TWI686202B - 體幹細胞 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一體幹細胞群及其製法。亦揭示其二亞群以及此等之各種用途。

Description

體幹細胞

相關申請案 本發明係依據2010年8月4日申請之美國臨時申請案61/370,600號、2010年9月17日申請之美國臨時申請案61/383,842號、2011年2月25日申請之美國臨時申請案61/446,669號請求優先權。此等前案以全文引用之方式納入本案中。

本發明係關於體幹細胞，其為多能性或全能性，以及相關方法。

幹細胞為在活體內或試管內可分化成許多或所有細胞譜系(cell lineages)之多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)細胞。由於其之多能性，一般相信胚胎幹(ES)細胞具有治療退化性或遺傳性疾病之遠大前景。但是倫理上之考量阻礙了人類幹細胞之使用。非胚胎來源之幹細胞則可規避該障礙。因此，對於非胚胎幹細胞具有需求。

本發明係關於體幹細胞，其為多能性或全能性，以及相關方法。

一方面，本發明之特徵為經單離之體幹細胞，其尺寸為0.3至6.0微米(尺寸為，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)且為CD9⁺ 。該經單離之體幹細胞可為CD9⁺ CD349⁺ 或CD9⁺ CD349^- 。細胞標記(marker)後之符號「+」代表用標記-特異性抗體染色時顯示較強的螢光，而用該抗體之同型(isotype)對照組染色時顯示較弱的螢光。細胞標記後之符號「-」代表用標記-特異性抗體染色時所顯示之螢光強度與用該抗體之同型對照組染色時所顯示者相同。在一具體實施例中，該經單離之體幹細胞為非吸附性。在本文中該細胞被稱為「SB-1」細胞。

另一方面，本發明之特徵為經單離之體幹細胞，其尺寸為0.3至6.0微米(尺寸為，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)且為SSEA1⁺ 、SSEA4⁺ 、CD13⁺ 、或Stro1⁺ 。在一具體實施例中，該經單離之體幹細胞為非吸附性。在本文中該細胞被稱為「SB-2」細胞。

又另一方面，本發明之特徵為製造體幹細胞群之方法。該方法包括：從個體(例如人類或非人類)得到含有複數個細胞之體液(例如血液、骨髓、臍帶血、月經、及羊水)樣品；將該樣品與二價陽離子螯合劑(例如，EDTA、EGTA、及檸檬酸鈉)或肝素(heparin)在容器中培養直至該樣品分為上層及下層；收集該上層；以及從該上層單離一群尺寸為0.3至6.0微米之體幹細胞(尺寸為，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)。在該上層中之細胞在本文中被稱為「SB細胞」或「SB細胞群」。

在SB細胞群中之體幹細胞可為CD9⁺ 、SSEA1⁺ 、SSEA4⁺ 、CD13⁺ 、或Stro1⁺ 。例如其可為CD9⁺ CD349⁺ 。此等體幹細胞非為吸附性且可具有受精卵細胞之形態及生長特徵。再者，其可被誘發生成所有3層胚層，即內胚層、外胚層及中胚層。

來自上層之SB細胞之單離可藉由根據細胞尺寸之方法(例如離心或過濾)或根據細胞表面標記之方法(例如流式細胞測量術)進行。

該方法進一步包括於收集該上層後，將其與ADP一起培養以允許血小板/微粒沉澱而使幹細胞進一步富化(enriched)。此外，該方法亦包括將從肝素處理過之樣品得到之上層與二價陽離子螯合劑一起培育，以使幹細胞活化而從細胞週期G0進入G1。

再一方面，本發明之特徵為藉由上述方法製備之SB細胞群。

又再一方面，本發明之特徵為細胞銀行，其包括複數群之體幹細胞。此等群係藉由上述方法從不同個體之體液樣品(例如血液及骨髓)分開製備。

本發明之進一步特徵為增加樣品中所含之幹細胞之數目之方法。該方法包括：將二價陽離子螯合劑加至該樣品中以及將該樣品中之幹細胞與二價陽離子螯合劑一起培養。該方法進一步包括在加入螯合劑之前及將該等細胞與螯合劑一起培養之後測定樣品中所述及之細胞(例如SB-1細胞、SB-2細胞、以及SB-1細胞與SB-2細胞二者)之計數。待用本方法檢驗之幹細胞之例子包括在SB群中之幹細胞，例如SB-1細胞。

評估個體具有老化相關性異常或癌症之風險之方法亦在本發明之範圍內。老化相關性異常之例子包括：自行-修復缺陷、退化性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病或糖尿病。該方法包括：個體取得某些體幹細胞群，以及測定該體幹細胞之計數。所得到之體幹細胞可為SB-1細胞或SB-2細胞。此等可為CD9⁺ 、CD349⁺ 、SSEA1⁺ 、SSEA4⁺ 、CD13⁺ 、或Stro1⁺ 。此等各個之尺寸為0.3至6.0微米。在SB群中之幹細胞可藉由上述方法得到，較佳使用肝素以將體液樣品分離成上層及下層。

若該計數低於第一預定值，則該個體被確定具有罹患該異常之風險，或者若該計數高於第二預定值，則該個體具有罹患癌症之風險。第一值可從年輕且健康的第一對照個體得到。第二值可從罹患癌症的第二對照個體得到。

本發明亦包括在個體中增加體幹細胞之數目之方法。該方法包括將有效量之在SB細胞群中之體幹細胞投與至需要其之個體。於投與之前及之後可測定在來自該個體之樣品(例如血液及骨髓)中所述及之細胞(諸如SB-1細胞)之個別計數。舉例言之，為了實施該方法。可使用在含有10 nM-5μM EDTA之250毫升磷酸鹽緩衝液中之體幹細胞。

最後，本發明之特徵為治療肌肉受傷或肌肉退化性疾病之方法。該方法包含將有效量之在SB細胞群中之體幹細胞投與至需要其之個體。該肌肉退化性疾病之例子包括肌肉營養不良症、纖維肌痛、肌肉病變、皮肌炎、多發性肌炎、橫紋肌溶解症或心肌炎。

本發明之一個或多個具體實施例之細節述於附圖及以下說明中。從該說明及圖式以及從申請專利範圍可顯而易知本發明之其他特徵、目的及優點。

本發明至少部分係基於下述未預期之發現：(i)多能性或全能性幹細胞群，即SB細胞群可從一般相信不含細胞之樣品中單離出；(ii)二價陽離子螯合劑(例如EDTA)會活化該群中之多能性或全能性幹細胞並在未使其喪失其分化潛力下強迫其增殖；以及(iii)該多能性或全能性幹細胞群可被分化成外胚層、內胚層及中胚層細胞。在該群中之SB-1細胞針對CD9染色時呈陽性，在該群中之SB-2細胞於染色時下述標記之1個或多個呈陽性，即SSEA1⁺、SSEA4⁺、CD13⁺、或Stro1⁺。SB細胞群、SB-1細胞及SB-2細胞可從人類或非人類動物單離。為上述體幹細胞之取得來源之非人類動物之例子如下：靈長類、狗、齧齒動物、天竺鼠、貓、馬、牛、羊及豬。換言之，其包括，但非限於，寵物動物、農場動物、實驗動物及疾病-模型動物。

A. 細胞

本發明係關於SB細胞群，其係從非胚胎來源製備之多能性或全能性幹細胞。如同ES細胞，在該群中之細胞為全能性或多能性。更重要地，該群可以極高產率容易地得到。所以在治療各種退化性疾病或組織損傷時可用於再生已分化之功能性細胞。如下述實施例所示，該群可容易地在試管中製備、維持及擴增，且可藉由使用例行的技術途徑誘發其分化。此外，於將該群中之幹細胞移植至動物個體(例如小鼠)時，無惡性腫瘤生長之跡象。此等幹細胞，由於含有正常的染色體組(chromosomal complement)，所以非由譜系提交(lineage-uncommitted)而可形成身體之所有體細胞(非生殖細胞)。其亦可形成生殖配子即精子及/或卵子、胚胎之細胞及組織、以及胎盤之胎兒部分。此等幹細胞能回應譜系-誘生劑、增殖劑、以及分化抑制劑。由於此等優點，其可做為其他幹細胞之替代物。

