WO2022163872A1

WO2022163872A1 - 椎間板再生用組成物

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Publication number: WO2022163872A1
Application number: PCT/JP2022/004342
Authority: WO
Inventors: 英毅須藤; 大介筌場; 勝久山田; 勝郎浦; 久崇鈴木; 有未伊谷; 隆史陶山
Original assignee: 国立大学法人北海道大学; ＰｕＲＥＣ株式会社; 持田製薬株式会社
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-08-04
Also published as: KR20230136606A; TW202246491A; AU2022214480A1; US20240100099A1; JPWO2022163872A1; CA3209669A1; BR112023014896A2

Abstract

低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板の髄核再生促進用組成物を提供する。特に、本発明の組成物は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又はヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する。

Description

椎間板再生用組成物

　本発明は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物に関する。本発明は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含有する椎間板再生用組成物に関する。

　人間の背骨（脊椎）は２４個の骨（椎骨）で構成されており、その椎骨と椎骨との間のクッションの役割を果たす組織を椎間板という。椎間板は、加齢、外傷、疾病などにより変性、損傷が生じる。椎間板の変性は、椎間板の細胞数、水分含有量、細胞外マトリックス（タイプＩＩコラーゲン、アグリカンなど）等が低下している状態であり、進行すると椎間板のショック吸収体としての機能が果たせなくなる。椎間板変性および椎間板損傷は、具体的には、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、外傷などによる椎間板損傷などである。例えば、椎間板ヘルニアでは、髄核を覆う線維輪が変形または亀裂を生じることによってヘルニアを形成して椎間板外へ突出し、変形また生じた亀裂から逸脱した髄核が、脊髄神経を圧迫し、痛み、麻痺などを引き起こす。

　椎間板ヘルニアに対する治療の一つに椎間板髄核摘出（切除）術があり、一定の効果が確認されている。しかしながら、椎間板髄核摘出（切除）術では、椎間板髄核摘出術後の手術部位に処置を施さないため、椎間板の変性変化が進行することがあることが知られている。椎間板髄核摘出術で髄核の一部を取り除くと、髄核部位に空洞（本明細書において「欠損部」ともいう）ができる。髄核には自己修復能及び再生能が著しく低いため、髄核の空洞は物理的にも弱くなりやすい。また、空洞部分には、線維芽様細胞が集積して本来の髄核とは力学的特性の異なる組織が形成されることがある。このため、椎間板髄核摘出術後は、ヘルニアの再発率が高い。椎間板髄核摘出後の５年以内の再発率は４~１５％程度といわれているが、最近の長期データでは１０年後には過半数に再発することが分かってきた。ヘルニアが再発すると再手術が必要になるが、脊髄神経は、１回目の手術後に形成された瘢痕組織の中に埋没しており、脊髄神経の位置を確認することが困難となる。

　これまで、アルギン酸を基盤とした高純度硬化性ゲルを開発し、ゲル単独投与（無細胞）でも椎間板組織が自然修復することを実証し（特許６４８７１１０号、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ　３７（２０１８）５２１−５３４）、２０~４９歳の腰椎椎間板ヘルニア患者に対してヘルニア摘出術後にゲルを埋植する臨床試験が実施されている。

　ところで、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）は、細胞採取に伴う倫理的問題が少なく、骨・軟骨・脂肪などへの多様な分化能を持つことから、造血幹細胞に次いで臨床応用が盛んに行われている体性幹細胞の一つである。ＭＳＣは、比較的簡単な手技により分離できることから、主に試験管内で軟骨や骨などへ分化誘導後に局所へ移植するなど、再生医療へ向けた材料として広く用いられている。そして、臨床応用を進める際には、一定の機能を維持する細胞を必要量製造できることが、製品化の必須条件となる。

　そして、本発明者らは、骨髄液からＬＮＧＦＲ、Ｔｈｙ−１共陽性細胞をフローサイトメトリーにより分離し、増殖の早いクローン（Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｌｏｎｅ：ＲＥＣ）を得ており、ドナーに由来するＭＳＣの増殖性の差を排除できる精製分離方法を確立した（特許第６４６３０２９号、ＷＯ２０１６／０１７７９５、Ｍａｂｕｃｈｉ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１（２）：１５２−１６５，２０１３）

