CN106148274A - 体干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明所描述的为一种体干细胞群，其为0.3至6.0微米且为CD349+。该细胞群通过如下步骤获得：将人类血液或者骨髓样品与EDTA或者肝素在容器中培养直至该样品分为上层及下层；以及收集该上层。该细胞群能够被用于治疗诸如神经退化疾病和自体免疫疾病的状况。

Description

体干细胞
本申请是申请日为2011年8月4日申请的申请号为201180035415.7，并且发明名称为“体干细胞”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本发明系依据2010年8月4日申请的美国临时申请案61/370,600号、2010年9月17日申请的美国临时申请案61/383,842号、2011年2月25日申请的美国临时申请案61/446,669号请求优先权。此等前案以全文引用的方式纳入本案中。
背景技术
干细胞为在活体内或试管内可分化成许多或所有细胞谱系(cell lineages)的多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)细胞。由于其的多能性，一般相信胚胎干(ES)细胞具有治疗退化性或遗传性疾病的远大前景。但是伦理上的考虑阻碍了人类干细胞的使用。非胚胎来源的干细胞则可规避该障碍。因此，对于非胚胎干细胞具有需求。
发明内容
本发明系关于体干细胞，其为多能性或全能性，以及相关方法。
一方面，本发明的特征为经离析的体干细胞，其尺寸为0.3至6.0微米(尺寸为，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)且为CD9+。该经离析的体干细胞可为CD9+CD349+或CD9+CD349-。细胞标记(marker)后的符号“+”代表用标记-特异性抗体染色时显示较强的荧光，而用该抗体的同型(isotype)对照组染色时显示较弱的荧光。细胞标记后的符号“-”代表用标记-特异性抗体染色时所显示的荧光强度与用该抗体的同型对照组染色时所显示者相同。在一具体实施例中，该经离析的体干细胞为非吸附性。在本文中该细胞被称为“SB-1”细胞。
另一方面，本发明的特征为经离析的体干细胞，其尺寸为0.3至6.0微米(尺寸为，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)且为SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Stro1+。在一具体实施例中，该经离析的体干细胞为非吸附性。在本文中该细胞被称为“SB-2”细胞。
又另一方面，本发明的特征为制造体干细胞群的方法。该方法包括：从个体(例如人类或非人类)得到含有多个细胞的体液(例如血液、骨髓、脐带血、月经、及羊水)样品；将该样品与二价阳离子螯合剂(例如，EDTA、EGTA、及柠檬酸钠)或肝素(heparin)在容器中培养直至该样品分为上层及下层；收集该上层；以及从该上层离析一群尺寸为0.3至6.0微米的体干细胞(尺寸为，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)。在该上层中的细胞在本文中被称为“SB细胞”或“SB细胞群”。
在SB细胞群中的体干细胞可为CD9+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Stro1+。例如其可为CD9+CD349+。此等体干细胞非为吸附性且可具有受精卵细胞的形态及生长特征。再者，其可被诱发生成所有3层胚层，即内胚层、外胚层及中胚层。
来自上层的SB细胞的离析可借由根据细胞尺寸的方法(例如离心或过滤)或根据细胞表面标记的方法(例如流式细胞测量术)进行。
该方法进一步包括于收集该上层后，将其与ADP一起培养以允许血小板/微粒沉淀而使干细胞进一步富化(enriched)。此外，该方法亦包括将从肝素处理过的的样品得到的的上层与二价阳离子螯合剂一起培育，以使干细胞活化而从细胞周期G0进入G1。
再一方面，本发明的特征为借由上述方法制备的SB细胞群。
又再一方面，本发明的特征为细胞银行，其包括多个群的体干细胞。此等群系借由上述方法从不同个体的体液样品(例如血液及骨髓)分开制备。
本发明的进一步特征为增加样品中所含的干细胞的数目的方法。该方法包括：将二价阳离子螯合剂加至该样品中以及将该样品中的干细胞与二价阳离子螯合剂一起培养。该方法进一步包括在加入螯合剂的前及将该等细胞与螯合剂一起培养的后测定样品中所述及的细胞(例如SB-1细胞、SB-2细胞、以及SB-1细胞与SB-2细胞二者)的计数。待用本方法检验的干细胞的例子包括在SB群中的干细胞，例如SB-1细胞。
评估个体是否有老化相关性异常或癌症的危险的方法亦在本发明的范围内。老化相关性异常的例子包括：自行-修复缺陷、退化性疾病、自体免疫疾病、心血管疾病或糖尿病。该方法包括：个体取得某些体干细胞群，以及测定该体干细胞的计数。所得到的体干细胞可为SB-1细胞或SB-2细胞。此等可为CD9+、CD349+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Stro1+。此等各个的尺寸为0.3至6.0微米。在SB群中的干细胞可借由上述方法得到，较佳使用肝素以将体液样品分离成上层及下层。
若该计数低于第一预定值，则该个体被认定有罹患该异常的危险，或者若该计数高于第二预定值，则该个体有罹患癌症的危险。第一值可从年轻且健康的第一对照个体得到。第二值可从罹患癌症的第二对照个体得到。
本发明亦包括在个体中增加体干细胞的数目的方法。该方法包括将有效量的在SB细胞群中的体干细胞投与至需要其的个体。于投与的前及的后可测定在来自该个体的样品(例如血液及骨髓)中所述及的细胞(诸如SB-1细胞)的个别计数。举例言之，为了实施该方法。可使用在含有10nM-5μM EDTA的250毫升磷酸盐缓冲液中的体干细胞。
最后，本发明的特征为治疗肌肉受伤或肌肉退化性疾病的方法。该方法包含将有效量的在SB细胞群中的体干细胞投与至需要其的个体。该肌肉退化性疾病的例子包括肌肉营养不良症、纤维肌痛、肌肉病变、皮肌炎、多发性肌炎、横纹肌溶解症或心肌炎。
本发明的一个或多个具体实施例的细节述于附图及以下说明中。从该说明及附图以及从权利要求可显而易知本发明的其他特征、目的及优点。
附图说明
图1包括5个散点图(scatter plot)，其显示估计P1-圈选区(P1-gated region)中的细胞的尺寸用的标准珠粒的尺寸。
图2包括3个散点图，其显示当以流式细胞测量术分析时在P3-圈选区中各具有小于6微米的尺寸的细胞。左图为显示具有大(＞6微米)、小细胞二者的全血的图；中间图为显示纯化后在SB细胞群中的细胞的图；以及右图为显示只有缓冲液的图。
图3包括3个散点图，其显示在P3-圈选区的SB细胞群，该SB细胞群包括在P2-圈选区的SB-1细胞及在P5-圈选区的SB-2细胞。注意缓冲液、血小板及微粒分别在P4-、P1-、P2-圈选区中。
图4包括2个散点图，其显示在P2-圈选区的SB-1细胞，该SB-1细胞系从血液中离析而来。如左侧格所示，几乎所有的SB-1细胞以SYTO染色时皆呈阳性。
图5包括2个散点图，其显示在P5-圈选区的SB-2细胞，该SB-2细胞系从血液中离析而来。如左图所示，几乎所有的SB-2细胞以SYTO染色时皆呈阴性。
图6包括2个散点图，其显示在P6-圈选区的红血球，该红血球系从血液中离析而来。如左图所示，所有红血球以SYTO染色时皆呈阴性。
详细说明
