KR20220133857A - 조직 공학적 척추 디스크 - Google Patents
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Abstract
공학적 척추 디스크를 포함하는 조작된 척추 디스크 임플란트가 개시되며, 조작된 척추 디스크는 수핵 영역 및 섬유륜 영역; 및 2개의 종판을 포함하고, 종판은 다공성 폴리머 폼을 포함하고, 종판은 채널을 포함한다. 개시된 공학적 척추 디스크 임플란트를 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 디스크 퇴행을 치료하는 방법이 개시되며, 공학적 척추 디스크 임플란트의 종판은 대상체의 척추에 부착된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 20일자로 출원된 미국 가출원 번호 제 62/938,078호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부의 후원에 의한 연구에 관한 성명서
본 발명은 재향 군인부에서 수여한 계약서 IK2 RX001476, I01 RX002274, IK1 RX002445, 및 I21 RX003289 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
배경
허리와 목 통증은 현대 사회에서 어디에나 존재하는데, 매년 성인의 약 절반에 영향을 미치며 성인의 약 2/3이 그들의 일생의 어느 시점에 영향을 받는다. 전 세계적으로, 허리와 목 통증은 장애를 가지고 산 세월의 4대 요인 중 중 두 가지이며, 이러한 상태의 치료는 환자 건강 상태가 개선되었다는 증거 없이 의료 지출을 증가시켰다. 허리 통증의 원인은 여러 가지이며 아직 완전히 이해되지는 않았지만 추간 디스크의 퇴행은 종종 축 방향 척추 통증 및 신경성 사지 통증과 관련된다. 추간 디스크 퇴행은 수핵 (nucleus pulposus, NP)의 프로테오글리칸 함량의 손실, 세포 사멸, 섬유륜 (annulus fibrosus, AF)의 분열 및 디스크 높이의 붕괴를 포함한 일련의 세포의 조성적 및 구조적 변화를 특징으로 하고; 더불어 이러한 변화는 궁극적으로 디스크의 기계적 기능을 손상시킨다. 척추 융합술은 쇠약해지는 축 방향 목 또는 허리 통증과 심하게 퇴행된 추간 디스크 환자에게 수행될 수 있고; 융합술은 또한 디스크 공간 높이를 복원 (간접적으로 신경 구멍의 압축 해제)하거나 척추관을 좁히는 디스크-골극 복합체에 접근하기 위해 추간 디스크를 제거해야 할 때 일반적으로 수행된다. 척추 융합술은 퇴행성 운동 분절을 고정시키기 때문에 네이티브 디스크 구조 또는 기계적 기능을 회복시키지 않고; 이것은 전체 척추 운동학의 변경으로 인해 인접한 운동 분절의 퇴행에 기여할 수 있다. 대부분 인접한 분절 퇴행의 잘 알려진 임상 문제로 인해, 추간 디스크 절제술 후 추간 디스크 운동학의 유지 또는 기계적 관절 성형술 장치를 사용한 디스크의 감압은 움직임을 유지하면서 디스크 높이를 복원하는 것을 목표로서 융합 절차의 대안으로 등장하였다. 그러나, 이러한 장치의 광범위한 채택은 부분적으로 침하, 마모 입자 생성, 및 재수술의 어려움에 대한 우려로 인해 더디게 진행되었다.
추간 디스크 퇴행으로 인한 통증 및 장애의 사회적, 경제적 부담과 현재 가능한 외과적 치료법의 한계를 고려할 때, 진행성 디스크 퇴행에 대한 새로운 치료법이 상당히 필요하다. 조직 공학은 큰 가능성을 제공한다 - 퇴행성 디스크를 조직 공학적 복합 디스크로 교체하면 네이티브 디스크 구조, 생물학, 및 기계적 기능을 회복할 수 있는 가능성이 있다. 현재까지, 일반적으로 배향된 세포-시드 또는 다공성 스캐폴드 (AF 영역의 유사체)내에 세포-시드 하이드로겔 (NP 영역의 유사체)의 조합을 포함하는 다수의 복합 공학적 추간 디스크가 생성되었다. 이러한 복합 디스크의 다양성은 시험관 내에서 특성화되었지만 생체 내에서 이러한 작제물을 평가한 연구는 거의 없었다. 생체 내, 특히 임상적으로 관련된 길이 스케일의 대형 동물 모델에서 공학적 디스크의 장기간 통합 및 기계적 기능을 이해하는 것은 이러한 공학적 디스크 기술을 인간 임상 시험으로 번역하는 데 필수적인 선구자가 될 것이다.
공학적 척추 디스크 임플란트가 개시되며, 상기 공학적 척추 디스크는 수핵 영역 및 섬유륜 영역; 및 2개의 종판을 포함하며, 상기 종판은 다공성 폴리머 폼을 포함하고, 상기 종판은 채널을 포함한다.
개시된 공학적 척추 디스크 임플란트 중 하나 이상을 임플란트를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 디스크 퇴행을 치료하는 방법이 개시되며, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트의 종판은 대상체의 척추에 부착된다.
개시된 방법 및 조성물의 추가 이점은 다음의 설명에서 부분적으로 설명될 것이고 설명으로부터 부분적으로 이해될 것이나 개시된 방법 및 조성물의 실행에 의해 학습될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물의 이점을 첨부된 청구범위에서 특히 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다. 전술한 일반적인 설명과 다음의 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적일 뿐이며 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 개시된 방법 및 조성물의 여러 실시양태를 예시하고 설명과 함께 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 공학적 척추 디스크 임플란트의 구성요소: 1) NP 하이드로겔 2) 라멜라 PCL 스캐폴드 3) PCL 폼 종판을 도시한다.
도 2a 및 도2b는 골 통합을 가속화하기 위해 종판 설계 (A) 및 하이드록시아파타이트 (B) 코팅에 통합된 채널 및 킬 (keel).
도 3a 내지 도3j는 (A-C) MRI T2 맵핑, (D) 콜라겐 (빨간색) 및 프로테오글리칸 (파란색)에 대해 염색된 조직학, 및 (E-G) 국소 프로테오글리칸 및 (H-J) 콜라겐 함량의 생화학적 측정에 의해 측정된 바와 같은, 공학적 디스크 임플란트 조성물의 예를 도시한다.
도 4a 내지 도 4f는 랫트 꼬리 모델에서의 공학적 척추 디스크 임플란트의 압축 (A-C) 및 인장 (D-F) 기계적 특성의 예를 도시한다.
도 5a 내지 도 5d는 염소 경추에 최대 8주 동안 생체내 이식한 후 공학적 척추 디스크 임플란트의 압축 (A-C) 기계적 특성 및 조직학적 외관 (D)의 예를 도시한다. 스케일 = 2 mm.
도 6a 및 도 6b는 랫트 및 염소 모델에 대한 eDAPS 제작 및 세포 시딩의 개략도를 도시한다. (A) 랫트 꼬리(caudal) 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS를 제작하기 위해, 나노 섬유, 정렬된 층을 이룬 PCL 및 PEO 스캐폴드를 전기방사하고, 30° 각도에서 스트립으로 절단하고, 맨드릴(mandrel) 주위에 굴려 AF 영역을 생성하였다. 그런 다음 AF 스캐폴드에 소 AF 세포를 시딩하고 UV 경화성 히알루론산 하이드로겔에 소 NP 세포를 시딩하였다. 배양 2주 후, AF 및 NP 영역을 PCL 폼 종판과 결합하여 eDAPS를 형성하였다. (B) 염소 경추 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS를 제작하기 위해, 나노 섬유로 정렬된 PCL 스캐폴드를 30° 각도에서 스트립으로 절단하고 염소 MSC로 시딩하였다. 염소 MSC를 또한 NP 영역을 형성하기 위해 아가로스 하이드로겔 내에 시딩하였다. 맞춤형 몰드를 사용하여 대향하는 섬유 각도로 스트립을 동심원으로 롤링하기 전에 MSC 시드 PCL 스트립을 일주일 동안 배양하여 eDAPS의 AF 영역을 생성하였다. 추가 배양 일주일 후, AF 및 NP 영역을 PCL 폼 종판과 결합하여 eDAPS를 형성하였다.
도 7a 내지 도 7j는 랫트 꼬리에 생체 내 이식 후 eDAPS 구조물 및 조성물을 나타낸다. (A) 4.7T에서 얻은, 10주 및 20주 (스케일 = 2 mm)에서 각 치료 그룹의 첫 번째 에코의 대표적인 원시 MR 이미지 (상부) 및 네이티브 디스크 및 eDAPS 임플란트의 평균 T2 맵 (하부). eDAPS (B) NP 및 (C) AF T2 값의 정량화, 막대는 유의성을 나타낸다 (P < 0.01). eDAPS 생화학적 함량은 네이티브 랫트 꼬리 디스크 공간 (스케일 = 500 μm)과 비교되어 10주 및 20주 임플란트의 (D) 알시안 블루 (프로테오글리칸) 및 피크로시리우스 레드 (콜라겐) 염색된 조직학 섹션을 통해 추가로 평가하였다. (E) NP, (F) AF 및 (G) eDAPS의 PCL 종판 영역에서 GAG 함량의 정량화. (H) NP (P = 0.01, 20W 대 이식 전), (I) AF (P = 0.04, 20W 대 이식 전) 및 (J) eDAPS의 PCL 종판 영역 (P = 0.01, 20W 대 이식 전)에서 콜라겐 함량의 정량화. 정량적 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 도시된다 (MRI 데이터의 경우 n = 그룹당 5-10 및 생화학 데이터의 경우 n = 그룹당 3-4). 그룹 간의 상당한 차이는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis로 평가하였다.
도 8은 이식 후 랫트 eDAPS의 종판 T2 값을 도시한다. eDAPS의 PCL 폼 종판 내의 T2 이완 시간은 (*P < 0.05 10주 및 20주 그룹과 비교) 이식 10주 및 20주 후에 감소하였다.
도 9는 생체 내에서 10주 및 20주 후의 랫트 eDAPS의 면역조직화학을 도시한다. 유형 II 콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트에 대한 면역조직화학적 염색은 eDAPS의 NP 영역에 국한되었으며, 이는 네이티브 랫트 꼬리 디스크의 기질 분포와 일치하였다. 유형 II 콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트 또한 PCL 말단 판 영역에 풍부하였다. 유형 I 콜라겐은 eDAPS의 모든 영역에 걸쳐 풍부하였다. 스케일 = 500 μm.
도 10은 네이티브와 비교하여 생체 내에서 20주 후의 랫트 eDAPS의 확대된 면역조직화학을 도시한다. 20주 eDAPS 임플란트의 NP 및 AF 영역의 확대된 콜라겐 II, 콘드로이틴 설페이트 및 콜라겐 I 면역조직화학을 네이티브 랫트 꼬리 디스크와 비교하였다. 스케일 = 250 μm.
도 11은 랫트 eDAPS의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 생체 내에서 10주 및 20주 후 eDAPS에서 NP 세포 분포의 유지를 입증할 뿐만 아니라 AF 및 종판으로의 증가된 세포 침투를 입증하였다. 스케일 = 50 μm.
도 12는 랫트 eDAPS의 DAPI 염색을 도시한다. 세포 핵에 대한 DAPI 염색은 eDAPS의 종판 및 AF 영역의 증가된 세포 침투 외에 두 시점 모두에서 eDAPS의 NP 영역에서 세포성의 유지를 입증하였다. 스케일 = 50 μm.
도 13a 내지 도 13f는 랫트 꼬리에 eDAPS 이식된 운동 분절의 압축 기계적 특성을 도시한다. (A) 이식 전, 및 이식 10주 및 20주 후 eDAPS의 대표적인 응력 변형률 곡선, 음영 처리된 화살표는 기계적 특성이 네이티브 값에 가까워지는 것을 강조한다. (B) 토(toe) 및 선형 영역 모듈러스의 정량화 (P = 0.01, 20W 토 모듈러스 대 이식 전 토 모듈러스), 및 (C) 전이 및 최대 변형률 (* = P < 0.01 모든 그룹과 비교). 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다 (n = 그룹당 4-6). 그룹 간의 상당한 차이는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis를 통해 평가하였다. (D) 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절 또는 20주 그룹의 eDAPS 이식된 운동 분절에서 생리학적 압축 적용 전후의 μCT 스캐닝. 색상 스케일은 골밀도를 나타낸다. 스케일 = 500 μm. (E) 맞춤형 MATLAB 코드를 통해 μCT 스캔에서 생성된 지역 디스크 높이의 축 방향 지도. 색상 스케일은 로컬 디스크 높이를 나타낸다. (F) 압축 하에 네이티브 디스크 및 eDAPS의 평균 디스크 높이에서 계산된 압축 변형률. 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다. (n = 그룹당 4). 20W와 네이티브 변형률 사이의 통계적 유의성은 양방향 Mann-Whitney 시험을 통해 평가하였다. (P = 0.11).
도 14a 내지 도 14g는 랫트 꼬리에서 eDAPS의 생체 내 통합을 도시한다. (A) 10주 및 20주 동안 이식된 eDAPS의 AF-종판 및 척추체 (VB) 종판의 2차 고조파 생성 (Second Harmonic Generation, SHG) 이미지. 네이티브 랫트 꼬리 IVD의 AF-척추체 경계는 비교를 위해 표시된다. 스케일 = 200 μm. (B) 10주 및 20주차에서 네이티브 랫트 꼬리 IVD 및 PCL 종판 영역의 말로리-하이덴하인 (Mallory-Heidenhain) 염색 조직학. 골 기질은 보라색/분홍색으로 염색되고, 미네랄이 없는 콜라겐은 파란색으로, 적혈구는 주황색으로 염색된다 (화살표). 스케일 = 200 μm. (C) 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절과 비교한 eDAPS 이식된 운동 분절의 인장에서 파괴 시험까지의 대표적인 응력 변형 곡선. 10주 그룹의 운동 분절 3개 중 2개는 정량화 가능한 인장 특성을 가졌으며 - 나머지 샘플은 해부 중에 실패하였다 (그래프 D-E에서 "0" 데이터 포인트로 표시됨). (D) 인장 토 및 (E) 선형 영역 모듈러스의 정량화 (P = 0.03, 10W 대 네이티브) (F) 파괴 응력의 정량화 (P = 0.01, 10W 대 네이티브) 및 (G) 파괴 변형률 (P = 0.03, 10W 대 네이티브). 정량적 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다 (n = 그룹당 3-5). 그룹간의 상당한 차이는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis를 사용하여 평가하였다.
도 15a 내지 도 15f는 염소 경추 디스크 교체 모델에서 eDAPS의 8주 정량적 MRI 및 기계적 특성을 도시한다. (A) 이식 전 eDAPS의 대표적인 T2-강조 (스케일 = 2 mm) 및 (B) 이식 후 8주 (화살표, 스케일 = 5 mm). (C) 네이티브 염소 경추 디스크와 비교한 eDAPS 임플란트에서 NP T2 이완 시간의 정량화 (P = 0.04, 양방향 Mann-Whitney 시험, n = 그룹당 3-13). (D) 네이티브 염소 경추 운동 분절과 비교한 이식 전후의 염소 eDAPS의 압축 시험에서 대표적인 응력-변형률 곡선. (E) 네이티브 염소 경추 운동 분절 및 eDAPS 이식 전 (P = 0.02, 이식 전 대 8W 토 모듈러스)과 비교한 eDAPS 이식된 운동 분절의 토 및 선형 모듈러스의 정량화. (F) 네이티브 운동 분절 및 eDAPS 이식 전과 비교한 8주 eDAPS 임플란트의 전이 및 최대 변형률의 정량화 (P = 0.04, 8W 대 이식 전 전이 변형률; P = 0.03, 8W 대 이식 전 최대 변형률). 정량적 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다. 그룹 간의 기계적 특성의 상당한 차이 (n = 그룹당 3-4)는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis를 통해 평가하였다.