特許第６４８７１１０号特許第６４６３０２９号国際公開２０１６／０１７７９５号パンフレット

Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎ　ａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ　ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｇｅｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｒｅｐａｉｒ：Ａ　ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ　ｓｔｕｄｙ，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ　３７（２０１８）５２１−５３４Ｍａｂｕｃｈｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，ＬＮＧＦＲ＋　Ｔｈｙ−１＋　Ｖｃａｍ−１ｈｉ＋　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｖｅａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１（２）：１５２−１６５，２０１３

　前記の通り、これまで、アルギン酸を基盤とした高純度硬化性ゲルを開発し、腰椎椎間板ヘルニア患者に対してヘルニア摘出術後にゲルを埋植する探索的医師主導治験が実施されている。しかしながら、自己修復能及び再生能がほとんどないと言われている髄核は、中高年期ではさらに自己修復能が乏しく、そのような患者にはゲル単独治療では明らかな限界がある。
　このため、椎間板組織が修復・再生できるさらなる組成物の開発が必要とされている。

　本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含む組成物が、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明の別の態様では、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含む組成物が、上記課題を解決し得ることを見出した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　［１］　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物。
　［１−１］　アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物。
　［２］　間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、［１］又は［１−１］に記載の組成物。
　［３］　前記間葉系幹細胞が、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞である［１］~［２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３］に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４−１］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３］に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４−２］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３］に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４−３］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３］に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４−４］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３］に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４−５］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３］に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［５］　対象の椎間板に適用し、当該適用時には流動性を有する、［１］~［４−５］のいずれか１項に記載の組成物。
　［５−１］　対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、［１］~［４］のいずれか１項に記載の組成物。
　［５−２］　対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、［１］~［４］のいずれか１項に記載の組成物。
　［６］　前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、［５］~［５−２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［７］　前記一部分の硬化は、組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させることにより行われる、［５−２］又は［６］に記載の組成物。
　［８］　前記架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、［５−１］又は［７］に記載の組成物。
　［８−１］　前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、［１］~［８］のいずれか１項に記載の組成物。
　［９］　前記低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、［１］~［８−１］のいずれか１項に記載の組成物。
　［１０］　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％~５．０ｗ／ｗ％である、［１］~［９］のいずれか１項に記載の組成物。
　［１１］　椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、［１］~［１０］のいずれか１項に記載の組成物。
　［１２］　前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症を伴う椎間板ヘルニア及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、［１１］に記載の組成物。
　［１２−１］　前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、［１１］又は［１２］に記載の組成物。

　［１３］　ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含有する、対象の椎間板髄核部位に適用される、椎間板再生用組成物。
　［１４］　ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又はヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、［１３］に記載の組成物。
　［１５］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される［１３］又は［１４］に記載の組成物。
　［１６］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［１３］~［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［１６−１］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［１３］~［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［１６−２］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［１３］~［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［１６−３］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［１３］~［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［１６−４］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［１３］~［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［１６−５］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［１３］~［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［１７］　前記組成物が、細胞を包埋するための担体をさらに含む、［１３］~［１６−５］のいずれか１項に記載の組成物。
　［１８］　前記担体が、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびガラクトサミノグリクロングリカン硫酸、並びにこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、［１７］に記載の組成物。
　［１９］　前記担体が、アルギン酸の１価金属塩である［１７］に記載の組成物。
　［２０］　対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、［１３］~［１９］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２１］　対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、［１３］~［１９］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２２］　前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、［２０］又は［２１］に記載の組成物。
　［２３］　前記架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、［２０］~［２２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２４］　前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、［１９］~［２３］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２５］　前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％~５．０ｗ／ｗ％である、［１９］~［２４］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２６］　前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、［１９］~［２５］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２７］　椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、［１３］~［２６］のいずれか１項に記載の組成物。
　［２８］　前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、［２７］に記載の組成物。
　［２８−１］　前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、［２７］又は［２８］に記載の組成物。
　［２９］　椎間板性疼痛を抑制するために用いられる、［１］~［２８−１］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３０］　前記椎間板性疼痛が、慢性腰痛である［２９］に記載の組成物。