本发明至少部分系基于下述未预期的发现：(i)多能性或全能性干细胞群，即SB细胞群可从一般相信不含细胞的样品中离析出；(ii)二价阳离子螯合剂(例如EDTA)会活化该群中的多能性或全能性干细胞并在未使其丧失其分化潜力下强迫其增殖；以及(iii)该多能性或全能性干细胞群可被分化成外胚层、内胚层及中胚层细胞。在该群中的SB-1细胞针对CD9染色时呈阳性，在该群中的SB-2细胞于染色时下述标记的1个或多个呈阳性，即SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Stro1+。SB细胞群、SB-1细胞及SB-2细胞可从人类或非人类动物离析。为上述体干细胞的取得来源的非人类动物的例子如下：灵长类、狗、啮齿动物、天竺鼠、猫、马、牛、羊及猪。换言之，其包括，但非限于，宠物动物、农场动物、实验动物及疾病-模型动物。
A.细胞
本发明系关于SB细胞群，其系从非胚胎来源制备的多能性或全能性干细胞。如同ES细胞，在该群中的细胞为全能性或多能性。更重要地，该群可以极高产率容易地得到。所以在治疗各种退化性疾病或组织损伤时可用于再生已分化的功能性细胞。如下述实施例所示，该群可容易地在试管中制备、维持及扩增，且可借由使用例行的技术途径诱发其分化。此外，于将该群中的干细胞移植至动物个体(例如小鼠)时，无恶性肿瘤生长的迹象。此等干细胞，由于含有正常的染色体组(chromosomal complement)，所以非由谱系提交(lineage-uncommitted)而可形成身体的所有体细胞(非生殖细胞)。其亦可形成生殖配子即精子及/或卵子、胚胎的细胞及组织、以及胎盘的胎儿部分。此等干细胞能回应谱系-诱生剂、增殖剂、以及分化抑制剂。由于此等优点，其可做为其他干细胞的替代物。
术语“干细胞”在本文中系指全能性或多能性细胞，亦即此等细胞能分化成许多的最终分化细胞类型。全能性干细胞典型地具有发育成任何细胞类型的能力。全能性干细胞在来源上可为胚胎或非胚胎。多能性干细胞典型地为能分化成数种不同的最终分化细胞类型的细胞。单能干细胞只能产生一种细胞类型，但具有自行换新(self-renewal)性质，此为其与非干细胞的区别。此等干细胞可源自各种组织或器官系统，包括血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨格、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺等。
本文所揭示的干细胞为实质纯。该术语“实质纯”，当用于描述干细胞或从其衍生的细胞(例如分化细胞)时。意指特定细胞构成制剂中的大部分细胞(即，例如，大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。一般而言，实质纯化的细胞群系构成制剂中的至少约70％的细胞，通常构成制剂中的约80％的细胞，尤其构成制剂中的至少约90％的细胞(例如，95％、97％、99％或100％)。因此，本发明具有“可得到特定类型细胞(例如，SB-1细胞)的实质纯群体而未被其他类型细胞污染”的优点。
可用来自个体的各种含细胞样品制备本发明的细胞群。在本发明的较佳具体实施例中，细胞群系从血液或骨髓样品制备。
为了确证该被离析的群实际上含有SB-1细胞，可检查许多特征，包括(1)悬浮液中细胞的尺寸系在0.3至6.0微米之间，以0.5至5.0微米为较佳，以及(2)细胞表面标记。可使用对抗细胞表面标记(诸如CD9)的抗体。此等抗体可与适当的卷标结合，此等卷标诸如荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)或量子点。SB-1细胞，其为CD+，可借由使用流式细胞仪而进一步富化。
此等经离析或富化的细胞然后借由标准技术检验。为了确证在SB细胞群中的干细胞的分化潜力，其借由本技艺已知的方法诱发以形成，例如，神经-胶质细胞、骨细胞及含脂肪细胞。例如，将此等细胞继代培养至细胞长满生长平面，然后移至生骨培养基或生脂培养基上并培养适当时间(例如3星期)。骨生成的分化潜力系借由钙蓄积的矿化(mineralization)而评估，该矿化可借由冯科萨(von Kossa)染色显现。为了检定生脂分化，细胞内脂肪小滴可借由油红O(Oil Red O)染色及于显微镜下观察。就神经分化而言，可将此等细胞在生神经(neurogenic)培养基中培养适当期间(例如7日)，然后承受血清耗竭(serumdepletion)及与巯基乙醇一起培养。分化后，其显示具有被排列成网状的延伸轴突样结构的可弯折细胞体的形态。进一步进行谱系特异性标记的RT PCR及免疫细胞化学染色以确证神经分化。此等标记的例子包括具神经元特异性的第III类—微管蛋白(Tuj-1)、神经丝(neurofilament)及GFAP。
或者，为了确认经离析细胞的身份，可利用SB-1细胞会响应二价阳离子螯合剂(EDTA)而迅速增殖的发现。为此，可将经离析的细胞与，例如，EDTA，一起培育。于该条件下，SB-1细胞将增殖。相对照地，CD66e+细胞行为模式不同。
可将SB细胞群中的干细胞在未分化培养基中进一步繁殖达10、20、50或100次倍增，且不会显示自然的分化、衰老、形态改变、生长速率增加或分化成神经元的能力改变。此等干细胞于使用前可借由标准方法贮存。
术语“增殖”及“扩增”在本文中用于描述细胞时可交换使用，其系指借由分裂相同类型的细胞的数目增加。术语“分化”系指使细胞变得特殊化而具有特定功能的发育过程，例如细胞获得1种或多种不同于初始细胞类型的形态特征及/或功能。术语“分化”包括谱系提交(lineage commitment)及终末分化过程。分化可借由，例如利用免疫组织化学或其他精于本技艺者已知的其他程序监测谱系标记的存在与否来评估。从祖先细胞衍生的已分化后代细胞可，但非必须，与做为干细胞的来源组织的相同胚层或组织有关。例如，神经祖先细胞及肌肉祖先细胞可分化成造血细胞谱系。
术语“谱系提交(lineage commitment)”及“特异化(specification)”在本文中可交换使用，系指干细胞所经历的一过程，其中该干细胞生成祖先细胞，该祖先细胞被提交形成有限范围的特定类型的分化细胞。被提交的祖先细胞常能够自行换新或细胞分裂。
术语“终末分化(terminal differentiation)”系指细胞最终分化为成熟、充分分化的细胞。例如，神经祖先细胞及肌肉祖先细胞可分化成造血细胞谱系，该造血细胞谱系的终末分化导致分化成属特定细胞类型的成熟血球。通常，终末分化连同发生从细胞周期的抽离及增殖的中止。术语“祖先细胞”在本文中系指被提交于特定细胞谱系的细胞，其借由一系列的细胞分裂生成该谱系的细胞。祖先细胞的一例可为成肌细胞，其能够只分化成一类型的细胞，但其本身未充分成熟或充分分化。
具有多个上述干细胞群的细胞银行或细胞库在本发明的范围内。此等干细胞可为人类细胞或非人类细胞。该银行可借由下述方法制备：分别从不同的个体收取SB细胞群；赋予此等SB细胞群特征以使各群得到至少一预定特征，根据该至少一预定特征将此等SB细胞群的各个分类。为了制备该银行，可将SB细胞群进一步扩增。该特征的例子包括个体的名字、性别、身体状况(包括遗传异常及MHC信息)。
B.细胞的使用
含有例如SB-1细胞的上述SB细胞群可以各种方式使用。
筛选方法：
在SB细胞群中的上述干细胞可被用于筛选分析以鉴定出可影响特定细胞类型的药物，而指示出在治疗与该细胞类型相关的异常上有用的药物。例如，可将干细胞用于鉴定治疗疾病(例如退化性疾病)的候选药的方法。该方法包括使受试化合物与干细胞接触并测定于该疾病中被下调的多肽的表达度(level)的步骤。存在该受试化合物下的表达度，若高于不存在该化合物下的表达度，则该化合物为治疗该疾病的候选药。该疾病的例子包括：糖尿病、神经退化疾病、关节炎、癌症或自体免疫异常。表达度系以mRNA量(level)或蛋白质量来测定。