도 16a 내지 도 16e는 eDAPS의 대형 동물 모델로의 번역을 도시한다. 골수 유래 동종 MSC로 제작 및 시딩된 염소 경추 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS의 사진. (A) C2-C3 디스크 공간은 전방 접근을 통해 노출되었고, 네이티브 디스크와 인접 종판의 일부는 견인 (distraction) 하에 제거되었다. (B) 최대 13주 동안 미리 성숙된 16 mm 직경 x 9 mm 높이 eDAPS를 준비된 디스크 공간 내에 배치하고 (C) 견인을 해제하였다. (D) 운동 분절은 경추 고정판으로 고정하였다. (E) 모든 동물은 합병증 없이 절차에서 회복되었고 완전한 경추 기능을 유지하였다.
도 17a 내지 도 17d는 염소 경추 디스크 교체 모델에서 eDAPS의 4주 생체 내 성능을 도시한다. (A) 이식 전 eDAPS의 알시안 블루 (프로테오글리칸) 및 피크로시리우스 레드 (콜라겐) 염색된 섹션 (사전 배양 13주 후). (B) 이식 4주 후 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색된 시상 조직학 섹션. 최고 및 최악의 대표적인 eDAPS가 도시되었다. 스케일 = 1 mm. (C) PCL 종판 내 조직화된 콜라겐 증착을 위한 SHG 이미지화, 스케일 = 200 μm. (D) eDAPS의 NP 및 AF 영역에서 콜라겐 II, 아그레칸, 및 콜라겐 I에 대한 DAPI 염색 (스케일 = 50 μm) 및 면역 조직화학 (스케일 = 250 μm).
도 18은 모든 동물로부터의 염소 eDAPS 임플란트의 조직학적 외관을 도시한다. 모든 4주 eDAPS 이식된 염소 (n = 4)의 시상 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색된 조직학 섹션. 스케일 = 1 mm.
도 19a 및 도 19b는 염소 eDAPS의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 염소 경추 디스크 공간에서 이식 4주 후 eDAPS의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 (A) AF 및 NP 영역 내에서 세포의 보유뿐만 아니라 PCL 종판으로의 강력한 세포 침투를 입증한다. 스케일 = 50 μm. (B) AF 주변으로의 호중구 침투 (화살표)는 가벼운 염증 반응을 나타낸다. 스케일 = 1 mm (최상부) 및 100 μm (최하부).
도 20은 생체 내에서 4주 후 염소 eDAPS의 면역조직화학을 도시한다. 4주 eDAPS 임플란트에서의 콜라겐 II, 아그레칸 및 콜라겐 I에 대한 면역조직화학을 네이티브 디스크와 비교하였다. 스케일 = 250 μm.
도 21은 염소 경추에서의 생체 내에서 8주 후 시상 μCT 슬라이스를 도시한다. 8주 염소 eDAPS 임플란트의 μCT 스캔으로부터의 중간-시상 슬라이스. PCL 종판은 지르코니아 나노입자를 포함하여 방사선 불투과성으로 렌더링되었다. 스케일 = 5 mm.
도 22a 및 도 22b는 (A) 알칼리성 포스포타젤 활성 및 (B) 골수 유래 MSC로 시딩되고 기저 또는 골형성 배지에서 5주 동안 배양된 HA 코팅 또는 PCL 단독 폼의 Von Kossa 염색을 도시한다. * - p<0.05 다른 모든 그룹과 비교. 스케일 = 1 mm.
도 23은 오스테오칼신 말로리-하이덴하인 트리크롬 염색 (분홍색 염색 = 미네랄화된 콜라겐, 파란색 = 미네랄화되지 않은 콜라겐, 왼쪽 스케일 = 1 mm, 오른쪽 스케일 = 100 μm)으로 염색한 오스테오칼신 (스케일 = 1 mm)의 면역조직화학, 및 10주 동안 랫트 꼬리뼈에 이식된 무세포 PCL의 μCT (스케일 =1 mm)을 도시한다.
도 24a 및 도 24b는 30주 동안 염소 경추에 이식된 eDAPS의 (A) T2-강조 중간 시상 MRI 및 (B) 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색 조직학 (스케일 = 1 mm) 을 도시한다. eDAPS는 5주간 경질판으로 고정시킨 후 2차 수술로 판 고정의 제거를 수행하였다. 동물은 이식의 나머지 25주 동안 제한되지 않은 움직임이 허용되었다.
도 1은 공학적 척추 디스크 임플란트의 구성요소: 1) NP 하이드로겔 2) 라멜라 PCL 스캐폴드 3) PCL 폼 종판을 도시한다.
도 2a 및 도2b는 골 통합을 가속화하기 위해 종판 설계 (A) 및 하이드록시아파타이트 (B) 코팅에 통합된 채널 및 킬 (keel).
도 3a 내지 도3j는 (A-C) MRI T2 맵핑, (D) 콜라겐 (빨간색) 및 프로테오글리칸 (파란색)에 대해 염색된 조직학, 및 (E-G) 국소 프로테오글리칸 및 (H-J) 콜라겐 함량의 생화학적 측정에 의해 측정된 바와 같은, 공학적 디스크 임플란트 조성물의 예를 도시한다.
도 4a 내지 도 4f는 랫트 꼬리 모델에서의 공학적 척추 디스크 임플란트의 압축 (A-C) 및 인장 (D-F) 기계적 특성의 예를 도시한다.
도 5a 내지 도 5d는 염소 경추에 최대 8주 동안 생체내 이식한 후 공학적 척추 디스크 임플란트의 압축 (A-C) 기계적 특성 및 조직학적 외관 (D)의 예를 도시한다. 스케일 = 2 mm.
도 6a 및 도 6b는 랫트 및 염소 모델에 대한 eDAPS 제작 및 세포 시딩의 개략도를 도시한다. (A) 랫트 꼬리(caudal) 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS를 제작하기 위해, 나노 섬유, 정렬된 층을 이룬 PCL 및 PEO 스캐폴드를 전기방사하고, 30° 각도에서 스트립으로 절단하고, 맨드릴(mandrel) 주위에 굴려 AF 영역을 생성하였다. 그런 다음 AF 스캐폴드에 소 AF 세포를 시딩하고 UV 경화성 히알루론산 하이드로겔에 소 NP 세포를 시딩하였다. 배양 2주 후, AF 및 NP 영역을 PCL 폼 종판과 결합하여 eDAPS를 형성하였다. (B) 염소 경추 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS를 제작하기 위해, 나노 섬유로 정렬된 PCL 스캐폴드를 30° 각도에서 스트립으로 절단하고 염소 MSC로 시딩하였다. 염소 MSC를 또한 NP 영역을 형성하기 위해 아가로스 하이드로겔 내에 시딩하였다. 맞춤형 몰드를 사용하여 대향하는 섬유 각도로 스트립을 동심원으로 롤링하기 전에 MSC 시드 PCL 스트립을 일주일 동안 배양하여 eDAPS의 AF 영역을 생성하였다. 추가 배양 일주일 후, AF 및 NP 영역을 PCL 폼 종판과 결합하여 eDAPS를 형성하였다.
도 7a 내지 도 7j는 랫트 꼬리에 생체 내 이식 후 eDAPS 구조물 및 조성물을 나타낸다. (A) 4.7T에서 얻은, 10주 및 20주 (스케일 = 2 mm)에서 각 치료 그룹의 첫 번째 에코의 대표적인 원시 MR 이미지 (상부) 및 네이티브 디스크 및 eDAPS 임플란트의 평균 T2 맵 (하부). eDAPS (B) NP 및 (C) AF T2 값의 정량화, 막대는 유의성을 나타낸다 (P < 0.01). eDAPS 생화학적 함량은 네이티브 랫트 꼬리 디스크 공간 (스케일 = 500 μm)과 비교되어 10주 및 20주 임플란트의 (D) 알시안 블루 (프로테오글리칸) 및 피크로시리우스 레드 (콜라겐) 염색된 조직학 섹션을 통해 추가로 평가하였다. (E) NP, (F) AF 및 (G) eDAPS의 PCL 종판 영역에서 GAG 함량의 정량화. (H) NP (P = 0.01, 20W 대 이식 전), (I) AF (P = 0.04, 20W 대 이식 전) 및 (J) eDAPS의 PCL 종판 영역 (P = 0.01, 20W 대 이식 전)에서 콜라겐 함량의 정량화. 정량적 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 도시된다 (MRI 데이터의 경우 n = 그룹당 5-10 및 생화학 데이터의 경우 n = 그룹당 3-4). 그룹 간의 상당한 차이는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis로 평가하였다.
도 8은 이식 후 랫트 eDAPS의 종판 T2 값을 도시한다. eDAPS의 PCL 폼 종판 내의 T2 이완 시간은 (*P < 0.05 10주 및 20주 그룹과 비교) 이식 10주 및 20주 후에 감소하였다.
도 9는 생체 내에서 10주 및 20주 후의 랫트 eDAPS의 면역조직화학을 도시한다. 유형 II 콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트에 대한 면역조직화학적 염색은 eDAPS의 NP 영역에 국한되었으며, 이는 네이티브 랫트 꼬리 디스크의 기질 분포와 일치하였다. 유형 II 콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트 또한 PCL 말단 판 영역에 풍부하였다. 유형 I 콜라겐은 eDAPS의 모든 영역에 걸쳐 풍부하였다. 스케일 = 500 μm.
도 10은 네이티브와 비교하여 생체 내에서 20주 후의 랫트 eDAPS의 확대된 면역조직화학을 도시한다. 20주 eDAPS 임플란트의 NP 및 AF 영역의 확대된 콜라겐 II, 콘드로이틴 설페이트 및 콜라겐 I 면역조직화학을 네이티브 랫트 꼬리 디스크와 비교하였다. 스케일 = 250 μm.
도 11은 랫트 eDAPS의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 생체 내에서 10주 및 20주 후 eDAPS에서 NP 세포 분포의 유지를 입증할 뿐만 아니라 AF 및 종판으로의 증가된 세포 침투를 입증하였다. 스케일 = 50 μm.
도 12는 랫트 eDAPS의 DAPI 염색을 도시한다. 세포 핵에 대한 DAPI 염색은 eDAPS의 종판 및 AF 영역의 증가된 세포 침투 외에 두 시점 모두에서 eDAPS의 NP 영역에서 세포성의 유지를 입증하였다. 스케일 = 50 μm.
도 13a 내지 도 13f는 랫트 꼬리에 eDAPS 이식된 운동 분절의 압축 기계적 특성을 도시한다. (A) 이식 전, 및 이식 10주 및 20주 후 eDAPS의 대표적인 응력 변형률 곡선, 음영 처리된 화살표는 기계적 특성이 네이티브 값에 가까워지는 것을 강조한다. (B) 토(toe) 및 선형 영역 모듈러스의 정량화 (P = 0.01, 20W 토 모듈러스 대 이식 전 토 모듈러스), 및 (C) 전이 및 최대 변형률 (* = P < 0.01 모든 그룹과 비교). 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다 (n = 그룹당 4-6). 그룹 간의 상당한 차이는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis를 통해 평가하였다. (D) 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절 또는 20주 그룹의 eDAPS 이식된 운동 분절에서 생리학적 압축 적용 전후의 μCT 스캐닝. 색상 스케일은 골밀도를 나타낸다. 스케일 = 500 μm. (E) 맞춤형 MATLAB 코드를 통해 μCT 스캔에서 생성된 지역 디스크 높이의 축 방향 지도. 색상 스케일은 로컬 디스크 높이를 나타낸다. (F) 압축 하에 네이티브 디스크 및 eDAPS의 평균 디스크 높이에서 계산된 압축 변형률. 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다. (n = 그룹당 4). 20W와 네이티브 변형률 사이의 통계적 유의성은 양방향 Mann-Whitney 시험을 통해 평가하였다. (P = 0.11).
도 14a 내지 도 14g는 랫트 꼬리에서 eDAPS의 생체 내 통합을 도시한다. (A) 10주 및 20주 동안 이식된 eDAPS의 AF-종판 및 척추체 (VB) 종판의 2차 고조파 생성 (Second Harmonic Generation, SHG) 이미지. 네이티브 랫트 꼬리 IVD의 AF-척추체 경계는 비교를 위해 표시된다. 스케일 = 200 μm. (B) 10주 및 20주차에서 네이티브 랫트 꼬리 IVD 및 PCL 종판 영역의 말로리-하이덴하인 (Mallory-Heidenhain) 염색 조직학. 골 기질은 보라색/분홍색으로 염색되고, 미네랄이 없는 콜라겐은 파란색으로, 적혈구는 주황색으로 염색된다 (화살표). 스케일 = 200 μm. (C) 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절과 비교한 eDAPS 이식된 운동 분절의 인장에서 파괴 시험까지의 대표적인 응력 변형 곡선. 10주 그룹의 운동 분절 3개 중 2개는 정량화 가능한 인장 특성을 가졌으며 - 나머지 샘플은 해부 중에 실패하였다 (그래프 D-E에서 "0" 데이터 포인트로 표시됨). (D) 인장 토 및 (E) 선형 영역 모듈러스의 정량화 (P = 0.03, 10W 대 네이티브) (F) 파괴 응력의 정량화 (P = 0.01, 10W 대 네이티브) 및 (G) 파괴 변형률 (P = 0.03, 10W 대 네이티브). 정량적 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다 (n = 그룹당 3-5). 그룹간의 상당한 차이는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis를 사용하여 평가하였다.
도 15a 내지 도 15f는 염소 경추 디스크 교체 모델에서 eDAPS의 8주 정량적 MRI 및 기계적 특성을 도시한다. (A) 이식 전 eDAPS의 대표적인 T2-강조 (스케일 = 2 mm) 및 (B) 이식 후 8주 (화살표, 스케일 = 5 mm). (C) 네이티브 염소 경추 디스크와 비교한 eDAPS 임플란트에서 NP T2 이완 시간의 정량화 (P = 0.04, 양방향 Mann-Whitney 시험, n = 그룹당 3-13). (D) 네이티브 염소 경추 운동 분절과 비교한 이식 전후의 염소 eDAPS의 압축 시험에서 대표적인 응력-변형률 곡선. (E) 네이티브 염소 경추 운동 분절 및 eDAPS 이식 전 (P = 0.02, 이식 전 대 8W 토 모듈러스)과 비교한 eDAPS 이식된 운동 분절의 토 및 선형 모듈러스의 정량화. (F) 네이티브 운동 분절 및 eDAPS 이식 전과 비교한 8주 eDAPS 임플란트의 전이 및 최대 변형률의 정량화 (P = 0.04, 8W 대 이식 전 전이 변형률; P = 0.03, 8W 대 이식 전 최대 변형률). 정량적 데이터는 표준 편차가 있는 평균으로 표시된다. 그룹 간의 기계적 특성의 상당한 차이 (n = 그룹당 3-4)는 Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis를 통해 평가하였다.
도 16a 내지 도 16e는 eDAPS의 대형 동물 모델로의 번역을 도시한다. 골수 유래 동종 MSC로 제작 및 시딩된 염소 경추 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS의 사진. (A) C2-C3 디스크 공간은 전방 접근을 통해 노출되었고, 네이티브 디스크와 인접 종판의 일부는 견인 (distraction) 하에 제거되었다. (B) 최대 13주 동안 미리 성숙된 16 mm 직경 x 9 mm 높이 eDAPS를 준비된 디스크 공간 내에 배치하고 (C) 견인을 해제하였다. (D) 운동 분절은 경추 고정판으로 고정하였다. (E) 모든 동물은 합병증 없이 절차에서 회복되었고 완전한 경추 기능을 유지하였다.
도 17a 내지 도 17d는 염소 경추 디스크 교체 모델에서 eDAPS의 4주 생체 내 성능을 도시한다. (A) 이식 전 eDAPS의 알시안 블루 (프로테오글리칸) 및 피크로시리우스 레드 (콜라겐) 염색된 섹션 (사전 배양 13주 후). (B) 이식 4주 후 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색된 시상 조직학 섹션. 최고 및 최악의 대표적인 eDAPS가 도시되었다. 스케일 = 1 mm. (C) PCL 종판 내 조직화된 콜라겐 증착을 위한 SHG 이미지화, 스케일 = 200 μm. (D) eDAPS의 NP 및 AF 영역에서 콜라겐 II, 아그레칸, 및 콜라겐 I에 대한 DAPI 염색 (스케일 = 50 μm) 및 면역 조직화학 (스케일 = 250 μm).