術語「幹細胞」在本文中係指全能性或多能性細胞，亦即此等細胞能分化成許多的最終分化細胞類型。全能性幹細胞典型地具有發育成任何細胞類型之能力。全能性幹細胞在來源上可為胚胎或非胚胎。多能性幹細胞典型地為能分化成數種不同的最終分化細胞類型之細胞。單能幹細胞只能產生一種細胞類型，但具有自行換新(self-renewal)性質，此為其與非幹細胞之區別。此等幹細胞可源自各種組織或器官系統，包括血液、神經、肌肉、皮膚、腸、骨格、腎臟、肝臟、胰臟、胸腺等。

本文所揭示之幹細胞為實質純。該術語「實質純」，當用於描述幹細胞或從其衍生之細胞(例如分化細胞)時。意指特定細胞構成製劑中之大部分細胞(即，例如，大於20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)。一般而言，實質純化之細胞群係構成製劑中之至少約70%之細胞，通常構成製劑中之約80%之細胞，尤其構成製劑中之至少約90%之細胞(例如，95%、97%、99%或100%)。因此，本發明具有「可得到特定類型細胞(例如，SB-1細胞)之實質純群體而未被其他類型細胞污染」之優點。

可用來自個體之各種含細胞樣品製備本發明之細胞群。在本發明之較佳具體實施例中，細胞群係從血液或骨髓樣品製備。

為了確證該被單離之群實際上含有SB-1細胞，可檢查許多特徵，包括(1)懸浮液中細胞之尺寸係在0.3至6.0微米之間，以0.5至5.0微米為較佳，以及(2)細胞表面標記。可使用對抗細胞表面標記(諸如CD9)之抗體。此等抗體可與適當的標籤結合，此等標籤諸如螢光素異硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)或量子點。SB-1細胞，其為CD⁺ ，可藉由使用流式細胞儀而進一步富化。

此等經單離或富化之細胞然後藉由標準技術檢驗。為了確證在SB細胞群中之幹細胞之分化潛力，其藉由本技藝已知之方法誘發以形成，例如，神經-膠質細胞、骨細胞及含脂肪細胞。例如，將此等細胞繼代培養至細胞長滿生長平面，然後移至生骨培養基或生脂培養基上並培養適當時間(例如3星期)。骨生成之分化潛力係藉由鈣蓄積之礦化(mineralization)而評估，該礦化可藉由馮科薩(von Kossa)染色顯現。為了檢定生脂分化，細胞內脂肪小滴可藉由油紅O (Oil Red O)染色及於顯微鏡下觀察。就神經分化而言，可將此等細胞在生神經(neurogenic)培養基中培養適當期間(例如7日)，然後承受血清耗竭(serum depletion)及與巰基乙醇一起培養。分化後，其顯示具有被排列成網狀之延伸軸突樣結構之可彎折細胞體之形態。進一步進行譜系特異性標記之RT PCR及免疫細胞化學染色以確證神經分化。此等標記之例子包括具神經元特異性之第III類—微管蛋白(Tuj-1)、神經絲(neurofilament)及GFAP。

或者，為了確認經單離細胞之身份，可利用SB-1細胞會回應二價陽離子螯合劑(EDTA)而迅速增殖之發現。為此，可將經單離之細胞與，例如，EDTA，一起培育。於該條件下，SB-1細胞將增殖。相對照地，CD66e⁺ 細胞行為模式不同。

可將SB細胞群中之幹細胞在未分化培養基中進一步繁殖達10、20、50或100次倍增，且不會顯示自然的分化、衰老、形態改變、生長速率增加或分化成神經元之能力改變。此等幹細胞於使用前可藉由標準方法貯存。

術語「增殖」及「擴增」在本文中用於描述細胞時可交換使用，其係指藉由分裂相同類型之細胞之數目增加。術語「分化」係指使細胞變得特殊化而具有特定功能之發育過程，例如細胞獲得1種或多種不同於初始細胞類型之形態特徵及/或功能。術語「分化」包括譜系提交(lineage commitment)及終末分化過程。分化可藉由，例如利用免疫組織化學或其他精於本技藝者已知之其他程序監測譜系標記之存在與否來評估。從祖先細胞衍生之已分化後代細胞可，但非必須，與做為幹細胞之來源組織之相同胚層或組織有關。例如，神經祖先細胞及肌肉祖先細胞可分化成造血細胞譜系。

術語「譜系提交(lineage commitment)」及「特異化(specification)」在本文中可交換使用，係指幹細胞所經歷的一過程，其中該幹細胞生成祖先細胞，該祖先細胞被提交形成有限範圍之特定類型之分化細胞。被提交的祖先細胞常能夠自行換新或細胞分裂。

術語「終末分化」係指細胞最終分化為成熟、充分分化之細胞。例如，神經祖先細胞及肌肉祖先細胞可分化成造血細胞譜系，該造血細胞譜系之終末分化導致分化成屬特定細胞類型之成熟血球。通常，終末分化連同發生從細胞週期之抽離及增殖之中止。術語「祖先細胞」在本文中係指被提交於特定細胞譜系之細胞，其藉由一系列之細胞分裂生成該譜系之細胞。祖先細胞之一例可為成肌細胞，其能夠只分化成一類型之細胞，但其本身未充分成熟或充分分化。

具有複數個上述幹細胞群之細胞銀行或細胞庫在本發明之範圍內。此等幹細胞可為人類細胞或非人類細胞。該銀行可藉由下述方法製備：分別從不同的個體收取SB細胞群；賦予此等SB細胞群特徵以使各群得到至少一預定特徵，根據該至少一預定特徵將此等SB細胞群之各個分類。為了製備該銀行，可將SB細胞群進一步擴增。該特徵之例子包括個體之名字、性別、身體狀況(包括遺傳異常及MHC資訊)。

B. 細胞之使用

含有例如 SB-1細胞之上述SB細胞群可以各種方式使用。

篩選方法：

在SB細胞群中之上述幹細胞可被用於篩選分析以鑑定出可影響特定細胞類型之藥物，而指示出在治療與該細胞類型相關之異常上有用之藥物。例如，可將幹細胞用於鑑定治療疾病(例如退化性疾病)之候選藥之方法。該方法包括使受試化合物與幹細胞接觸並測定於該疾病中被下調之多胜肽之表現度之步驟。存在該受試化合物下之表現度，若高於不存在該化合物下之表現度，則該化合物為治療該疾病之候選藥。該疾病之例子包括：糖尿病、神經退化疾病、關節炎、癌症或自體免疫異常。表現度係以mRNA量(level)或蛋白質量來測定。

因此，本發明之一態樣係關於鑑定會改變SB細胞群中未分化細胞之功能之作用劑(agent)之方法，其係藉由將該等細胞與受試作用劑接觸。存在該受試作用劑下細胞之功能或基因表現度與不存在該受試作用劑下之功能相較發生改變，表示該受試作用劑為能改變細胞之功能或細胞中基因表現之作用劑。術語「受試作用劑」係指正被檢查是否具有改變細胞功能或細胞中基因表現之能力之任何分子。雖然該方法通常係用於篩選分析以鑑定具有期望活性之先前未知分子，但本發明之篩選方法亦可用於確證已知具有特定活性之作用劑。

該功能可為典型在細胞中表現(或未表現)之基因之表現，且該作用劑可藉由增加或減少被表現基因之表現度、或者藉由啟動細胞中未表現基因之表現(例如誘導譜系-特異性抗原之表現)而改變該功能。

在一具體實施例中，會影響細胞功能之作用劑為能誘導幹細胞分化者，藉此產生分化細胞。此等分化細胞可為多潛能(multipotential)人類幹細胞(例如造血幹細胞)或終末分化細胞(例如，肌肉細胞、神經元細胞、血球、結締組織或上皮細胞)。因此，該方法可被用於鑑定能誘導在SB細胞群中之幹細胞分化成終末分化細胞之作用劑，其中終末分化細胞包括胰臟β細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞或任何其他細胞類型。如此鑑定出之作用劑或化合物可用於治療退化性異常、癌症或免疫異常。

表現度係以mRNA量(level)或蛋白質量來測定。測量樣品中mRNA量之方法在本技藝中為熟知。為了測量mRNA量，可將細胞溶裂，在溶裂物中mRNA之量，不論純化與否，皆可藉由例如雜交分析(使用附有可檢測標籤之基因-特異性DNA或RNA探針)及定量或半定量RT-PCR(使用適當的基因-特異性引子)來測定。另一選擇為使用附有可檢測標籤(例如螢光或酶)之DNA或RNA探針對組織切片或未溶裂細胞懸浮液進行定量或半定量原位雜交分析。另外的mRNA-定量方法包括RNA保護分析(RPA)法及基因表現之系列分析(SAGE)法。

