WO2004076652A1 - 椎間板再生用の幹細胞用培地及び幹細胞を用いた椎間板の再生 - Google Patents

椎間板再生用の幹細胞用培地及び幹細胞を用いた椎間板の再生 Download PDF

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intervertebral disc
cell culture
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Joji Mochida
Daisuke Sakai
Takeshi Nomura
Kazuhiro Nishimura
Masahiko Okuma
Yukihiro Yamamoto
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Tokai University
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    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells

Definitions

  • the present invention relates to a stem cell culture medium for intervertebral disc regeneration and treatment of low back pain, particularly intervertebral disc disorders associated with intervertebral disc degeneration.
  • Back pain which accounts for over 40% of orthopedic patients, is a problem that began when humans, who originally had four-legged walking, started standing up walking.
  • the main cause of low back pain is intervertebral disc disorders associated with intervertebral disc degeneration.
  • herniated discs are common in the blues of their 20s and 40s, and are particularly common in middle-aged children, and are a social problem with restrictions on daily life and work disorders.
  • posterior entry hernia resection is currently generally employed as a treatment for intervertebral hernia.
  • nucleus pulposus was removed from the disc after surgery, and the inside of the disc became hollow, and the nucleus pulposus, which is indispensable for maintaining the morphology of the disc, was lost. To promote the problem. Also, progression of disc degeneration has triggered low back pain in herniated discs, lumbar spondylolisthesis, and lumbar spondylolisthesis without surgery.
  • the present inventors have previously conducted experiments to demonstrate that the reactivation of nucleus pulposus cells by a proprietary co-culture system can be used to re-insert the nucleus pulposus cells into the nucleus pulposus of the intervertebral disc, thereby suppressing the degeneration of the disc tissue. (Refer to Non-patent Documents 1 to 3 below) and started clinical application in 2000.
  • Non-patent document 1 Ni shimura K, Mo chida J: Per cutaneous reinsert ion of the nucleus pulposus -An experimental study-. Spine. 22: 1531-1539; 1998
  • Non-Patent Document 2 Okuma M, Mochida J, Nishimura K, Sakabe K, Seiki K: Reinsertion of activated nucleus pulposus cells r eta rds intervertebral disc degeneration-An in vitro and in vivo experimental study-.J Orthop Res. 18 : 983-997; 2000
  • Non-Patent Document 3 Nomura T, Mochida J, et al: Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration -An in vivo experimental study-. Clin. Orthop., 388: 94-101 2001
  • our technology is The number of cells that can be collected in humans is small for widespread clinical applications, and the problem of obtaining fresh nucleus pulposus is that it is not practical to obtain the nucleus pulposus from a healthy disc. Summary of the Invention
  • the present invention provides a method for regenerating an intervertebral disc and a medium for stem cells which can be widely and generally applied to the disorders associated with intervertebral disc degeneration, which overcomes the above-mentioned problems in the treatment of conventional intervertebral disc disorders.
  • the purpose is to:
  • an autoserum obtained by sterilizing and inactivating serum of an individual having an intervertebral disc to be regenerated, a cell culture medium, and a stem cell culture medium for intervertebral disc regeneration comprising at least one antibiotic.
  • a stem cell collected from an autologous or homologous or heterologous solid is directly or cultivated using a cell culture technique, in particular, a stem cell culture medium for intervertebral disc regeneration of the present invention.
  • a method of regenerating an intervertebral disc comprising the steps of suspending or embedding in a cell carrier, and then transplanting the suspension or embedding of the stem cells into the nucleus pulposus of the disc.
  • Fig. 1 (a) shows a normal state of the rabbit intervertebral disc used in the examples
  • Fig. 1 (b) shows a degenerated state thereof
  • Fig. 1 (c) shows a sagittal section of the intervertebral disc in a state after regeneration.
  • Fig. 2 (a) shows the normal state of the rabbit intervertebral disc used in the examples
  • Fig. 2 (b) shows its degenerated state
  • Fig. 2 (c) shows the tissue under the microscope in the sagittal section of the disc after regeneration. It is a drawing (photograph) showing each image.