因此，本发明的一态样系关于鉴定会改变SB细胞群中未分化细胞的功能的作用剂(agent)的方法，其系借由将该等细胞与受试作用剂接触。存在该受试作用剂下细胞的功能或基因表达度与不存在该受试作用剂下的功能相较发生改变，表示该受试作用剂为能改变细胞的功能或细胞中基因表达的作用剂。术语“受试作用剂”系指正被检查是否具有改变细胞功能或细胞中基因表达的能力的任何分子。虽然该方法通常系用于筛选分析以鉴定具有期望活性的先前未知分子，但本发明的筛选方法亦可用于确证已知具有特定活性的作用剂。
该功能可为典型在细胞中表达(或未表达)的基因的表达，且该作用剂可借由增加或减少被表达基因的表达度、或者借由启动细胞中未表达基因的表达(例如诱导谱系-特异性抗原的表达)而改变该功能。
在一具体实施例中，会影响细胞功能的作用剂为能诱导干细胞分化者，借此产生分化细胞。此等分化细胞可为多潜能(multipotential)人类干细胞(例如造血干细胞)或终末分化细胞(例如，肌肉细胞、神经元细胞、血球、结缔组织或上皮细胞)。因此，该方法可被用于鉴定能诱导在SB细胞群中的干细胞分化成终末分化细胞的作用剂，其中终末分化细胞包括胰脏β细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞或任何其他细胞类型。如此鉴定出的作用剂或化合物可用于治疗退化性异常、癌症或免疫异常。
表达度系以mRNA量(level)或蛋白质量来测定。测量样品中mRNA量的方法在本技艺中为熟知。为了测量mRNA量，可将细胞溶裂，在溶裂物中mRNA的量，不论纯化与否，皆可借由例如杂交分析(使用附有可检测标签的基因-特异性DNA或RNA探针)及定量或半定量RT-PCR(使用适当的基因-特异性引物)来测定。另一选择为使用附有可检测标签(例如荧光或酶)的DNA或RNA探针对组织切片或未溶裂细胞悬浮液进行定量或半定量原位杂交分析。另外的mRNA-定量方法包括RNA保护分析(RPA)法及基因表达的系列分析(SAGE)法。
测量样品中蛋白质量的方法在本技艺中亦为熟知。其中一些使用可特异性地结合于标靶蛋白质的抗体(例如单株或多株抗体)。在此种分析中，可使该抗体本身或结合于该抗体的二次抗体附上可检测的标签。另一选择为该抗体可与生物素(biotin)结合。其的存在可由附有可检测标签的抗生物素蛋白(avidin)测定。此等途径的组合(包括“多层三明治”分析)可用于增加此等方法的敏感度。一些蛋白质-测量分析(例如ELISA或西方点渍法)可应用于体液或细胞的溶裂物，以及一些(例如免疫组织化学染色法或荧光流式细胞测量术)可应用于组织切片或未溶裂细胞悬浮液。适当的标签包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶或半乳糖苷酶)、荧光/发光剂(例如荧光、若丹明(rhodamine)、藻红蛋白(phycoerythrin)、GFP、BFP及奈米粒子(例如，QdotTM，由Quantum Dot Corporation供应，Palo Alto，CA)。其他可应用的方法包括定量免疫沉淀或补体固定分析。
受试化合物或作用剂可为任何类型的分子，例如，多核苷酸、肽、模拟肽、类肽(peptoids)(诸如乙烯肽)、小有机分子或类似物，且可以各种方式的任一种作用而改变SB细胞群中干细胞的功能。例如，受试作用剂可借由结合于由细胞所表达的细胞表面受器而作用于细胞外，借此改变通常结合于该受器并经由该受器作用的配体于结合时所媒介的功能。另一选择为：该受试作用剂可为被动或经由主动运输机制横越细胞膜，并在细胞内作用而改变功能者。
肽类受试作用剂可为胺基酸或胺基酸类似物的任何聚合物，其可由约3至4个残基乃至数百个或数千个残基构成。肽类受试作用剂可借由化学合成、或使用蛋白质纯化的方法制备，继而进行蛋白质水解，且若期望，进一步借由层析或电泳方法纯化；或者可从编码聚核苷酸表达。肽类受试作用剂可以已知肽(例如天然肽)为主体，但可从天然序列变化，例如含有一种或多种胺基酸类似物。
聚核苷酸类作用剂可为由磷酸二酯键键结在一起的2个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。该聚核苷酸类作用剂可为RNA或DNA，其可为基因或基因的一部分，例如cDNA、RNAi剂、合成多脱氧-核糖核酸序列或类似物，且可为单股或双股、以及DNA/RNA杂交物。其可为天然核酸分子以及合成分子，该天然核酸分子可从细胞离析，该合成分子可借由例如化学合成方法或借由酶方法(诸如借由聚合物酶连锁反应(PCR))制备。在各种具体实施例中，本发明的聚核苷酸可含有核苷或核苷酸类似物或者磷酸二酯键以外的主干键结。此等核苷酸类似物在本技艺中为熟知且可从市面取得，含有此种核苷酸类似物的聚核苷酸亦复如此(Pagratis et al.,Nature Biotechnol.15:68-73,1997)。
可使用本文所揭示的方法或本技艺已知的其他方法将聚核苷酸类受试作用剂与SB细胞群中的干细胞接触或引进该等干细胞中。一般而言，但非必须，将聚核苷酸引进细胞中，在该细胞中其直接发挥其功能或于转录或转译(translation)或二者的后发挥其功能。例如，该聚核苷酸可编码肽类受试作用剂，该肽类受试作用剂在细胞中被表达并改变该等细胞的功能。聚核苷酸类受试作用剂亦可为或可编码反义分子、核酶(ribozyme)或三联剂(triplexing agent)，其可被设计成标定1种或多种特异性标靶核酸分子。
待筛选的候选作用剂或化合物(例如蛋白质、肽、模拟肽、类肽、抗体、小分子或其他药物)可借由使用在本技艺中已知的组合库方法中的许多途径的任一者而得到。此等库包括：肽库、类肽库(具有肽的官能基，但具有对酶降解有抗性的新颖非肽类主干)；可空间寻址的并行固相(spatially addressable parallel solid phase)库或溶液相库；借由重迭合法(deconvolution)或亲和性层析选择得到的合成库；以及“一株粒、一化合物”库。参见，例如，Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145。分子库的合成方法的例子记载于，例如，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；以及Gallop et al.,1994J.Med.Chem.37:1233。化合物库可以溶液形式(例如Houghten,1992,Biotechniques 13:412-421)呈现，或在珠粒(Lam,1991,Nature 354:82-84)、芯片(Fodor,1993,Nature 364:555-556)、细菌(美国专利第5,223,409号)、孢子(美国专利第5,223,409号)、质体(Cull et al.,1992,PNAS USA 89:1865-1869)、或嗜菌体(Felici 1991,J.Mol.Biol.222:301-310；以及美国专利第5,223,409号)上。
治疗退化性异常
可以使用在本文中所揭示的在SB细胞群中的干细胞治疗退化性或遗传性疾病，而可规避人类胚胎处理所涉及的伦理考虑。