測量樣品中蛋白質量之方法在本技藝中亦為熟知。其中一些使用可特異性地結合於標靶蛋白質之抗體(例如單株或多株抗體)。在此種分析中，可使該抗體本身或結合於該抗體之二次抗體附上可檢測之標籤。另一選擇為該抗體可與生物素(biotin)結合。其之存在可由附有可檢測標籤之抗生物素蛋白(avidin)測定。此等途徑之組合(包括「多層三明治」分析)可用於增加此等方法之敏感度。一些蛋白質-測量分析(例如ELISA或西方點漬法)可應用於體液或細胞之溶裂物，以及一些(例如免疫組織化學染色法或螢光流式細胞測量術)可應用於組織切片或未溶裂細胞懸浮液。適當的標籤包括放射性核素(例如¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S、³ H或³² P)、酶(例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或半乳糖苷酶)、螢光/發光劑(例如螢光、若丹明(rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、GFP、BFP及奈米粒子(例如，Qdot^TM ，由Quantum Dot Corporation供應，Palo Alto，CA)。其他可應用之方法包括定量免疫沉澱或補體固定分析。

受試化合物或作用劑可為任何類型之分子，例如，多核苷酸、胜肽、模擬肽、類胜肽(peptoids)(諸如乙烯肽)、小有機分子或類似物，且可以各種方式之任一種作用而改變SB細胞群中幹細胞之功能。例如，受試作用劑可藉由結合於由細胞所表現之細胞表面受器而作用於細胞外，藉此改變通常結合於該受器並經由該受器作用之配體於結合時所媒介之功能。另一選擇為：該受試作用劑可為被動或經由主動運輸機制橫越細胞膜，並在細胞內作用而改變功能者。

胜肽類受試作用劑可為胺基酸或胺基酸類似物之任何聚合物，其可由約3至4個殘基乃至數百個或數千個殘基構成。胜肽類受試作用劑可藉由化學合成、或使用蛋白質純化之方法製備，繼而進行蛋白質水解，且若期望，進一步藉由層析或電泳方法純化；或者可從編碼聚核苷酸表現。胜肽類受試作用劑可以已知胜肽(例如天然胜肽)為主體，但可從天然序列變化，例如含有一種或多種胺基酸類似物。

聚核苷酸類作用劑可為由磷酸二酯鍵鍵結在一起之2個或多個去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之序列。該聚核苷酸類作用劑可為RNA或DNA，其可為基因或基因之一部分，例如cDNA、RNAi劑、合成多去氧-核糖核酸序列或類似物，且可為單股或雙股、以及DNA/RNA雜交物。其可為天然核酸分子以及合成分子，該天然核酸分子可從細胞單離，該合成分子可藉由例如化學合成方法或藉由酶方法(諸如藉由聚合物酶連鎖反應(PCR))製備。在各種具體實施例中，本發明之聚核苷酸可含有核苷或核苷酸類似物或者磷酸二酯鍵以外之主幹鍵結。此等核苷酸類似物在本技藝中為熟知且可從市面取得，含有此種核苷酸類似物之聚核苷酸亦復如此(Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73, 1997)。

可使用本文所揭示之方法或本技藝已知之其他方法將聚核苷酸類受試作用劑與SB細胞群中之幹細胞接觸或引進該等幹細胞中。一般而言，但非必須，將聚核苷酸引進細胞中，在該細胞中其直接發揮其功能或於轉錄或轉譯或二者之後發揮其功能。例如，該聚核苷酸可編碼胜肽類受試作用劑，該胜肽類受試作用劑在細胞中被表現並改變該等細胞之功能。聚核苷酸類受試作用劑亦可為或可編碼反義分子、核酶(ribozyme)或三聯劑(triplexing agent)，其可被設計成標定1種或多種特異性標靶核酸分子。

待篩選之候選作用劑或化合物(例如蛋白質、胜肽、模擬肽、類胜肽、抗體、小分子或其他藥物)可藉由使用在本技藝中已知之組合庫方法中之許多途徑之任一者而得到。此等庫包括：胜肽庫、類胜肽庫(具有胜肽之官能基，但具有對酶降解有抗性之新穎非胜肽類主幹)；可空間尋址之併行固相(spatially addressable parallel solid phase)庫或溶液相庫；藉由重疊合法(deconvolution)或親和性層析選擇得到之合成庫；以及「一株粒、一化合物」庫。參見，例如，Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145。分子庫之合成方法之例子記載於，例如，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;以及 Gallopet al ., 1994 J. Med. Chem. 37:1233。化合物庫可以溶液形式(例如Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421)呈現，或在珠粒(Lam, 1991, Nature 354:82-84)、晶片(Fodor, 1993, Nature 364:555-556)、細菌 (美國專利第5,223,409號)、孢子(美國專利第5,223,409號)、質體(Cullet al ., 1992, PNAS USA 89:1865-1869)、或嗜菌體(Felici 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; 以及美國專利第5,223,409號)上。

治療退化性異常

可以使用在本文中所揭示之在SB細胞群中之幹細胞治療退化性或遺傳性疾病，而可規避人類胚胎處理所涉及之倫理考量。

為了如此做，可從病患單離SB細胞群，該病患例如為缺少組織或器官適當發育所必需的功能性基因者。然後將編碼該基因之功能版(functional version)之表現核酸載體引進SB細胞群中之幹細胞中。可經由各種技術將該載體引入幹細胞中，此等技術包括磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖-媒介之轉染、脂質體轉染(lipofection)、電穿孔、顯微注射、或病毒-媒介技術。以不會影響該等細胞之多能性為較佳。此等技術之說明記載於，例如，美國專利第7,422,736號及第5,591,625號。將功能基因輸送入幹細胞後，可用本技藝已知之方法將其移植回該病患。當幹細胞係從該病患製得時，該治療不會引起免疫排斥。

另一選擇為：可從由健康人製備之SB細胞群製造全適供體細胞(universal donor cells)。製造全適供體細胞之方法在本技藝中為已知，從SB細胞群製造通用多能幹細胞之方法述於下文中。

於適當條件下，被移植的幹細胞可發育成功能性組織或器官。為了促進該發育，可將誘導細胞發育之因子投與該病人。此等因子可為小分子化合物、胜肽及核酸。其之例子包括，但非限於，轉形生長因子β、骨形成蛋白質(bone morphogenic protein)、及神經生長因子。

全適供體幹細胞在研究譜系發育及分化之發育或分化機制上亦有用。可藉由使用此種細胞做為模型系統而鑑定出誘導全能或多能幹細胞發育成特定組織或器官之條件。再者，可藉由使用本技藝已知之分化cDNA篩選而單離出於發育期間扮有角色之基因。可從已被誘導而發育成某種譜系(例如上述神經-膠質譜系)之細胞製備cDNA庫。該庫繼而可用於單離及研究被分化地表現之基因。可進一步研究此等經單離之基因以界定其在個別過程中之角色。相關技術在本技藝中為已知。請參見，例如美國專利第7,422,736號。多能性幹細胞亦可藉由使用本技藝已知之方法而發育成動物之器官或純系(clone)。所以，就寵物及家畜產業而言，此等細胞有價值，且可用於保存瀕臨絕種之動物。

在一方面，本發明之特徵為治療個體退化性疾病之方法。該方法包含將有效量之上述幹細胞投與至需要其之個體。在一具體實施例中，此等細胞之至少一種包括重組核酸。該重組核酸可編碼多胜肽且該幹細胞可含有編碼多胜肽之mRNA。退化性疾病之例子包括糖尿病、神經退化性疾病及關節炎。神經退化性疾病之例子包括帕金森氏症。

在另一方面，本發明之特徵為治療個體自體免疫性疾病之方法。該方法包括將有效量之上述組成物投與至需要其之個體。

待治療上述異常之一之個體可藉由該特定異常用之標準診斷技術來鑑定。「治療」係指將組成物(例如細胞組成物)投與至罹患該異常或有發展成該異常之虞之個體，其目的為治癒、減輕、緩解、彌補、延遲出現、預防或改善該異常、該異常之症狀、繼發於該異常之疾病狀態、發展成損傷/異常之傾向。「有效量」係指組成物在接受治療之個體中能產生醫療上期望結果之量。該治療方法可單獨進行或與其他藥物或治療併用。