  • Disc degeneration the leading cause of chronic low back pain, is an irreversible change. Since 1993, we have experimentally demonstrated the effect of re-insertion of the activated nucleus pulposus to suppress degeneration of the disc, with the aim of suppressing and regenerating the disc, and started clinical application. However, the number of cells that can be collected from a degenerated disc is limited, and fresh nucleus pulposus can only be searched for from a healthy disc, and it seems practically difficult to obtain fresh nucleus pulposus. Therefore, an attempt was made to regenerate an intervertebral disc using mesenchymal stem cells or universal stem cells having universal plasticity, and a certain effect was confirmed in animal experiments, leading to the present invention.
  • the stem cells transplanted into the nucleus pulposus of the intervertebral disc provide trophic factors and the like to surrounding cells at the transplant site when transplanted, and also serve as trophic factors derived from surrounding tissues, differentiation-inducing factors, and the like.
  • the stem cells themselves are also induced to differentiate.
  • the stem cells are transplanted into the degenerated disc as described above, the cells are induced into cells showing the characteristics of the disc cells, and the disc tissue can be regenerated.
  • stem cells those derived from autologous or allogeneic or heterologous solids can be used, and specific examples include mesenchymal stem cells and universal stem cells.
  • the collected stem cells can be directly suspended in our newly developed stem cell culture medium for intervertebral disc regeneration, or implanted in cell carriers (eg, agarose, alginate, atherocollagen gel, etc.).
  • cell carriers eg, agarose, alginate, atherocollagen gel, etc.
  • the method of transplanting into the nucleus pulposus of the intervertebral disc is preferable because the regenerating effect of the intervertebral disc is high.
  • a medium for stem cells for intervertebral disc regeneration As a medium for stem cells for intervertebral disc regeneration according to the present invention, a commercially available culture solution generally used for culturing mesenchymal stem cells, A stem cell culture medium containing a growth factor synthesized in advance or serum derived from another animal can be used.
  • a stem cell culture medium containing a growth factor synthesized in advance or serum derived from another animal can be used.
  • stem cell culture medium containing a growth factor synthesized in advance or serum derived from another animal can be used.
  • the disc was regenerated by implanting it into the nucleus pulposus of the disc.
  • a required amount of whole blood is collected from an individual used for transplantation, blood cell components are spun down using a centrifuge, and serum is separated.
  • the serum is sterilized using a sterile filter and heated in a thermostat at, for example, 50 to 70 ° C, preferably 55 to 60 ° C, for example, for 20 to 40 minutes, preferably for 25 to 35 minutes, and inactivated. Is applied.
  • a cell culture medium that has been sterilized in advance, such as DMEM (Dulbecos Modified Eagle Medium), DMEM / F ⁇ 12MEM (Minimum
  • the autologous serum is co-injected into a cell culture medium so as to have a concentration of 1 to 25% by weight, preferably 5 to 20% by weight.
  • These media have been conventionally known as cell culture media and are commercially available. These media can be used as effects or mixtures.
  • an antibiotic having a concentration capable of obtaining an antibacterial action per culture medium and allowing the cultured cells to survive specifically, for example, bencilin: 8,000 to 10,000 U / ml, Tolmycin: 8,000 to 10,000 ⁇ g / ml, Amphotericin B: 20 to 25 ⁇ g / ml, Gentamicin: 0.5 to 50 ⁇ g / ml, Hygromycin B: 25 to 1000 ⁇ g / ml, sulfate Kanamycin: 0.5-5-50 ⁇ g / ml, actinomycin D: 0.5-50 ⁇ g / ml, Neomycin sulfate: A culture medium for stem cells for disc regeneration can be obtained by adding 8,000 to 10,000 ⁇ g / ml alone or as a mixture.
  • the technique for transplanting stem cells into the intervertebral disc tissue is not particularly limited.
  • a technique that can inject a liquid such as a syringe and a gel-like cell carrier after exposing the intervertebral disc or use a skid holder (eg, a bioabsorbable polymer) ) Can be performed by placing it directly in the disc.
  • the disc may have cracks or holes in the disc.
  • a conventional general physiological tissue adhesive for example, fibrin glue
  • connective tissue such as periosteum.
  • This transplantation technique is used to control or regenerate disc degeneration during surgery that directly or indirectly affects the disc (eg, herniated disc).
