过约200、约150、约100、约90、约80、约70、约60、约50、约40、约30、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约3、约2、或约1个多能干细胞。

根据本发明的一些实施例，当处于悬浮培养中时，多个多能干细胞中的每一个都不粘附于另一个多能干细胞。

根据一个实施例，通过机械分离将多能干细胞团块分离成单个细胞，即通过使用物理力而不是酶活性。

对于机械分离，可通过在少量培养基(例如，0.2-1ml)中上下吸移细胞来分离多能干细胞的颗粒(其可通过细胞离心来实现)或分离的多能干细胞团块。例如，可以使用200微升或1000微升移液器的吸头进行多次移液(例如3-20次)。

附加地或替代地，大的多能干细胞团块的机械分离可使用设计成将团块破碎至预定大小的装置进行。这种装置可从瑞典CellArtis Goteborg获得。另外或替代地，可以使用诸如27g针(BD Microlance，Drogeda，Ireland)的针手动执行机械分离，同时在倒置显微镜下观察团块。

根据一个实施例，通过酶促解离(例如通过胰蛋白酶、弹性蛋白酶和/或胶原酶)将多能干细胞团块分离成单个细胞。

根据本发明的一些实施例，在没有酶解的条件下进行传代。

根据本发明的一些实施例，悬浮培养在没有细胞簇/团块的酶促解离的条件下进行。

根据本发明的一些实施例，培养条件不使用抗细胞凋亡剂。

根据本发明的一些实施例，用抗凋亡剂例如Rho相关激酶(ROCK)抑制剂影响培养条件。ROCK抑制剂可从EMD Biosciences，Inc.La Jolla，CA，USA等公司购得。

根据一个实施例，当悬浮培养物中的多能干细胞在没有细胞簇的酶促解离的情况下机械传代至少约2代且不超过约10代时，多能干细胞采用细胞生长的单细胞模式(即，它们扩展为多个单细胞而不是细胞团块)，并且在不需要细胞簇进一步解离的情况下生长至少约15、20或25次额外传代(如先前在PCT公开号WO/2012/032521中所讨论的)。

根据本发明的一些实施例，在未分化多能状态下进行培养至少一代，至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代、至少10代、至少11代、至少12代、至少13代、至少14代、至少15代、至少16代、至少17代、至少18代、至少19代、至少20代。

应当注意，虽然细胞作为多个单个细胞培养，但当细胞浓度超过每毫升约1x10⁶个细胞(例如每5毫升培养皿5x10⁶个)时，它们仍需要稀释。

根据一个实施例，多能干细胞分化为间充质干细胞的过程需要3-30天，例如大约3-21天，例如大约3-18天，例如大约3-14天，例如大约3-12天，例如大约3-10天，例如大约3-7天，例如大约3-5天，例如大约5-21天，例如大约5-14天，例如大约5-10天，例如大约5-7天，例如大约7-21天，例如大约7-14天，例如大约7-12天，例如大约7-10天，例如大约10-21天，例如大约10-14天，

根据一个实施例，多能干细胞分化为间充质干细胞的过程需要约3天、约5天、约7天、约10天、约12天、约14天、约17天、约19天、约21天、约24天，约27天，约30天。

根据一个实施例，多能干细胞分化为间充质干细胞的过程长达约5天、约7天、约10天、约12天、约14天、约17天、约19天、约21天、约24天、约27天、约30天。

根据特定实施例，多能干细胞分化为间充质干细胞的过程约3-14天(例如约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天)。

根据特定实施例，多能干细胞分化为间充质干细胞的过程约3-10天(例如约3、4、5、6、7、8、9、10天)。

根据特定实施例，多能干细胞分化为间充质干细胞的过程约3-5天(例如约3、4、5天)。

可以使用本领域已知的任何方法来确定多能干细胞已经分化为间充质干细胞。例如，通过使用例如FACS分析测定细胞表面标记物的表达(如下所述)。附加地或替代地，可以在体外和体内进行功能测定，特别是与干细胞产生多个分化子代的能力有关的测定、对标准WNT信号的响应性测定等。

根据一个实施例，MSCs的特征在于细胞表面的表达例如CD54、CD9、CD29、CD44、CD56、CD61、CD63、CD71、CD73、CD90、CD97、CD98、CD99、CD105、CD106、CD112、CD146、CD155、CD166、CD276和/或CD304。根据一个实施例，MSCs的特征在于缺乏例如CD31、CD34、CD20、CD19、CD14和/或CD45的细胞表面表达。根据一个实施例，人MSCs的特征在于不存在CD14和/或CD11b的细胞表面表达；CD19和/或CD79a；或HLA-DR。应当理解，所有标记物可以在单个MSC细胞上表达，或者可替代地，标记物可以表达在不同的MSC细胞上(例如在相同的培养物中)。