　［３１］　アルギン酸の１価金属塩とヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞とを含む椎間板再生用組成物であって、対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用されるための椎間板再生用組成物。
　［３１−１］　対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、組成物を硬化させる処置を要しない使用のための、上記［３１］に記載の椎間板再生用組成物。
　［３１−２］　対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる上記［３１］又は［３１−１］に記載の椎間板再生用組成物。
　［３２］　ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又はヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、［３１］~［３１−２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３３］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される［３１］~［３２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３４］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３１］~［３３］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［３４−１］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３１］~［３３］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［３４−２］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［３１］~［３３］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［３４−３］　前記変動係数が３５％以下である、［３４］~［３４−２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３５］　前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、［３１］~［３４］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３６］　前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、［３１］~［３５］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３７］　前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％~５．０ｗ／ｗ％である、［３１］~［３６］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３８］　前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、［３１］~［３７］のいずれか１項に記載の組成物。
　［３９］　椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、［３１］~［３８］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４０］　前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、慢性腰痛、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、［３９］に記載の組成物。
　［４１］　前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、［３９］又は［４０］に記載の組成物。
　［４２］　椎間板性疼痛を抑制するために用いられる、［３１］~［４１］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４３］　前記椎間板性疼痛が、慢性腰痛である［４２］に記載の組成物。

　［４４］　アルギン酸の１価金属塩とヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞とを含む、椎間板性疼痛抑制用組成物であって、対象の髄核部位に流動性を有する状態で適用されるための組成物。
　［４４−１］　対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、組成物を硬化させる処置を要しない使用のための、上記［４４］に記載の椎間板性疼痛抑制用組成物。
　［４４−２］　対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる上記［４４］又は［４４−１］に記載の椎間板性疼痛抑制用組成物。
　［４５］　前記疼痛が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種を伴う疼痛である、［４４］~［４４−２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４６］　前記疼痛が、慢性腰痛である、［４４］~［４５］に記載の組成物。
　［４７］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される［４４］~［４６］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４８］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［４４］~［４７］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４８−１］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［４４］~［４７］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４８−２］　前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、［４４］~［４７］のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
　［４８−３］　前記変動係数が３５％以下である、［４８］~［４８−２］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４８−４］　前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、［４４］~［４８−３］のいずれか１項に記載の組成物。
　［４９］　前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、［４４］~［４８−４］のいずれか１項に記載の組成物。
　［５０］　前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％~５．０ｗ／ｗ％である、［４４］~［４９］のいずれか１項に記載の組成物。
　［５１］　前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、［４４］~［５０］のいずれか１項に記載の組成物。
　［５２］　対象の椎間板髄核部位に、Ｘ線透視下で適用し、髄核部位への適用時に流動性を有し、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる［３１］~［５１］のいずれか１項に記載の組成物。
　［５３］　対象の椎間板髄核部位に、Ｘ線透視下で圧力計シリンジを用いて適用し、髄核部位への適用時に流動性を有し、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる［５２］に記載の組成物。

　［５４］　ヒツジ重度椎間板変性モデルを用いて、当該モデルの椎間板に適用した組成物における椎間板の再生能を評価する方法であって、以下の（ａ１）又は（ａ２）の工程、及び（ｂ１）又は（ｂ２）の工程を含む方法により作製された重度椎間板変性モデルの椎間板に、細胞含有組成物を投与する工程を含む、前記評価方法。
（ａ１）ヒツジ椎間板からヒツジ体重の０．００００４％~０．００００５％に相当する量の髄核組織を除去し、変性椎間板を作製する工程
（ａ２）ヒツジ椎間板から２０ｍｇの髄核組織を除去し、変性椎間板を作製する工程
（ｂ１）前記工程（ａ１）又は（ａ２）の４週後に、さらにヒツジ体重の０．０００１４％~０．０００１７５％に相当する量の髄核組織を除去する工程
（ｂ２）前記工程（ａ１）又は（ａ２）の４週後に、さらに７０ｍｇの髄核組織を除去する工程
　［５５］　組成物を投与する工程が、工程（ｂ１）又は（ｂ２）の後に行われる、［５４］に記載の方法。
　［５６］　評価は、組成物投与後に、変性モデルから採取した椎体及び椎間板に対して、ＭＲＩ、組織染色、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの評価方法により行う、［５４］又は［５５］に記載の方法。