  • a required amount of whole blood was collected from the ear artery of a 12-week-old rabbit used for transplantation, blood cells were centrifuged using a centrifuge, and serum was separated. This serum was sterilized using a sterilizing filter, and heated at 56 ° C for 30 minutes in a thermostat. Inactivated.
  • the above autologous serum was mixed with a sterilized DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium to a concentration of 10%, and penicillin: 10,000 U / ml, and strep Tomycin: 10,000 ⁇ g / ml, Amphotericin B: 25 ⁇ g / ml, and a medium for stem cells for disc regeneration was prepared.
  • the bone marrow fluid of 12 week old rabbits were harvested, monocytes layer recovered using gravity separation liquid recovery monocyte layer were seeded in culture flask, a constant temperature bath at 37 ° C and 5% C0 2 atmosphere
  • the cells were cultured in the flask until almost all the surfaces of the flask were grown (until they reached subconfluent) (about 14 days).
  • the medium was prepared by introducing an adeno- or leto-mouth virus vector incorporating a marker gene of LacZ (beta-galactosidase) or GFP (Green Fluorescent Protein) into the adherent cells grown in the stem cell culture medium for intervertebral disc regeneration. It was marked so that survival and activity after transplantation could be confirmed.
  • the cells were recovered by trypsinization and used as cells for transplantation.
  • cartilage, bone and adipocytes were induced, and the reproducibility of their plasticity confirmed that they were mesenchymal stem cells.
  • it can be confirmed by examining the leukocyte surface antigen of the bone marrow mesenchymal cells using a mouth-site method.
  • the mesenchymal stem cells obtained above are suspended in the above-mentioned medium for intervertebral disc regeneration, and the cell suspension is directly or embedded in an atelocollagen gel, which is a cell carrier, and then subjected to the above denaturation treatment.
  • the rabbit was implanted into the disc using a syringe with a 27 G needle.
  • the water content in the intervertebral disc was measured by magnetic resonance imaging (MRI), and then euthanized.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the four intervertebral discs were excised, fixed in formalin, decalcified, and embedded in paraffin to prepare a 4 ⁇ m thick sagittal section. Histological and immunohistological studies were performed using these sections to evaluate the degree of degeneration and regeneration in the disc tissue.
  • the water content in the intervertebral disc at the MRI was maintained at a relatively high value as compared with the control degenerated group not transplanted, and the control degenerated group No decrease in intervertebral disc height was observed. Histological examination revealed that the intervertebral disc space into which the mesenchymal stem cells had been transplanted was filled with disc-like cells. In the following five-point evaluation of the degree of disc degeneration, stem cells were compared to those in the control degeneration group at the age of 20 weeks (after 8 weeks), which were already the most degraded grades 4-5.
  • the Grade 0 to 1 was the closest to normal, even at the age of 60 weeks (after 48 weeks).
  • the level of staining of proteodalican also showed that the group transplanted with the stem cells of the present invention showed 3- to 3.5-fold staining as compared with the control degeneration group, and degeneration was suppressed significantly.
  • Grade 1 Light meander Grade 2: Moderate meandering
  • FIGS. 1 (a), (b) and (c) magnification: 4 times
  • FIGS. 2 (a), (b) and (c) Magnification: 10 times
  • FIGS. 1 (a), (b) and (c) show the normal state
  • FIGS. 2 (a), (b) and (c) show the regenerative state
  • Figures 1 (a), (b) and (c) show the sagittal of the disc.
  • FIG. 2 (a), (b) and (c) also show sagittal cut images.
  • 1 is a bone
  • 2 is a nucleus pulposus
  • 3 is an annulus
  • 4 is a cavity
  • 5 Indicates transplanted stem cells.
  • the nucleus pulposus 2 and the annulus fibrosus 3 exist between the bone parts 1 and no degeneration of the disc is observed, but in the degenerated state (b), the nucleus pulposus 2 does not exist and the annulus fibrosus 3 The height of the part has decreased.
  • the transplanted stem cells 5 are induced to differentiate, and although they have different shapes, they are in a state corresponding to the normal state (a).