根据特定实施例，人MSCs的特征在于CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-细胞的表达特征。

根据一个实施例，至少约20-100％，例如约20-30％，例如约20-40％，例如约20-60％，例如约30-50％，例如约30-70％，例如约40-50％，例如约40-80％，例大约50-60％，例如约50-70％，例如约60-80％，例如约60-90％，例如约70-90％，例如通过本发明的一些实施例的方法产生的约80-100％的MSCs的特征在于CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-表达特征。

根据本发明的一些实施例，至少约30％(例如30％)、至少约35％(例如35％)、至少约40％(例如40％)、至少约45％(例如45％)、至少约50％(例如50％)、至少约55％(例如55％)、至少约60％(例如60％)、至少约65％(例如65％)、至少约70％(例如70％)、至少约75％(例如75％)、至少约80％(例如80％)、至少约81％(例如81％)、至少约82％(例如82％)、至少约83％(例如83％)、至少约84％(例如84％)、至少约85％(例如85％)、至少约86％(例如86％)、至少约87％(例如87％)、至少约88％(例如88％)、至少约89％(例如89％)、至少约90％(例如90％)，至少约91％(例如91％)，至少约92％(例如92％)，至少约93％(例如93％)，至少约94％(例如94％)，至少约95％(例如95％)、至少约96％(例如96％)、至少约97％(例如97％)、至少约98％(例如98％)、至少约99％(例如99％)，例如100％的通过本发明的一些实施例的方法产生的MSCs的特征在于CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-表达特征。

根据一具体的实施例，至少30％的通过本发明的一些实施方案的方法产生的MSCs的特征在于CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-表达特征。

根据一具体的实施例，至少40％的通过本发明的一些实施方案的方法产生的MSCs的特征在于CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-表达特征。

根据一具体的实施例，至少50％的通过本发明的一些实施方案的方法产生的MSCs的特征在于CD105+/CD146+/CD90+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-表达特征。

根据一个实施例，提供了根据本发明一些实施例的方法产生的悬浮培养物中的分离的间充质干细胞(MSCs)群。

根据一个实施例，提供了一种细胞培养物，其包含MSCs和本发明一些实施例的培养基。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包含MSCs和成分确定的培养基，所述培养基包含基础培养基和有效量的敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中培养基是无血清的。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包含MSCs和成分确定的培养基，所述培养基包含基础培养基，基础培养基包含DMEM/F12、浓度至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度至少约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中培养基是无血清的。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包含MSCs和培养基，培养基包含基础培养基，所述基础培养基包含DMEM/F12和MEMα，DMEM/F12与MEMα的体积比在0.4至2.3之间。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包含MSCs和培养基，培养基包含基础培养基，所述基础培养基包含DMEM/F12和MEMα，DMEM/F12与MEMα的体积比在0.6至1.5之间，并包含浓度至少约3％的基因敲除血清替代物(KoSR)，浓度至少约0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，以及浓度至少约5％的血清。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs的和本发明一些实施例的培养基。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs和包括培养基，培养基包括基础培养基，基础培养基具有MEMα、血清和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs的和包含基础培养基的培养基，基础培养基包括MEMα、浓度至少为5％的血清和浓度至少为1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs和成分确定的培养基，所述培养基包括基础培养基和有效量的敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中培养基是无血清的。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs和成分确定的培养基，所述培养基包括基础培养基，基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少约5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度至少约0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中培养基不含血清。根据一个具体实施例，所述培养基进一步包含浓度至少约1纳克/毫升的bFGF(例如FGF2)。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs和培养基，所述培养基包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，DMEM/F12和MEMα的体积比在0.4至2.3之间。

根据一个实施例，本发明提供了一种细胞培养物，其包括PSCs和培养基，所述培养基包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，DMEM/F12和MEMα的体积比在0.6至1.5之间，并包括浓度至少约3％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少约0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)和浓度至少约5％的血清。

本发明一些实施例的间充质干细胞或本发明一些实施例的细胞培养物可用于产生大量(大量生产)蛋白质，例如激素、细胞因子、生长因子和药物。例如，为了产生蛋白质，应该通过转染诱导细胞过度表达蛋白质，并且在扩增后可以从培养基中分离蛋白质。

本发明的一些实施例的间充质干细胞或本发明的某些实施例的细胞培养物可用于筛选影响谱系前体向最终分化细胞分化(例如用于药物筛选)的因素(例如小分子药物、肽、多核苷酸等)或条件(例如培养条件或操作)。例如，可以通过将影响生长的物质、毒素或潜在分化因子添加到培养基中来测试它们。