退化性疾病係指受犯組織或器官之功能或結構隨時間經過逐漸變差，而不論其係因遺傳缺陷、受傷、缺乏適當的細胞分化(例如在細胞增殖異常中者)、常態身體負荷(normal bodily wear)或生活方式之選擇。退化性疾病之例子包括神經退化性疾病(例如阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓氏舞蹈症、多發性硬化症、及肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS))；其他神經系統異常(例如，橫紋肌炎、腦或脊索外傷後脫髓鞘、急性腦損傷、頭部外傷、脊髓損傷、周圍神經損傷、缺血性腦損傷、中樞神經系統(CNS)之遺傳性髓鞘異常、癲癇、新生兒周產期窒息、窒息、缺氧症、重積性癲癇、謝-德拉格(Shy-Drager)症候群、自閉症及中風)；癌症或相關癌症治療(例如化學治療)所引起之病況；代謝性疾病(例如糖尿病及尼曼匹克(Niemann Pick)症)；自體免疫或發炎相關性疾病(例如紅斑症、炎性腸疾病(IBD)、乾癬症、骨關節炎、骨質疏鬆症、風濕性關節炎、狼瘡、糖尿病及氣喘)；眼睛異常(例如，青光眼、網膜色素變性、諾理(Norrie)疾病、以及黃斑點退化)；心臟及循環異常(例如，粥腫樣硬化、心衰竭、心肌梗塞及心血管疾病)；血液異常(例如威斯科特-奧爾德里奇(Wiscott Aldrich)症候群)；肌肉萎縮；胃腸道疾病；腎臟疾病；肝臟疾病；肺臟疾病；腎上腺異常(例如愛迪生氏症)；由傷害引起之病況(例如燒傷、中風、受傷組織(包括外傷、老化受傷細胞及老化受傷組織))；與老化相關之病況(例如掉髮，包括雄性禿及圓形禿)；病毒病症(例如C型肝炎感染症及後天免疫缺乏異常)；以及可用器官移植或幹細胞恢復、再生或改善與異常相關之徵候及/或症狀之任何其他異常。本發明之方法可用於治療勃起功能障礙以及用於女性之整形外科或乳房移植。

治療個體中大腦或中樞神經組織損傷或減輕該異常之症狀之方法亦在本發明之範圍內。該方法包括鑑定罹患腦組織損傷或有發展成該症之虞之個體。該個體可為人類或非人類哺乳動物，諸如貓、狗或馬。該腦組織損傷之例子包括由腦缺血(例如慢性中風)所引起者或神經退化性疾病(例如帕金森氏症、阿茲海默症、脊髓小腦疾病、亨丁頓氏舞蹈症)。待治療之個體可藉由診斷所論及之病況或異常之標準技術來鑑定。治療方法包含將有效量之上述幹細胞或活性作用劑/化合物投與至需要其之個體。

可根據標準方法評估此等幹細胞之療效。例如，為了確證在促進腦血管之血管新生上之效力，可在治療之前及之後藉由標準的腦照影技術檢查該個體，此等腦照影技術諸如電腦斷層攝影(CT)、都普勒(Doppler)超音波造影(DUI)、磁共振造影(MRI)、及質子磁共振光譜術(¹ H-MRS)。例如，¹ H-MRS代表取得與腦代謝活性相關之生化資訊之非侵入性手段(Lu et al., 1997, Magn. Reson. Med. 37, 18-23)。該技術可應用於評估在施行或不施行幹細胞移植下涉及腦缺血之代謝改變。例如，其可用於研究腦中N-乙醯基天冬胺酸(NAA)濃度，NAA為神經元完整性之標記。雖然NAA之再分佈及陷於神經元碎片限制其做為定量性神經元標記之用途，但腦缺血時腦中NAA濃度降低被認為係神經元減損或功能不良之指標(Demougeot et al., 2004, J. Neurochem. 90, 776-83)。所以，藉由¹ H-MRS測得之NAA濃度為追蹤腦缺血後幹細胞移植之效果之有用指示劑。

基因治療

在本文中所述之幹細胞可用於表現外源性重組多胜肽。因此，此種含有重組核酸之幹細胞在本發明之範圍之內。該重組核酸可編碼多胜酞且該幹細胞可含有編碼多胜肽之mRNA。

此等幹細胞可予以基因加工(genetically manipulated)，以使其不會表現β2-微球蛋白基因或不會表現1種或多種由第I類主要組織相容性複合體(MHC)基因所編碼之蛋白質，該蛋白質會激發T淋巴球所媒介之對抗細胞之反應。既然此等細胞不會導致移植片之宿主排斥，因此可將此等細胞用做全適供體細胞。

所以，本發明之一特徵為將異源核酸引進個體中之方法。該方法包括取得上述幹細胞以及將該等細胞投與至需要其之病患之步驟，其中該等幹細胞之至少一個包括異源核酸。該異源核酸可編碼多胜肽。

術語「異源」為相對性術語，當用於描述核酸之部分時表示該核酸包含2個或更多個亞序列，此等亞序列彼此之關係在自然界中未被發現。例如，以重組方式產生之核酸典型地具有2個或更多個來自不相關基因之序列，此等序列被人工排列而製成新穎的功能性核酸，此等序列例如為來自一來源之啟動子及來自另一來源之編碼序列。因此，在本文中該二核酸被稱為彼此異源。重組核酸，當被加入細胞中時，對於該細胞之內生性基因而言亦為異源。因此，在染色體中，異源核酸將包括被整合入該染色體之非原生(非天然產生)核酸、或非原生(非天然產生)染色體外核酸。相對地，染色體之天然易位片段在本申請案之範疇內不被認為係屬異源，因為其包含對突變細胞而言為原生之內生性核酸序列。同樣地，異源蛋白質表示該蛋白質包含2個或更多個亞序列，此等亞序列彼此之關係在自然界中未被發現(例如，「融合蛋白質」，其中該二亞序列係由單一核酸序列所編碼)。此種蛋白質可藉由重組技術產生。

術語「重組」，當用於描述，例如，細胞、核酸、蛋白質或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由異源核酸或蛋白質之引進或者原生核酸或蛋白質之改變而修飾，或者表示從如此修飾之細胞衍生之細胞。因此，舉例言之，重組細胞表現在細胞之原生(天然)形式中未曾發現之基因，或者表現原生基因之第2套(copy)，該原生基因可為正常或異常表現、已被表現或完全未被表現。

上述幹細胞及方法可用於本技藝已知之各種基因治療方法。基因治療包括活體外及活體內技術。更特定而言，上述幹細胞可用寡核苷酸調節因子(modulator)或編碼該調節因子之核酸分子予以活體外基因加工，然後將該經基因加工之細胞提供給待治療之病患。可調配細胞培養物以投與至病患，例如，可藉由解離該細胞(例如，藉由機械解離)並將該細胞與醫藥上容許之載劑(例如，磷酸鹽緩衝食鹽溶液)充分混合來達成。另一選擇為：可將細胞在適當的生物相容性支持物上培養，然後移植入病患。此等經基因加工之細胞通常為自體的(autologous)以規避異種(xenogeneic)排斥或異型(allotypic)排斥。此等活體外方法為本技藝所熟知。

此等細胞可藉由使用本技藝已知之技術投與寡核苷酸或核酸分子而予以基因加工。例如，寡核苷酸或其他核酸分子可藉由下述方法投與：直接注射「裸露」的核酸分子(美國專利第5,679,647號)或被調配成組合物之核酸分子，其中該組成物係由該核酸分子與1種或多種可促進核酸分子被細胞攝取之其他作用劑[諸如皂素(saponin)(參見，例如，美國專利第5,739,118號)或陽離子多元胺(參見，例如，美國專利第5,837,533號)]調配而成；施行微粒轟擊(例如，經由使用「基因槍」(gene gun, Biolistic)，杜邦公司)；用脂質、細胞-表面受器或轉染劑塗布核酸分子；將核酸分子包封在脂質體、微粒或微膠囊中；投與連結於胜肽之核酸分子，其中該胜肽已知會進入核；或投與連結於配體之核酸分子，其中該配體會遭受受器-媒介之內吞作用而可用於標定特異性表現該受器之細胞類型。