  • mesenchymal stem cells are transplanted into an intervertebral disc by using the stem cell culture medium for intervertebral disc regeneration according to the present invention
  • degeneration of the intervertebral disc is suppressed, and the transplanted stem cells are transplanted.
  • the differentiation is induced into intervertebral disc-like cells by growth factors and induction promoting factors secreted from the site, and the disc can be regenerated.
  • mesenchymal stem cells are useful as a new transplant material for disc regeneration.
  • the transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells into the intervertebral disc can be performed using all materials. It is considered that this method can be expected for immediate clinical application.
  • the intervertebral disc can be regenerated using stem cells other than mesenchymal stem cells, for example, universal stem cells.

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Abstract

再生すべき椎間板を有する個体の血清を滅菌及び非働化した自己血清、細胞培養用培地及び少なくとも一種の抗生物質を含む椎間板再生用の幹細胞用培地並びに自己又は同種もしくは異種の個体より採取した幹細胞を、直接又は椎間板再生用の幹細胞用培地を用いて培養した後、前記培地中に懸濁せしめるか、又は細胞キャリアーに包埋せしめ、次いでこの幹細胞の懸濁液又は包埋物を椎間板の髄核腔に移植する椎間板の再生方法。

Description

椎間板再生用の幹細胞用培地及び幹細胞を用いた椎間板の再生
発明の技術分野
本発明は、 椎間板再生用の幹細胞用培地及び腰痛、 特に椎間板変 性に伴なう椎間板障害の治療に関する。
明 発明の背景
書
腰痛は整形外科患者の約 4割強を占め、 元来四つ足歩行であった 人類が起立歩行を始めた時から発生した問題である。 腰痛の主たる 原因に椎間板変性にともなう椎間板障害が挙げられ、 中でも椎間板 ヘルニアは 20〜40代の青、 壮年期に好発し、 日常生活制限、 労働障 害を伴う社会問題となっている。 椎間板ヘルニアの治療法と しては 、 現在後方進入ヘルニア摘出術が一般的に採用されている。 しかし 、 この治療は、 手術後、 椎間板から髄核が摘出された後の椎間板内 が空洞となり、 椎間板の形態維持に不可欠である髄核を失ったため 、 椎間板が変性の一途を迪り腰痛の再発を促し、 問題となっている 。 また手術を行わない椎間板ヘルニアや腰椎すベり症、 変形性腰椎 症においても椎間板変性の進行が腰痛出現の引き金となっている。
しかし、 現在、 椎間板の再生に対し臨床的に有効な手段はほとん ど認められていない。
本発明者らは、 先きに、 独自の共培養システムによ り再活性化し た髄核細胞を椎間板の髄核腔内に再挿入することで椎間板組織の変 性を抑制しうることを実験的に証明し （以下の非特許文献 1〜 3参 照） 、 2000年に臨床応用を開始した。
非特許文献 1 ： N i shimura K , Mo chida J： Per cutane ous r e ins e r t ion of the nucleus pulposus -An experimental study -. Spine. 22: 1531-1539; 1998