本发明一些实施例的间充质干细胞或本发明一些实施例的细胞培养物可用于制备疫苗。例如，多能干细胞、间充质干细胞或由其分化的细胞可以用病毒颗粒接种并在合适的培养基中进一步培养直至发生细胞裂解并且新产生的病毒颗粒释放到培养基中。所述细胞可用于生产属于痘病毒家族的减毒病毒，特别是鸭痘病毒、禽痘病毒和牛痘病毒，如天然或重组牛痘病毒[例如，改良牛痘病毒Ankara，如以ATCC编号VR-1508获得的MVA)或其他正痘病毒]。有关更多描述，请参见美国专利申请号US 20040058441，其通过引用完全并入本文。

本发明的一些实施例的多能干细胞或间充质干细胞可以通过使用感兴趣的多核苷酸的感染或转染来进行遗传操作。多核苷酸可以包含在启动子调控下的核酸构建体中。

将多核苷酸引入细胞的方法描述于Sambrook等人，[分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(19891992)]；Ausubel等人，[分子生物学中的当前协议，John Wiley andSons，巴尔的摩，马里兰州(1989)]；Chang等人，[体细胞基因治疗，CRC出版社，密歇根州安娜堡(1995)]；Vega等人，[基因靶向，CRC出版社，Ann Arbor MI(1995)]；载体[分子克隆载体及其用途综述，Butterworths，Boston MA(1988)]和Gilboa等人[生物技术4(6):504-512(1986)]，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质感染、电穿孔和用重组病毒载体感染[例如，使用逆转录病毒、腺病毒(例如，腺病毒衍生载体Ad-TK，Sandmair等人，2000，基因治疗，11：2197-2205)，一种结合逆转录病毒和腺病毒成分的嵌合腺病毒/逆转录病毒载体(Pan等人，癌症信息，184:179-1882002)。还可参见涉及中枢神经系统的载体的美国专利US 4866042，以及用于诱导同源重组的正负选择方法的美国专利US 5464764和US 5487992。

本发明设想了本发明一些实施例的扩增的MSCs和/或分化的MSCs用于治疗需要细胞替代治疗(基于细胞的治疗)的疾病的用途。

例如，间充质细胞可用于治疗骨和软骨缺损、心血管疾病、神经系统疾病和免疫疾病(如Parekkadan和Milwid，《间充质干细胞作为治疗学》，生物工程年度修订期刊，(2010)12:87–117中所述)。

本发明的一些实施例的间充质干细胞可施用于生物体本身，或在药物组合物中，其与合适的载体或赋形剂混合。

如本文所用术语“药物组合物”是指一种或多种本文所述的活性成分与其他化学成分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。

在本文中术语“活性成分”是指负责生物效应的间充质干细胞。

在下文中，可以互换使用的术语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显着刺激并且不会消除所施用的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。这些短语包括佐剂。

本文中术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例但不限于包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物的配制和给药技术可在“雷明顿制药科学”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，其通过引用并入本文。

合适的给药途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠或肠外给药，包括肌肉内、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接脑室内、心内，例如，进入右心室或左心室腔，进入共同冠状动脉，静脉内、腹腔内、鼻内，或眼内注射。

本发明的一些实施例的药物组合物可以通过本领域公知的方法制造，例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包囊、包埋或冻干方法。

因此，根据本发明的一些实施例使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。正确的配方取决于选择的给药途径。

例如，对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中配制，优选在生理兼容的缓冲液中，例如汉克氏溶液、林格氏液或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的。

适用于本发明一些实施例的药物组合物包括其中活性成分以有效实现预期目的的量存在的组合物。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善病症(例如骨和软骨缺陷)的症状或延长接受治疗的受试者的存活的活性成分(间充质干细胞)的量。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

对于本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可从体外和细胞培养测定中估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到期望的浓度或效价。这些信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。

本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过标准药物程序在体外、细胞培养物或实验动物中测定。从这些体外和细胞培养试验以及动物研究中获得的数据可用于制定一系列用于人类的剂量。剂量可根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。确切的制剂、给药途径和剂量可由个体医师根据患者的情况来选择。(参见例如Fingl等人，1975年，“治疗的药理学基础”，Ch.1p.1)。

剂量和间隔可以单独调整以提供足够量的活性成分以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。每种制剂的MEC会有所不同，但可以根据体外数据进行估计。实现MEC所需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测分析可用于测定血浆浓度。根据待治疗病情的严重程度和反应性，给药可以是单次或多次给药，疗程持续数天至数周，或直到治愈或病情减轻。