为了如此做，可从病患离析SB细胞群，该病患例如为缺少组织或器官适当发育所必需的功能性基因者。然后将编码该基因的功能版(functional version)的表达核酸载体引进SB细胞群中的干细胞中。可经由各种技术将该载体引入干细胞中，此等技术包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-媒介的转染、脂质体转染(lipofection)、电穿孔、显微注射、或病毒-媒介技术。以不会影响该等细胞的多能性为较佳。此等技术的说明记载于，例如，美国专利第7,422,736号及第5,591,625号。将功能基因输送入干细胞后，可用本技艺已知的方法将其移植回该病患。当干细胞系从该病患制得时，该治疗不会引起免疫排斥。
另一选择为：可从由健康人制备的SB细胞群制造全适供体细胞(universal donorcells)。制造全适供体细胞的方法在本技艺中为已知，从SB细胞群制造通用多能干细胞的方法述于下文中。
于适当条件下，被移植的干细胞可发育成功能性组织或器官。为了促进该发育，可将诱导细胞发育的因子投与该病人。此等因子可为小分子化合物、肽及核酸。其的例子包括，但非限于，转形生长因子β、骨形成蛋白质(bone morphogenic protein)、及神经生长因子。
全适供体干细胞在研究谱系发育及分化的发育或分化机制上亦有用。可借由使用此种细胞做为模型系统而鉴定出诱导全能或多能干细胞发育成特定组织或器官的条件。再者，可借由使用本技艺已知的分化cDNA筛选而离析出于发育期间扮有角色的基因。可从已被诱导而发育成某种谱系(例如上述神经-胶质谱系)的细胞制备cDNA库。该库继而可用于离析及研究被分化地表达的基因。可进一步研究此等经离析的基因以界定其在个别过程中的角色。相关技术在本技艺中为已知。请参见，例如美国专利第7,422,736号。多能性干细胞亦可借由使用本技艺已知的方法而发育成动物的器官或纯系(clone)。所以，就宠物及家畜产业而言，此等细胞有价值，且可用于保存濒临绝种的动物。
在一方面，本发明的特征为治疗个体退化性疾病的方法。该方法包含将有效量的上述干细胞投与至需要其的个体。在一具体实施例中，此等细胞的至少一种包括重组核酸。该重组核酸可编码多肽且该干细胞可含有编码多肽的mRNA。退化性疾病的例子包括糖尿病、神经退化性疾病及关节炎。神经退化性疾病的例子包括帕金森氏症。
在另一方面，本发明的特征为治疗个体自体免疫性疾病的方法。该方法包括将有效量的上述组成物投与至需要其的个体。
待治疗上述异常的一的个体可借由该特定异常用的标准诊断技术来鉴定。“治疗”系指将组成物(例如细胞组成物)投与至罹患该异常或有发展成该异常的虞的个体，其目的为治愈、减轻、缓解、弥补、延迟出现、预防或改善该异常、该异常的症状、继发于该异常的疾病状态、发展成损伤/异常的倾向。“有效量”系指组成物在接受治疗的个体中能产生医疗上期望结果的量。该治疗方法可单独进行或与其他药物或治疗并用。
退化性疾病系指受犯组织或器官的功能或结构随时间经过逐渐变差，而不论其系因遗传缺陷、受伤、缺乏适当的细胞分化(例如在细胞增殖异常中者)、常态身体负荷(normal bodily wear)或生活方式的选择。退化性疾病的例子包括神经退化性疾病(例如阿兹海默症、帕金森氏症、亨丁顿氏舞蹈症、多发性硬化症、及肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))；其他神经系统异常(例如，横纹肌炎、脑或脊索外伤后脱髓鞘、急性脑损伤、头部外伤、脊髓损伤、周围神经损伤、缺血性脑损伤、中枢神经系统(CNS)的遗传性髓鞘异常、癫痫、新生儿周产期窒息、窒息、缺氧症、重积性癫痫、谢-德拉格(Shy-Drager)症候群、自闭症及中风)；癌症或相关癌症治疗(例如化学治疗)所引起的病况；代谢性疾病(例如糖尿病及尼曼匹克(Niemann Pick)症)；自体免疫或发炎相关性疾病(例如红斑症、炎性肠疾病(IBD)、干癣症、骨关节炎、骨质疏松症、风湿性关节炎、狼疮、糖尿病及气喘)；眼睛异常(例如，青光眼、网膜色素变性、诺理(Norrie)疾病、以及黄斑点退化)；心脏及循环异常(例如，粥肿样硬化、心衰竭、心肌梗塞及心血管疾病)；血液异常(例如威斯科特-奥尔德里奇(WiscottAldrich)症候群)；肌肉萎缩；胃肠道疾病；肾脏疾病；肝脏疾病；肺脏疾病；肾上腺异常(例如爱迪生氏症)；由伤害引起的病况(例如烧伤、中风、受伤组织(包括外伤、老化受伤细胞及老化受伤组织))；与老化相关的病况(例如掉发，包括雄性秃及圆形秃)；病毒病症(例如C型肝炎感染症及后天免疫缺乏异常)；以及可用器官移植或干细胞恢复、再生或改善与异常相关的征候及/或症状的任何其他异常。本发明的方法可用于治疗勃起功能障碍以及用于女性的整形外科或乳房移植。
治疗个体中大脑或中枢神经组织损伤或减轻该异常的症状的方法亦在本发明的范围内。该方法包括鉴定罹患脑组织损伤或有发展成该症的虞的个体。该个体可为人类或非人类哺乳动物，诸如猫、狗或马。该脑组织损伤的例子包括由脑缺血(例如慢性中风)所引起者或神经退化性疾病(例如帕金森氏症、阿兹海默症、脊髓小脑疾病、亨丁顿氏舞蹈症)。待治疗的个体可借由诊断所论及的病况或异常的标准技术来鉴定。治疗方法包含将有效量的上述干细胞或活性作用剂/化合物投与至需要其的个体。
可根据标准方法评估此等干细胞的疗效。例如，为了确证在促进脑血管的血管新生上的效力，可在治疗的前及的后借由标准的脑照影技术检查该个体，此等脑照影技术诸如计算机断层摄影(CT)、都普勒(Doppler)超音波造影(DUI)、磁共振造影(MRI)、及质子磁共振光谱术(1H-MRS)。例如，1H-MRS代表取得与脑代谢活性相关的生化信息的非侵入性手段(Lu et al.,1997,Magn.Reson.Med.37,18-23)。该技术可应用于评估在施行或不施行干细胞移植下涉及脑缺血的代谢改变。例如，其可用于研究脑中N-乙酰基天冬胺酸(NAA)浓度，NAA为神经元完整性的标记。虽然NAA的再分布及陷于神经元碎片限制其做为定量性神经元标记的用途，但脑缺血时脑中NAA浓度降低被认为系神经元减损或功能不良的指针(Demougeot et al.,2004,J.Neurochem.90,776-83)。所以，借由1H-MRS测得的NAA浓度为追踪脑缺血后干细胞移植的效果的有用指示剂。
基因治疗
在本文中所述的干细胞可用于表达外源性重组多肽。因此，此种含有重组核酸的干细胞在本发明的范围之内。该重组核酸可编码多胜酞且该干细胞可含有编码多肽的mRNA。
此等干细胞可予以基因加工(genetically manipulated)，以使其不会表达β2-微球蛋白基因或不会表达1种或多种由第I类主要组织兼容性复合体(MHC)基因所编码的蛋白质，该蛋白质会激发T淋巴球所媒介的对抗细胞的反应。既然此等细胞不会导致移植片的宿主排斥，因此可将此等细胞用做全适供体细胞。
所以，本发明的一特征为将异源核酸引进个体中的方法。该方法包括取得上述干细胞以及将该等细胞投与至需要其的病患的步骤，其中该等干细胞的至少一个包括异源核酸。该异源核酸可编码多肽。
术语“异源”为相对性术语，当用于描述核酸的部分时表示该核酸包含2个或更多个亚序列，此等亚序列彼此的关系在自然界中未被发现。例如，以重组方式产生的核酸典型地具有2个或更多个来自不相关基因的序列，此等序列被人工排列而制成新颖的功能性核酸，此等序列例如为来自一来源的启动子及来自另一来源的编码序列。因此，在本文中该二核酸被称为彼此异源。重组核酸，当被加入细胞中时，对于该细胞的内生性基因而言亦为异源。因此，在染色体中，异源核酸将包括被整合入该染色体的非原生(非天然产生)核酸、或非原生(非天然产生)染色体外核酸。相对地，染色体的天然易位片段在本申请案的范畴内不被认为系属异源，因为其包含对突变细胞而言为原生的内生性核酸序列。同样地，异源蛋白质表示该蛋白质包含2个或更多个亚序列，此等亚序列彼此的关系在自然界中未被发现(例如，“融合蛋白质”，其中该二亚序列系由单一核酸序列所编码)。此种蛋白质可借由重组技术产生。