도 18은 모든 동물로부터의 염소 eDAPS 임플란트의 조직학적 외관을 도시한다. 모든 4주 eDAPS 이식된 염소 (n = 4)의 시상 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색된 조직학 섹션. 스케일 = 1 mm.
도 19a 및 도 19b는 염소 eDAPS의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 염소 경추 디스크 공간에서 이식 4주 후 eDAPS의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 (A) AF 및 NP 영역 내에서 세포의 보유뿐만 아니라 PCL 종판으로의 강력한 세포 침투를 입증한다. 스케일 = 50 μm. (B) AF 주변으로의 호중구 침투 (화살표)는 가벼운 염증 반응을 나타낸다. 스케일 = 1 mm (최상부) 및 100 μm (최하부).
도 20은 생체 내에서 4주 후 염소 eDAPS의 면역조직화학을 도시한다. 4주 eDAPS 임플란트에서의 콜라겐 II, 아그레칸 및 콜라겐 I에 대한 면역조직화학을 네이티브 디스크와 비교하였다. 스케일 = 250 μm.
도 21은 염소 경추에서의 생체 내에서 8주 후 시상 μCT 슬라이스를 도시한다. 8주 염소 eDAPS 임플란트의 μCT 스캔으로부터의 중간-시상 슬라이스. PCL 종판은 지르코니아 나노입자를 포함하여 방사선 불투과성으로 렌더링되었다. 스케일 = 5 mm.
도 22a 및 도 22b는 (A) 알칼리성 포스포타젤 활성 및 (B) 골수 유래 MSC로 시딩되고 기저 또는 골형성 배지에서 5주 동안 배양된 HA 코팅 또는 PCL 단독 폼의 Von Kossa 염색을 도시한다. * - p<0.05 다른 모든 그룹과 비교. 스케일 = 1 mm.
도 23은 오스테오칼신 말로리-하이덴하인 트리크롬 염색 (분홍색 염색 = 미네랄화된 콜라겐, 파란색 = 미네랄화되지 않은 콜라겐, 왼쪽 스케일 = 1 mm, 오른쪽 스케일 = 100 μm)으로 염색한 오스테오칼신 (스케일 = 1 mm)의 면역조직화학, 및 10주 동안 랫트 꼬리뼈에 이식된 무세포 PCL의 μCT (스케일 =1 mm)을 도시한다.
도 24a 및 도 24b는 30주 동안 염소 경추에 이식된 eDAPS의 (A) T2-강조 중간 시상 MRI 및 (B) 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색 조직학 (스케일 = 1 mm) 을 도시한다. eDAPS는 5주간 경질판으로 고정시킨 후 2차 수술로 판 고정의 제거를 수행하였다. 동물은 이식의 나머지 25주 동안 제한되지 않은 움직임이 허용되었다.
개시된 방법 및 조성물은 특정 구현예의 하기 상세한 설명 및 이에 포함된 실시예 및 이들의 이전 및 하기 설명을 참조하여 더 쉽게 이해될 수 있다.
개시된 방법 및 조성물은 달리 명시하지 않는 한 특정 합성 방법, 특정 분석 기술, 또는 특성 시약에 한정되지 않으며, 따라서 이들이 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 전문 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 한정하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 함께 사용될 수 있거나, 제조하는 데 사용될 수 있거나, 개시된 방법 및 조성물의 생성물인, 재료, 조성물, 및 구성성분이 개시된다. 이들 및 기타 재료가 본원에 개시되어 있으며, 이들 재료의 조합, 부분집합, 상호작용, 그룹 등이 개시되고 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집합적 조합 및 순열에 대한 특정 참조가 명시적으로 개시되어 있지 않을 수 경우, 각각은 본원에 구체적으로 고려되고 설명된다는 것이 이해된다. 따라서, 분자 A, B, 및 C의 부류와 분자 D, E, 및 F의 부류 및 조합 분자의 예가 개시되어 있는 경우, A-D가 개시되고, 각각이 개별적으로 인용되지 않더라고, 각각 개별적으로 및 집합적으로 고려된다. 따라서, 이 예에서, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F 각각이 구체적으로 고려되며, A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 예시 조합 A-D의 개시로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 유사하게, 이들의 임의의 부분집합 또는 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F, 및 C-E의 하위 그룹이 구체적으로 고려되며, A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 예시 조합 A-D의 개시로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 이 개념은 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 단계를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이러한 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 구현예 또는 구현예의 조합으로 수행될 수 있으며, 이러한 각각의 조합은 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 함이 이해된다.
A. 정의
개시된 방법 및 조성물은 설명된 특정 방법, 프로토콜, 및 시약으로 한정되지 않으며 이들이 다양할 수 있음이 이해된다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a ", "an", 및 "the"는 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다는 점을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "채널"에 대한 언급은 복수의 이러한 채널을 포함하고, "공학적 척추 디스크"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 공학적 척추 디스크 및 이의 등가물 등에 대한 언급이다.
본원에서 사용되는 "대상체"는 척추동물을 지칭한다. 용어 "대상체"는 사육된 동물 (예를 들어, 고양이, 개 등), 가축 (예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등) 및 실험용 동물 (예를 들어, 쥐, 토끼, 랫트, 기니 피그 등)을 포함한다. 한 측면에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 인간이다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인, 아동, 청소년 및 신생아 대상체는 남성이든 여성이든 상관 없이 대상으로 한다.
"치료하다"는 질환 또는 상태의 영향의 악화를 예방 또는 지연시키거나 질환의 영향 (예를 들어, 퇴행)을 부분적으로 또는 완전히 역전시키기 위해 디스크 퇴행의 발병에 대해 증가된 민감성을 갖거나 디스크 퇴행을 갖는 인간 또는 다른 포유동물과 같은 대상체에게 하나 이상의 본 발명의 공학적 척추 디스크 임플란트를 투여하거나 이식하는 것을 의미한다.
"예방하다"는 디스크 퇴행의 발병에 대해 증가된 민감성을 갖는 대상체가 디스크 퇴행이 발병할 가능성을 최소화하는 것을 의미한다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 이후에 설명된 이벤트, 상황 또는 문제가 발생하거나 존재하지 않을 수 있음을 의미하며, 설명에는 이벤트, 상황 또는 문제가 발생하거나 존재하는 경우 및 이들이 발생하지 않거나 존재하지 않는 경우가 포함된다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값, 및/또는 "약" 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 문맥에서 구체적으로 달리 나타내지 않는 한 하나의 특정 값 및/또는 다른 특정 값까지의 범위가 또한 구체적으로 고려되고 개시되는 것으로 간주된다. 유사하게, 값이 "약"을 사용하여 근사치로 표현될 때, 특정 값은 문맥에서 구체적으로 달리 나타내지 않는 한 개시되는 것으로 간주되어야 하는 또 다른 구체적으로 고려되는 구현예를 형성함을 이해할 것이다. 각 범위의 종점은 문맥이 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 다른 종점과 관련하여, 및 다른 종점과 독립적으로 모두 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 마지막으로, 명시적으로 개시된 범위 내에 함유된 모든 개별 값 및 하위 범위의 값 또한 구체적으로 고려되며, 문맥이 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 개시된 것으로 간주되어야 함을 이해해야 한다. 전술한 내용은 특정 경우에 이들 구현예의 일부 또는 전부가 명시적으로 개시되었는지 여부와 관계없이 적용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학용어는 개시된 방법 및 조성물이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특히 유용한 방법, 장치, 및 재료는 설명된 바와 같다. 본원에 인용된 간행물 및 그들이 인용된 자료는 참조로서 본원에 구체적으로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 모든 참조가 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하지 않는다. 참고 문헌에 대한 논의는 저자가 주장하는 바를 명시하며, 출원인은 인용된 문헌의 정확성과 적절성에 의의를 제기할 권리가 있다. 다수의 간행물이 본원에 언급되어 있지만, 그러한 참조가 이들 문서 중 어느 것도 해당 기술 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하지 않는다는 것이 명백하게 이해될 것이다.
본 명세서의 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 단어의 변형은 "포함(including)하지만 이에 한정되지 않는"을 의미하며, 예를 들어 다른 첨가제, 구성성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 특히, 하나 이상의 단계 또는 작업을 포함하는 것으로 언급된 방법에서 각 단계는 열거된 것("~로 구성되는"과 같은 한정 용어를 포함하지 않는 한)을 포함하는 것으로 구체적으로 고려되며, 이는 각 단계가 예를 들어 다른 첨가제, 구성성분, 정수 또는 단계에 열거되지 않는 단계를 배제하도록 의도되지 않음을 의미한다.
B. 공학적 척추 디스크 임플란트
공학적 척추 디스크 임플란트가 개시된다. 일부 측면에서, 공학적은 비-자연적으로 발생하는 척추 디스크 임플란트를 지칭한다.
공학적 척추 디스크를 포함하는 공학적 척추 디스크 임플란트가 개시되며, 여기서 공학적 척추 디스크는 수핵 영역 및 섬유륜 영역; 및 2개의 종판을 포함하고, 여기서 종판은 다공성 폴리머 폼을 포함하며, 여기서 종판은 채널을 포함한다.
일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트는 프로테오글리칸 및 콜라겐을추가로 포함할 수 있다. 프로테오글리칸 및 콜라겐은 합성 또는 천연일 수 있다. 일부 측면에서, 프로테오글리칸 및 콜라겐은 공학적 척추 디스크 내에 존재하는 생존 세포에 의해 생성된다.
일부 측면에서, 제1 종판의 최상부면에서 제2 종판의 최하부면까지 측정된 공학적 척추 디스크 임플란트의 깊이는 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5, mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm 또는 20 mm일 수 있다.
1. 공학적 척추 디스크
수핵 영역 및 섬유륜 영역을 포함하는 공학적 척추 디스크가 개시된다.
i. 수핵 영역
수핵 영역은 척추 디스크의 내부 코어 영역이다. 본질적으로 및 본원에 개시된 바와 같이, 수핵 영역은 젤라틴성 물질로 구성된다.
일부 측면에서, 수핵 영역은 최상부면, 최하부면, 및 최상부면과 최하부면 사이에서 연장되는 수핵 영역의 주연부를 한정하는 측면 엣지를 포함한다.
일부 측면에서, 수핵의 주연부는 섬유륜 영역에 의해 원주 방향으로 둘러싸여 있다. 따라서, 수핵 영역은 내부 코어 영역이고 섬유륜 영역은 주연부 주위의 수핵 영역을 둘러싸지만, 최상부면 및 최하부면은 둘러싸지 않는다.
일부 측면에서, 수핵 영역은 하이드로겔을 포함한다. 일부 측면에서, 하이드로겔은 히알루론산 또는 아가로스 하이드로겔일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 하이드로겔은 생존 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 생존 세포는 중간엽 줄기 세포 또는 네이티브 디스크 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 측면에서, 네이티브 디스크 세포는 네이티브 수핵 세포일 수 있다. 일부 측면에서, 생존 세포는 하이드로겔을 첨가하기 전에 배양되었다. 일부 측면에서, 수핵 영역이 배양되었다.
ii. 섬유륜 영역
섬유륜 영역은 척추 디스크의 외부이다. 섬유륜은 수핵 영역을 둘러싼다. 섬유륜은 수핵의 젤라틴성 물질이 척추 디스크 밖으로 누출되는 것을 방지하는 섬유의 층 또는 시트를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 섬유륜 영역은 최상부면, 최하부면, 내측면 엣지, 및 섬유륜 영역의 주연부를 한정하는 외측면 엣지를 포함하고, 여기서 내측면 엣지 및 외측면 엣지는 최상부면과 최하부면 사이에서 연장된다. 일부 측면에서, 내측면 엣지는 수핵 영역과 접촉할 수 있다.
일부 측면에서, 섬유륜 영역은 폴리머, 예컨데 폴리 (ε-카프로락톤) (PCL), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리락트산, 폴리-DL-락타이드, 또는 폴리디악사논을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 섬유륜 영역은 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO)를 추가로 포함한다. 따라서, 예를 들어, 섬유륜은 PCL과 PEO의 혼합물일 수 있다.
일부 측면에서, 섬유륜 영역은 나노-섬유 폴리머의 하나 이상의 시트를 포함한다. 예를 들어, 섬유륜 영역은 나노-섬유 PCL의 하나 이상의 시트를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 나노-섬유 폴리머 (예를 들어, PCL)의 시트는 라멜라 구조를 형성하도록 정렬될 수 있다.
일부 측면에서, 섬유륜 영역은 생존 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 생존 세포는 중간엽 줄기 세포 또는 네이티브 디스크 세포이다. 일부 측면에서, 네이티브 디스크 세포는 네이티브 섬유륜 세포이다.
일부 측면에서, 수핵 영역의 세포 및 섬유륜 영역의 세포는 동일한 기원에서 유래한다. 일부 측면에서, 수핵 영역의 세포 및 섬유륜 영역의 세포는 상이한 기원에서 유래한다. 일부 측면에서, 수핵 영역 또는 섬유륜 영역 또는 둘 모두의 세포는 이전에 배양되었다. 일부 측면에서, 섬유륜 영역이 배양되었다. 일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트가 배양되었다.
일부 측면에서, 동심원으로 감고 섬유륜 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 시딩하였다. 각 층 내의 나노-섬유는 임플란트의 장축에 대해 30도 각도로 배향되고 각 연속층에서 교대 방향 (+/-30도)으로 배향된다. 임플란트의 크기에 따라 5-20개의 층이 있을 수 있으며, 층의 두께 범위는 200-300 마이크로미터이다.
2. 종판
다공성 폴리머 폼 및 채널을 포함하는 종판이 개시된다. 일부 측면에서, 종판은 자연적으로 발생하지 않기 때문에 변형된 종판으로 간주될 수 있다.
일부 측면에서, 개시된 종판은 골 경계 측면 및 척추 디스크 경계 측면을 가질 수 있다. 골 경계 측면은 골, 예컨데 척추와 상호작용할 수 있다. 척추 디스크 경계 측면은 척추 디스크와 상호작용할 수 있다. 일부 측면에서, 개시된 종판은 종판의 골 경계 측면과 척추 디스크 경계 측면사이에서 연장된 주변 측면 엣지를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 제1 종판의 척추 디스크 경계 측면은 수핵 및 섬유륜 영역의 최상부면에 부착되고, 여기서 제2 종판의 척추 디스크 경계 측면은 수핵 및 섬유륜 영역의 최하부면에 부착된다.
일부 측면에서, 각 종판은 5 mm 미만, 4 mm 미만, 3 mm 미만, 2 mm 미만, 1 mm 미만의 두께를 갖는다. 두께는 골 경계 측면에서 종판을 통해 척추 디스크 경계 측면까지 직선으로 측정할 수 있다.
일부 측면에서, 2개의 종판 중 적어도 하나는 하나 이상의 혈관-촉진제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 혈관 촉진제는 혈관 내피 성장 인자, 데페록사민, 니모디핀, 또는 프탈아미드 신생혈관형성 인자 (PNF-1)일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
i. 폴리머 폼
일부 측면에서, 다공성, 폴리머 폼은 PCL이다. 일부 측면에서, 다공성, 폴리머 폼은 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리락트산, 폴리-DL-락타이드, 또는 폴리디악사논일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
ii. 하이드록시아파타이트
공학적 척추 디스크를 포함하는 공학적 척추 디스크 임플란트가 개시되며, 여기서 공학적 척추 디스크는 수핵 영역 및 섬유륜 영역; 및 2개의 종판을 포함하고, 여기서 종판은 다공성 폴리머 폼을 포함하고, 여기서 종판은 채널을 포함하고, 여기서 종판은 하이드록시아파타이트를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 하이드록시아파타이트는 종판의 표면 상에 코팅될 수 있다. 일부 측면에서, 하이드록시아파타이트는 종판 전체에 걸쳐 존재한다. 일부 측면에서, 하이드록시아파타이트는 표면 상에 및 종판 전체에 걸쳐 있을 수 있다.
iii. 본체 및 돌출부
일부 측면에서, 2개의 종판 중 적어도 하나는 본체; 및 본체로부터 외측으로 연장되는 골 경계 측면 상의 돌출부를 포함한다. 돌출부는 형상과 크기가 다양할 수 있다. 일부 측면에서, 돌출부는 원형, 직사각형, 또는 삼각형일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 돌출부는 종판의 두 축을 따라 종판 직경의 30-75%일 수 있다. 일부 측면에서, 돌출부는 종판의 골 경계 측면의 최대 80%일 수 있다.