当然，待施用的组合物的量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。

如果需要，本发明的一些实施例的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可附有给药说明。包装或分配器也可以通过与容器相关的通知来容纳，该通知的格式由管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构对组合物或人类或兽医管理形式的批准。例如，此类通知可以是美国食品和药物管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。还可以制备包含在兼容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并标记为治疗指定病症，如上文进一步详述的。

如本文所用术语“ng”是指纳克。如本文所用术语“pg”是指皮克。如本文所用术语“ml”是指毫升。如本文所用术语“mM”是指毫摩尔。如本文所用术语“μM”是指微摩尔。

如本文所用术语“约”是指±10％。

如本文所用术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。

如本文所用术语“由……组成”是指“包括并限于”。

如本文所用术语“基本上由......组成(consisting essentially of)”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征。

本文所使用的单数型式“一”、“一个”及“至少一”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在。应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。

每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。本文所用术语，第一指示数字及第二指示数字"之间的范围”及第一指示数字"到”第二指示数字"的范围"在本文中可互换使用，并指包括第一指示数字及第二指示数字，及其间的所有分数及整数。

如本文所用的术语「方法(method)」指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学、药理、生物、生化及医学领域从业者所开发。

如本文所用术语“治疗”包括消除、实质上抑制、减缓或逆转病情的进展，实质上改善病情的临床或美学症状，或实质上防止病情的临床症状或美学症状的出现。

可以理解的是，本发明中的特定特征，为清楚起见，在分开的实施例的内文中描述，也可以在单一实施例的组合中提供。相反地，本发明中，为简洁起见，在单一实施例的内文中所描述的各种特征，也可以分开地、或者以任何合适的子组合、或者在适用于本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各种实施例的内文中所描述的特定特征，并不被认为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施例没有那些元素就不起作用。

上文描述的和权利要求书部分要求保护的本发明的各种实施例和方面在以下实施例中得到实验支持。

实施例

现在参考以下实施例，这些实施例与上述描述一起以非限制性方式说明本发明。

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。

这些技术在文献中得到了详尽的解释。例如参见“分子克隆：实验室手册”Sambrook等人(1989)；“分子生物学中的当前协议”卷I-III Ausubel，R.M.，编辑(1994)；Ausubel等人，“分子生物学的当前协议”，John Wiley and Sons，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，《分子克隆实用指南》，John Wiley&Sons，纽约(1988)；沃森等人，“重组DNA”，《美国科学书籍》，纽约；Birren等人(eds)“基因组分析：实验室手册系列”，卷1-4，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；美国专利US 4666828；US 4,683,202；US 4,801,531；US5192659和US 5272057；“细胞生物学：实验室手册”，卷I-III Cellis，J.E.，编辑(1994)；“免疫学中的当前协议”卷I-III Coligan J.E.，编辑(1994)；Stites等人(eds)，“基础和临床免疫学”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“细胞免疫学中的选择方法”，W.H.Freeman和Co.，纽约(1980)；在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定，例如参见美国专利号US 3,791,932；US 3,839,153；US 3,850,752；US 3,850,578；US 3,853,987；US 3,867,517；US 3,879,262；US 3,901,654；US 3,935,074；US3,984,533；US 3,996,345；US 4,034,074；US 4,098,876；US 4,879,219；US 5,011,771和US 5,281,521；“寡核苷酸合成”Gait，M.J.，编辑(1984)；“核酸杂交”Hames，B.D.和HigginsS.J.，eds.(1985)；“转录和翻译”Hames、B.D.和希金斯S.J.，eds.(1984)；“动物细胞培养”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“固定化细胞和酶”IRL出版社(1986)；“分子克隆实用指南”Perbal，B.(1984)和“酶学方法”第1-317卷，学术出版社；“PCR协议：方法和应用指南”，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥(1990)；Marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册”CSHL出版社(1996)；所有这些通过引用并入本文，如同在本文中完全阐述一样。

本文中提供了其他一般参考文献。其中的过程被认为是本领域众所周知的并且是为了读者的方便而提供的。其中包含的所有信息均通过引用并入本文。

一般材料和实验程序

诱导多能干(iPS)细胞系

使用KYOU-DXR0109B人诱导多能干(IPS)细胞[201B7]，ATCC目录号ACS-1023。

DYR0100，人类诱导多能干细胞(iPS)，ATCC，目录号ACS-1011

人类胚胎干细胞(hESC)系

使用I3(TE03)、ESC、女性细胞

间充质干细胞(MSC)系

使用了以下细胞：

hMSC-BM-c PromoCell，目录号C-12974

hMSC-UC-c PromoCell，目录号C-12971。

hMSC-Adipo-c PromoCell，目录号C-12977

三维培养中的细胞培养/间充质分化

hPSCs在悬浮培养(三维，3D)中用无血清培养基培养为细胞聚集体或多个单细胞。细胞聚集体每3-7天通过温和移液进行机械传代或使用胰蛋白酶EDTA(Sigma)或任何等效酶进行酶促传代。