非特許文献 2 ： Okuma M， Mochida J， Nishimura K, Sakabe K, S eiki K： Reinsertion of activated nucleus pulposus cells r eta rds intervertebral disc degeneration - An in vitro and in viv o experimental study-. J Orthop Res. 18: 983 - 997; 2000
非特許文献 3 ： Nomura T, Mochida J , et al： Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration -An in v ivo experimental study -. Clin. Orthop. , 388： 94-101 2001 しかしながら、 我々のこれらの技術は、 広く臨床応用するにはヒ トでは採取できる細胞数が少なく、 新鮮な髄核を得るためには、 健 常椎間板から髄核を採取する他無く、 現実的でないという問題があ る。 発明の要約
従って、 本発明は前述の従来の椎間板障害の治療における問題点 を克服し、 椎間板変性に伴う障害に対し広く一般的に適用すること ができる椎間板の再生方法及びそれに使用する幹細胞用培地を提供 することを目的とする。
本発明に従えば、 再生すべき椎間板を有する個体の血清を滅菌及 び非働化した自己血清、 細胞培養用培地及び少なく とも一種の抗生 物質を含んでなる椎間板再生用の幹細胞用培地が提供される。
本発明に従えば、 また自己又は同種もしくは異種の固体よ り採取 した幹細胞を、 直接、 又は細胞培養技術、 特に本発明の椎間板再生 用の幹細胞用培地を用いて培養した後を、 培地中に懸濁せしめるか 、 又は細胞キャリ アーに包埋せしめ、 次いでこの幹細胞の懸濁液又 は包埋物を椎間板の髄核腔に移植する工程を含む椎間板の再生方法 が提供される。 図面の簡単な説明
以下、 図面を参照しながら本発明を具体的に説明する。
図 1 ( a ) は実施例で用いた家兎の椎間板の正常状態、 図 1 ( b ) はその変性状態及び図 1 ( c ) はその再生後の状態の椎間板の矢 状断面をそれぞれ示す図面 （写真） であり、
図 2 ( a ) は実施例で用いた家兎の椎間板の正常状態、 図 2 ( b ) はその変性状態及び図 2 ( c ) はその再生後の状態の椎間板矢状 断における顕微鏡下の組織像をそれぞれ示す図面 （写真） である。 発明の詳細な説明
慢性腰痛の主たる原因である椎間板変性は不可逆的変化である。 我々は、 1993年以降、 椎間板の変性抑制、 再生を目指し、 活性化髄 核の再挿入による椎間板変性抑制効果を実験的に証明し、 臨床応用 を開始した。 しかし変性された椎間板から採取できる細胞数には限 りがあり、 新鮮な髄核は健常な椎間板から探敢する他無く、 新鮮な 髄核を得ることは現実的には困難と思われた。 そこで間葉系幹細胞 、 又は万能な可塑性を有する万能幹細胞、 を用いた椎間板の再生を 試み、 動物実験において一定の効果を確認し、 本発明をするに至つ た。
我々は、 変性椎間板内に移植された間葉系幹細胞又は万能な可塑 性を有する万能幹細胞が、 その後椎間板類似又は椎間板細胞そのも のへ誘導され、 椎間板が機能的に再生されることを見出した。 この 方法は我々が従来行って来た自己又は同種由来の椎間板細胞再揷入 法に比べ、 健常椎間板からの細胞を必要とせず、 比較的容易に移植 細胞を得ることが出来、 再生効果も高いことから臨床応用に非常に 適した画期的な変性椎間板の再生法といえる。
幹細胞を用いた椎間板の再生に関する研究の文献的報告は我々は 知らない。 特に椎間板への移植においては我々が第 17回日本整形外 科学会基礎学術集会 （平成 14年 10月） において報告したものが世界 で最初と考える。 今後、 かかる技法が広く臨床応用可能となった場 合、 現在、 椎間板変性抑制治療と して有効な手段がないため、 医学 のみならず社会的ィンパク トも大きいと考える。 この方法は、 椎間 板の構造上、 比較的臨床応用しやすく、 また髄核再揷入術の臨床応 用の経験もあることから、 本発明は医療経済的にも高い社会的貢献 が期待される。
