JP4036881B2 - 椎間板再生用懸濁液又は包埋物 - Google Patents
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Description
慢性腰痛の主たる原因である椎間板変性は不可逆的変化である。我々は、1993年以降、椎間板の変性抑制、再生を目指し、活性化髄核の再挿入による椎間板変性抑制効果を実験的に証明し、臨床応用を開始した。しかし変性された椎間板から採取できる細胞数には限りがあり、新鮮な髄核は健常な椎間板から採取する他無く、新鮮な髄核を得ることは現実的には困難と思われた。そこで骨髄由来の間葉系幹細胞を用いた椎間板の再生を試み、動物実験において一定の効果を確認し、本発明をするに至った。
椎間板組織への骨髄由来の間葉系幹細胞の移植手技には特に限定はないが、椎間板を露出した上で注射器などの液体、ゲル状の細胞キャリアーを注入できる適当なものを用いるか、スキャホールド(例えば生体吸収性ポリマーなど)を用いる場合においては直接椎間板内へ留置することによって実施することができる。ヒトの場合、椎間板に亀裂や穴が空いていることがあるが、その場合には移植細胞の流出を防ぐために、従来から公知の一般的な生理的組織接着剤(例えばフィブリンのりなど)や骨膜などの結合組織を用いて修復する。この移植法は椎間板に直接又は間接的に影響を与える手術(例えば椎間板ヘルニア摘出など)の施行時に椎間板の変性を抑制又は再生させる目的で使用される。また手術を行わない椎間板ヘルニアや腰椎すべり症、変形性腰椎症においても椎間板変性の進行した場合には我々の開発した椎間板再生用の骨髄由来の間葉系幹細胞用培地及び椎間板再生方法を用いることによって抑制又は再生させることができる。これらの際、移植する骨髄由来の間葉系幹細胞は自己のものを用いることが望ましいが、同種でも又は異種の個体より得られたものを用いることができる。
まず移植に使用する12週令の家兎の耳動脈より全血を必要量採取し、遠振器にて血球成分を遠沈し、血清を分離した。この血清を滅菌フィルターを使用して滅菌し、恒温槽内で56℃にて30分加熱し、非働化させた。次に、あらかじめ滅菌処理をしたDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地に対して上記自己血清を10%の濃度になるように混注し、さらに抗生物質として、ペニシリン:10,000U/ ml、ストレプトマイシン:10,000μg/ ml、アンフォテリシンB:25μg/ mlの濃度で加え、椎間板再生用の骨髄由来の間葉系幹細胞の培養用の培地を得た。
12週令の家兎の骨髄液を採取し、比重分離液を用いて単球層を回収し、回収単球層をカルチャーフラスコに播種し、37℃及び5%CO2雰囲気の恒温槽中でフラスコのほぼ全表面にわたって細胞が増殖するまで(subconfluentに達するまで)(約14日)培養した。なお、培地は前記椎間板再生用の骨髄由来の間葉系幹細胞用培地で増殖した付着細胞に、LacZ(ベータガラクトシダーゼ)又はGFP(Green Fluorescent Protein)のマーカー遺伝子を組み込んだアデノ又はレトロウイルスベクターを導入し、移植後の生着、活性を確認できるようにマーキングした。その後トリプシン処理により細胞を回収し、移植用細胞とした。このようにして得られた骨髄間葉系幹細胞を用いて、軟骨、骨、脂肪細胞への誘導を行い、その可塑性の再現性から間葉系幹細胞であることを確認した。なおヒトで行う場合は、フローサイトメトリーにて骨髄間葉系細胞の白血球表面抗原を調べることによって確認できる。
上で用いたのと同じ、14週令となった(2週経過後)家兎に対し麻酔下に経側腹アプローチにて腰椎2/3〜5/6の4椎間を展開し、椎間板に21G針付注射器を用いて穿刺し、髄核約5mgを吸引搾取することにより変性処理を施した。なお、この方法における椎間板変性モデル作製法の妥当性は前記非特許文献1〜3及びその他の文献に記載されている通りである。