通过将培养基组成从hPSCs生长培养基改为MSC分化培养基来诱导间充质分化(见分化培养基列表，下表6至表9)。细胞每3至7天通过缓慢移液进行机械传代或使用胰蛋白酶EDTA(Sigma)或任何等效酶进行酶促传代。分化2至21天后，检查CD105、CD146、CD73、CD90、CD44、CD31和/或CD45的表面表达。MSC分化通常通过CD105、CD146、CD73、CD90和/或CD44的表达/高表达以及CD31、CD34和/或CD35的低表达/无表达来确定。此外，检查了关键多能性标记物(例如Oct4和Nanog)的表达，表明通过间充质分化丧失了多能性。

从hESC或iPSC分化而来的所得MSC细胞在下文中分别称为“hESC-MSCs”或“iPSC-MSCs”，当在2D贴壁培养中重新铺板时，它们是塑料贴壁的。hESC-MSCs在2D培养中进一步分化为骨细胞、脂肪细胞，在3D颗粒培养中进一步分化为软骨细胞。

脂肪生成分化

将来自3D培养物的hESC-MSCs接种在2D培养物中，并在含有10％FBS和2mM l-谷氨酰胺的DMEM F-12培养基中生长。用0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/mL胰岛素、10-6M地塞米松和0.1mM吲哚美辛(均来自Sigma-Aldrich)补充培养基。培养基每3-4天更换一次，最多4周。脂肪形成分化通过油红O染色(Sigma Aldrich)确认，如下所述。

成骨分化

将来自3D培养物的hESC-MSCs接种在2D培养物中，并在由GMEM BHK-21(GibcoBRL)、10％FBS、1mM丙酮酸钠(Gibco BR L)、1％非必需氨基酸、50mg/mL L-抗坏血酸(Sigma)、0.075mM b-巯基乙醇、10mM b-甘油磷酸和0.1mM地塞米松(均来自Sigma)组成的成骨培养基中生长。每3-4天更换一次培养基，持续3-4周。成骨分化通过茜素红染色确认，如下所述。

软骨分化

来自3D培养物的hESC-MSCs(2x10⁵个细胞)在15mL聚丙烯猎鹰管中以300g离心5分钟以形成细胞沉淀。细胞在DMEM(Gibco BRL)中生长4-9周，补充10-7M地塞米松、1％ITS、50mg/mL L-抗坏血酸、1mM丙酮酸钠、4mM L-脯氨酸(生物工业，也称为BI)和10ng/mL TGFβ3(R&D系统)。每周更换两次培养基而不干扰细胞团。通过苏木精和伊红(H&E)和阿尔新蓝染色确认软骨形成分化，如下所述。

细胞培养—成人和胎儿MSC

成人和胎儿MSCs在2D培养基(有或没有平板涂层)中至少培养3代(见下文表1至表4和表5A至表5C中的生长培养基列表)。使用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)或任何等效酶每3-7天酶促传代细胞。

或者，将hESC-MSCs或iPSC-MSCs在生长培养基(参见生长培养基列表，下表1-4和表5A-C)中悬浮培养(3D)培养7-30天。细胞通过缓慢移液进行机械传代，或使用胰蛋白酶EDTA(Sigma)或任何等效酶进行酶促传代。

这些细胞的特征在于标记物表达(CD105、CD146、CD73、CD90和/或CD44的表达以及CD31、CD34和/或CD45的低表达/无表达)和向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的多向分化潜能。

在所有实验中，生长因子(GF)都是在每次更换培养基时新鲜添加的。

成人和胎儿MSCs生长培养基清单

测试了以下培养基组合在2D培养或悬浮培养(3D)中支持MSCs生长(细胞增殖/扩增)的能力：

表1A：包含DMEM/F12(不含bFGF或其他生长因子)的MSC基础培养基

表1B：包含DMEM高葡萄糖(DMEM HG)(不含bFGF或其他生长因子)的MSC基础培养基

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表2:MSC生长培养基(基于MSC-Diff 0-F12或MSC-Diff 0-HG+生长因子)-第一部分

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表3:MSC生长培养基(基于MSC-Diff 0-F12或MSC-Diff 0-HG+生长因子)-第二部分

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表4：MSC生长培养基中使用的生长因子(见上文表2和表3)