本発明に従って、 椎間板髄核腔に移植された幹細胞は、 移植され ると移植部位にて周囲細胞に対して栄養因子などを提供する他、 周 囲組織由来の栄養因子、 分化誘導促進因子などによ り幹細胞自身も 分化誘導される。 このよ うに幹細胞を変性椎間板へ移植すると、 椎 間板細胞の形質を示す細胞へと誘導され、 椎間板組織を再生するこ とができる。 このような幹細胞としては、 自己又は同種もしく は異 種の固体に由来するものを用いることができ、 具体的には間葉系幹 細胞、 万能幹細胞などをあげることができる。 採取された幹細胞は 直接我々の開発した椎間板再生用の幹細胞用培地に懸濁させたり、 細胞キヤリァ一 (例えばァガロース、 アルジネート、 ァテロコラ一 ゲンゲルなど） に包埋して移植することができる。 しかし、 我々の 実験によれば、 我々の開発した椎間板再生用の幹細胞用培地内で培 養して増殖させた後、 前述の培地中に懸濁させたり、 細胞キャリア 一に包埋させて、 椎間板の骨髄核腔に移植する方法が椎間板の再生 効果が高くて好ましい。
本発明に従った、 椎間板再生用の幹細胞用培地と しては、 一般的 に間葉系幹細胞を培養する際に用いられる、 市販の培養液、 即ち、 あらかじめ合成された成長因子や他動物由来の血清を混在させた、 幹細胞用培地を用いることができる。 しかし、 我々は幹細胞を生体 内に移植するに際し可能な限り、 移植を受ける生体成分に近い状態 のものを移植することが望ましいという観点から、 以下の培地を用 いて実験を行い、 間葉系幹細胞を椎間板の髄核腔内へ移植すること で椎間板を再生させることに成功した。
即ち、 まず移植に使用する個体より全血を必要量採取し、 遠振器 にて血球成分を遠沈し、 血清を分離する。 この血清を滅菌フィルタ 一を使用して滅菌し、 恒温槽内で例えば 50〜70°C、 好ましく は 55〜 60°Cで、 例えば 20〜40分間、 好ましくは 25〜35分間加熱し、 非働化 を施す。 次に、 あらかじめ滅菌処理をした細胞培養用培地、 例えば DMEM(Dulbecco s Modified Eagle Medium) , DMEM/F~12MEM( Minimum
Essential Medium) , RPMI 1640 , BME(Basal Medium Eagle) , Br ins ter's BMOC-3, BGJb, CMRL 1066, F - 10， F - 12， Glasgow MEM, IMDM
I scove ' s Dulbecco ' s Medium) , McCoy's 5A Medium , MCDB131 Med ium , Medium 199， NCTC - 109 Medium , Waymouth ' s MB 752-1 Medium , William's Medium E , Opt i-MEM I Reduced-Serum Mediumなどの 細胞培養用培地中に、 前記自己血清が 1〜25重量％、 好ましく は 5 〜20重量％の濃度になるように混注する。 なお、 これらの培地は従 来から細胞培養用培地と して知られており、 市販されている。 これ らの培地は効果又は混合物と して使用することができる。
本発明に従えば、 さらに培地当 り抗菌作用が得られかつ培養細胞 が生存し得る濃度の抗生物質、 具体的には例えばべニシリ ン ： 8,00 0〜10，000U/ ml、 ス 卜 レプ卜マイシン ： 8，000〜10，000 μ g / ml、 アンフォテリ シン B ： 20〜25 μ g / ml、 ゲンタマイシン ： 0.5〜 50 μ g / ml、 ハイグロマイシン B ： 25-1000 μ g / ml、 硫酸カナマイ シン ： 0· 5〜50 μ g / ml, ァクチノマイシン D ： 0· 5〜50 μ g / ml、 硫酸ネオマイ シン ： 8，000〜10，000 β g / mlなどを単独又は混合物 として加えることによつて椎間板再生用の幹細胞用培地を得ること ができる。
椎間板組織への幹細胞の移植手技には特に限定はないが、 椎間板 を露出した上で注射器などの液体、 ゲル状の細胞キヤリァーを注入 できる適当なものを用いるか、 スキヤホール ド （例えば生体吸収性 ポリマーなど） を用いる場合においては直接椎間板内へ留置するこ とによつて実施するこ とができる。 ヒ トの場合、 椎間板に亀裂や穴 が空いていることがあるが、 その場合には移植細胞の流出を防ぐた めに、 従来から公知の一般的な生理的組織接着剤 (例えばフィブリ ンのりなど） や骨膜などの結合組織を用いて修復する。 この移植法 は椎間板に直接又は間接的に影響を与える手術 （例えば椎間板ヘル ニァ摘出など） の施行時に椎間板の変性を抑制又は再生させる目的 で使用される。 また手術を行わない椎間板ヘルニアや腰椎すベり症 、 変形性腰椎症においても椎間板変性の進行した場合には我々の開 発した椎間板再生用の幹細胞用培地及び椎間板再生方法を用いるこ とによって抑制又は再生させることができる。 これらの際、 移植す る幹細胞は自己のものを用いることが望ましいが、 同種でも又は異 種の個体より得られたものを用いることができる。