일부 측면에서, 본체의 일부는 돌출부 바로 아래에 위치한다.
일부 측면에서, 돌출부는 횡축에 대해 종판의 중앙에 위치한다.
iv. 채널
일부 측면에서, 개시된 종판 중 하나 이상은 채널을 포함한다. 일부 측면에서, 채널은 공학적이다. 예를 들어, 채널은 자연적으로 발생하지 않는다.
일부 측면에서, 각 종판의 채널은 횡축에 대해 이격된 복수의 채널을 포함한다. 일부 측면에서, 각 종판의 복수의 채널은 서로 평행하거나 실질적으로 평행할 수 있고, 여기서 각 종판의 복수의 채널은 횡축에 수직이거나 실질적으로 수직일 수 있다.
일부 측면에서, 각 종판은 두께를 가지며, 여기서 종판의 각 채널은 종판의 두께보다 작은 깊이를 갖는다. 일부 측면에서, 각 채널의 깊이는 종판의 골 경계 측면에서 종판의 척추 디스크 경계 측면을 향해 측정할 수 있다.
일부 측면에서, 각 종판의 채널은 횡축에 대해 균일하게 이격된다. 일부 측면에서, 각 종판의 순차적 채널은 0.5 내지 5 mm 범위의 거리만큼 이격된다.
일부 측면에서, 종판의 각 채널은 종판의 주변 측면 엣지로부터 이격된 대향 단부를 갖는다.
일부 측면에서, 종판의 각 채널의 최대 깊이에서, 각 채널은 종판의 척추 디스크 경계 측면으로부터 동일하거나 실질적으로 동일하게 이격된다. 일부 측면에서, 종판의 각 채널의 최대 깊이에서, 적어도 하나의 채널은 종판의 척추 디스크 경계 측면으로부터 동일하게 이격되지 않는다.
일부 측면에서, 돌출부는 본체와 협력하여 종판의 적어도 하나의 채널을 한정한다. 일부 측면에서, 본체는 종판의 복수의 채널만을 한정한다. 일부 측면에서, 돌출부와 본체에 의해 한정된 적어도 하나의 채널은 본체에 의해서만 한정된 채널의 깊이보다 더 큰 깊이를 갖는다. 일부 측면에서, 돌출부와 본체에 의해 한정된 각 채널의 깊이는 0.5 내지 3.5 mm 범위의 깊이를 가지며, 본체에 의해서만 한정된 각 채널의 깊이는 0.5 내지 1.5 mm 범위의 깊이를 갖는다.
일부 측면에서, 채널은 종판의 본체에만 존재한다. 일부 측면에서, 채널은 종판의 돌출부에만 존재한다. 일부 측면에서, 채널은 종판의 본체 및 돌출부 모두에 존재한다.
C. 디스크 퇴행 치료 방법
개시된 공학적 척추 디스크 임플란트를 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 디스크 퇴행을 치료하는 방법이 개시되며, 여기서 공학적 척추 디스크 임플란트의 종판은 대상체의 척추에 부착된다.
디스크 퇴행을 치료하는데 사용하기 위한 공학적 척추 디스크 임플란트가 개시되며, 여기서 공학적 척추 디스크 임플란트는 본원에 개시된 공학적 척추 디스크 임플란트 중 하나 이상이고, 여기서 공학적 척추 디스크 임플란트의 종판은 디스크 퇴행이 있는 대상체의 척추에 부착된다.
디스크 퇴행을 치료하는데 사용하기 위한 공학적 척추 디스크 임플란트가 개시되며, 여기서 공학적 척추 디스크 임플란트는 공학적 척추 디스크를 포함하고, 여기서 공학적 척추 디스크는 수핵 영역 및 섬유륜 영역; 및 2개의 종판을 포함하고, 여기서 종판은 다공성 폴리머 폼을 포함하고, 여기서 종판은 채널을 포함한다. 일부 측면에서, 청구항 제1항의 공학적 척추 디스크 임플란트에서 종판은 하이드록시아파타이트를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트의 2개의 종판 중 적어도 하나는 본체; 및 본체로부터 바깥쪽으로 연장되는 골 경계 측면 상의 돌출부를 포함한다.
일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트는 환자에게 이식하기 전에 배양될 수 있다. 일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트 내의 생존 세포는 환자에게 이식하기 전에 배양되었다. 일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트는 환자에게 이식하기 전에 TGF-β3의 존재 하에 배양될 수 있다. 일부 측면에서, 배양은 공학적 척추 디스크 임플란트에서 세포의 분화를 초래한다. 세포의 분화는 자연적인 척추 디스크의 것과 유사한 특성을 갖는 공학적 척추 디스크 임플란트로 이어질 수 있다. 일부 측면에서, 배양에 의해 얻어지는 특성은 세포 생존력의 유지, 수핵 및 섬유륜 영역 내의 콜라겐 (유형 I 및 II) 및 프로테오글리칸 기질의 축적, 섬유륜 및 수핵 영역의 통합, 및 네이티브 수준을 향한 압축 기계적 특성의 성숙을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 개시된 방법은 공학적 척추 디스크 임플란트를 이식하기 전에 퇴행성 디스크를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 개시된 방법은 공학적 척추 디스크 임플란트를 이식하기 전에 척추의 일부를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 일부가 제거될 수 있는 척추는 공학적 척추 디스크 임플란트가 이식될 바로 위 또는 아래에 있는 척추이다. 일부 측면에서, 척추의 일부를 제거하는 단계는 척추를 긁거나 드릴링하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 척추의 일부를 제거하는 단계는 혈액 및 골 세포가 공학적 척추 디스크 임플란트에 통합되도록 할 수 있다.
일부 측면에서, 공학적 척추 디스크 임플란트의 세포는 대상체로부터 얻은 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 대상체로부터 얻어져, 공학적 척추 디스크 임플란트를 생성하는 데 사용되는 스캐폴드, 예컨데 공학적 척추 디스크 또는 이의 일부에 증착되거나 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 세포를 포함하는 스캐폴드는 공학적 척추 디스크를 대상체에게 이식하기 전에 세포가 분화되도록 배양된다. 일부 측면에서, 세포를 얻은 대상체는 공학적 척추 디스크 임플란트가 이식된 동일한 대상체이다. 일부 측면에서, 세포를 얻은 대상체는 공학적 척추 디스크 임플란트가 이식되는 대상체와 다른 대상체이다.
일부 측면에서, 종판은 골 경계 측면을 통해 척추에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 제1 종판은 그 위의 척추에 부착되고, 제2 종판은 그 아래의 척추에 부착된다. 척추에 종판을 부착하는 것은, 예를 들어 판 또는 지지대를 포함한 추가 하드웨어를 포함하거나 포함하지 않고 나사 배치와 같은 다양한 메커니즘을 통한 것일 수 있다. 일부 측면에서, 하드웨어는 금속 또는 생체-흡수성 폴리머로 만들어질 수 있다. 일부 측면에서, 생분해성 폴리머는 폴리(α -하이드록시산) 등급 - 예컨데 폴리 (락트산), 폴리 (글리콜산) 및 폴리 (락트산-코-글리콜라이드)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 종판은 척추와 통합된다. 일부 측면에서, 척추에 종판을 부착하기 전 또는 부착하는 동안, 척추와 종판의 적절한 정렬이 수행된다. 적절한 정렬은 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 측면에서, 적절한 정렬은 공학적 척추 디스크 임플란트가 부착되면 임플란트의 위와 임플란트 아래의 척추가 건강한 척추 뼈와 유사한 방식으로 정렬되는 것을 의미할 수 있다.
일부 측면에서, 대상체의 세포는 공학적 척추 디스크 임플란트에 침투한다. 대상체의 세포가 공학적 척추 디스크 임플란트에 침투하면, 공학적 척추 디스크 임플란트의 종판에 생존 세포가 생성될 수 있다.
일부 측면에서, 종판은 콜라겐을 포함한다. 일부 측면에서, 종판은 혈관을 형성한다. 혈관 형성은 주변 골 및 조직에서 침투하는 혈액과 세포에서 발생할 수 있다.
D. 키트
상술한 물질 및 기타 물질은 개시된 방법을 수행하거나 돕는데 유용한 키트로서 임의의 적합한 조합으로 함께 포장될 수 있다. 주어진 키트의 키트 구성요소가 개시된 방법에서 함께 사용하도록 설계되고 개조된 경우 유용하다. 예를 들어, 공학적 척추 디스크 임플란트의 하나 이상의 구성요소를 포함하는 키트가 개시된다. 개시된 수핵 영역 중 하나 이상, 개시된 공학적 척추 디스크 중 하나 이상, 개시된 종판 중 하나 이상 및/또는 세포를 포함하는 키트가 개시된다.
실시예
A. 실시예 1
1. 배경기술
네이티브 디스크의 내부 수핵 (NP, 물 및 프로테오글리칸 풍부) 및 외부 섬유륜 (AF, 라멜라 콜라겐 구조) 하위구조를 모방하도록 설계된 공학적 하위구성요소와 함께 다양한 조직 공학적 디스크가 문헌에 기술되어 있다. 본 발명자의 설계를 제외하고 생체 내에서 평가된 유일한 다른 공학적 디스크 작제물은 NP 영역에 대한 세포-시딩된 알지네이트 하이드로겔과 그 안에 시딩된 세포에 의해 원주 방향으로 정렬된 AF 영역에 대한 콜라겐 겔로 구성된다. 개시된 발명은 네이티브 조직을 보다 밀접하게 재현하는 AF 영역에 대해 라멜라 구조를 이용한다는 점에서 선행 기술과 상이하다. 네이티브 골과의 통합을 촉진하는, NP 및 AF 구성요소에 부착된 생체재료 경계도 포함되어 있다.
2. 설명
본원에서는 다음의 4개의 구성요소로 구성된 공학적 척추 디스크 임플란트라고도 지칭되는 종판-변형된 디스크형 앵글-플라이 구조물(disc-like angle-ply structure) (eDAPS)가 개시된다: (도 1) 하이드로겔: 세포 (중간엽 세포, 또는 네이티브 디스크 세포)가 시딩된 하이드로겔은 공학적 디스크의 수핵 영역을 포함한다. 정렬된 나노-섬유, 라멜라 폴리 (ε-카프로락톤): 디스크의 섬유륜 영역은 정렬된 전기방사 폴리 (ε-카프로락톤) (PCL) 시트로 제작된다. 나노섬유의 시트는 섬유가 각 스트립에서 30° 각도로 배향되도록 스트립으로 절단된다. 스트립에 세포 (중간엽 줄기 세포, 또는 네이티브 디스크 세포)를 시딩한 다음 연속 층에서 ±30° 섬유 방향을 달성하도록 결합하고, 원형 몰드에 감아 라멜라 구조를 생성한다. 그런 다음, 세포 시딩된 하이드로겔을 고리 구조의 중앙에 배치하여 복합 AF-NP 구조를 생성한다. 다공성 폴리 (ε-카프로락톤) 폼: 2개의 다공성 PCL 폼은 염 침출 프로세스를 통해 제작되며, 배양 동안 AF-NP 복합재의 양측면에 부착된다. 이러한 "종판" 영역은 생체 내 이식 후 인접한 골과 연결되도록 설계되었으며, 통합이 발생할 경계를 제공한다. 폼은 또한 채널을 함유할 수 있으며, 골 통합을 촉진하기 위해 하이드록시아파타이트로 변형될 수 있다 (도 2). 혈관-촉진제를 함유하는 미소구체는 네이티브 골과 연결될 폼의 엣지에 통합될 수 있다.
eDAPS는 인간의 경추 디스크 공간에 맞는 크기를 포함하는, 다중 길이 스케일로 제작될 수 있다. 이 대규모 스케일에서, 세포가 시딩된 eDAPS는 TGF-β3를 갖는 화학적으로 정의된 배지에서 최대 17주 동안 사전-배양되어, 세포가 스캐폴드 내에 프로테오글리칸 및 콜라겐 풍부 기질을 증착함에 따라 임플란트의 기계적 특성이 성숙하도록 한다.
eDAPS의 성능은 소형 (랫트 꼬리) 및 대형 (염소 경추) 동물 모델 모두에서 생체 내 평가하였다. 랫트 꼬리 디스크 교체 모델에서 생체 내 이식 후, MRI, 조직학, 및 생화학 데이터는 eDAPS 조성물 및 수화물이 생체 내에서 20주 동안 안정적이며 eDAPS가 네이티브 디스크 조성물 및 구조물의 많은 특징을 요약한다는 것을 입증한다 (도 3). 종판-척추체 경계의 성숙 증거는 이식 10주 내지 20주 사이에 관찰되었다. AF 및 종판 영역으로의 증가된 세포 침투는 10주 내지 20주 사이의 조직학 샘플에서 분명했지만, 세포는 동일한 기간 동안 NP 내에 남아있었다. 공학적 종판이 이식 당시 무세포 였다는 점을 감안할 때, 이는 인접 조직의 네이티브 세포가 시간이 지남에 따라 종판의 개방된 다공성 구조로 이동하여 기질을 생성할 수 있음을 나타낸다.
eDAPS 압축 기계적 특성의 현저한 성숙 (도 4a 내지 도 4c)은 또한 생체 내 이식 기간이 증가함에 따라 관찰되었으며, 궁극적으로 대부분의 측면에서 네이티브 운동 분절 값과 일치한다. eDAPS 토 영역 모듈러스는 이식 전 값에 비해 20주 후에 상당히 증가하였으며, 10주 또는 20주에서는 네이티브 디스크 토 영역 모듈러스와 다르지 않았다. 디스크의 토 영역 역학은 주로 NP의 기능에 의해 결정되며, 이는 NP 영역이 생체 내 이식 후 계속 성숙하여 전반적인 디스크 기능에 기여함을 나타낸다. 선형 영역 모듈러스는 이식 전 수준에 비해 증가하는 경향이 있었지만 생체 내 이식에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 이식된 eDAPS는 선형 영역 압축 모듈러스 측면에서 10주 또는 20주차에 네이티브 디스크와 다르지 않았다. eDAPS의 선형 영역 응답은 초기에 eDAPS의 AF 영역을 포함하는 PCL에 의해 지배되고; 따라서, 네이티브 선형 영역 역학은 이식 전에도 어느 정도 재현된다. 네이티브 조직과 eDAPS의 통합 강도는 또한 인장 대 파괴 시험을 통해 랫트 꼬리 모델에서 평가하였다 (도 4d 내지 4f). 인장 토 영역 모듈러스와 선형 영역 모듈러스의 증가는 이식 10주에서 20주 사이에 분명하였다. 인장의 토 및 선형 영역 모듈러스는 20주 eDAPS 이식된 운동 분절에서 네이티브 랫트 꼬리의 범위 내에 있었다. eDAPS의 파괴 응력과 변형률은 각각 생체 내에서 20주 후 네이티브 값의 46.6% 및 50.1%이었다.