表5A：额外的MSC生长培养基

表5B：额外的MSC生长培养基

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表5C：额外的MSC生长培养基

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MSC分化培养基列表

测试了以下培养基支持人多能干细胞(hPSC)在悬浮培养(3D)中分化为MSC的能力：

表6：hPSCs分化为MSCs的分化培养基

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*值得注意的是，L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素溶液加起来占最终培养基的1％。

表7：hPSCs分化为MSCs的分化培养基

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*值得注意的是，L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素溶液加起来占最终培养基的1％。

表8:hPSCs向MSCs分化的分化培养基

*值得注意的是，L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素溶液加起来占最终培养基的1％。

表9:hPSCs向MSCs分化的分化培养基

*值得注意的是，L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素溶液加起来占最终培养基的1％。

增殖测定

一旦每个实验中的细胞达到约70-90％的汇合，就对细胞进行计数，并通过群体倍增时间(PDT)或比色测定(PrestoBlue)确定细胞的倍数增加、群体倍增时间和累积细胞计数。

流式细胞术分析(FACS)

使用酶溶液(用于2D培养物)或离心(用于3D培养物)收获细胞。将细胞重新悬浮在染色缓冲液中，并与每种指定的抗体(CD45、CD105、CD44、C146、CD31、CD34(Miltenyi)、CD73(eBioscience)、CD90(BD Pharmingen)、Oct3/4和/或Nanog(Miltenyi))一起培养，并使用BDTMLSR II流式细胞仪采集。

茜素红染色

用PBS冲洗细胞两次，用4％PFA固定20分钟，再次冲洗，并在室温下用2％茜素红溶液(pH 4.1-4.5；Sigma)染色15分钟，用水冲洗三次，然后留在水中。

油红染色

用PBS冲洗细胞三次，用4％多聚甲醛(PFA；电子显微镜科学)固定20分钟，再用PBS冲洗，并在室温下用油红O溶液(Sigma Aldrich)染色10分钟，然后用水冲洗三次，然后留在水中。

阿尔新蓝染色

在用4％PFA固定细胞颗粒并包埋在低熔点琼脂糖(1.5％)中后，制备细胞切片。进行苏木精和伊红(H&E)和阿尔新蓝染色。

实施例1

三维悬浮培养中人先驱干细胞向间充质干细胞的分化

在悬浮培养系统中以聚集体(MaxellsTM)或多个单细胞(SinglesTM)的形式培养人PSCs(系：TE03、Kyou、I3)。

通过将培养基从hPSCs基础生长培养基改为MSC-Diff和高水平36培养基，并在悬浮培养中2-21天后，细胞分化为MSCs，如形态学(图1A和图1C)和CD105、CD44、CD73、CD90和高水平CD146的共表达所示(图2A-图2C)。此外，细胞缺乏内皮标记物CD31和造血标记物CD45(图2D-图2E)。此外，细胞是可塑性粘附的(图1B和图1D)，并在体外分化为中胚层衍生物(成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞)(图3A-图3C)。

在进一步的实验中，人诱导的干细胞(iPS细胞系Dyr0100)在三种不同的分化培养基中生长，即MSC-Diff 36、MSC-Diff 37或MSC-Diff 38，在悬浮培养7-14天后，评估细胞的MSC细胞特征。如图13所示，在开始用所有三种分化培养基培养后7-8天，间充质标记物CD90明显。通过间充质标记物CD73、CD105和CD146的表达增加和造血标记物CD45的表达减少(图14)，以及随着间充质分化的进行，多能性标记物OCT4的显着减少(图15)，MSC分化在所有三种培养基中进一步明显。此外，iPSC衍生的MSCs(在所有三种测试培养基中进行7或14天的间充质分化后)在体外分化为骨细胞(图16A-图16H)和脂肪细胞(图17A-图17D)。

在2D贴壁培养物中重新接种后，iPSC衍生的MSCs的结果相似。具体而言，在3D悬浮培养中用分化培养基MSC-Diff 37和MSC-Diff38分化的人iPS衍生MSCs在2D培养中重复15天后保持间充质标记物CD73、CD90、CD105和CD146的高表达(图18A-图18B和图19)，并表现出造血标记物CD45的低表达(图19)。此外，在2D培养物中重新接种后，这些iPSC衍生的MSCs在体外分化为骨细胞(图20A-图20C)和脂肪细胞(图21A-图21C)。

使用ESC观察到使用MSC-Diff 36、MSC-Diff 37和MSC-Diff 38培养基的3D间充质分化的类似结果。图22A和图22B分别显示了在3D培养中胚胎干细胞间充质分化8天后Oct4和Nanog的表达水平的降低，而图23A-图23D显示了茜素红染色阳性，表明胚胎干细胞来源的骨髓间充质干细胞具有成骨潜力。