上で得た骨髄由来の間葉系幹細胞を、前述の椎間板再生用培地に懸濁し、その細胞懸濁液を、直接又は細胞キャリアーであるアテロコラーゲンゲル内に包埋した後、上記変性処理を施した家兎の椎間板へ27G針付注射器を用いて移植した。
2,4,8,16,24,48週経過時にMRI(Magnetic Resonance Imaging 磁気共鳴画像)により椎間板内の含水量を測定したのちに安楽死させ、前記処置を加えた4椎間を摘出、ホルマリン固定後、脱灰、パラフィンに包埋して4μm厚の矢状断切片を作成した。この切片を用いて組織学的及び免疫組織学的検討を行ない、椎間板組織内の変性程度、再生を評価した。
上記評価の結果、本発明に従って骨髄由来の間葉系幹細胞を移植した群においては、移植していない対照変性群に比べ、MRIでの椎間板内水分含量は比較的高い値を保ち、対照変性群で認める椎間板高の減少は認められなかった。組織学的検討の結果、骨髄由来の間葉系幹細胞が移植された椎間板腔は椎間板細胞様な細胞で満たされていた。また以下の椎間板変性度分類の5段階評価においては、20週令(8週経過後)の対照変性群ですでに最も変性が進んだGrade4〜5であったのに対し、幹細胞を移植した群では60週令(48週経過後)でももっとも正常に近いGrade0〜1であった。さらにプロテオグリカンの染色性レベルも、本発明の骨髄由来の間葉系幹細胞を移植した群は対照変性群に比較して3〜3.5倍の染色性を示し、変性が優位に抑制されていた。
Grade1:軽度蛇行
Grade2:中等度蛇行
Grade3:軽度反転を伴なう著しい蛇行
Grade4:著しい反転
Grade5:線維輪構造の消失
Claims (4)
- 自己又は同種もしくは異種の個体より採取した骨髄由来の間葉系幹細胞を、(i)細胞培養用培地、(ii)細胞培養用培地中の濃度が1〜25重量%の再生すべき椎間板を有する個体の血清を滅菌及び非働化した自己血清及び(iii)少なくとも一種の抗生物質を含む培養培地中で培養して得られる、椎間板の髄核腔に移植して椎間板を再生するのに用いる椎間板再生用懸濁液又はその懸濁液のアテロコラーゲンゲルからなる細胞キャリアー中への包埋物。
- 前記培地中の抗生物質の濃度が抗菌作用が得られかつ培養細胞が生存し得る濃度である請求項1に記載の懸濁液又は包埋物。
- 前記細胞培養用培地が DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM/F-12MEM(Minimum Essential Medium), RPMI1640, BME(Basal Medium Eagle), Brinster's BMOC-3, BGJb, CMRL 1066, F-10, F-12, Glasgow MEM, IMDM(Iscove's Dulbecco's Medium), McCoy's 5A Medium, MCDB131 Medium, Medium 199, NCTC-109 Medium, Waymouth's MB 752-1 Medium, William's Medium E及びOpti-MEM I Reduced-Serum Mediumからなる群から選ばれた少なくとも1種の培地である請求項1又は2に記載の懸濁液又は包埋物。
- 前記抗生物質がペニシリン:8,000〜10,000U/ ml、ストレプトマイシン:8,000〜10,000μg/ ml、アンフォテリシンB:20〜25μg/ ml、ゲンタマイシン:0.5〜50μg/ ml、ハイグロマイシンB:25〜1000μg/ ml、硫酸カナマイシン:0.5〜50μg/ ml、アクチノマイシンD:0.5〜50μg/ ml、硫酸ネオマイシン: 8,000〜10,000μg/ mlからなる群から選ばれた少なくとも1種である請求項1〜3のいずれか1項に記載の懸濁液又は包埋物。
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