また本発明は、以下の態様を含む。
　［５７］　椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
　アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含む、前記方法。
　［５８］　椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
　ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含む、前記方法。
　［５９］　椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
　ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記方法。
　［６０］　椎間板性疼痛の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
　ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記方法。
　［６１］　アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞を含有する組成物を、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制において使用されるためのアルギン酸の１価金属塩および間葉系幹細胞。
　［６２］　椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制に使用するための、アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する組成物。
　［６３］　椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制に使用するための、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞。
　［６４］　椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制に使用するための、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物であって、当該組成物は、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記組成物。
　［６５］　椎間板性疼痛の治療、予防または再発抑制に使用するための、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物であって、当該組成物は、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記組成物。

　本発明により、椎間板の髄核の再生を促進することが可能な髄核補填用組成物が提供される。本発明の組成物によれば、椎間板髄核のみならず線維輪も含めた椎間板組織全体の変性変化も抑制することも可能となる。また、本発明の組成物は、髄核におけるタイプＩＩコラーゲン陽性の硝子軟骨様細胞の割合を増加させる効果を有する。そして、中高年期の自己修復作用の弱い症例、例えば５０歳以上の中高年期に多くみられる混合性の腰部脊柱管狭窄症（脊柱管狭窄症と椎間板ヘルニアを合併）に対しても、再生促進効果を得ることができる。また、本発明の一態様では、組成物投与時の簡便性、身体への侵襲の低減を考慮し、細胞を包埋するための担体を硬化するための処置なしに用い、椎間板性疾患に伴う疼痛、特に腰痛、より好ましくは慢性的な腰痛を抑制することができる。