实施例2

间充质干细胞在包含不同生长因子的培养基中的增生

将成人MSCs(从骨髓或脐带获得)在包含不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的MSC基础培养基(MSC-diff 0-F12)中培养(下表10)。如图4和图5所示，bFGF对促进MSCs的生长和增生至关重要。即使使用低浓度的bFGF，例如5ng/ml，MSCs的生长和增生也是明显的。

表10：在包含不同浓度bFGF的生长培养基中增生MSCs的实验设计

接下来，在包含不同生长因子的MSC基础培养基(MSC-diff 0-F12)中检查MSCs的生长和扩增。具体而言，根据上表2，将bFGF、表皮生长因子(EGF)和/或血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)以不同浓度和组合添加到MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12)中，并检查其对成年hMSC UC细胞增殖、扩增和存活的影响。因此，一旦每个实验中的细胞达到大约70-90％汇合，就对细胞进行计数，并确定倍数增加、群体倍增时间和累积细胞计数。

在另一组实验中，根据上表2和表3，将bFGF、FGF4、转化生长因子β1或β3(分别为TGFβ1或TGFβ3)、PDGF-BB、EGF和/或WNT-3a以不同浓度和组合添加到MSC基础培养基(MSC-Diff 0-F12或MSC-Diff 0-HG)中，并检查它们对成人hMSC UC细胞增殖、扩增和存活的影响。因此，一旦每个实验中的细胞达到大约70-90％的汇合度，就会根据比色法(PrestoBlue)评估细胞增殖。

如图6A至图6C所示，每天增加的倍数(即每天增加的细胞数量与每段开始时接种的细胞数量(P)相比)、群体倍增时间(PDT)(即每次测试24小时内细胞的倍增率)以及累积细胞计数(即，将每个细胞计数加到前一个细胞计数上，以获得如果前一个计数中的所有细胞都已接种，则本应获得的细胞总数)说明了生长因子组合和浓度的不同影响。用MSC基础培养基(MSC Diff 0-F12)培养的成人hMSC UC细胞的代表性形态如图7所示，所述培养基包含不同浓度和组合的bFGF、PDGF-BB和EGF。如图8和图10所示，bFGF、TGFb1、TGFb3、PDGF-BB和WNT3a的不同浓度和组合导致MSC-diff 0-F12或MSC-diff 0-HG中的细胞增殖增加，其代表性形态如图9和图11所示。

MSCs在MSC-Diff 51培养基中进一步生长(见上表5B)，这导致长期培养后保持形态，如培养第4至78天的第1代至第11代所示(见图12A-图12E)。重要的是，MSCs在78天的长期培养期间表现出显着的增殖，如成人hMSC-UC细胞所示(见图12F)。

此外，MSCs在MSC-Diff 52培养基中的生长和增生(见上表5C)导致MSCs显着增殖，同时在长期培养后保持形态(数据未显示)。

尽管已经结合本发明的具体实施例描述了本发明，但显然的是，对于本领域技术人员来说，许多替代方案、修改和变化是显而易见的。因此，本发明主要特征包含在落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修改和变化。

在本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请以其整体在此通过引用并入本说明书中。其程度如同各单独的出版物、专利或专利申请被具体及单独地指明而通过引用并入本文中。此外，所引用的或指出的任何参考文献不应被解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。本申请中标题部分在本文中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。另外，本申请的任何优先权文件在此以引用方式并入本文。

Claims (50)

1.一种成分确定的培养基，其特征在于：包括一基础培养基和一有效量的敲除血清替代物(KoSR)以及ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

2.一种培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.4至2.3之间，其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基包括DMEM/F12。

4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基包括DMEM高葡萄糖(DMEMHG)。

5.如权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述DMEM/F12与所述MEMα的所述体积比为DMEM/F12比MEMα在0.6至1.5之间。

6.如权利要求2或5所述的培养基，其特征在于：进一步包括敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)中的至少一种。

7.如权利要求1、3、4或6中任一项所述的培养基，其特征在于：所述KoSR的浓度为2.5％至15％。

8.如权利要求1、3、4、6或7中任一项所述的培养基，其特征在于：所述ITS的浓度为0.1％至3％。

9.如权利要求1、3或7-8中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括葡萄糖、L-抗坏血酸和丙酮酸钠中的至少一种。

10.如权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述葡萄糖的浓度为1克/升至5克/升。

11.如权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述L-抗坏血酸的浓度为20微克/毫升至200微克/毫升。

12.如权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述丙酮酸钠的浓度为20微克/毫升至200微克/毫升。