术语“重组”，当用于描述，例如，细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已借由异源核酸或蛋白质的引进或者原生核酸或蛋白质的改变而修饰，或者表示从如此修饰的细胞衍生的细胞。因此，举例言之，重组细胞表达在细胞的原生(天然)形式中未曾发现的基因，或者表达原生基因的第2套(copy)，该原生基因可为正常或异常表达、已被表达或完全未被表达。
上述干细胞及方法可用于本技艺已知的各种基因治疗方法。基因治疗包括活体外及活体内技术。更特定而言，上述干细胞可用寡核苷酸调节因子(modulator)或编码该调节因子的核酸分子予以活体外基因加工，然后将该经基因加工的细胞提供给待治疗的病患。可调配细胞培养物以投与至病患，例如，可借由解离该细胞(例如，借由机械解离)并将该细胞与医药上容许的载剂(例如，磷酸盐缓冲食盐溶液)充分混合来达成。另一选择为：可将细胞在适当的生物兼容性支持物上培养，然后移植入病患。此等经基因加工的细胞通常为自体的(autologous)以规避异种(xenogeneic)排斥或异型(allotypic)排斥。此等活体外方法为本技艺所熟知。
此等细胞可借由使用本技艺已知的技术投与寡核苷酸或核酸分子而予以基因加工。例如，寡核苷酸或其他核酸分子可借由下述方法投与：直接注射“裸露”的核酸分子(美国专利第5,679,647号)或被调配成组合物的核酸分子，其中该组成物系由该核酸分子与1种或多种可促进核酸分子被细胞摄取的其他作用剂[诸如皂素(saponin)(参见，例如，美国专利第5,739,118号)或阳离子多元胺(参见，例如，美国专利第5,837,533号)]调配而成；施行微粒轰击(例如，经由使用“基因枪”(gene gun,Biolistic)，杜邦公司)；用脂质、细胞-表面受器或转染剂涂布核酸分子；将核酸分子包封在脂质体、微粒或微胶囊中；投与连结于肽的核酸分子，其中该肽已知会进入核；或投与连结于配体的核酸分子，其中该配体会遭受受器-媒介的内吞作用而可用于标定特异性表达该受器的细胞类型。
可形成核酸-配体复合物，其中该配体包含可使内涵体(endosome)破裂的融合病毒肽，使得核酸免于被溶酶体(lysosome)降解；或者核酸分子可借由标定特异性受器而在活体内被细胞特异性摄取及表达所标定。此外，在细胞核中引进、表达及蓄积反义(anti-sense)寡核苷酸的有效率方法被记载于美国专利第6,265,167号中，该方法允许该反义寡核苷酸与核中的有意义(sense)mRNA杂交，借此防止反义核酸被加工或被输送至细胞质。本发明亦涵盖借由本技艺已知的同源重组，将核酸分子引进至细胞内继而并入宿主细胞DNA中以供表达。
聚核苷酸亦可被并入适当的表达载体中。许多适于基因治疗应用的载体在本技艺中为已知(参见，例如，Viral Vectors:Basic Science and Gene Therapy,EatonPublishing Co.(2000))。
表达载体可为质体载体。制造及纯化质体DNA的方法迅速且直接。此外，质体DNA通常不会整合入宿主细胞的基因组，而系以分立的实体维持在游离基因位置，此可免除染色体整合可能引起的基因毒性问题。现在各种质体可容易地从市面获取且包括从大肠杆菌及枯草杆菌衍生者，此等中有许多经特别设计以供哺乳动物系统使用。可用于本发明的质体的例子包括，但非限于：真核表达载体pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV及pAd/TR5/GFPq(Massie et al.,(1998)Cytotechnology 28:53-64)。在一例示的具体实施例中，质体为pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)、或PVAX Invitrogen)。
表达载体可为病毒系载体。病毒系载体的例子包括，但非限于：衍生自复制缺陷性反转录病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、腺病毒(adenovirus)、腺病毒相关病毒。反转录病毒及腺病毒相关病毒载体目前为在活体内转移外源性寡核苷酸(尤其是转移至人体内)的首选重组基因输送系统。此等载体提供基因的有效率输送至细胞内，且被转移的核酸被安定地整合入宿主的染色体DNA。使用反转录病毒的主要先决条件系确保其使用的安全性，尤其是有关将野生型病毒散布于细胞群的可能性。可从反转录病毒载体衍生的反转录病毒包括，但非限于：莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒、劳氏(Rous)肉瘤病毒、哈维(Harvey)肉瘤病毒、鸟类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及哺乳动物肿瘤病毒。特异性反转录病毒包括pLJ、pZIP、pWE及pEM，此等为精于本技艺人士所熟知。
建立细胞银行
本发明的特征为便于系统性存取不同干细胞系的干细胞银行或细胞库。在该银行或库中的SB细胞群衍生自健康个体或具有已知疾病状态或疾病症状的个体，其对于使用者，例如，研究者为无价的。具有从上述干细胞分化而来的细胞的细胞银行或细胞库亦在本发明的范围内。从干细胞分化而来的细胞的例子包括：脑细胞、神经元、星形细胞、胶质细胞、T细胞、B细胞、软骨细胞、骨细胞、胰岛细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、肺脏细胞、肌肉细胞及眼睛细胞。该个体可为人类或非人类脊椎动物。干细胞可衍生自任何哺乳动物，诸如人类、小鼠、兔子、牛、猪等。
在银行或库中的细胞系根据预定的特征来分类，此等特征包括表型数据、形态特征、分化模式、血形、主要组织兼容性复合体、供体(donor)的疾病状态、或基因型数据(例如，与基因相关的特异性核酸序列的单一核酸多型性(SNP)、或者基因组DNA或粒线体DNA)。此等细胞贮存于适当的条件(通常被冷冻)以使此等干细胞保持存活及具有功能。编目(cataloguing)可建立所得到的各细胞群的特征的集中记录，诸如，但非限于：书写记录或输入有数据的计算机数据库。本具体实施例主要系关于干细胞银行的制造。干细胞银行利于从多个特异性干细胞的样品中选出适于使用者需要的样品。因此，本发明的另一具体实施例系关于干细胞银行，其包含从分离来源取得的多个干细胞样品且根据至少一种预定特征鉴定此等样品的特征及编目。另一具体实施例系关于建立干细胞银行的方法，该方法包含从多个来源收集干细胞样品；根据至少一种预定特征将此等样品编目并于可保持细胞存活的条件下贮存细胞。
干细胞银行系统亦在本发明的范围内，该干细胞银行系统含有：多个干细胞群，此等干细胞群被配置在个别容器中并贮存在能保持此等干细胞存活的条件下；数据库计算机，其包含至少一个处理模块、显示器、储存媒体，其中该储存媒体包含各干细胞群的至少一种特征数据；以及至少一个程序代码模块(program code module)，其于用户下达指令时可使该数据显现在该显示器上。在一特定具体实施例中，本发明的干细胞银行系统中干细胞群具有从患有病症的个体得到的干细胞。该病症可包括上述的退化性疾病。SB细胞群系从患有不同疾病的不同个体收取并鉴定干细胞的特征。将该特征输入数据库计算机。此外，或另一选择，细胞系根据特异性表型鉴定特征，该特异性表型非必须与病症有关。例如肝细胞可根据其代谢某些化合物(如咖啡因、酒精、药剂等)的能力来鉴定特征，以研究此等不同代谢能力的遗传基础或与其相关的生理原因。其他类型的细胞可根据功能及/或形态表型来鉴定特征。