実施例
以下に幹細胞の椎間板内移植方法の一例を具体的に説明するが、 本発明を以下の実施例に限定するものでないことはいうまでもない 椎間板再生用の幹細胞用培地の作製
まず移植に使用する 12週令の家兎の耳動脈よ り全血を必要量採取 し、 遠振器にて血球成分を遠沈し、 血清を分離した。 この血清を滅 菌フィルターを使用して滅菌し、 恒温槽内で 56°Cにて 30分加熱し、 非働化させた。 次に、 あらかじめ滅菌処理をした DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 培地に対して上記自己血清を 10%の濃度 になるよ うに混注し、 さらに抗生物質として、 ペニシリ ン ： 10,000 U/ ml、 ス ト レプ トマイシン ： 10，000 μ g / ml、 アンフォテリ シン B ： 25 μ g / mlの濃度で加え、 椎間板再生用の幹細胞用培地を得た 間葉系幹細胞の準備
12週令の家兎の骨髄液を採取し、 比重分離液を用いて単球層を回 収し、 回収単球層をカルチャーフラスコに播種し、 37°C及び 5 %C0 2雰囲気の恒温槽中でフラスコのほぼ全表面にわたつて細胞が増殖 するまで （subconfluentに達するまで）（約 14日） 培養した。 なお、 培地は前記椎間板再生用の幹細胞用培地で増殖した付着細胞に、 La cZ (ベータガラク トシダーゼ） 又は GFP (Green Fluorescent Prote in) のマーカー遺伝子を組み込んだアデノ又はレト口ウィルスべク ターを導入し、 移植後の生着、 活性を確認できるよ うにマーキング した。 その後 ト リ プシン処理によ り細胞を回収し、 移植用細胞と し た。 このよ うにして得られた骨髄間葉系幹細胞を用いて、 軟骨、 骨 、 脂肪細胞への誘導を行い、 その可塑性の再現性から間葉系幹細胞 であることを確認した。 なおヒ トで行う場合は、 フ口—サイ トメ ト リ一にて骨髄間葉系細胞の白血球表面抗原を調べることによって確 認できる。
家兎変性椎間板の準備
上で用いたのと同じ、 14週令となった （ 2週経過後） 家兎に対し 麻酔下に経側腹アプローチにて腰椎 2/3〜5/6の 4椎間を展開し、 椎 間板に 21 G針付注射器を用いて穿刺し、 髄核約 5 mgを吸引搾取する ことによ り変性処理を施した。 なお、 この方法における椎間板変性 モデル作製法の妥当性は前記非特許文献 1 〜 3及びその他の文献に 記載されている通りである。
移植手技
上で得た間葉系幹細胞を、 前述の椎間板再生用培地に懸濁し、 そ の細胞懸濁液を、 直接又は細胞キヤリア一であるァテロコラーゲン ゲル内に包埋した後、 上記変性処理を施した家兎の椎間板へ 27 G針 付注射器を用いて移植した。
評価方法
2， 4 , 8 , 16, 24, 48週経過時に MRI ( Magne t i c Re s onanc e Im aging 磁気共鳴画像） によ り椎間板内の含水量を測定したのちに安 楽死させ、 前記処置を加えた 4椎間を摘出、 ホルマ リ ン固定後、 脱 灰、 パラフィ ンに包埋して 4 μ m厚の矢状断切片を作成した。 この 切片を用いて組織学的及び免疫組織学的検討を行ない、 椎間板組織 内の変性程度、 再生を評価した。
結果
上記評価の結果、 本発明に従って間葉系幹細胞を移植した群にお いては、 移植していない対照変性群に比べ、 MR Iでの椎間板内水分 含量は比較的高い値を保ち、 対照変性群で認める椎間板高の減少は 認められなかった。 組織学的検討の結果、 間葉系幹細胞が移植され た椎間板腔は椎間板細胞様な細胞で満たされていた。 また以下の椎 間板変性度分類の 5段階評価においては、 20週令 （ 8週経過後） の 対照変性群ですでに最も変性が進んだ Grade 4〜 5であつたのに対 し、 幹細胞を移植した群では 60週令 （48週経過後） でももっとも正 常に近い Grade 0〜 1であった。 さ らにプロテオダリカ ンの染色性 レベルも、 本発明の幹細胞を移植した群は対照変性群に比較して 3 〜 3. 5倍の染色性を示し、 変性が優位に抑制されていた。