13.如权利要求2、5或6-8中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括血清。

14.如权利要求13所述的培养基，其特征在于：所述血清的浓度为3％至30％。

15.如权利要求1至14中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

16.如权利要求15所述的培养基，其特征在于：所述bFGF包括FGF2或FGF4。

17.如权利要求15所述的培养基，其特征在于：所述bFGF包括FGF2及FGF4。

18.如权利要求16至17中任一项所述的培养基，其特征在于：所述FGF2的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。

19.如权利要求16至17中任一项所述的培养基，其特征在于：所述FGF4的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。

20.如权利要求1至19中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)和WNT-3a中的至少一种。

21.如权利要求15所述的培养基，其特征在于：所述PDGF包括PDGF-BB。

22.如权利要求20至21中任一项所述的培养基，其特征在于：所述PDGF浓度为5纳克/毫升至100纳克/毫升。

23.如权利要求20所述的培养基，其特征在于：所述TGFβ包括TGFβ1或TGFβ3。

24.如权利要求20或23任一项所述的培养基，其特征在于：所述TGFβ的浓度为5纳克/毫升至50纳克/毫升。

25.如权利要求20所述的培养基，其特征在于：所述EGF的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。

26.如权利要求20所述的培养基，其特征在于：所述WNT-3a的浓度为10纳克/毫升至200纳克/毫升。

27.一种成分确定的培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度至少0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

28.一种培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，其中所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.6至1.5之间；浓度至少为3％的基因敲除血清替代物(KoSR)；浓度至少为0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，以及浓度至少为5％的血清，并且其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

29.一种成分确定的培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少为5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少为0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)以及浓度至少25微克/毫升的L-抗坏血酸，其中所述培养基不含血清，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

30.一种成分确定的培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM HG、浓度至少为5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少为0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、浓度至少25微克/毫升的L-抗坏血酸以及浓度至少为25微克/毫升的丙酮酸钠，其中所述培养基不含血清，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。

31.如权利要求27至30中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括浓度至少为1纳克/毫升的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

32.一种无分化增生间充质干细胞(MSCs)的方法，其特征在于：所述方法包括在权利要求1至31中任一项的培养基中对所述MSCs进行培养，从而允许所述MSCs在无分化增生的培养条件下培养所述MSCs。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于：所述培养包括2D培养。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于：所述培养包括悬浮(3D)培养。

35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其特征在于：所述培养至少进行5代。

36.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其特征在于：所述培养最多进行25代。

37.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其特征在于：所述MSCs分化为脂肪生成谱系、成骨细胞谱系和软骨生成谱系中的任何一种。

38.一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，其特征在于：所述方法包括在权利要求1至31中任一项所述的培养基中的悬浮培养物中，在适合于将所述PSCs分化为MSCs的培养条件下培养所述PSCs，从而产生所述MSCs。

39.一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，其特征在于：所述方法包括在适合PSCs分化为MSCs的培养条件下，在一培养基以一悬浮培养物中培养PSCs，所述培养基包括一基础培养基，所述基础培养基包括MEMα、血清和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，从而产生所述MSCs。

40.一种从多能干细胞(PSCs)产生间充质干细胞(MSCs)的方法，其特征在于：所述方法包括在适合于PSCs分化为MSCs的培养条件下，在包括一基础培养基的一培养基中以一悬浮培养物培养PSCs，所述基础培养基包括MEMα、浓度至少5％的血清和浓度至少1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，从而产生所述MSCs。

41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其特征在于：所述培养在没有基质粘附的培养条件下进行。

42.如权利要求38至41中任一项所述的方法，其特征在于：所述PSCs的所述悬浮培养物包括团块。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于：包含所述团块的所述悬浮培养物包括含有超过约250个多能干细胞的细胞团。

44.如权利要求38至41中任一项所述的方法，其特征在于：所述PSCs的所述悬浮培养物不含团块。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于：不含所述团块的所述悬浮培养物包含单个细胞或小细胞团，每个所述小细胞团包括不超过约200个多能干细胞。

46.一种悬浮培养物中分离的间充质干细胞(MSCs)群，其特征在于：根据权利要求38至45中任一项的方法产生的。

47.一种细胞培养物，其特征在于：包括MSCs和权利要求1至31中任一项所述的培养基。

48.一种细胞培养物，其特征在于：包括多能干细胞(PSCs)和权利要求1至31中任一项所述的培养基。

49.一种细胞培养物，其特征在于：包括多能干细胞(PSCs)和一培养基，所述培养基包括一基础培养基，所述基础培养基包括MEMα、血清和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

50.一种细胞培养物，其特征在于：包括多能干细胞(PSCs)和一培养基，所述培养基包括一基础培养基，所述基础培养基包括MEMα、浓度至少为5％的血清和浓度至少为1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)。

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