다음으로, eDAPS 생체 내 성능은 보다 임상적으로 관련된 모델에서 평가되었으며, 염소 경추는 그의 반-직립 특성과 인간 경추와 디스크 높이 및 면적이 유사하여 선택되었다. 염소 경추에 사전-배양된 eDAPS를 이식한 후 (도 5), eDAPS 조성물 및 구조물은 생체 내에서 4주 후에도 이식 전 수준 이상으로 유지되었다. 생체 내에서 8주 후, PCL 종판과 섬유륜 내 콜라겐 기질 증착이 증가하였으며, 4주차에 비해 NP 영역 내 프로테오글리칸 염색이 약간 감소하였다. SHG 이미지는 또한 초기에 무세포 PCL 종판 내에서 조직화된 콜라겐의 증착을 나타내었고, 그 결과 eDAPS와 척추체의 초기 통합이 4주차에 나타났으며, 이는 8주 후에 추가로 성숙되었다. 압축 기계적 시험은 생체 내에서 8주 후 이식 전 값으로부터 eDAPS 기계적 특성의 상당한 성숙을 보여주었다. eDAPS 이식 운동 분절의 토 및 선형 영역 모듈러스는 네이티브 염소 경추 모듈러스 보다 높은 경향이 있었지만, 전이 및 최대 변형률은 8주차에서 사전-이식 수준으로부터 크게 감소하였으며, 네이티브 경추 운동 분절과 크게 다르지 않았다.
B. 실시예 2
1. 서론
공학적 디스크의 현재 문제를 해결하기 위해, 공학적 척추 디스크 임플란트라고도 지칭되고 3개의 별개 구성요소로 구성된 종판-변형된 디스크형 앵글 플라이 구조물 (eDAPS)가 네이티브 척추 운동 분절의 계층 구조를 모방하기 위해 개발되었다. NP 영역은 세포-시딩된 히알루론산 또는 아가로스 하이드로겔로 형성되는 반면, AF 영역은 세포-시딩된 정렬된 나노섬유 폴리 (ε-카프로락톤) (PCL)의 동심층으로 구성된다. 하이드로겔은 네이티브 NP의 고도로 수화된 상태를 요약하기 위해 NP 영역에 선택되었고, 반면 PCL은 느린 분해 속도, 강력한 기계적 특성, 및 섬유륜의 섬유 아키텍쳐를 복제하는 정렬된 구조로 전기방사를 통해 제조할 수 있는 능력으로 인해 AF 영역에 선택되었다. AF 및 NF 영역은 eDAPS 작제물을 생성하기 위해 종판 (EP) 유사체로서 2개의 무세포, 다공성 PCL 폼과 조합된다. 이러한 eDAPS는 이전에 단기 연구에서 랫트 꼬리 디스크 교체 모델에서 평가되었으며, 종판-변형된 작제물은 종판이 없는 작제물보다 더 뛰어나다. 여기에서, eDAPS의 장기간 생체 내 통합 및 기계적 기능은 랫트 꼬리뼈에서 입증되었다. 이러한 공학적 디스크는 생체 내에서 기능적으로 성숙하는 동안 조성물 및 구조물을 유지하여 20주까지 네이티브 인장 및 압축 기계적 특성에 도달하였다. 조직 공학적 디스크 교체의 임상 번역을 더욱 증진시키기 위하여, 인간 크기의 eDAPS를 대형 동물 (염소) 모델의 경추에 성공적으로 이식하였다.
2. 결과
i. eDAPS 구조물 및 조성물은 생체 내에서 유지된다.
조직 공학적 디스크가 장기간 이식을 통해 네이티브 디스크의 구조와 기능을 재현할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, eDAPS를 최대 20주 동안 소형 동물 디스크 교체 모델에 생체 내 이식하였다. 랫트 꼬리뼈에 맞는 크기의 eDAPS (4-5 mm 직경, 5-6 mm 높이)를 제작하고, 히알루론산 하이드로겔 내에 소 NP 세포를 시딩하고 계층화된 PCL/폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO) 스캐폴드 내에 소 AF 세포를 시딩하고, 2개의 무세포 PCL 폼 종판과 조합하였다 (도 6). eDAPS는 운동 분절을 고정하고 eDAPS 보유를 보장하도록 외부 고정으로 10주 (n = 5) 또는 20 주 (n = 9) 동안 흉선 랫트 꼬리 디스크 공간에 이식하기 전에 TGF-β3가 포함된 화학적으로 정의된 배지에서 시험관 내에서 5주 동안 배양되었다.
자기 공명 영상 (MRI), 특히 T2-강조 MRI는 디스크 건강을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 임상 도구이다. 디스크의 정량적 T2 맵핑은 또한 NP에서 T2 이완 시간이 디스크 수화, 프로테오글리칸 함량 및 역학과 긍정적인 상관관계가 있음을 입증하였다. 이식된 eDAPS의 T2 맵핑 (도 7a)은 NP에서 T2 이완 시간이 생체 내 이식 10주 또는 20주 후에 네이티브 값으로 유지되었음을 입증하였다 (도 7b). 그러나, eDAPS AF T2 값은 20주차에 네이티브 AF 보다 상당히 더 높았다 (P < 0.01) (도 7c). 반대로, 종판 T2 값은 10주 및 20주차에 사전-이식 값으로부터 감소했으며, 이는 이 영역에서 새로운 기질이 증착되었음을 나타낸다 (도 8). 전반적으로, 이 MRI 데이터는 eDAPS가 장기간 이식으로 NP와 AF 내에서 생화학적 조성물과 수화물을 유지했음을 나타낸다.
MRI 결과는 조직학 및 정량적 생화학을 통해 확인되었다. eDAPS 이식된 운동 분절의 알시안 블루 및 피크로시리우스 레드 염색 섹션은 NP에서 강력하고 지속적인 프로테오글리칸 염색을 보여주었고 10주에서 20주 사이에 AF에서 콜라겐 증착을 증가시켰으며 - 이는 네이티브 디스크의 기질 분포를 재현한 것이다 (도 7d). 공학적 종판과 네이티브 척추체의 통합이 증가했다는 증거는 이식 기간이 길어질수록 관찰되었다. 네이티브 디스크에서, 유형 II 콜라겐과 콘드로이틴 설페이트는 주로 NP 영역에 분포되고, 유형 I 콜라겐이 풍부한 AF에서는 거의 발현되지 않았다. 이 기질 분포는 디스크의 기계적 기능에 매우 중요하며 - 프로테오글리칸이 풍부하고 고도로 수화된 NP에서 생성된 정수압은 AF를 긴장 상태로 만들어 디스크가 압축 하중을 견딜 수 있도록 한다. 면역조직화학 (도 9, 도 10)은 NP 영역에서 유형 II 콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트에 대한 강력한 염색과 함께 이식 10주 및 20주 후 eDAPS 내 기질 분포의 유사한 패턴을 나타냈다. 유형 II 콜라겐 및 콘드로이틴 설페이트 염색은 AF 영역에서 더 낮았지만, PCL 폼 종판에 존재했으며, 10주에서 20주로 증가하였다. 유형 I 콜라겐은 10주 및 20주 시점 모두에서 eDAPS 전체에 고르게 분포되었다.
조직학적 소견에 따르면, NP, AF, 및 종판 글리코사미노글리칸 (GAG) 함량은 이식 후 20주 동안 사전-이식 값으로 유지되었다 (도 7e 내지 도 7g). NP, AF, 및 종판 콜라겐 함량은 생체 내에서 20 주 후 사전-이식 값으로부터 상당히 증가하였다 (각각 P = 0.01, 0.04 및 0.01) (도 7h 내지 7j). NP 및 AF GAG 및 콜라겐 함량은 두 시점에서 네이티브 값 미만으로 유지된 AF GAG 함량을 제외하고 일반적으로 네이티브 랫트 꼬리 NP 및 AF의 범위에 있었다.
이러한 MRI, 조직학, 및 생화학 데이터는 eDAPS 조성물 및 수화물이 생체 내에서 20주 동안 안정적이며 eDAPS가 네이티브 디스크 조성물 및 구조물의 많은 특징을 재현한다는 것을 입증하였다. 종판-척추체 경계의 성숙 증거는 이식 10주에서 20주 사이에 관찰되었다. AF 및 종판 영역으로의 증가된 세포 침투는 10주에서 20주 사이의 조직학 샘플에서 명백했지만, 세포는 동일한 기간 동안 NP 내에 남아있었다 (도 11, 도 12). 공학적 종판이 이식 당시 무세포였다는 점을 감안할 때, 이는 인접 조직의 네이티브 세포가 시간이 지남에 따라 종판의 개방된 다공성 구조로 이동하여 기질을 생성할 수 있음을 나타낸다.
ii. eDAPS 기계적 특성은 생체 내 네이티브 값에 접근한다.
관찰된 eDAPS의 생체 내 통합 및 성숙이 척추 기계적 기능에 어떻게 영향을 미치는지 설명하기 위해, eDAPS 이식된 운동 분절의 압축 및 인장 특성을 정량화하였다. 생체 내에서 10주 및 20주 후, 척추-eDAPS-척추 운동 분절은 분리되고, 생리학적 부하 (20주기 압축, 0 내지 -3N ~ 0 내지 0.25 MPa) 하에서 압축 기계적 시험이 실시되었다. 이 하중 체계는 공학적 디스크에 인체 체중의 0.5배 응력의 인가, 공학적 디스크 임플란트의 생체 내 연구에 대해 지금까지 고려되는 가장 까다로운 기계적 시험 프로파일, 및 랫트 꼬리뼈에 이식한 후 조직 공학적 디스크의 기계적 기능을 특성화하는데 이전에 사용된 것보다 16배 더 큰 것을 나타낸다. 이러한 시험에서, eDAPS 이식된 운동 분절의 압축 기계적 특성을 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절과 비교했을 뿐만 아니라 5주의 시험관 내 배양 (사전-이식) 후 eDAPS 작제물의 특성과 비교하였다.
eDAPS 압축 기계적 특성의 현저한 성숙은 생체 내 이식 기간이 증가함에 따라 관찰되었으며, 궁극적으로 대부분의 측면에서 네이티브 운동 분절 값과 일치한다 (도 13a). eDAPS 토 영역 모듈러스는 사전-이식 값에 비해 20주 후에 상당히 증가하였으며 (P = 0.01), 10주 또는 20주에서는 네이티브 디스크 토 영역 모듈러스와 다르지 않았다 (도 13b). 디스크의 토 영역 역학은 주로 NP의 기능에 의해 결정되며, 이는 NP 영역이 생체 내 이식 후 계속 성숙하여 전반적인 디스크 기능에 기여함을 나타낸다. 선형 영역 모듈러스는 사전-이식 수준에 비해 증가하는 경향이 있었지만 생체 내 이식에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 이식된 eDAPS는 선형 영역 압축 모듈러스 측면에서 10주 또는 20주차에 네이티브 디스크와 다르지 않았다 (도 13b). eDAPS의 선형 영역 응답은 초기에 eDAPS의 AF 영역을 포함하는 PCL에 의해 지배되고; 따라서, 네이티브 선형 영역 역학은 이식 전에도 어느 정도 재현된다. 조직학에서, eDAPS AF 내의 PCL은 생체 내에서 20주 동안 지속되었으며 (도 7d), 따라서 새로운 조직이 이 영역에 증착되고 축적됨에 따라 그 시점에서 선형 영역 역학에 여전히 기여했을 가능성이 있다. eDAPS 작제물은 이식 전 미성숙 상태에 있고 기질 수준이 낮으며, 작제물의 전이 및 최대 변형률은 초기에 초-생리학적이다. 그러나, 생체 내 10 또는 20주 후, 전이 및 최대 변형률 모두가 네이티브 값으로 상당히 감소되었는데 (P < 0.01), 이는 작제물의 조성적 성숙 및 네이티브 조직과의 통합을 나타낸다 (도 13c). 전반적으로, 이러한 결과는 eDAPS가 장기간 이식 후 네이티브 운동 분절 기계적 기능을 재현하고 척추 운동 분적의 까다로운 하중 환경을 견딜 수 있음을 입증한다.
거시적 압축 시험은 eDAPS 전체의 기계적 기능에 대한 정보를 제공하고; 따라서, 디스크 영역 자체 (종판 사이에 위치한 조직)의 기능은 이 방법으로 결정할 수 없다. 공학적 종판은 네이티브 척추체와 통합되고 시간이 지남에 따라 골로 재형성되기 때문에, 공학적 디스크 (DAPS) 영역은 점점 더 운동 분절의 기능을 담당하게 될 것이다. 종판과 무관하게 DAPS의 기계적 특성을 해결하기 위해, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 결합 압축 시험을 사용하여 생체 내에서 20주 후에 역학을 평가하였다. 20주 이식 그룹의 경우, 종판은 지르코니아 옥사이드 나노입자를 포함하여 방사선 불투과성으로 만들어 디스크/DAPS 경계의 μCT의 시각화를 허용하였다. 거시적 압축 시험 후, 체중의 0.5배에 해당하는 3N 압축 하중을 인가하기 전 및 후에 척추-eDAPS-척추 운동 분절 및 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절에 μCT 스캔을 적용하였다 (도 13d). 방사선 불투과성 PCL 종판 사이의 공학적 디스크 (DAPS)의 높이와 척추 종판 사이의 네이티브 디스크의 높이는 압축 전후 3차원 μCT 렌더링에서 정량화되었다. 이 분석을 통해 디스크 자체의 변형률을 계산할 수 있다. 축방향 디스크 높이의 공간 맵 (도 13e)은 초기 DAPS 높이가 네이티브 값보다 컸음에도 불구하고 네이티브 디스크 및 압축 후 DAPS에 걸쳐 디스크 높이에서 유사한 분포를 나타내었다. 생리학적 압축 하에서 압축 변형률은 네이티브 디스크보다 높은 경향 (P = 0.11)이었다 (도 13f). 이는 eDAPS의 거시적 특성이 동석 설정에서 측정될 때 네이티브 운동 분절의 특성을 전체적으로 재현하지만, 평형 상태에서 측정할 때 20주차에 임플란트의 디스크 영역에 일부 기계적 불충분함이 남아있음을 나타낸다. 이는 특히 AF 영역에서 네이티브 디스크에 비해 eDAPS GAG 함량이 부족하기 때문일 수 있다.
iii. eDAPS는 기능적으로 네이티브 조직과 통합된다.
조직학, 생화학적 함량 및 거시적 역학은 이식 후 네이티브 조직과 eDAPS의 점진적 통합을 나타내었다. 이 통합의 정도는 조직 내 조직화된 콜라겐의 시각화를 제공하는 2차 고조파 생성 (SHG) 이미지화를 통해 추가로 평가하였다. 공학적 종판 내의 SHG 신호는 10주에서 20주로 실질적으로 증가하였다 (도 14a). SHG는 또한 이식 후 시간이 증가함에 따라 AF 종판 및 종판-척추체 경계 모두에서 eDAPS의 점점 더 강력한 통합을 입증하였다. 미네랄화된 콜라겐 및 희박한 혈관형성은 말로리-하이덴하인 염색 조직학 섹션을 통해 관찰된 바와 같이 20주차에 공학적 종판에서 명백했으며 (도 14b), 여기서 골 기질은 짙은 회색으로 염색되고, 미네랄화된 콜라겐은 밝은 회색으로 염색되고 적혈구는 화살표로 도시되었다.
이러한 점진적 통합은 10주 내지 20주 이식으로 개선된 인장 기계적 특성의 실질적인 변화를 초래하였다 (도 14c). 압축 매크로- 및 마이크로-CT 기반 기계적 시험 후, eDAPS 임플란트를 둘러싼 연조직의 완전한 방출이 수행되었다. 10주차에, 주변 연조직으로부터 운동 분적을 제거하는 작업은 3개의 샘플 중 1개에서 실패하였다. 반대로, 20주 그룹의 모든 샘플은 원주 방향 조직 방출 후에서 온전한 상태를 유지하였다. 이러한 20주 eDAPS 이식된 운동 분절이 인장 파괴에 대해 시험되었을 때, 모든 샘플에서 AF/NP-PCL 종판 접합부에서 파괴가 발생하였다. 네이티브 랫트 꼬리에서는 성장판에서 인장 파괴가 발생하였다. 인장 토 영역 모듈러스와 선형 영역 모듈러스의 증가는 이식 10주에서 20주 사이에 분명하였다. 인장의 토 및 선형 영역 모듈러스 (도 14d 내지 도 14e)는 20주 eDAPS 이식된 운동 분절에서 네이티브 랫트 꼬리의 범위 내에 있었다. eDAPS의 파괴 응력 및 변형률 (도 14f 내지 도 14g)은 각각 생체 내 20주 후 네이티브 값의 46.6% 및 50.1%였다. 생체 내 이식 후 조직 공학적 디스크의 파괴에 대한 인장 특성은 이전에 보고된 적이 없었다. 본 연구에서 도달한 인장 응력 (파괴에 인장을 인가)은 랫트 꼬리 디스크 공간에 이식된 조직 공학적 디스크의 비-파괴 인장 시험 (±3% 인가된 인장 변형률) 동안 이전에 보고된 것 보다 45배 높다 (675 kPa 대 15 kPa).
iv. eDAPS는 대형 동물 모델에 이식한 후 구성적으로 및 기능적으로 성숙된다.