Grade 0 ： 正常
Grade 1 ： 軽度蛇行 Grade 2 ： 中等度蛇行
Grade 3 ： 軽度反転を伴なう著しい蛇行
Grade 4 ： 著しい反転
Grade 5 ： 線維輪構造の消失
上記実施例に用いた家兎の椎間板の状態を示す写真を図 1 ( a ) 、 ( b ) 及び （ c ) (倍率 ： 4倍） 及び図 2 ( a ) 、 ( b ) 及び （ c ) (倍率 ： 10倍） に示す。 それぞれの写真において、 （ a ) は正 常状態を、 （ b ) は変性状態を、 そして （ c ) は再生状態を示し、 図 1 ( a ) 、 ( b ) 及び （ c ) は椎間板の矢状断肉眼像を示し、 図 2 ( a ) 、 ( b ) 及び ( c ) は同じく矢状断組織像を示す。 図 1 ( a ) 、 ( b ) 及び （ c ) 並びに/又は図 2 ( a ) 、 ( b ) 及び （ c ) において 1 は骨部、 2は髄核、 3は線維輪、 4は空洞、 5は移植 幹細胞を示す。 正常状態 （ a ) においては骨部 1 の間に髄核 2及び 線維輪 3が存在し、 椎間板の変性は認められないが、 変性状態 ( b ) では髄核 2が存在せず、 線維輪 3の部分の高さが減少している。 これを再生した状態 （ c ) (24週経過後） では移植した幹細胞 5が 分化誘導されて、 形状は異なるものの、 正常状態 （ a ) の状態に相 当する状態となっている。 産業上の利用性
以上のとおり、 本発明に係る椎間板再生用の幹細胞用培地を使用 するこ とによって、 間葉系幹細胞を椎間板内に移植した場合には、 椎間板の変性が抑制され、 さらに移植された幹細胞は移植部位より 分泌される成長因子、 誘導促進因子などによ り椎間板様細胞へと分 化誘導され、 椎間板を再生するこ とができる。 このよ うに、 間葉系 幹細胞は椎間板再生用の新たな移植材料と して有用である。 特に椎 間板内への自家骨髄間葉系幹細胞移植は全て自己材料で行えるため 、 即時臨床応用の期待が持てる手法と考えられる。 なお、 同様の方 法にて間葉系幹細胞以外の幹細胞、 例えば万能幹細胞を用いて椎間 板を再生することもできる。

Claims

1. 再生すべき椎間板を有する個体の血清を滅菌及び非働化した 自己血清、 細胞培養用培地及び少なく とも一種の抗生物質を含んで なる椎間板再生用の幹細胞用培地。
2. 自己血清の細胞培養用培地中の濃度が 1 ~25重量％であり、 冑
かつ培地中の抗生物質の濃度が抗菌作用が得られかつ培養細胞が生 存し得る濃度である請求項 1に記載の幹細胞用培地。
の
3 . 前記細胞培養用培地が DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Me dium) , DMEM/F-12MEM(Minimum Essential Medium) , RPMI1640, BME (Basal Medium Eagle) , Brinster's BMOC囲 - 3， BGJb, CMRL 1066, F - 10 , F- 12， Glasgow MEM , IMDM( I scove ' s Dulbecco ' s Medium) , McC oy ' s 5A Medium， MCDB131 Medium , Medium 199， NCTC-109 Medium,
Waymouth' s MB 752-1 Medium, William' s Medium E及び Opti - MEM I Reduced-Serum Mediumからなる群から選ばれた少なく とも 1種の 培地である請求項 1に記載の幹細胞用培地。
4. 自己又は同種もしく は異種の個体よ り擦取した幹細胞を、 直 接又は請求項 1に記載の幹細胞用培地を用いて培養した後、 請求項 1に記載の培地中に懸濁せしめるか、 又は細胞キヤ リ ァ一に包埋せ しめ、 次いでこの幹細胞の懸濁液又は包埋物を椎間板の髄核腔に移 植する工程を含む稚間板の再生方法。
5. 前記幹細胞が間葉系幹細胞又は万能幹細胞である請求項 4に 記載の方法。
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