可形成核酸-配體複合物，其中該配體包含可使內涵體(endosome)破裂之融合病毒胜肽，使得核酸免於被溶酶體(lysosome)降解；或者核酸分子可藉由標定特異性受器而在活體內被細胞特異性攝取及表現所標定。此外，在細胞核中引進、表現及蓄積反義(anti-sense)寡核苷酸之有效率方法被記載於美國專利第6,265,167號中，該方法允許該反義寡核苷酸與核中之有意義(sense)mRNA雜交，藉此防止反義核酸被加工或被輸送至細胞質。本發明亦涵蓋藉由本技藝已知之同源重組，將核酸分子引進至細胞內繼而併入宿主細胞DNA中以供表現。

聚核苷酸亦可被併入適當的表現載體中。許多適於基因治療應用之載體在本技藝中為已知(參見，例如，Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy, Eaton Publishing Co. (2000))。

表現載體可為質體載體。製造及純化質體DNA之方法迅速且直接。此外，質體DNA通常不會整合入宿主細胞之基因組，而係以分立的實體維持在游離基因位置，此可免除染色體整合可能引起之基因毒性問題。現在各種質體可容易地從市面獲取且包括從大腸桿菌及枯草桿菌衍生者，此等中有許多經特別設計以供哺乳動物系統使用。可用於本發明之質體之例子包括，但非限於：真核表現載體pRc/CMV (Invitrogen)、pCR2.1 (Invitrogen)、pAd/CMV及pAd/TR5/GFPq (Massie et al., (1998) Cytotechnology 28:53-64)。在一例示之具體實施例中，質體為pRc/CMV、pRc/CMV2 (Invitrogen)、pAdCMV5 (IRB-NRC)、pcDNA3 (Invitrogen)、pAdMLP5 (IRB-NRC)、或PVAX Invitrogen)。

表現載體可為病毒系載體。病毒系載體之例子包括，但非限於：衍生自複製缺陷性反轉錄病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、腺病毒(adenovirus)、腺病毒相關病毒。反轉錄病毒及腺病毒相關病毒載體目前為在活體內轉移外源性寡核苷酸(尤其是轉移至人體內)之首選重組基因輸送系統。此等載體提供基因之有效率輸送至細胞內，且被轉移之核酸被安定地整合入宿主之染色體DNA。使用反轉錄病毒之主要先決條件係確保其使用之安全性，尤其是有關將野生型病毒散布於細胞群之可能性。可從反轉錄病毒載體衍生之反轉錄病毒包括，但非限於：莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒、脾臟壞死病毒、勞氏(Rous)肉瘤病毒、哈維(Harvey)肉瘤病毒、鳥類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及哺乳動物腫瘤病毒。特異性反轉錄病毒包括pLJ、pZIP、pWE及pEM，此等為精於本技藝人士所熟知。

建立細胞銀行

本發明之特徵為便於系統性存取不同幹細胞系之幹細胞銀行或細胞庫。在該銀行或庫中之SB細胞群衍生自健康個體或具有已知疾病狀態或疾病症狀之個體，其對於使用者，例如，研究者為無價的。具有從上述幹細胞分化而來之細胞之細胞銀行或細胞庫亦在本發明之範圍內。從幹細胞分化而來之細胞之例子包括：腦細胞、神經元、星形細胞、膠質細胞、T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、胰島細胞、脂肪細胞、心臟細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、肺臟細胞、肌肉細胞及眼睛細胞。該個體可為人類或非人類脊椎動物。幹細胞可衍生自任何哺乳動物，諸如人類、小鼠、兔子、牛、豬等。

在銀行或庫中之細胞係根據預定之特徵來分類，此等特徵包括表型資料、形態特徵、分化模式、血形、主要組織相容性複合體、供體(donor)之疾病狀態、或基因型資料(例如，與基因相關之特異性核酸序列之單一核酸多型性(SNP)、或者基因組DNA或粒線體DNA)。此等細胞貯存於適當之條件(通常被冷凍)以使此等幹細胞保持存活及具有功能。編目(cataloguing)可建立所得到之各細胞群之特徵之集中記錄，諸如，但非限於：書寫記錄或輸入有資料之電腦資料庫。本具體實施例主要係關於幹細胞銀行之製造。幹細胞銀行利於從複數個特異性幹細胞之樣品中選出適於使用者需要之樣品。因此，本發明之另一具體實施例係關於幹細胞銀行，其包含從分離來源取得之複數個幹細胞樣品且根據至少一種預定特徵鑑定此等樣品之特徵及編目。另一具體實施例係關於建立幹細胞銀行之方法，該方法包含從多個來源收集幹細胞樣品；根據至少一種預定特徵將此等樣品編目並於可保持細胞存活之條件下貯存細胞。

幹細胞銀行系統亦在本發明之範圍內，該幹細胞銀行系統含有：複數個幹細胞群，此等幹細胞群被配置在個別容器中並貯存在能保持此等幹細胞存活之條件下；資料庫電腦，其包含至少一個處理模組、顯示器、儲存媒體，其中該儲存媒體包含各幹細胞群之至少一種特徵資料；以及至少一個程式碼模組(program code module)，其於使用者下達指令時可使該資料顯現在該顯示器上。在一特定具體實施例中，本發明之幹細胞銀行系統中幹細胞群具有從患有病症之個體得到之幹細胞。該病症可包括上述之退化性疾病。SB細胞群係從患有不同疾病之不同個體收取並鑑定幹細胞之特徵。將該特徵輸入資料庫電腦。此外，或另一選擇，細胞係根據特異性表型鑑定特徵，該特異性表型非必須與病症有關。例如肝細胞可根據其代謝某些化合物(如咖啡因、酒精、藥劑等)之能力來鑑定特徵，以研究此等不同代謝能力之遺傳基礎或與其相關之生理原因。其他類型之細胞可根據功能及/或形態表型來鑑定特徵。

在某些具體實施例中，可經由引進經基因加工之載體或其他遺傳物質而使從SB細胞群中之幹細胞分化而來之細胞處於分化或去分化之條件下。去分化包含處理細胞使其具有較低分化細胞之性質。

本發明之幹細胞庫可用於以上述方式篩選可用於治療退化性異常、癌症、或免疫異常之作用劑或化合物。此等庫適於高通量篩選以及可用於鑑定對於特定個體有特異性療效之作用劑。為了高通量篩選，可將幹細胞引進玻璃片或微晶片製之多孔盤之孔中並可與受試作用劑接觸。一般而言，將細胞排成陣列，尤其是可設定位址的陣列，以致便於使用機器人來操作細胞及溶液以及監測細胞，尤其是有關正在檢查之功能。使用高通量格式之優點在於可併行檢查許多受試作用劑，以及若期望，亦可在與試驗條件相同之條件下進行對照反應。因此，本發明之篩選方法提供篩選一種、少許或大量受試作用劑之手段，以鑑定出可改變幹細胞功能之作用劑，例如，能誘導細胞分化成所期望之細胞類型之作用劑，或者鑑定出，例如，藉由維持調節分子之高度表現而防止自然分化之作用劑。

全適供 體細胞

上述幹細胞可被基因加工以產生移植用之組織相容性供體細胞或組織。移植及細胞治療之目標為用功能性供體組織或器官成功地置換衰竭之組織或器官。不過，為了使移植成功，需要克服2種主要障礙：適當供體組織或器官之可獲取性以及免疫反應。衰竭之組織或器官之置換以及排斥之治療受限於有限數目之合格供體以及對於同時投與毒性免疫抑制藥物及長期免疫抑制療程之需求。目前移植及實驗性移植療程主要仰賴親屬供體、其他少數異體(allogeneic)供體、以及異種(xenogeneic)供體。上述經基因加工之幹細胞可用於克服此等限制。

更特定而言，本文所述之幹細胞可被基因加工成在其表面不會表現第II類MHC分子。更佳地，此等細胞被加工成不會實質地表現所有細胞表面第I類及第II類MHC分子。在本文中，術語「不會表現」意指在細胞表面之表現量不足以激發回應或缺乏被表現之蛋白質以致無法激發回應。

MHC分子係指HLA分子，尤其是HLA A、B、C類及第II類HLA DP、DQ及DR以及此等之亞類。該術語一般被詮釋為專指人類MHC，但在本文中意圖包括來自供體細胞物種之對等MHC基因，例如，若細胞之來源為豬，則不論為MHC I或II，術語HLA皆係指對等豬MHC分子。當第II類MHC分子被移除時，CD4+T-細胞不會識別經基因加工之內皮細胞；當第I類及第II類MHC分子皆被移除時，CD4+及CD8+細胞皆不會識別經修飾之細胞。