랫트 꼬리 디스크 교체 모델의 결과는 유망했지만, 랫트 꼬리 디스크는 인간의 요추 또는 경추 디스크의 크기의 분획이며, 랫트 꼬리뼈 또한 인간의 척추와 다른 해부학 및 기계적 하중 환경을 갖는다. 따라서, eDAPS의 임상 번역은 인간 척추와 유사한 기하학적 기능 및 기계적 기능을 갖는 대형 동물 모델에서 크기 및 평가에 있어서 작제물의 규모 확대를 필요로 한다. 인간의 경추는 금속 및 플라스틱 인공 전체 디스크 임플란트가 이미 이 위치에서 어느 정도 성공적으로 사용되었고 요추에 비해 더 작은 크기와 덜 까다로운 기계적 부하 환경을 가지고 있다는 점을 감안할 때 조직 공학적 전체 디스크 교체를 위한 첫 번째 임상 목표일 가능성이 있다. 염소 경추는 다음에 eDAPS 성능을 평가할 대형 동물 모델로 선택되었다. 염소는 척추 연구에 일반적으로 사용되는 대형 동물 모델이며, 염소 경추는 인간의 경추와 유사한 반 직립 신장과 디스크 치수의 이점을 갖는다. DAPS를 임상적으로 관련된 대규모 스케일로 확장할 수 있는 가능성이 입증되었으며, 염소 경추 디스크 공간에 맞는 크기의 DAPS는 시험관 내 배양 동안 구성적으로 및 기능적으로 성숙하지만 더 작은 DAPS보다 느린 속도로 설명되었다.
이 맥락에서 eDAPS를 평가하기 위해, 염소 경추 (9 mm 높이, 16 mm 직경)에 이식하기 위한 크기의 작제물을 NP 영역에 아가로스 하이드로겔을 사용하고 AF 영역에 정렬된 PCL의 동심층을 사용하여 무세포 PCL 폼 종판과 조합하여 제작하였다 (도 15). 대형 동물 연구에 보다 번역 관련성이 높은 세포 소스를 사용하기 위해, eDAPS에 동종 염소 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 시딩하고, 이식 전에 13-15주 동안 배양하였다. 7마리의 큰 체격의 수컷 염소의 C2-C3 디스크 공간이 노출되었고, 인간의 경추 수술에 일반적으로 사용되는 도구를 사용하여 네이티브 디스크 및 인접한 척추 뼈 및 연골 종판의 일부를 견인 하에 제거하였다. eDAPS를 대피 공간 내에 배치하고, 견인을 해제하고 (eDAPS를 압축 하에 놓음), 인터스페이스를 전방 경추 판으로 고정시켰다 (도 16a 내지 도 16d). 판 고정은 고정 없이 비글 경추에서 공학적 디스크 보유 문제를 입증한 이전 작업으로 활용하였다. 모든 염소는 합병증 없이 수술 절차로부터 회복되었고 (도 16e), 완전한 경추 기능을 유지하였다. 이식 4주 후, 4마리의 동물을 안락사시키고 조직학적 분석을 위해 경추를 채취하였다.
생체 내에서 4주 후, 아시안 블루 및 피크로시리우스 레드로 염색된 중간-시상 조직학 섹션은 eDAPS 구조가 염소 경추 공간 내에서 보존되었고, 기질 분포 및 함량이 유지되거나 이식 전 값과 비교하여 약간 개선되었음을 입증하였다 (도 17a 내지 도 17b, 도 18). 조직학 및 SHG 이미지는 또한 종판 영역과 네이티브 조직의 초기 통합을 입증하였다. SHG 신호는 PCL 폼 내에 존재하고 eDAPS의 인접한 척추체 및 AF 영역으로부터의 신호와 연속적이었는데, 이는 초기에 무세포 PCL 폼 종판 내에서 새로운 조직화된 콜라겐 기질 증착을 나타낸다 (도 17c). 또한, eDAPS의 NP 및 AF 영역의 세포성은 4주 이식 기간 동안 유지되었는데, 이는 PCL 폼 종판으로 내인성 세포가 침투한 증거였다 (도 17d, 도 19). 콜라겐 II, 아그레칸, 및 콜라겐 I에 대한 면역조직화학은 eDAPS의 기질 조성이 일반적으로 콜라겐 II 및 아그레칸이 풍부한 NP 및 주로 콜라겐 I로 구성된 AF를 갖는 네이티브 디스크의 특성을 재현한다는 것을 입증하였다 (도 17d, 도 20). 헤마톡실린 및 에오신 염색은 4마리 동물 중 3마리에서 eDAPS AF의 외층으로 호중구 (neutrophils)가 일부 침투된 것으로 나타났는데, 이는 잠재적으로 동종 세포 소스로 인한 국소화된 경증 염증 반응을 나타낸다 (도 19). 그러나, 이것은 임플란트의 가장 바깥쪽 영역으로 제한되었고 동물은 연구 기간 동안 감염, 임플란트 거부반응, 또는 기능 손상의 임상 징후를 보이지 않았다.
나머지 3마리는 이식 후 8주차에 안락사되었고, eDAPS 임플란트와 네이티브 염소 경추 운동 분절은 정량적 MRI 및 압축 기계적 시험을 통해 분석하였다. 이식 8주 후 eDAPS의 T2-강조 MRI는 생체 내 eDAPS 구조의 유지를 입증하였고 이식 전 값에 비해 NP 및 AF 영역에서 신호 강도가 증가하였다 (도 15a 내지 15b). eDAPS 임플란트의 정량적 T2-맵핑은 이식 8주 후 NP T2 값이 네이티브 T2 값보다 상당히 낮았지만 (P = 0.04), 건강한 네이티브 염소 경추 디스크의 범위 내에 있음을 입증하였다 (도 15c). 이식 8주 후 eDAPS의 기능을 평가하기 위해, 전방 고정 판을 제거한 후 척추-eDAPS-척추 운동 분적을 분리하고 생리학적 부하에서 압축 시험을 실시하였다. eDAPS에 가해지는 응력은 평균적인 인간의 경추 디스크 공간에 가해지는 응력과 동일하였다 (20 주기의 압축, 0 내지 25N, 0 내지 0.084 MPa). 대형 동물 모델에서 생체 내 조직 공학적 디스크의 기계적 기능은 이전에 보고된 적이 없었다.
eDAPS의 압축 기계적 특성은 이들의 이식 전 값에서 증가했으며, 인접한 네이티브 경추 디스크의 압축 특성과 일치하거나 초과하였다 (도 15d). 토 영역 모듈러스는 이식 전 값과 비교하여 eDAPS 이식된 운동 분적에서 상당히 증가한 반면 (P = 0.02) (도 15e), 전이 및 최대 변형률은 생체 내 8주 후 이식 전 값에서 상당히 감소하였다 (각각 P = 0.04 및 P = 0.03) (도 15f). eDAPS 모듈러스 및 변형률은 생체 내에서 7주 후 네이티브 경추 디스크와 크기 다르지 않았다. 임플란트의 기계적 특성의 이러한 성숙은 μCT 이미지화를 통해 알 수 있듯이 eDAPS와 네이티브 조직의 점진적 통합으로 인한 것일 것이다 (도 21).
이전 연구는 랫트 꼬리에서 비글 경추까지 조직 공학적 디스크의 번역을 선도하였지만; 비글 경추 디스크 공간은 인간의 경추 디스크 공간 크기의 절반 미만이다. 이 비글 척추에 대한 이전 연구는 4주차에 유망한 결과를 발견하였지만; 프로테오글리칸 함량과 디스크 높이의 손실은 더 오랜 기간 동안 명백했으며, 이식 후 기계적 특성은 보고되지 않았다. 본원에서, 인간의 경추와 유사한 치수를 공유하는 염소 경추 디스크 교체 모델이 확립되었으며, 그 결과 eDAPS를 이 대형 동물 모델로의 번역 가능성을 보여준다. eDAPS 조성물, 수화물 및 세포성은 생체 내에서 유지되었는데, 이는 eDAPS가 네이티브 척추체와 통합되었다는 증거였다. 이식 8주 후, eDAPS 임플란트의 기계적 기능은 네이티브 디스크 기계적 특성과 유사했으며, 이식 전 값에서 상당한 성숙을 보여주었다.
3. 논의
전체 디스크 조직 공학은 외과적 개입이 필요한 말기 디스크 퇴행 및 관련 척추 병리를 갖는 환자를 위한 치료 전략으로서 유망하다. 생체 내 이식 시, 성공적인 조직 공학적 디스크 교체는 네이티브 디스크 공간 높이를 복원하고, 인접한 척추체와 통합되며, 생리학적 부하 하에서 디스크의 기계적 기능을 재현하고, 생존 세포 집단을 보유하여 건강한 네이티브 디스크와 유사한 기질 구성 및 분포를 유지할 것이다. 임상 번역을 진행하기 위해, 조직 공학적 디스크는 인간 척추와 유사한 기하학, 해부학, 및 역학을 갖는 대형 동물 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 인체 임상 적용을 위한 추간 디스크의 조직 공학에는 길이 스케일이라는 추가 과제가 있으며, 경추의 경우 디스크 높이가 5 mm이고 요추의 경우 11 mm이다. 추간 디스크는 또한 신체에서 가장 큰 무혈성 구조라는 점에서 독특하며, 그 결과 대규모 조직 공학적 작제물에 도전이 될 저영양 환경을 초래한다.
이러한 문제를 감안할 때, 지금까지 현장에서 대부분의 작업은 작은 크기 스케일 (높이 2-3 mm 및 직경 4-10 mm)에서 조직 공학적 디스크의 시험관 내 특성화로 제한되었다. 게다가, 척추 내에서 생체 내 전체 조직 공학적 디스크를 평가한 연구는 거의 없으며, 연구는 수행될 때 소형 동물 모델로 제한되었다. 조직 공학적 전체 디스크 교체의 임상 번역을 증진시키기 위해, 종판 (DAPS 및 eDAPS)이 있거나 없는 조직 공학적 디스크가 개발되었으며, 이러한 작제물은 시험관 내에서 다양한 크기 스케일 (최대 인간 경추 디스크 크기)로 평가되었고, 소형 동물 모델에서 단기간에 시험관 내에서 평가하였다. 이 연구에서, eDAPS의 조성물 및 기계적 기능을 랫트 꼬리 디스크 교체 모델에서 최대 20주 동안 생체 내에서 평가하였으며, 추가로 최대 8주 동안 대형 동물 모델에서 인간 경추 크기의 eDAPS를 평가하였다.
이 연구의 결과는 eDAPS가 랫트 꼬리에서 시간이 지남에 따라 생체 내에서 구성적으로 성숙하여 20주 차에 네이티브 디스크와 유사한 기계적 특성을 달성한다는 것을 보여주었다. eDAPS는 기능적으로 인접한 척추체와 통합되어, 인장력에서 강력한 기계적 특성을 생성한다. 생체 내 조직 공학적 디스크의 기능적 통합은 이전에 입증되지 않았지만, 이것은 임상 번역을 위한 중요한 벤치마크이다. 네이티브 디스크의 기능은 본질적으로 사실상 기계적이기 때문에, 척추에 가해지는 압축 하중은 AF 콜라겐 섬유를 긴장 상태로 만드는 NP 내의 정수압의 발달을 통해 지원되며, 인접한 척추체와 네이티브 디스크의 경계는 적절한 기계적 기능이 중요하며 생체 내 이식 후 조직 공학적 작제물을 재현하는 데 필수적이다. eDAPS에서, 인장 기계적 특성의 개선은 eDAPS 경계, 특히 PCL 종판-척추체 접합부의 성숙을 증가시키는 것을 동반하였고, 여기서 침투하는 숙주 세포는 시간이 지남에 따라 미네랄화 및 혈관화되기 시작한 종판 내에 콜라겐을 증착시켰다.
랫트 꼬리에 대한 이러한 결과를 바탕으로, 이 기술은 인간의 경추에 직접 적용할 수 있는 더 큰 길이의 스케일로 번역되었고, 염소 경추에서 eDAPS로 성공적인 전체 디스크 교체를 보여주었다. eDAPS는 AF 및 NP 세포와 비교하여 디스크 조직 공학에 대해 임상적으로 더 관련된 세포 소스인 골수 유래 MSC로부터 성공적으로 제작될 수 있다. 염소 경추는 인간 경추와 유사한 반 직립 신장과 디스크 공간의 높이와 너비로 인해 특히 매력적인 사전-임상 모델이다. 염소 경추 디스크 크기의 eDAPS는 염소 모델에서 사용된 것과 동일한 외과적 접근방식 및 기기를 사용하여 인간의 전체 디스크 교체에 사용할 수 있다. 이 이식의 결과는 4주 후 기질 분포가 이러한 대규모-스케일 eDAPS 내에서 유지되거나 개선되었으며 eDAPS가 인접한 척추체와 통합되었다는 증거였음을 나타낸다. MRI 결과는 8주차의 조성물이 염소 경추의 생체 내 이식 전 값에서 유지되거나 개선되었으며 eDAPS 이식된 운동 분절의 압축 기계적 특성이 네이티브 염소 경추 디스크의 것과 일치하거나 초과함을 나타낸다. 제작의 차이에도 불구하고 (MSC 대 네이티브 디스크 세포 및 아가로스 대 히알루론산 하이드로겔), 염소 척추에서 생체 내 eDAPS의 성숙 궤적은 지금까지 기계적 특성의 점진적 성숙, PCL 종판, 초기 시점에서의 구성 유지를 포함하여 랫트 모델에서 본 발명자의 발견과 유사하다.
4. 재료 및 방법
i. 연구 설계.
이 연구의 목적은 소형 (랫트 꼬리뼈) 및 대형 (염소 경추) 동물 모델 모두에 이식 후 종판 (eDAPS)이 있는 조직 공학적 추간 디스크의 생체 내 성숙 및 기계적 특성을 설명하는 것이었다. eDAPS는 구성적으로 성숙하고, 시간이 지남에 따라 네이티브 조직과 기능적으로 통합되며, 이러한 모델에서 네이티브 디스크 기계적 기능을 재현할 수 있다. 소형 동물 연구의 경우, eDAPS를 10주 (n = 5) 또는 20 주 (n = 9) 동안 외부 고정으로 수컷의 무흉선 랫트의 꼬리 디스크 공간에 이식하였다. 운동 분절 채취 후, 모든 표본에 MRI T2 맵핑을 실시하였다. 그런 다음 샘플을 조직학 (10w: n = 2, 20w: n = 2), 거시적 기계적 시험 (10w: n = 4, 20w: n = 6), 미시적 기계적 시험 (20w: n = 4), 및 생화학 (10w: n = 3, 20w: n = 4)을 위해 무작위로 지정하였다. 대형 동물 연구의 경우, eDAPS를 4주 (n = 4) 또는 8주 (n = 3) 동안 내부 고정으로 수컷의 큰 체격 염소의 경추 디스크 공간에 이식하였다. 4주차에, 이식된 모든 운동 분절을 조직학을 위해 처리하였다. 8주차에, 모든 eDAPS 이식된 운동 분절에 정량적 MRI T2 맵핑, 및 압축 기계적 시험을 실시하였다. 소형 및 대형 동물 연구 모두에 대해, 인접한, 건강한 네이티브 추간 디스크를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 블라인드되지 않았으며, 이 연구에서 제외된 데이터는 없었다.
ii. 통계학적 분석
Prism (Graph Pad Software Inc.)에서 통계학적 분석을 수행했으며, 유의성은 P < 0.05로 정의되었다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 샘플 크기가 너무 작아 정규성 (Shapiro-Wilk 정규성 시험)을 시험할 수 없었기 때문에 데이터를 비정규 분포로 가정하였다. Dunn의 다중 비교 시험이 포함된 Kruskal-Wallis 시험은 네이티브 값과 이식 전 값과 비교하여 10주 및 20주 동안 랫트 꼬리 디스크 공간에 이식된 eDAPS에 대한 MRI T2 값, GAG 및 콜라겐 함량, 및 인장 및 압축의 기계적 특성의 차이를 평가하는 데 사용하였다. Dunn의 다중 비교가 포함된 Kruskal-Wallis 시험은 네이티브 염소 경추 디스크와 비교하여 이식 8주 전후 염소 eDAPS 임플란트 간의 압축 기계적 특성의 차이를 평가하는데 사용하였다. 양방향 Mann-Whitney 시험을 20주 eDAPS 이식된 운동 분절과 네이티브 디스크 사이의 μCT 압축 시험을 통해 측정된 변형률의 통계적 차이와 네이티브 염소 디스크와 비교한 8주 염소 eDAPS 임플란트의 NP T2 값의 차이를 평가하는 데 사용하였다.
iii. 세포 분리 및 확장.