在某些具体实施例中，可经由引进经基因加工的载体或其他遗传物质而使从SB细胞群中的干细胞分化而来的细胞处于分化或去分化的条件下。去分化包含处理细胞使其具有较低分化细胞的性质。
本发明的干细胞库可用于以上述方式筛选可用于治疗退化性异常、癌症、或免疫异常的作用剂或化合物。此等库适于高通量筛选以及可用于鉴定对于特定个体有特异性疗效的作用剂。为了高通量筛选，可将干细胞引进玻璃片或微芯片制的多孔盘的孔中并可与受试作用剂接触。一般而言，将细胞排成数组，尤其是可设定地址的数组，以致便于使用机器人来操作细胞及溶液以及监测细胞，尤其是有关正在检查的功能。使用高通量格式的优点在于可并行检查许多受试作用剂，以及若期望，亦可在与试验条件相同的条件下进行对照反应。因此，本发明的筛选方法提供筛选一种、少许或大量受试作用剂的手段，以鉴定出可改变干细胞功能的作用剂，例如，能诱导细胞分化成所期望的细胞类型的作用剂，或者鉴定出，例如，借由维持调节分子的高度表达而防止自然分化的作用剂。
全适供体细胞
上述干细胞可被基因加工以产生移植用的组织兼容性供体细胞或组织。移植及细胞治疗的目标为用功能性供体组织或器官成功地置换衰竭的组织或器官。不过，为了使移植成功，需要克服2种主要障碍：适当供体组织或器官的可获取性以及免疫反应。衰竭的组织或器官的置换以及排斥的治疗受限于有限数目的合格供体以及对于同时投与毒性免疫抑制药物及长期免疫抑制疗程的需求。目前移植及实验性移植疗程主要仰赖亲属供体、其他少数异体(allogeneic)供体、以及异种(xenogeneic)供体。上述经基因加工的干细胞可用于克服此等限制。
更特定而言，本文所述的干细胞可被基因加工成在其表面不会表达第II类MHC分子。更佳地，此等细胞被加工成不会实质地表达所有细胞表面第I类及第II类MHC分子。在本文中，术语“不会表达”意指在细胞表面的表达量不足以激发响应或缺乏被表达的蛋白质以致无法激发响应。
MHC分子系指HLA分子，尤其是HLA A、B、C类及第II类HLA DP、DQ及DR以及此等的亚类。该术语一般被诠释为专指人类MHC，但在本文中意图包括来自供体细胞物种的对等MHC基因，例如，若细胞的来源为猪，则不论为MHC I或II，术语HLA皆系指对等猪MHC分子。当第II类MHC分子被移除时，CD4+T-细胞不会识别经基因加工的内皮细胞；当第I类及第II类MHC分子皆被移除时，CD4+及CD8+细胞皆不会识别经修饰的细胞。
对于干细胞进行的较佳基因修饰包括：1)破坏内生性恒定链基因(invariantchain gene)，该基因具有集合及运输第II类MHC分子至细胞表面并负载抗原性肽的功能；以及2)破坏内生性β2-微球蛋白基因(β2M基因)，该基因编码所有第I类MHC分子的细胞表面表达所需的蛋白质。另一选择为：只有恒定链基因被破坏。咸信恒定链为抗原性肽片段插入第II类MHC分子所必需者。抗原性肽及MHC系一起由T细胞识别。在抗原性肽不存在下，通常得不到T细胞识别，第II类MHC分子也无法适当地折迭。因此，若细胞中缺乏恒定链，肽的展现(presentation)将缺失，而且即使得到极少量的细胞表面MHC，其也可能无法展现肽，所以不会产生免疫作用。
此等基因的破坏可借由同源重组基因标定技术来达成。此等技术为本技艺所熟知，请参见，例如，美国专利第6916654号及第6986887号。
组成物
本发明提供含有上述细胞或活性作用剂/化合物的医药组成物。该医药组成物可借由将治疗有效量的细胞或活性作用剂/化合物，视需要连同其他活性物质，与医药上容许的载剂混合而制备。该载剂可视投与途径而具有不同形式。其他活性物质的例子包括已知或借由上述筛选方法所鉴定出的活性化合物。
上述医药组成物可借由使用习知医药赋形剂及制备方法来制备。可将所有赋形剂与崩散剂、溶剂、制粒剂、润湿剂及黏合剂混合。在本文中，术语“有效量”或“治疗有效量”系指能使特异性异常的至少一种症状或变量有可测得的改善的量。上述干细胞的治疗有效量可由本技艺已知的方法决定。治疗异常的有效量可容易地由本技艺中具有普通技术的人士所已知的经验法来测定。投与至病患的确切量将视异常的状态及严重度以及病患的身体状况而变。任何症状或变量的可测得改善可由精于本技艺人士所测定或由病人向医师报告。应了解上述异常的任何症状或变量的任何临床上或统计学上有意义的减轻或改善皆在本发明的范围内。临床上有意义的减轻或改善意指可由病患及/或医师觉察到者。
词组“医药上可容许”系指此种组成物的分子实体及其他成分当投与至人类时，为生理上可耐受且通常不会产生不期望的反应。较佳地，术语“医药上可容许”系指联邦政府或州政府的管理机构所许可，或者美国药典或其他一般公认的药典所列出用于哺乳动物，更特定而言，用于人类者。医药上容许的盐、酯、酰胺及原药系指在经深思熟虑的医疗判断下，被认为适合用于与病患的组织接触且无过度的毒性、刺激、过敏反应等而与合理的利/弊比相称，且就其的预期用途而言为有效的那些盐(例如羧酸盐、胺基酸加成盐)、酯、酰胺及原药。
应用于上述医药组成物的载剂系指与化合物一起投与的稀释剂、赋形剂或载剂。此等医药载剂可为无菌液体，诸如水及油。较佳地使用水或水溶液、食盐溶液以及葡萄糖及甘油水溶液，尤其是注射溶液，作为载剂。适当的医药载剂被记载于Remington'sPharmaceutical Sciences by E.W.Martin,18th Edition。
可将上述干细胞经由输注或注射(例如，静脉内、鞘内、肌内、腔内、气管内、腹膜腔内或皮下)、口服、穿皮、或本技艺已知的其他方法投与至个体。投与可为每2星期1次，每星期1次或更常，但在疾病或异常的维持期(maintenance phase)可减少频率。
可使用异源及自体细胞二者。在前一情况中，应进行HLA-配对以避免或减少宿主反应。在后一情况中，将自体细胞从个体富化及纯化并贮存供稍后使用。此等细胞可于存在宿主或活体外移植T细胞下培养并将其再引进宿主中。此可具有宿主本身能识别该等细胞的优点以及提供较佳的T细胞活性降低。
剂量及投与频率视临床征候而定，借由精于本技艺人士所已知的急性期临床征候的至少1种或多种(较佳多于1种)减少或消失来确证缓解期的维持。更广泛言之，剂量及频率系部分视以上述组成物所治疗的病理性征候以及病况或异常的临床及亚临床症状的消退而定。剂型及投与法可视所投与对象的年龄、性别及身体状况，在待治疗的病患或哺乳动物个体中的效益及副作用，以及医师的判断而定，如精于本技艺的人士所了解。在所有上述方法中，可将干细胞以每次1x104至1x1010的量投与至个体。
评估方法
本文所揭示的干细胞及方法可用于评估个体。一般而言，年轻的健康个体具有相对较高比率的干细胞(诸如SSEA4+细胞、CD66e+/BLSCs、或CD9+/SB-1细胞)。如在下文实施例4中所讨论，当个体老化时或因遗传缺陷或暴露于不利的环境因子，此等细胞的数目或百分率减少。该减少危害个体的干细胞相关性能力，包括受伤后修复组织的能力。
在下文的实施例4中亦显示，此等改变可被用于评估个体患有老化相关性异常的危险。例如，若个体具有高于平均值的干细胞，则其具有受伤后修复组织的优异能力以及发生癌症的高度危险。换言之，在得自个体的样品中上述干细胞的高浓度表示个体具有年轻的发育状态且(1)修复组织损伤、从受伤恢复、及防御致病菌的能力较佳以及(2)发生自体免疫疾病、心血管疾病、糖尿病及其他与老化相关的异常的机率较低。另一方面，此种较高浓度与罹患癌症的较高危险性呈正向关系。
下文中的特异性实施例仅为例示说明，非以任何方式限制揭示内容的其余部分。咸信在未进一步详细阐述下，精于本技艺人士可依据本文中的说明充分利用本发明。本文所引用的所有刊物以其全文被引用的方式纳入。再者，下文所提出的任何机制不会以任何方式限制所请求发明的范围。
实施例1