對於幹細胞進行之較佳基因修飾包括：1)破壞內生性恆定鏈基因(invariant chain gene)，該基因具有集合及運輸第II類MHC分子至細胞表面並負載抗原性胜肽之功能；以及2)破壞內生性β2-微球蛋白基因(β2 M基因)，該基因編碼所有第I類MHC分子之細胞表面表現所需之蛋白質。另一選擇為：只有恆定鏈基因被破壞。咸信恆定鏈為抗原性胜肽片段插入第II類MHC分子所必需者。抗原性胜肽及MHC係一起由T細胞識別。在抗原性胜肽不存在下，通常得不到T細胞識別，第II類MHC分子也無法適當地折疊。因此，若細胞中缺乏恆定鏈，胜肽之展現(presentation)將缺失，而且即使得到極少量之細胞表面MHC，其也可能無法展現胜肽，所以不會產生免疫作用。

此等基因之破壞可藉由同源重組基因標定技術來達成。此等技術為本技藝所熟知，請參見，例如，美國專利第6916654號及第6986887號。

組成物

本發明提供含有上述細胞或活性作用劑/化合物之醫藥組成物。該醫藥組成物可藉由將治療有效量之細胞或活性作用劑/化合物，視需要連同其他活性物質，與醫藥上容許之載劑混合而製備。該載劑可視投與途徑而具有不同形式。其他活性物質之例子包括已知或藉由上述篩選方法所鑑定出之活性化合物。

上述醫藥組成物可藉由使用習知醫藥賦形劑及製備方法來製備。可將所有賦形劑與崩散劑、溶劑、製粒劑、潤濕劑及黏合劑混合。在本文中，術語「有效量」或「治療有效量」係指能使特異性異常之至少一種症狀或變數有可測得之改善之量。上述幹細胞之治療有效量可由本技藝已知之方法決定。治療異常之有效量可容易地由本技藝中具有普通技術之人士所已知之經驗法來測定。投與至病患之確切量將視異常之狀態及嚴重度以及病患之身體狀況而變。任何症狀或變數之可測得改善可由精於本技藝人士所測定或由病人向醫師報告。應了解上述異常之任何症狀或變數之任何臨床上或統計學上有意義之減輕或改善皆在本發明之範圍內。臨床上有意義之減輕或改善意指可由病患及/或醫師覺察到者。

片語「醫藥上可容許」係指此種組成物之分子實體及其他成分當投與至人類時，為生理上可耐受且通常不會產生不期望之反應。較佳地，術語「醫藥上可容許」係指聯邦政府或州政府之管理機構所許可，或者美國藥典或其他一般公認之藥典所列出用於哺乳動物，更特定而言，用於人類者。醫藥上容許之鹽、酯、醯胺及原藥係指在經深思熟慮的醫療判斷下，被認為適合用於與病患之組織接觸且無過度的毒性、刺激、過敏反應等而與合理的利/弊比相稱，且就其之預期用途而言為有效的那些鹽(例如羧酸鹽、胺基酸加成鹽)、酯、醯胺及原藥。

應用於上述醫藥組成物之載劑係指與化合物一起投與之稀釋劑、賦形劑或載劑。此等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油。較佳地使用水或水溶液、食鹽溶液以及葡萄糖及甘油水溶液，尤其是注射溶液，作為載劑。適當的醫藥載劑被記載於Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin, 18th Edition。

可將上述幹細胞經由輸注或注射(例如，靜脈內、鞘內、肌內、腔內、氣管內、腹膜腔內或皮下)、口服、穿皮、或本技藝已知之其他方法投與至個體。投與可為每2星期1次，每星期1次或更常，但在疾病或異常之維持期(maintenance phase)可減少頻率。

可使用異源及自體細胞二者。在前一情況中，應進行HLA-配對以避免或減少宿主反應。在後一情況中，將自體細胞從個體富化及純化並貯存供稍後使用。此等細胞可於存在宿主或活體外移植T細胞下培養並將其再引進宿主中。此可具有宿主本身能識別該等細胞之優點以及提供較佳的T細胞活性降低。

劑量及投與頻率視臨床徵候而定，藉由精於本技藝人士所已知之急性期臨床徵候之至少1種或多種(較佳多於1種)減少或消失來確證緩解期之維持。更廣泛言之，劑量及頻率係部分視以上述組成物所治療之病理性徵候以及病況或異常之臨床及亞臨床症狀之消退而定。劑型及投與法可視所投與對象之年齡、性別及身體狀況，在待治療之病患或哺乳動物個體中之效益及副作用，以及醫師之判斷而定，如精於本技藝的人士所了解。在所有上述方法中，可將幹細胞以每次1x10⁴ 至1x10¹⁰ 之量投與至個體。

評估方法

本文所揭示之幹細胞及方法可用於評估個體。一般而言，年輕的健康個體具有相對較高比率之幹細胞(諸如SSEA4⁺ 細胞、CD66e⁺ /BLSCs、或CD9⁺ /SB-1細胞)。如在下文實施例4中所討論，當個體老化時或因遺傳缺陷或暴露於不利的環境因子，此等細胞之數目或百分率減少。該減少危害個體之幹細胞相關性能力，包括受傷後修復組織之能力。

在下文之實施例4中亦顯示，此等改變可被用於評估個體患有老化相關性異常之風險。例如，若個體具有高於平均值之幹細胞，則其具有受傷後修復組織之優異能力以及發生癌症之高度風險。換言之，在得自個體之樣品中上述幹細胞之高濃度表示個體具有年輕的發育狀態且(1)修復組織損傷、從受傷恢復、及防禦致病菌之之能力較佳以及(2)發生自體免疫疾病、心血管疾病、糖尿病及其他與老化相關之異常之機率較低。另一方面，此種較高濃度與罹患癌症之較高風險性呈正向關係。

下文中之特異性實施例僅為例示說明，非以任何方式限制揭示內容之其餘部分。咸信在未進一步詳細闡述下，精於本技藝人士可依據本文中之說明充分利用本發明。本文所引用之所有刊物以其全文被引用之方式納入。再者，下文所提出之任何機制不會以任何方式限制所請求發明之範圍。

實施例 1

從人抽取血液樣品及骨髓樣品並置於抗凝血EDTA試管或肝素試管中。將該試管於4℃靜置6至48小時後，該樣品分離成2層。上層含有SB細胞群，其係進一步藉由C6 Accuri流式細胞測量術、免疫細胞化學及RNA萃取/RT-PCR進一步分析。底層含有紅血球及白血球，此等不小於6.0微米。

在頂層中之粒子藉由流式細胞測量術之定尺寸珠粒來分析。發現此等粒子小於6.0微米。已知盤及微量盤比6.0微米小，但沒有核，所以無法被DAPI或SYTO染色。為了檢查粒子，進行DAPI或SYTO染色。結果顯示許多粒子以二種染料，即DAPI及SYTO染色時為陽性，此暗示此等粒子為含有DNA核之細胞，而非為血小板及微粒。進一步發現DAPI-陰性粒子為約0.01至1.5微米。此等結果暗示上層(被稱為StemBios細胞群或SB細胞群)含有細胞/幹細胞、血小板及微粒。

為了確證DAPI-陽性粒子實際上為細胞，將此等粒子放在細胞培養皿中並於含有3%FBS及10 nM bFGF及EGF之Opti-MEM培養基中培養。

培養1星期後，於顯微鏡下檢查此等皿。發現粒子之數目增加而且許多尺寸大於3微米之細胞出現。DAPI染色再次展現粒子中之DNA。培養數星期後，此等細胞中之ㄧ些形成圓球。此外，此等細胞中之ㄧ些顯示GAPDH基因表現，如同藉由RT-PCR所展現者，其中RT-PCR所使用之引子為：AGC TGA ACG GGA AGC TCA CT (序列編號: 1)及 TGC TGT AGC CAA ATT CGT TG (序列編號: 2)。

為了進一步確證DAPI陽性粒子為細胞，使用標準技術培育此等粒子並用含GFP表現匣之慢病毒感染。培育後，發現此等粒子表現GFP。由於慢病毒必須整合入染色體才會表現GFP，該結果暗示此等粒子含有染色體。