소 AF 및 NP 세포를 이전에 기술한 바와 같이 꼬리 디스크(~3세 및 희생 후 ~2시간, JBS Souderton Inc,)에서 분리하였다. 동종 염소 MSC는 이전에 기술된 바와 같이 관련 없는 프로젝트를 위한 수술 중에 취한 대형 프레임 염소 (~3세)의 장골능 골수 흡인물에서 분리하였다. 소 디스크 세포 및 염소 MSC를 고 포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Invitrogen Life Sciences), 10% 소 태아 혈청 (FBS, Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/펀지존 (PSF, Gibco)으로 구성된 기저 배지에서 계대 2로 확장하였다.
iv. 랫트 꼬리뼈 이식을 위한 eDAPS 제작 및 시험관 내 배양.
랫트 꼬리뼈에 맞는 크기 (2 mm 높이, 4-5 mm 직경)의 eDAPS를 이전에 기술한 바와 같이 제작하였다. eDAPS의 AF 영역은 전기방사 폴리 (ε-카프로락톤) (PCL)의 동심층으로부터 제작되었으며, 여기서 각 층 내 나노섬유의 방향은 네이티브 AF의 구조와 일치하도록 eDAPS 장축에 대해 ±30°로 교대하였다. 폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO)의 중간 층이 PCL 층 사이에 포함되었고 이후에 스캐폴드 수화 및 멸균 시 용해되었다. AF 스캐폴드는 20 μg/mL의 피브로넥틴 (Sigma-Aldrich)으로 코팅되었고, 소 AF 세포는 AF 영역의 상부면 및 하부면 상에 시딩되어 (측면 당 1 x 106 세포), AF 층 사이에 침투하였다. DAPS의 NP 영역은 메틸아크릴레이트화 히알루론산 (MeHA) 하이드로겔로 제작하였다. 소 NP 세포 (2천만 세포/mL)를 0.05% 광개시제 (Irgacure 2959, Ciba-Geigy)에 용해된 1% w/v MeHA에 현탁시켰다. MeHA 하이드로겔을 2개의 유리판 사이에서 10분 동안 UV 경하시키고 펀칭하여 2 mm 직경 및 1.5 mm 높이의 겔을 수득하였다. PCL 폼 종판을 염 침출을 통해 제작하고 펀칭하여 기공 크기가 ~100 μm인 4 mm 직경 및 1.5 mm 높이의 무세포 작제물을 생성하였다. 20주 이식 그룹에 사용된 eDAPS의 하위집합에서, 지르코니아 나노입자가 PCL 폼 내에 통합되어 방사선 불투과성이 되었다.
세포 시딩 후, 1% PSF, 40 ng/mL 덱사메타손 (Sigma-Aldrich), 50 μg/mL 아스코르베이트 2-포스페이트 (Sigma-Aldrich), 40 μg/mL L-프롤린 (Sigma-Aldrich), 100 μg/mL 나트륨 피루베이트 (Corning Life Sciences), 0.1% 인슐린, 트랜스페린, 및 셀렌산 (ITS Premix Universal Culture Supplement; Corning), 1.25 mg/mL 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich), 5.35 μg/mL 리놀레산 (Sigma-Aldrich), 및 10 ng/mL TGF-β3 (R&D Systems)이 보충된 고 포도당 DMEM으로 구성된 화학적으로 정의된 배지 (CM+)에서 eDAPS의 AF 및 NP 영역을 2주 동안 별도로 배양하였다. 배지를 일주일에 3 번 변경하였다. 2주 후, eDAPS의 AF 및 NP 영역을 조합하고, 2개의 무세포 PCL 폼 종판을 작제물의 높이를 통해 2개의 30 G 바늘을 통과시켜 AF 영역의 양쪽에 배치하였다. eDAPS를 이식 전에 CM+에서 추가로 3주 (총 5주 사전-배양) 동안 배양하였다. 바늘을 이식 전에 제거하였다.
v. 염소 경추 이식을 위한 eDAPS 제작 및 시험관 내 배양
염소 경추 디스크 공간에 맞는 크기의 eDAPS를 제작하기 위해, 6 mm의 너비 및 150 mm의 높이로 정렬된 전기방사 스트립을 섬유 방향에 대해 30°의 각도에서 스트립으로 절단하고 이전에 기술한 바와 같이 측면 당 3백만 개의 세포의 밀도로 염소 MSC를 직접 시딩하였다. MSC 시딩된 스트립을 CM+에서 일주일 동안 배양한 후 반대 섬유 방향 (±30°)을 달성하기 위해 4개의 스트립을 적층하고 외경이 16 mm인 동심의 라멜라 작제물을 생성하기 위해 맞춤형 몰드를 사용하여 래핑함으로써 AF 영역을 조립하였다. AF 영역을 궤도 진탕기에서 CM+에서 추가로 일주일 동안 배양하였다. NP 영역을 이전에 기술한 바와 같이 2% 아가로스 하이드로겔에 염소 MSC를 시딩하여 생성하였다. 염소 eDAPS에 필요한 두께로 히알루론산 하이드로겔을 UV 경화하기 어렵기 때문에 염소 eDAPS에 아가로스를 사용하였다. NP 하이드로겔을 펀칭하여 8mm의 직경 및 6 mm의 높이의 작제물을 생성하고 이를 CM+에서 2주 동안 배양하였다. 무세포 다공성 PCL을 염 침출을 통해 제작하고 펀칭하여 1.5mm의 높이 및 16 mm 직경의 종판을 얻었다. 배양 2주 후, AF 및 NP 영역을 상기 기술한 바와 같이 PCL 종판과 조합하여 eDAPS를 형성하였다. eDAPS를 염소 경추에 이식하기 전에 13-15주 동안 궤도 진탕기에서 20 mL의 CM+ 배지에서 배양하였으며, 배지를 일주일에 3번 교체하였다. 도 6은 랫트 및 염소 모델에 대한 eDAPS 제작 및 세포 시딩의 개략도를 도시한다.
vi. eDAPS 생체 내 이식.
eDAPS를 이전에 기술한 바와 같이 5주의 사전배양 후 무흉선의 랫트 (Foxn1rnu retired breeders, Envigo)의 랫트 꼬리 디스크 공간에 이식하였다. 2개의 kirschner 와이어가 C8 및 C9 척추체를 통과하여 이식된 레벨을 고정하도록 설계된 강성 외부 고정 장치 (rigid external fixator)를 배치할 수 있다. 네이티브 디스크를 제거하고 고속 버 (burr)를 사용하여 디스크에 인접한 척추체의 부분 절제술 (종판 당 ~1-2 mm 뼈 제거)을 수행하였다. 그런 다음 eDAPS를 개구부 (opening)에 위치시키고, 피부를 봉합사로 봉합하였고, 랫트는 연구의 남은 기간 동안 정상적인 케이지 활동으로 돌아갔다. 동물은 분석을 위해 이식 후 10주 (n = 5) 또는 20 주 (n = 9)차에 안락사되었다. 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절 (C6-C7 레벨)은 eDAPS 임플란트 위의 수준으로부터 얻어지고 대조군 (n = 10)으로 활용되었다.
염소 경추 디스크 공간에 eDAPS를 이식하기 위해, 수컷 대형 프레임 염소 (~3 세, Thomas D. Morris, Inc.)를 전신 마취 하에 등쪽으로 누운 자세로 배치하였다. C2-C3 디스크 공간을 절개하기 전에 이미지화로 국소화하였다. C2-C3인터스페이스 위 경추의 왼쪽에 가로 절개가 이루어졌으며, 척추가 촉지된 후인두 공간을 통해 경동맥초의 내측으로 절개가 이루어졌다. 척추 전방의 연조직과 근육을 골막하 방식으로 절개하여 추간 공간의 측면 범위와 두개골 및 꼬리 척추체의 인접한 1/3을 노출시켰다. 외과적 노출이 완료된 후, 네이티브 디스크와 인접한 척추 연골 종판의 일부를 제거하였고; Caspar 경추 견인기 시스템을 사용하여 추간 공간에 견인을 적용하여 인터스페이스의 등쪽 (후방) 1/3에 접근할 수 있도록 하였다. 추간 디스크 절제술 및 종판 절제술 (종판 당 ~1-2 mm 뼈 제거)을 직선 및 각진 큐렛, 롱저, 고속 버의 조합을 사용하여 수행하였다. 흡입 및 멸균 식염수 세척을 사용하여 종판 절개술로부터 생성된 골 분획과 혈액 사이의 인터스페이스를 청소하였다. 준비되고 당겨진 인터스페이스에 eDAPS를 배치하였다. eDAPS를 배치한 후, 견인이 해제되었고 이식된 운동 분절은 복부 CSLP 잠금 판 (DePuy Synthes)의 배치를 통해 고정되었다. 임플란트 위치는 직교 형광투시로 확인한 후 절개 부위를 층으로 봉합하여 확인하였다. 마취에서 회복된 후, 동물은 자유 운동이 가능한 12 x 12 ft 외양간으로 구성된 표준 하우징으로 돌아갔다. 동물의 수술 후 회복은 디지털 방사선 촬영과 컴퓨터 단층 촬영으로 모니터링하였다. 임플란트 상태를 모니터링하기 위해 서 있고 깨어있는 동물의 배-복부 및 측면도를 격주로 얻었다. 동물은 분석을 위해 이식 후 4주 (n = 4) 또는 8주 (n = 3)차에 안락사되었다.
MRI 스캔 및 분석.
4.7T 스캐너 (Magnex Scientific Limited) 및 맞춤형 17mm 직경 솔레노이드 코일을 사용하여 eDAPS-이식 및 대조군 랫트 꼬리 운동 분절의 MRI 스캔을 수행하였다. 다중-에코-다중-스핀 시퀀스를 사용하여 정량적 T2 맵핑 (0.5 mm 슬라이스 두께, 평면 해상도에서 117 μm, 16개 에코, TR/TE = 2,000/11.13 ms)을 위한 일련의 이미지를 획득하였다. 각 실험군에 대한 평균 T2 맵은 이전에 기술한 바와 같이 맞춤형 MATLAB 코드를 사용하여 생성되었다. eDAPS 이식된 염소 경추의 경우, 3T 스캐너 (Siemens Magnetom TrioTim)를 사용하여 T2-강조 (5 mm 슬라이스 두께, 평면 해상도에서 0.5 mm, TR/TE = 4,540/123 ms) 중간 시상 이미지를 얻었다. T2 맵핑을 위한 일련의 경추 이미지도 얻었다 (6개의 에코, TE=13 ms, 5 mm 슬라이스 두께, 평면 해상도에서0.5 mm).
viii. 기계적 시험 및 분석.
척추-eDAPS-척추 운동 분절 및 네이티브 운동 분절은 꼬리의 피부를 조심스럽게 제거하고 eDAPS에 인접한 척추체의 연조직 (인접한 근육 및 힘줄은 온전한 상태로 남아있음)을 제거함으로써 압축 시험을 위해 준비되었다. 잉크 반점은 시험 동안 광학 변위 추적을 위한 기준 마커 역할을 하기 위해 eDAPS의 바로 원위 및 근위 척추 뼈에 배치되었다. 압축 기계적 특성을 결정하기 위해, 운동 분절을 맞춤형 고정 장치의 낮은 용융 온도 인듐 주조 합금 (McMaster-Carr)에 담그고 실온에서 포스페이트 완충 식염수 (PBS)의 욕조에서 0 내지 -3N (0 내지 -0.25 MPa)의 20주기 압축으로 구성된 시험 프로토콜을 실시하였다. 기계적 특성 (토 및 선형 영역 모듈러스, 전이 및 최대 변형률)은 이전에 기술한 바와 같이 MATLAB의 20번째 압축 주기에서 계산되었고 압축 MR 이미지로부터 측정된 디스크 면적 및 높이로 정규화되었다. 5주 동안 시험관 내에서 배양된 eDAPS의 압축 기계적 특성 (이식 전) 또한 유사한 방식으로 정량화되었다. 거시적 압축 시험 후, 20주 이식 그룹의 운동 분절은 이하에 기술되는 바와 같이 μCT 스캐닝 및 압축 시험이 실시되었다.
압축 시험 후, eDAPS를 둘러싼 근육과 힘줄의 완전한 원주 방향 박리를 수행하였다. 그런 다음 이식된 eDAPS 및 네이티브 운동 분절은 0.025 mm/초에서 파괴에 대한 인장 시험을 거쳤다. MATLAB에서 인장 곡선의 쌍선형 맞춤을 사용하여 토 및 선형 인장 모듈러스 및 파괴 응력 및 변형률을 정량화하였다.
8주 동안 염소 경추 디스크 공간에 이식된 eDAPS의 경우, 척추체-eDAPS-척추체, 또는 네이티브 경추 디스크 운동 분절을 분리하고, 손톱(handsaw)으로 후방 및 측방 뼈 요소를 제거하였다. 두개골 및 꼬리 척추체를 낮은 용융 온도 합금에 담그고 표본을 0 내지 -25 N (0 내지 0.084 MPa)의 20주기 압축으로 구성된 PBS의 욕조에서 압축 시험 프로토콜 (Instron 5948)에 적용하였다. MATLAB에서 압축 곡선의 이중 선형 맞춤을 수행하여 eDAPS 및 네이티브 염소 경추 디스크에 대한 토 및 선형 영역 모듈러스, 및 전이 및 최대 변형률을 정량화하였다. 염소 경추에 맞는 크기이며 15주 동안 배양된 eDAPS는 이식 전에 eDAPS의 기계적 특성을 결정하기 위해 유사한 방식으로 압축 기계적 시험을 거쳤다.
ix. μCT 시험 및 분석.
20주차에 네이티브 랫트 꼬리 운동 분절 및 eDAPS 이식된 운동 분절에 μCT 압축 시험을 실시하였다. 운동 분절을 PBS에 적신 거즈로 감싸고 척추체의 근위 및 원위 부분을 파라핀 왁스에 담근 후 Scanco Medical 압축/인장 장치 내에 배치하여 장치 내에서 운동 분절을 안정화하였다. 3N 압축 하중을 인가하기 전후에 운동 분절을 Scanco Medical μCT50을 사용하여 10 μm 해상도로 스캔하였다. 네이티브 디스크의 높이, 또는 eDAPS의 디스크 부분 (방사선 불투과성 PCL 폼 종판을 제외한)을 이전에 기술한 바와 같이 맞춤형 MATLAB 코드를 사용하여 압축 전후에 정량화하였다. 변형률은 압축에 따른 디스크 높이의 변화를 원래의 디스크 높이로 나눈 값으로 계산하였다.
x. eDAPS 조성물 및 구조물의 평가.