从人抽取血液样品及骨髓样品并置于抗凝血EDTA试管或肝素试管中。将该试管于4℃静置6至48小时后，该样品分离成2层。上层含有SB细胞群，其系进一步借由C6Accuri流式细胞测量术、免疫细胞化学及RNA萃取/RT-PCR进一步分析。底层含有红血球及白血球，此等不小于6.0微米。
在顶层中的粒子借由流式细胞测量术的定尺寸珠粒来分析。发现此等粒子小于6.0微米。已知盘及微量盘比6.0微米小，但没有核，所以无法被DAPI或SYTO染色。为了检查粒子，进行DAPI或SYTO染色。结果显示许多粒子以二种染料，即DAPI及SYTO染色时为阳性，此暗示此等粒子为含有DNA核的细胞，而非为血小板及微粒。进一步发现DAPI-阴性粒子为约0.01至1.5微米。此等结果暗示上层(被称为StemBios细胞群或SB细胞群)含有细胞/干细胞、血小板及微粒。
为了确证DAPI-阳性粒子实际上为细胞，将此等粒子放在细胞培养皿中并于含有3％FBS及10nM bFGF及EGF的Opti-MEM培养基中培养。
培养1星期后，于显微镜下检查此等皿。发现粒子的数目增加而且许多尺寸大于3微米的细胞出现。DAPI染色再次展现粒子中的DNA。培养数星期后，此等细胞中的ㄧ些形成圆球。此外，此等细胞中的ㄧ些显示GAPDH基因表达，如同借由RT-PCR所展现者，其中RT-PCR所使用的引物为：AGC TGA ACG GGA AGC TCA CT(序列编号:1)及TGC TGT AGC CAA ATT CGTTG(序列编号:2)。
为了进一步确证DAPI阳性粒子为细胞，使用标准技术培育此等粒子并用含GFP表达匣的慢病毒感染。培育后，发现此等粒子表达GFP。由于慢病毒必须整合入染色体才会表达GFP，该结果暗示此等粒子含有染色体。
此等结果证明此等小于3微米的粒子实际上为细胞，其会增殖并产生大于3微米的细胞。
然后对此等细胞进行C6Accuri流式细胞测量术分析以确证其尺寸。更特定而言，尺寸为0.1至7微米的珠粒与FITC结合并借由流式细胞测量术分析。根据图1所示的此等珠粒的分散模式，测知图2所示的P3圈选区中细胞的尺寸为0.3至6微米。相对地，红血球(RBC)各具有约6微米的尺寸且T淋巴球各具有约6至7微米的尺寸。用DAPI的进一步分析指出在P3圈选区中的90％粒子为活细胞，因为其显示核染色。
然后对用EDTA试管所制备的SB细胞群中的所有细胞进行细胞标记分析。发现在离析的SB细胞群的P3圈选区(图3)中的细胞的70％针对CD9染色时呈强阳性且此等细胞的98％以SYTO染色时呈阳性(图4)。在一些情况中，SB细胞群的P3圈选区中的细胞多达90％为CD9+。此等以SYTO染色呈阳性的CD9+细胞被命名为“SB-1细胞”。亦发现SB细胞群的P3圈选区(图3)中的细胞的约15％于针对下述标记染色时呈阳性，即SSEA1+、SSEA4+、CD13+及/或Stro1+。几乎所有此等细胞以SYTO染色时呈阳性(图5)。其被命名为“SB-2细胞”。相对地，在P6圈选区中的CD235a+红血球(RBCs)以SYTO染色时呈阴性(图6)。
再者发现所有被测试的SB细胞群含有CD349+细胞。在此等CD9+细胞中，高达约25％亦为CD349+。RT-PCR分析显示在SB细胞群中的干细胞表达CD9、CD349、Oct4、及Nanog，但不表达Sox2及CXCR4。供RT-PCR用的引物示于下文中：
借由流式细胞测量术测定的40种不同的血液样品的额外分析显示SB细胞群的上述P3圈选区含有少于5％的CD31+、CXCR4+、CD66+及/或CD271+细胞。在大多数样品中，该区含有少于1％的CD66e或CD66a阳性细胞，而只有三个样本含有多于2％的CD66e或CD66a阳性细胞。此暗示Blastomere-样干细胞非为SB干细胞群的主要成分。事实上，发现CD9+或CD9+CD349+细胞为SB干细胞群中的主要成分。
再者，发现SB细胞群中的ㄧ些细胞为CD90阳性，CD90为间叶干细胞(MSCs)的标记；且一些为CD34阳性，CD34为造血干细胞(HSCs)的标记。但是，此等细胞在SB细胞群的上述P3圈选区的细胞中的比率小于1％。此外，SB细胞群的上述P3圈选区中的细胞，小于1％呈CD133阳性。
即使SB细胞群可能含有血小板，不过，血小板的半衰期只有5～9日。SB细胞群于抽血至EDTA或肝素试管中后，于4℃可存活超过12日且仍具有非常强的CD9及CD349表达。
令人感到兴趣地，在一分析检定中，从患有免疫疾病的18岁病患制备SB细胞群。检查该样品的上述干细胞标记后，发现该病患与健康人(对照浓度)相较，具有较高浓度的SSEA4、CD66e、CXCR4、SSEA1、Stro1、CD34、CD9、CD349、CD56、或CD184。
实施例2
进行分析以展示上文所指出的增殖的SB细胞为能分化成不同细胞谱系的干细胞。
简言之，SB细胞群以上述方式得自个体。然后将此等细胞在分化培养基中培养。二星期后发现在培养基中，CD9+CD349+细胞及CD9+CD349-细胞形成球粒，且该等球粒的细胞为SSEA4(ES细胞标记)、CD66e(BLSC标记)、CD90及CD73阳性。亦发现在SB细胞群中的干细胞形成受精卵样的结构且在以胶原包覆的盘上长成多层。
进行另外的分析以检定SB细胞群进一步分化成外胚层(例如神经细胞及表皮细胞)、中胚层(例如脂肪细胞、成骨细胞及肌肉细胞)及内胚层细胞(例如肝细胞、胰岛细胞)的能力。所有用于借由实时RT-PCR检测分化标记的引物列于下文：
诱导来自骨髓的SB细胞群表达巢蛋白，巢蛋白系形成神经元(外胚层)及胰岛细胞(内胚层)的早期标记。简言之，将SB细胞群在标准培养基中培养2至4星期，然后转换至含有10nM肾上腺糖皮质素及10％FBS的诱导培养基中。经1个月治疗后，萃取RNA且基因表达系由实时(Real Time)PCR决定。巢蛋白的表达系由RT-PCR检测，其中使用引物对：序列编号：37及38。
内皮细胞系以多角形为特征。检测2种肝细胞标记(运铁蛋白及白蛋白)及3种胰岛细胞标记(胰岛素、α-胎儿蛋白及HNF4α)的表达。此外，西方点渍及ELISA亦检测在分化细胞中白蛋白的表达。此等结果指示SB细胞群中的干细胞被分化成肝细胞且一些分化成胰岛细胞。
外胚层细胞具有丝样特征。SB细胞群中的干细胞分化成神经元细胞系借由实时RT-PCR确证；实时RT-PCR检测许多神经元标记的表达，此等神经元标记包括CD133、巢蛋白、微管-相关性蛋白质II、GABA受器、NR4A2、N-cam、酪蛋白羟化酶、神经丝及Tau。
再者，诱导来自血液的SB细胞群分化成脂肪细胞或成骨细胞，即中胚层细胞。更特定而言，将来自2供体(供体29及供体32)的血液的SB细胞群接续在培养基A、B、C、D及E中培养。然后，将培养基以脂肪细胞分化培养基(Invitrogen)置换共计8星期。将脂肪细胞用Oil-red-O染色并在OD490ELISA分光亮度计中检测。供体29的SB细胞群的细胞计数不寻常地高，此造成脂肪细胞计数高。或者，培养基以骨生成培养基(Invitrogen)置换。置换培养基后观察成骨细胞共计2至4星期。成骨细胞用Alizarin Red染色，并借由从细胞中萃取Alizarin Red而检测，其系于分光亮度计中于OD 405nm测量。
为了诱导生成其他中胚层细胞，将在SB细胞群中的干细胞于含有10nM肾上腺糖皮质素及10％FBS的培养基中培养。治疗1个月后，从此等细胞萃取RNA，且数种基因的表达系由实时PCR测定。肌球蛋白重链及骨骼肌球蛋白轻链的可检测表达指示SB细胞群中的干细胞分化成心肌细胞及骨骼肌细胞。
SB细胞群，如ES细胞，可在MEF供给细胞的上面增殖/生长并在其上生成球体。又，如同ES细胞，在相似条件下，SB细胞群可生成不同类型的细胞且形成类似受精卵的细胞自行分裂的结构。