此等結果證明此等小於3微米之粒子實際上為細胞，其會增殖並產生大於3微米之細胞。

然後對此等細胞進行C6 Accuri流式細胞測量術分析以確證其尺寸。更特定而言，尺寸為0.1至7微米之珠粒與FITC結合並藉由流式細胞測量術分析。根據第一圖所示之此等珠粒之分散模式，測知第二圖所示之P3圈選區中細胞之尺寸為0.3至6微米。相對地，紅血球(RBC)各具有約6微米之尺寸且T淋巴球各具有約6至7微米之尺寸。用DAPI之進一步分析指出在P3圈選區中之90%粒子為活細胞，因為其顯示核染色。

然後對用EDTA試管所製備之SB細胞群中之所有細胞進行細胞標記分析。發現在單離之SB細胞群之P3圈選區(第三圖)中之細胞之70%針對CD9染色時呈強陽性且此等細胞之98%以SYTO染色時呈陽性(第四圖)。在一些情況中，SB細胞群之P3圈選區中之細胞多達90%為CD9⁺ 。此等以SYTO染色呈陽性之CD9⁺ 細胞被命名為「SB-1細胞」。亦發現SB細胞群之P3圈選區(第三圖)中之細胞之約15%於針對下述標記染色時呈陽性，即SSEA1⁺ 、SSEA4⁺ 、CD13⁺ 及/或Stro1⁺ 。幾乎所有此等細胞以SYTO染色時呈陽性(第五圖)。其被命名為「SB-2細胞」。相對地，在P6圈選區中之CD235a⁺ 紅血球(RBCs)以SYTO染色時呈陰性(第六圖)。

再者發現所有被測試之SB細胞群含有CD349⁺ 細胞。在此等CD9⁺ 細胞中，高達約25%亦為CD349⁺ 。RT-PCR分析顯示在SB細胞群中之幹細胞表現CD9、CD349、Oct4、及Nanog，但不表現Sox2及CXCR4。供RT-PCR用之引子示於下文中：

藉由流式細胞測量術測定之40種不同的血液樣品之額外分析顯示SB細胞群之上述P3圈選區含有少於5%之CD31⁺ 、CXCR4⁺ 、CD66⁺ 及/或CD271⁺ 細胞。在大多數樣品中，該區含有少於1%之CD66e或CD66a陽性細胞，而只有三個樣本含有多於2%之CD66e或CD66a陽性細胞。此暗示Blastomere-樣幹細胞非為SB幹細胞群之主要成分。事實上，發現CD9⁺ 或CD9⁺ CD349⁺ 細胞為SB幹細胞群中之主要成分。

再者，發現SB細胞群中之ㄧ些細胞為CD90陽性，CD90為間葉幹細胞(MSCs)之標記；且一些為CD34陽性，CD34為造血幹細胞(HSCs)之標記。但是，此等細胞在SB細胞群之上述P3圈選區之細胞中之比率小於1%。此外，SB細胞群之上述P3圈選區中之細胞，小於1%呈CD133陽性。

即使SB細胞群可能含有血小板，不過，血小板之半衰期只有5~9日。SB細胞群於抽血至EDTA或肝素試管中後，於4℃可存活超過12日且仍具有非常強的CD9及CD349表現。

令人感到興趣地，在一分析檢定中，從患有免疫疾病之18歲病患製備SB細胞群。檢查該樣品之上述幹細胞標記後，發現該病患與健康人(對照濃度)相較，具有較高濃度之SSEA4、CD66e、CXCR4、SSEA1、Stro1、CD34、CD9、CD349、CD56、或CD184。

實施例 2

進行分析以展示上文所指出之增殖之SB細胞為能分化成不同細胞譜系之幹細胞。

簡言之，SB細胞群以上述方式得自個體。然後將此等細胞在分化培養基中培養。二星期後發現在培養基中，CD9⁺ CD349⁺ 細胞及CD9⁺ CD349^- 細胞形成球粒，且該等球粒之細胞為SSEA4(ES細胞標記)、CD66e (BLSC標記)、CD90及CD73陽性。亦發現在SB細胞群中之幹細胞形成受精卵樣之結構且在以膠原包覆之盤上長成多層。

進行另外的分析以檢定SB細胞群進一步分化成外胚層(例如神經細胞及表皮細胞)、中胚層(例如脂肪細胞、成骨細胞及肌肉細胞)及內胚層細胞(例如肝細胞、胰島細胞)之能力。所有用於藉由即時RT-PCR檢測分化標記之引子列於下文：

誘導來自骨髓之SB細胞群表現巢蛋白，巢蛋白係形成神經元(外胚層)及胰島細胞(內胚層)之早期標記。簡言之，將SB細胞群在標準培養基中培養2至4星期，然後轉換至含有10 nM腎上腺糖皮質素及10%FBS之誘導培養基中。經1個月治療後，萃取RNA且基因表現係由即時(Real Time)PCR決定。巢蛋白之表現係由RT-PCR檢測，其中使用引子對：序列編號：37及38。

內皮細胞係以多角形為特徵。檢測2種肝細胞標記(運鐵蛋白及白蛋白)及3種胰島細胞標記(胰島素、α-胎兒蛋白及HNF4α)之表現。此外，西方點漬及ELISA亦檢測在分化細胞中白蛋白之表現。此等結果指示SB細胞群中之幹細胞被分化成肝細胞且一些分化成胰島細胞。

外胚層細胞具有絲樣特徵。SB細胞群中之幹細胞分化成神經元細胞係藉由即時RT-PCR確證；即時RT-PCR檢測許多神經元標記之表現，此等神經元標記包括CD133、巢蛋白、微管-相關性蛋白質II、GABA受器、NR4A2、N-cam、酪蛋白羥化酶、神經絲及Tau。

再者，誘導來自血液之SB細胞群分化成脂肪細胞或成骨細胞，即中胚層細胞。更特定而言，將來自2供體 (供體29及供體32)之血液之SB細胞群接續在培養基A、B、C、D及E中培養。然後，將培養基以脂肪細胞分化培養基(Invitrogen)置換共計8星期。將脂肪細胞用Oil-red-O染色並在OD490 ELISA分光光度計中檢測。供體29之SB細胞群之細胞計數不尋常地高，此造成脂肪細胞計數高。或者，培養基以骨生成培養基(Invitrogen)置換。置換培養基後觀察成骨細胞共計2至4星期。成骨細胞用Alizarin Red染色，並藉由從細胞中萃取Alizarin Red而檢測，其係於分光光度計中於OD 405 nm測量。

為了誘導生成其他中胚層細胞，將在SB細胞群中之幹細胞於含有10 nM腎上腺糖皮質素及10%FBS之培養基中培養。治療1個月後，從此等細胞萃取RNA，且數種基因之表現係由即時PCR測定。肌球蛋白重鏈及骨骼肌球蛋白輕鏈之可檢測表現指示SB細胞群中之幹細胞分化成心肌細胞及骨骼肌細胞。

SB細胞群，如ES細胞，可在MEF供給細胞之上面增殖/生長並在其上生成球體。又，如同ES細胞，在相似條件下，SB細胞群可生成不同類型之細胞且形成類似受精卵之細胞自行分裂之結構。

上述結果暗示SB細胞群在組織中通常為休止狀態。當接收到信號(例如受傷)時，其被活化且分化成適當的組織以修復受損組織。因此，SB細胞群含有成人多能性幹細胞且可用於基因治療、基因銀行、藥物篩選及創建全適供體細胞。又，此等細胞能用於治療退化性疾病、自體免疫疾病或癌症。

實施例 3

進行分析檢定以檢查二價陽離子螯合劑EDTA在SB細胞群中之幹細胞(包括SB-1細胞)上之角色。

簡言之，以在上述實施例1中所述之方式，分別從使用EDTA試管或肝素試管之個體得到SB細胞群。在該二群中SB細胞之數目係藉由標準方法測定。結果示於下表。

在EDTA試管及肝素試管中1至6.0微米之細胞/粒子之百分比分別為約5.8%及0.2%。此等結果暗示EDTA增加SB-1細胞之數目。

再者，用肝素試管製備之SB細胞群被分成二樣品。一樣品與含EDTA之培養基一起培育(「肝素+EDTA」)；另一與不含EDTA之對照培養基(「肝素」)一起培育。培養3日後，測定在該2樣品中小細胞(小於3微米)之比率。亦得到在該2樣品中大細胞(大於3微米)之比率。此等結果示於下文：