기계적 시험 후, eDAPS를 운동 분절로부터 절개하고 수동으로 AF, NP 및 EP 부분으로 분리하고 60℃에서 프로테이나제 K에서 밤새 개별적으로 소화시켰다. 각 영역의 GAG 함량은 디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료 결합 검정을 사용하여 결정하였고 콜라겐 함량은 오르토-하이드록시프롤린 (OHP)에 대한 p-디아미노벤즈알데히드/클로라민-T 검정을 통해 정량화하였다. GAG 및 콜라겐 함량은 샘플 습윤 중량으로 정규화하였고, 5주 동안 시험관 내에서 배양된 (이식 전) eDAPS의 생화학적 함량과 비교하였다.
eDAPS 이식된 랫트 꼬리 운동 분절 (시점 당 n = 2-3), eDAPS 이식된 염소 경추 운동 분절 (n = 4), 네이티브 랫트 꼬리 및 염소 경추 운동 분절을 고정하고, 탈석회화 (Formical-2000, Decal Chemical Corporation, Tallman, NY)하고 파라핀을 통해 처리하였다. 10 μm 섹션을 알시안 블루 (글리코스아미노글리칸) 및 피크로시리우스 레드 (콜라겐)으로 염색하였다. 랫트 eDAPS의 경우, 콜라겐 II (DSHB, II-II6B3) 및 콘드로이틴 설페이트 (DSHB, 9BA12) 및 콜라겐 I (Millipore, AB749P)에 대해 면역조직화학을 수행하였다. 염소 eDAPS의 경우, 콜라겐 II (DSHB, II-II6B3), 아그레칸 (Millipore, ABT1373), 및 콜라겐 I (Millipore, AB749P)에 대해 면역조직화학을 수행하였다. 각 항체에 대해 각 실험군의 섹션을 동시에 염색하였다. 재수화된 섹션을 5분 동안 프로테이나제 K (Dako), 10분 동안 3% 과산화수소, 30분 동안 말 혈청 (Vectastain ABC Universal Kit, Vector Laboratories) 및 4℃에서 밤새 1차 항체에서 실온에서 연속적으로 배양하였다. 2차 시각화는 Vectastain ABC Universal HRP Kit (PK-6200, Vector Laboratories) 및 3,3'-디아미노벤지딘 (Millipore)을 사용하여 달성하였다.
xi. 2차 고조파 생성 이미지화.
파라핀 포매된 eDAPS 및 네이티브 디스크 둘 모두의 10 μm 섹션을 유리 슬라이드에 장착하고 시트리솔브(citrisolv)로 청소하고, 퍼마운트 및 커버슬립에 장착하기 전에 재수화하였다. 섹션은 콜라겐 2차 고조파 생성을 위해 880 nm로 설정된 Specta Physics Deep See Insight 조정 가능 레이저가 장착된 Nikon A1R 공초점 현미경으로 관찰하였다. 0.4 μm 두께의 Z 스택이 단면 깊이에 걸쳐 캡처되어 평균 강도 투사로 표시되었다.
C. 실시예 3 조직-공학적 전체 디스크 교체의 통합을 증진시키기 위한 다공성 폴리카프로락톤의 하이드록시아파타이트 코팅
척추의 추간 디스크 및 인접한 척추체 사이의 경계를 형성하는 것은 얇은 유리질 연골 층 및 인접한 피질골 층으로 구성된 종판이다. 노화 또는 그로 인한 부상에 따라, 추간 디스크 및 인접한 종판의 퇴행히 흔히 발생하고 종종 요통과 관련이 있다. 디스크와 척추 종판 모두를 다루는 새로운 치료 전략을 개발할 필요가 있다. 이를 위해, 조직 공학적 전체 디스크 교체품은 중증 진행성 디스크 및 종판 퇴행의 치료를 위해 종판 (종판 변형된 디스크 유사 앵글-플라이 구조, eDAPS)로 개발되었다. 조직 공학적 전체 디스크를 위한 다른 설계와 달리, eDAPS의 다공성 폴리머 종판 유사체는 공학적 디스크와 네이티브 척추체의 통합이 발생할 수 있는 경계를 제공한다. 그러나, 대형 동물 모델에 이식한 지 30주 후에도 이 경계의 강력한 미네랄화가 여전히 관찰되지 않는다. 이 연구의 목적은 생체 내 이식 후 eDAPS의 통합을 개선하기 위해 하이드록시아파타이트 (HA) 코팅을 포함하는 것을 통해 종판 영역의 설계를 최적화하는 것이다.
스캐폴드 제작 및 HA 코팅: 다공성 폴리(ε-카프로락톤) (PCL) 폼을 염 침출법을 통해 제작하여 4 mm의 직경 및 1.5 mm의 두께의 작제물을 생성하였다. HA에서 PCL 폼을 코팅하기 위해, 폼을 에탄올 구배를 통해 수화시킨 다음 2M NaOH 및 모의 체액 (SBF)에 밤새 연속적으로 담궜다.
시험관 내 연구: 세포 시딩 전에 PCL 단독 폼 및 HA 코팅된 PCL 폼을 에탄올 구배를 통해 수화 및 멸균하고 피브로넥틴에서 밤새 코팅하였다. P2 소 골수 유래된 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 각 폼의 최상부면 및 최하부면에 3,333 세포/mm2의 밀도로 시딩하였다. MSC-시딩된 폼을 기저 또는 골형성 배지 (n = 그룹당 4)에서 5주동안 배양하였다. 배양 기간이 끝나면, 작제물 생존력 (MTT 검정) 및 알칼리성 포스파타제 활성 (ALP, Sigma Aldrich kit)을 정량화하였다. 추가 샘플 (n = 그룹당 3)을 시상면에서 동결절단 (cryosectioned)하고 Von Kossa 염색 키트 (Abcam)를 사용하여 칼슘 증착물에 대해 염색하였다.
생체 내 연구: HA 코팅의 생체 내 평가를 위해, eDAPS 작제물의 크기를 모방하기 위해 4 mm의 직경 및 5 mm의 두께로 PCL 폼을 제작하였다. 5마리의 흉선이 없는 랫트의 꼬리 디스크 공간에 수술 절차와 외부 고정장치를 사용하여 무세포 PCL 폼 (n=2) 또는 HA-코팅된 PCL 폼 (n=3)을 이식하였다. 요약하면, 네이티브 C8-C9 꼬리 디스크 공간을 제거하고, 작제물이 척추체의 골수와 인접하게 배치될 수 있도록 고속 버를 사용하여 인접한 척추체의 부분 척추체 제거술을 수행하였다. 10주 후, 동물을 안락사시키고 척추체-PCL 폼-척추체 운동 분절을 분석을 위해 채취하였다. 운동 분절을 포르말린에 고정하고 10μm 해상도에서 μCT 스캐닝을 실시하여 생체 내 이식 후 PCL 폼 내의 3차원 조직 분포를 시각화하였다. 그런 다음 샘플을 탈석회화하고 파라핀 조직학을 위해 처리하였다. 조직학적 절편을 말로리-하이덴하인 트리크롬 염색으로 염색하여 미네랄화된 콜라겐 (짙은 회색)으로부터 미네랄화되지 않은 콜라겐 (밝은 회색)을 구별하고 오스테오칼신에 대해 면역조직화학 (IHC)를 수행하였다. 그룹 간의 유의차 (p<0.05)는 Tukey의 사후 시험을 사용한 ANOVA를 통해 평가하였다.
골수 유래 MSC가 접종된 HA-코팅 및 PCL 단독 작제물의 시험관 내 연구는 골형성 배지에서 배양된 HA-코팅된 그룹에서 작제물의 ALP 활성의 상당한 증가를 입증하였다 (도 22a). 그룹 간 MTT 흡광도에서는 통계적으로 상당한 차이가 없었다. 작제물을 염색하는 Von Kossa는 기저 및 골형성 배지 배양 조건 모두에서 PCL 단독 그룹과 비교하여 HA 코팅된 그룹에서 증가된 칼슘 증착을 나타내었다 (도 22b). 생체 내에서, 콜라겐 기질 증착은 이식 10주 후에 PCL 단독 및 HA 코팅된 그룹 모두에서 초기 무세포 작제물 내에서 발생하였다. PCL 단독 대조군과 비교하여 HA 코팅된 그룹에 존재하는 오스테오칼신에 대한 면역조직화학 염색이 증가하였다 (도 23, 왼쪽 패널). 추가로, 말로리-하이덴하인 트리크롬 염색은 PCL 단독 대조군에서는 존재하지 않는 HA 코팅된 그룹에 존재하는 미네랄화된 콜라겐 (분홍색 염색)을 입증하였다 (도 23, 중간 패널). 이식 10주 후 작제물의 3D μCT 재구성은 PCL 단독 대조군과 비교하여 HA 코팅된 그룹에서 증가된 조직 증착을 추가로 입증하였다 (도 23, 오른쪽 패널).
시험관 내 및 생체 내 실험의 결과는 다공성 PCL 폼을 HA로 코팅하면 그들의 골형성 가능성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. PCL 단독 종판이 있는 eDAPS가 랫트 꼬리 디스크 공간에 이식된 이전의 작업에서, 미네랄화된 콜라겐은 이식 후 20주차까지 종판 영역 내에서 관찰되지 않았다. 여기에서, HA 코팅된 그룹에 이식 후 10주차에 작제물 내에서 미네랄화된 콜라겐에 대한 염색이 관찰되었으며, 이는 통합이 HA 코팅에 의해 가속화될 수 있음을 나타낸다. 이러한 발견은 다른 방법에 의한 하이드록시아파타이트 코팅이 시험관 내 및 생체 내 골형성을 개선한 골절 치유 분야의 이전 연구와 일치한다.
이러한 결과는 조직 공학적 종판 및 추간 디스크 교체에 대한 설계 변형이 임상 번역에 중요할 수 있는 네이티브 골과 작제물의 통합을 개선하고 가속화할 수 있음을 보여준다.
당업자는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 일상적인 실험에 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 청구범위에 포함되도록 의도된다.
Claims (52)
- 공학적 척추 디스크 임플란트로서,
수핵 영역 및 섬유륜 영역을 포함하는 공학적 척추 디스크; 및
다공성 폴리머 폼을 포함하고, 그리고 채널을 포함하는, 2개의 종판;을 포함하는,
공학적 척추 디스크 임플란트. - 제1항에 있어서, 상기 종판은 하이드록시아파타이트를 추가로 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제2항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 상기 종판의 표면 상에 코팅되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 상기 종판 전체에 걸쳐 존재하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종판은 골 경계 측면 및 척추 디스크 경계 측면을 갖는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제5항에 있어서, 상기 2개의 종판 중 적어도 하나는
본체; 및
상기 본체로부터 바깥쪽으로 연장되는 상기 골 경계 측면 상의 돌출부;
를 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개의 종판 중 적어도 하나는 하나 이상의 혈관-촉진제를 추가로 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 혈관-촉진제는 혈관 내피 성장 인자, 데페록사민, 니모디핀 또는 프탈이미드 신생혈관형성 인자 (PNF-1)인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수핵 영역은 최상부면, 최하부면, 및 상기 최상부면과 상기 최하부면 사이에서 연장되고 상기 수핵 영역의 주연부를 한정하는 측면 엣지를 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제9항에 있어서, 상기 수핵 영역의 주연부는 상기 섬유륜 영역에 의해 원주방향으로 둘러싸인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유륜 영역은 최상부면, 최하부면, 내부면 엣지, 및 상기 섬유륜 영역의 주연부를 한정하는 외부면 엣지를 포함하고, 상기 내부면 엣지 및 상기 외부면 엣지는 상기 최상부면과 상기 최하부면 사이에서 연장되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제11항에 있어서, 제1 종판의 상기 척추 디스크 경계 측면은 상기 수핵 영역 및 상기 섬유륜 영역의 최상부면에 부착되고, 제2 종판의 상기 척추 디스크 경계 측면은 상기 수핵 영역 및 상기 섬유륜 영역의 최하부면에 부착되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수핵 영역은 하이드로겔을 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제13항에 있어서, 상기 하이드로겔은 생존 세포를 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제14항에 있어서, 상기 생존 세포는 중간엽 줄기 세포 또는 네이티브 디스크 세포, 또는 이들의 조합인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 히알루론산 또는 아가로스 하이드로겔인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수핵 영역은 나노 섬유 PCL의 하나 이상의 시트를 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제17항에 있어서, 상기 나노 섬유 PCL의 시트는 라멜라 구조를 형성하도록 정렬되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유륜 영역은 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO)를 추가로 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유륜 영역은 생존 세포를 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제20항에 있어서, 상기 생존 세포는 중간엽 줄기 세포 또는 네이티브 디스크 세포인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수핵 영역의 세포와 상기 섬유륜 영역의 세포는 동일한 기원에서 유래하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수핵 영역 또는 상기 섬유륜 영역의 세포는 이전에 배양된 것인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트는 배양된 것인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트는 프로테오글리칸 및 콜라겐을 추가로 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각 종판의 채널은 횡축에 대해 이격된 복수의 채널을 포함하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제26항에 있어서, 각 종판의 상기 복수의 채널은 서로 평행하거나 실질적으로 평행하고, 상기 각각의 종판의 복수의 채널은 횡축에 수직이거나 실질적으로 수직인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각 종판은 두께를 가지며, 상기 종판의 각 채널은 상기 종판의 두께보다 작은 깊이를 갖는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제28항에 있어서, 각각의 채널의 깊이는 상기 종판의 골 경계 측면으로부터 상기 종판의 척추 디스크 경계 측면을 향해 측정되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각 종판의 채널은 상기 횡축에 대해 균일하게 이격되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제30항에 있어서, 각 종판의 순차적 채널은 0.5 내지 5 nm 범위의 거리만큼 이격되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제5항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 각 종판은 상기 종판의 골 경계 측면과 상기 척추 디스크 경계 측면 사이에서 연장되는 주변 측면 엣지를 가지며, 상기 종판의 각 채널은 상기 종판의 주변 측면 엣지로부터 이격된 대향 단부를 갖는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제6항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌출부는 상기 본체와 협력하여 상기 종판의 적어도 하나의 채널을 한정하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제33항에 있어서, 상기 본체는 상기 종판의 복수의 채널만을 한정하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 돌출부는 상기 횡축에 대해 상기 종판의 중앙에 위치하는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 돌출부와 상기 본체에 의해 한정된 상기 적어도 하나의 채널은 상기 본체에 의해서만 한정된 상기 채널의 깊이보다 더 큰 깊이를 갖는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제36항에 있어서, 상기 돌출부와 상기 본체에 의해 한정된 각 채널의 깊이는 0.5 내지 3.5 mm 범위의 깊이를 가지며, 상기 본체에 의해서만 한정된 각 채널의 깊이는 0.5 내지 1.5 mm 범위의 깊이를 갖는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 종판의 각 채널의 최대 깊이에서, 각 채널은 상기 종판의 척추 디스크 경계 측면으로부터 동일하거나 실질적으로 동일하게 이격되는, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 폴리머 폼은 폴리 (ε-카프로락톤) (PCL), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리락트산, 폴리-DL-락타이드, 또는 폴리디악사논인, 공학적 척추 디스크 임플란트.
- 제1항 내지 제39항의 공학적 척추 디스크 임플란트 중 하나 이상을 임플란트를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 디스크 퇴행을 치료하는 방법으로서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트의 종판은 상기 대상체의 척추에 부착되는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트는 환자에게 이식되기 전에 배양되는, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트는 환자에게 이식되기 전에 TGF-β3의 존재 하에 배양되는, 방법.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 배양은 상기 공학적 척추 디스크 임플란트에서 세포의 분화를 일으키는, 방법.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트를 이식하기 전에 퇴행성 디스크를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트를 이식하기 전에 척추의 일부를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 척추의 일부를 제거하는 단계는 상기 척추를 긁거나 드릴링하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공학적 척추 디스크 임플란트의 세포는 상기 대상체로부터 얻은 세포인, 방법.
- 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종판은 상기 경계 측면을 통해 상기 척추에 부착되는, 방법.
- 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종판은 상기 척추와 통합되는, 방법.
- 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 세포는 상기 공학적 척추 디스크 임플란트 내로 침투하는, 방법.
- 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종판은 콜라겐을 포함하는, 방법.
- 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종판은 혈관을 형성하는, 방법.
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