上述结果暗示SB细胞群在组织中通常为休止状态。当接收到信号(例如受伤)时，其被活化且分化成适当的组织以修复受损组织。因此，SB细胞群含有成人多能性干细胞且可用于基因治疗、基因银行、药物筛选及创建全适供体细胞。又，此等细胞能用于治疗退化性疾病、自体免疫疾病或癌症。
实施例3
进行分析检定以检查二价阳离子螯合剂EDTA在SB细胞群中的干细胞(包括SB-1细胞)上的角色。
简言之，以在上述实施例1中所述的方式，分别从使用EDTA试管或肝素试管的个体得到SB细胞群。在该二群中SB细胞的数目系借由标准方法测定。结果示于下表。
SB细胞
EDTA试管 200x 106/毫升
肝素试管 10x106/毫升
在EDTA试管及肝素试管中1至6.0微米的细胞/粒子的百分比分别为约5.8％及0.2％。此等结果暗示EDTA增加SB-1细胞的数目。
再者，用肝素试管制备的SB细胞群被分成二样品。一样品与含EDTA的培养基一起培育(“肝素+EDTA”)；另一与不含EDTA的对照培养基(“肝素”)一起培育。培养3日后，测定在该2样品中小细胞(小于3微米)的比率。亦得到在该2样品中大细胞(大于3微米)的比率。此等结果示于下文：
“肝素+EDTA”：“肝素”
小细胞 161：40
大细胞 10：8
此等结果显示于存在EDTA下，在SB细胞群中的小细胞的数目增加超过300％(161：40)；相对地，大细胞的数目(即非-SB细胞)只增加25％(10：8)。
来自1个体的流式细胞测量数据亦显示在从SB细胞群的上述P3圈选区中的39.5％至65.1％细胞而来的样品中，EDTA使CD9+/SB-1细胞的数目增加。相对地，使用肝素试管制备的SB细胞群具有显著较高比率的细胞为SSEA1+及CD66e+，即2-10％。
在EDTA试管中细胞/粒子数目的增加可能系由于血小板及微粒的数目增加。事实上，EDTA可防止血小板及微粒形成凝集物，该凝集物将会沉淀。为了排除该可能性，在进行流式细胞测量的前，将从肝素试管制备的SB细胞群与EDTA一起培育48至72小时。发现粒子数目的增加几乎均来自干细胞，干细胞的尺寸在1微米与6.0微米之间。细胞数目增加50％。
为了进一步纯化CD9+细胞(或移除血小板及微粒)，将从EDTA试管制备的SB细胞群与ADP一起培育约24小时。发现CD9+CD349+细胞借由该ADP培育而被进一步富化。CD9+CD349+细胞占已与ADP一起培育的SB细胞群的上述P3-圈选区中的细胞的15.9％；相对地，CD9+CD349+细胞占未与ADP一起培育的SB细胞群的上述P3-圈选区中的细胞的9.9％。
此等结果亦显示EDTA特异性地增加SB-1细胞的数目，该SB-1细胞小于6.0微米且染色呈CD9阳性(CD9+)，但非CD66e+或SSEA4+细胞。该机制与EDTA压抑p53的功能的能力(可能借由螯合Zn++)有关，借由压抑p53的功能，可允许干细胞离开G0休止期并进入细胞周期G1。由于p53蛋白质需要Zn++才能适当地折迭，形成功能性蛋白质，借由EDTA螯合Zn++为活化干细胞的关键步骤。EDTA与其他二价离子螯合并借此活化在G0期的干细胞且迫使此等干细胞增殖及扩增亦有可能。
实施例4
如下文所讨论，可使用SB细胞群的细胞计数评估个体罹患老化-相关异常或癌症的危险。
根据流式细胞测量术，2名超过50岁的男人，在SB细胞群的上述P3-圈选区中的CD349+细胞的百分比皆低于15％，亦即分别为12.0％及4.2％。相对地，2名小于25岁的健康男人，在SB细胞群的CD349+细胞的百分比皆高于15％，亦即分别为18.6％及22.9％。此等结果显示年轻健康个体与年老健康个体相较，所具有的SB细胞群的细胞计数相对较高。老年相关疾病减损个体以干细胞为基础的能力，包括受伤后修复组织的能力。
又，借由流式细胞测量术测定时，SSEA4+细胞占从年轻癌症幸存者离析的SB细胞群的上述P3-圈选区中的细胞的35.6％。该细胞计数远高于健康年轻人组的平均值。根据该高于平均值的SSEA4计数，预测该个体具有修复受伤组织的优异能力以及发展成癌症的高度危险。该评估可借由下述确证：(1)该个体具有良好修复能力的病史，包括迅速从眼睛近视雷射(Lasik)手术及腹部手术恢复以及(2)个体的癌症病史。可使用本文所揭示的CD9+细胞进行相似评估。
上述结果暗示使用上述肝素试管制备的SB细胞群中的干细胞(例如SSEA4+细胞/SB-2或CD9+/SB-1细胞)可用做活体内药物筛选、从伤害或感染恢复的预后、以及癌症诊断的生物标记。高浓度的SSEA4+或CD9+细胞表示该个体呈年轻发育状态且具有较佳的修复组织损伤、从伤害恢复及防御致病菌的能力。另一方面，其与较高的罹患癌症危险性有正向相关性。
实施例5
在活体内细胞示踪检定分析中，将从离析自人类骨髓样品的SB细胞群而来的106个细胞静脉注射至SCID小鼠(实验组SCID小鼠)的尾部。将PBS静脉注射至SCID小鼠(对照组SCID小鼠)的尾部，以做为对照。30、60及90日后，从实验组及对照组SCID小鼠收集骨髓、血液及肌肉。使用流式细胞测量术分析小鼠骨髓样品。此等结果显示MSC标记(即人类CD105、EGF受器、Strol及CXCR1)、BLSC标记(即CEA)以及极小胚胎-连结干细胞(VSEL)标记(即CD133)在实验组SCID小鼠中可借由流式细胞测量术检测到，但在对照组SCID小鼠中则否。此等结果暗示BLSCs、VSELs及MSCs在SB细胞群中的干细胞的下游。此外，萃取自小鼠肌肉样品的RNA系借由RT-PCR分析。人类生肌因子4、SM22、Pax7及GAPDH系借由实时RT-PCR检测。所有用于以实时RT-PCR检测肌肉标记的引物列于下文：
其他具体实施例
本说明书所揭示的所有特征可以任何组合的方式组合。本说明书所揭示的各特征可由应用在相同、对等或类似目的的另外特征所置换。因此，除非另有陈述，所揭示的各特征仅为一系列对等或相似特征的例子。
已说明本发明的许多具体实施例。但是，应了解可在不偏离的本发明的精神及范围下进行各种修改。所以，其他具体实施例亦在下述权利要求的范畴内。

Claims (7)

1.一种经离析的体干细胞群，该体干细胞为0.3至6.0微米且为CD349+，该细胞群是通过以下步骤获得：
将人类血液或骨髓样品与EDTA或肝素(heparin)在容器中培养直至该样品分为上层及下层；
收集该上层；以及
从该上层鉴定和离析一群尺寸为0.3至6.0微米且为CD349+的体干细胞。
2.如权利要求1所述的体干细胞群，其中该群为CD9+、CD133-、CD34-和CD90-。
3.一种如权利要求1或2所述的体干细胞群在治疗以下疾病中的应用，该疾病选自由神经退化性疾病、癌症、自体免疫异常、炎性异常、肝脏疾病、肺脏疾病、心血管异常、糖尿病、肾脏疾病、病毒病症、肌肉受伤、肌肉退化性疾病或伤口组成的组。
4.一种如权利要求1或2所述的体干细胞群用于生成脑细胞、神经元、星形细胞、胶质细胞、T细胞、B细胞、软骨细胞、骨细胞、胰岛细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、肺脏细胞、肌肉细胞、眼睛细胞及成骨细胞的应用。
5.一种如权利要求1或2所述的体干细胞群用于增加人类个体中的干细胞的数目的应用。
6.一种确定体干细胞群的细胞计数的方法，该方法包含：
将人类血液或骨髓样品与EDTA或肝素在容器中培养直至该样品分为上层及下层；
收集该上层；以及
确定在该上层中尺寸为0.3至6.0微米且为CD349+的体干细胞的计数。
7.如权利要求6所述的方法，其中该体干细胞为CD9+、CD133-、CD34-和CD90-。
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