此等結果顯示於存在EDTA下，在SB細胞群中之小細胞之數目增加超過300%(161：40)；相對地，大細胞之數目(即非-SB細胞)只增加25%(10：8)。

來自1個體之流式細胞測量數據亦顯示在從SB細胞群之上述P3圈選區中之39.5%至65.1%細胞而來之樣品中，EDTA使CD9⁺ /SB-1細胞之數目增加。相對地，使用肝素試管製備之SB細胞群具有顯著較高比率之細胞為SSEA1⁺ 及CD66e⁺ ，即2-10%。

在EDTA試管中細胞/粒子數目之增加可能係由於血小板及微粒之數目增加。事實上，EDTA可防止血小板及微粒形成凝集物，該凝集物將會沉澱。為了排除該可能性，在進行流式細胞測量之前，將從肝素試管製備之SB細胞群與EDTA一起培育48至72小時。發現粒子數目之增加幾乎均來自幹細胞，幹細胞之尺寸在1微米與6.0微米之間。細胞數目增加50%。

為了進一步純化CD9⁺ 細胞(或移除血小板及微粒)，將從EDTA試管製備之SB細胞群與ADP一起培育約24小時。發現CD9⁺ CD349⁺ 細胞藉由該ADP培育而被進一步富化。CD9⁺ CD349⁺ 細胞佔已與ADP一起培育之SB細胞群之上述P3-圈選區中之細胞之15.9%；相對地，CD9⁺ CD349⁺ 細胞佔未與ADP一起培育之SB細胞群之上述P3-圈選區中之細胞之9.9%。

此等結果亦顯示EDTA特異性地增加SB-1細胞之數目，該SB-1細胞小於6.0微米且染色呈CD9陽性(CD9⁺ )，但非CD66e⁺ 或SSEA4⁺ 細胞。該機制與EDTA壓抑p53之功能之能力(可能藉由螯合Zn⁺⁺ )有關，藉由壓抑p53之功能，可允許幹細胞離開G0休止期並進入細胞週期G1。由於p53蛋白質需要Zn⁺⁺ 才能適當地折疊，形成功能性蛋白質，藉由EDTA螯合Zn⁺⁺ 為活化幹細胞之關鍵步驟。EDTA與其他二價離子螯合並藉此活化在G0期之幹細胞且迫使此等幹細胞增殖及擴增亦有可能。

實施例 4

如下文所討論，可使用SB細胞群之細胞計數評估個體罹患老化-相關異常或癌症之風險。

根據流式細胞測量術，2名超過50歲之男人，在SB細胞群之上述P3-圈選區中之CD349⁺ 細胞之百分比皆低於15%，亦即分別為12.0%及4.2%。相對地，2名小於25歲之健康男人，在SB細胞群之CD349⁺ 細胞之百分比皆高於15%，亦即分別為18.6%及22.9%。此等結果顯示年輕健康個體與年老健康個體相較，所具有之SB細胞群之細胞計數相對較高。老年相關疾病減損個體以幹細胞為基礎之能力，包括受傷後修復組織之能力。

又，藉由流式細胞測量術測定時，SSEA4⁺ 細胞佔從年輕癌症倖存者單離之SB細胞群之上述P3-圈選區中之細胞之35.6%。該細胞計數遠高於健康年輕人組之平均值。根據該高於平均值之SSEA4計數，預測該個體具有修復受傷組織之優異能力以及發展成癌症之高度風險。該評估可藉由下述確證：(1)該個體具有良好修復能力之病史，包括迅速從眼睛近視雷射(Lasik)手術及腹部手術恢復以及(2)個體之癌症病史。可使用本文所揭示之CD9⁺ 細胞進行相似評估。

上述結果暗示使用上述肝素試管製備之SB細胞群中之幹細胞(例如SSEA4⁺ 細胞/SB-2或CD9⁺ /SB-1細胞)可用做活體內藥物篩選、從傷害或感染恢復之預後、以及癌症診斷之生物標記。高濃度之SSEA4⁺ 或CD9⁺ 細胞表示該個體呈年輕發育狀態且具有較佳的修復組織損傷、從傷害恢復及防禦致病菌之能力。另一方面，其與較高的罹患癌症風險性有正向相關性。

實施例 5

在活體內細胞示踪檢定分析中，將從單離自人類骨髓樣品之SB細胞群而來之10⁶ 個細胞靜脈注射至SCID小鼠(實驗組SCID小鼠)之尾部。將PBS靜脈注射至SCID小鼠(對照組SCID小鼠)之尾部，以做為對照。30、60及90日後，從實驗組及對照組SCID小鼠收集骨髓、血液及肌肉。使用流式細胞測量術分析小鼠骨髓樣品。此等結果顯示MSC標記(即人類CD105、EGF受器、Strol及CXCR1)、BLSC標記(即CEA)以及極小胚胎-連結幹細胞(VSEL)標記(即CD133)在實驗組SCID小鼠中可藉由流式細胞測量術檢測到，但在對照組SCID小鼠中則否。此等結果暗示BLSCs、VSELs及MSCs在SB細胞群中之幹細胞之下游。此外，萃取自小鼠肌肉樣品之RNA係藉由RT-PCR分析。人類生肌因子4、SM22、Pax7及GAPDH係藉由即時RT-PCR檢測。所有用於以即時RT-PCR檢測肌肉標記之引子列於下文：

其他具體實施例

本說明書所揭示之所有特徵可以任何組合之方式組合。本說明書所揭示之各特徵可由應用在相同、對等或類似目的之另外特徵所置換。因此，除非另有陳述，所揭示之各特徵僅為一系列對等或相似特徵之例子。

已說明本發明之許多具體實施例。但是，應了解可在不偏離之本發明之精神及範圍下進行各種修改。所以，其他具體實施例亦在下述申請專利範圍之範疇內。

無

第一圖包括5個散點圖(scatter plot)，其顯示估計P1-圈選區(P1-gated region)中之細胞之尺寸用之標準珠粒之尺寸。

第二圖包括3個散點圖，其顯示當以流式細胞測量術分析時在P3-圈選區中各具有小於6微米之尺寸之細胞。左圖為顯示具有大(＞6微米)、小細胞二者之全血之圖；中間圖為顯示純化後在SB細胞群中之細胞之圖；以及右圖為顯示只有緩衝液之圖。

第三圖包括3個散點圖，其顯示在P3-圈選區之SB細胞群，該SB細胞群包括在P2-圈選區之SB-1細胞及在P5-圈選區之SB-2細胞。注意緩衝液、血小板及微粒分別在P4-、P1-、P2-圈選區中。

第四圖包括2個散點圖，其顯示在P2-圈選區之SB-1細胞，該SB-1細胞係從血液中單離而來。如左側格所示，幾乎所有的SB-1細胞以SYTO染色時皆呈陽性。

第五圖包括2個散點圖，其顯示在P5-圈選區之SB-2細胞，該SB-2細胞係從血液中單離而來。如左圖所示，幾乎所有的SB-2細胞以SYTO染色時皆呈陽性。

第六圖包括2個散點圖，其顯示在P6-圈選區之紅血球，該紅血球係從血液中單離而來。如左圖所示，所有紅血球以SYTO染色時皆呈陰性。

無

Claims (7)

1. 一種含有體幹細胞群之組合物用於製備在個體中治療疾病的藥物之用途，該疾病是自體免疫或發炎疾病，其中該體幹細胞群為尺寸為0.3至6.0微米且為CD9+、CD349+、CD90-、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、Stro1+、CD133-、Sox2-、及CXCR4-，以及其中該體幹細胞群係經一種方法製造，包括：將人類血液或骨髓樣品與EDTA在容器中於4℃培養6至48小時直至該樣品分為上層及下層；以及收集該上層，藉此該體幹細胞群予以製造。
2. 如請求項1之用途，其中該疾病是糖尿病。
3. 如請求項1之用途，其中該體幹細胞群係由血液樣品獲得。
4. 如請求項1之用途，其中該體幹細胞群係由骨髓樣品獲得。
5. 如請求項1之用途，其中該血液或骨髓樣品是由該個體獲得。
6. 如請求項1之用途，其中該組合物含有1x10⁶~10¹¹個體幹細胞。
7. 如請求項1之用途，其中該體幹細胞群係經一種方法製造，由以下所組成：將人類血液或骨髓樣品與EDTA在容器中於4℃培養6至48小時直至該樣品分為上層及下層；以及收集該上層，藉此該體幹細胞群予以製造。

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