　［図１］アルギン酸ナトリウム溶液（以下、「ＵＰＡＬ」（低エンドトキシン高純度アルギン酸ゲル（Ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｇｅｌ）という場合がある）を用いた７日間の共培養後の、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）で標識した骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）及び非標識髄核細胞（ＮＰＣ）の分離のための細胞選別データを示す図。
（ａ）：共培養細胞の二次元（２Ｄ）ドットプロット。Ｐ１ゲートは、単一の生細胞の周りに配置された。
（ｂ）：分類されたＰ２ゲート中の非標識ＮＰＣ及びＰ３ゲート中のＣＦＤＡ−ＳＥ標識ＢＭＳＣの２Ｄドットプロット。
ＦＳＣ−Ａ：前方散乱領域；ＦＳＣ−Ｗ：前方散乱幅；ＳＳＣ−Ａ：側方散乱領域；ＣＦＤＡ−ＳＥ−Ａ：ＣＦＤＡ−ＳＥ−領域。
各細胞の遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを基準とし、対数スケール（ｙ軸）でプロットした。データは、４つの異なるウサギＮＰＣ系統の平均値である。
（ｃ）：ＨＩＦ−１α、（ｄ）：ＧＬＵＴ−１、（ｅ）：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、（ｆ）：ＣＤＭＰ−１、（ｇ）：ＴＧＦ−β、（ｈ）：ＩＧＦ−１、（ｉ）：ＩＩ型コラーゲン、及び（ｊ）：アグリカン。
データは平均値±標準誤差で表し、ｐ値はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの事後検定を用いた一元配置分散分析により求めた。
　［図２］骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）が椎間板（ＩＶＤ）で生存することを示す図。
　カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）で標識した移植後の骨由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）は、術後４週目及び１２週目の椎間板（ＩＶＤ）で生存する。ＩＶＤの凍結切片を４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。画像は、４回の反復試験（無傷対照及びＢＭＳＣ＋Ｇｅｌ、ｎ＝４；４週間及び１２週間）の代表である。スケールバー＝５０μｍ。
　［図３］骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）と組み合わせたゲルは、椎間板切除後の変性椎間板（ＩＶＤ）の水分含量を保存することを示す図。
（ａ）：術後４週目と１２週目の変性ＩＶＤのＴ２強調、正中矢状断像。画像は、８回の撮像の代表画像である。
（ｂ）：ＩＶＤ変性のＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類。データは平均値±標準誤差（無傷の対照、穿刺，椎間板切除，ゲル，及びＢＭＳＣ＋ゲル，ｎ＝８；４週及び１２週）である。
（ｃ）ＮＰの変性変化に対する磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）ｉｎｄｅｘ（髄核（ＮＰ）面積×平均信号強度）。数値は、無傷の対照ＩＶＤと比較した割合（％）として表される。データは平均値±標準誤差であり、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定を用いて事後解析を伴う一元配置分散分析によりｐ値を求めた。
　［図４］骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）と組み合わせたゲルは、椎間板切除後の椎間板（ＩＶＤ）変性を予防することを示す図。
（ａ，ｂ）：ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）又はサフラニン０で染色されたＩＶＤの正中矢状断切片画像（８回の実験画像の代表例）（無傷対照（Ｉｎｔａｃｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ）、穿刺（Ｐｕｎｃｔｕｒｅ）、椎間板切除（Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）、ゲル、ＢＭＳＣ＋ゲル、ｎ＝８；４及び１２週間）。
ＡＦ：線維輪、ＮＰ：髄核。スケールバー＝（Ａ）：５００μｍ（上から１番目及び３番目のセクション）、５０ｍｍ（上から２番目及び４番目のセクション）、及び（Ｂ）：５００μｍ。
（ｃ）：４週目と１２週目の組織学的変性度を示す。
データは平均値±標準誤差であり、ｐ値はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの事後検定を用いた一元配置分散分析により求めた。
　［図５］ウサギ髄核（ＮＰ）におけるＩＩ型コラーゲン陽性細胞を示す図。
（ａ）：ウサギ椎間板（ＩＶＤ）の正中矢状断切片をＩＩ型コラーゲンに対して染色した。画像は、８回の反復実験結果（無傷対照、穿刺、椎間板切除、ゲル、ＢＭＳＣ＋ゲル、ｎ＝８；４及び１２週間）の代表画像である。矢印は、ＩＩ型コラーゲンに対して陽性の細胞を示す。スケールバー＝５００μｍ（上から１番目及び３番目のセクション）及び２０μｍ（上から２番目及び４番目のセクション）。
（ｂ）：ＩＩ型コラーゲン陽性細胞の割合。データは平均値±標準誤差であり、ｐ値はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの事後検定を用いた一元配置分散分析により求めた。
　［図６］ウサギＮＰにおける髄核（ＮＰ）マーカー陽性細胞を示す図。
（ａ−ｃ）：１、７、２８日目にＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ染色したウサギ椎間板（ＩＶＤ）の水平切片。画像は４回の反復実験（無傷対照、椎間板切除、及びＢＭＳＣ＋ゲル、ｎ＝４；ｄａｙ１、７、２８）の代表画像である。スケールバー＝５０μｍ。
（ｄ−ｆ）：全細胞に対するＮＰマーカー陽性細胞の割合。
（ｇ−ｉ）：ＣＦＤＡ−ＳＥ陽性細胞（移植されたＢＭＳＣを代表する）に対するＮＰマーカー陽性細胞の割合。データは平均±標準誤差であり、ｐ値は対応のあるｔ検定を用いて決定した。
　［図７］椎間板（ＩＶＤ）再生のメカニズムを示す図。
　移植された骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）は、既存の髄核細胞（ＮＰＣ）の活性化をもたらす成長因子と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を産生する。既存のＮＰＣ活性化はまた、増殖因子及びＥＣＭの産生を増加させる。移植されたＢＭＳＣはＮＰＣに分化する。ＵＰＡＬ：超精製アルギン酸塩（低エンドトキシン高純度アルギン酸塩ともいう）。
　［図８］ＲＥＣクローンの網羅的解析結果を示す図である。
　［図９］ヒトの健常椎間板髄核細胞（ＮＰＣ）及び高純度間葉系細胞（ＲＥＣ）における各種遺伝子の発現量を示す図。
　［図１０］移植後４週目のヒツジモデルにおける椎間板のＭＲＩの結果を示す図。
　［図１１］移植後４週目のヒツジモデルにおける椎間板の組織学的検査結果を示す図。
　［図１２］移植後４週目のヒツジモデルにおける椎間板の組織学的検査結果を示す図。
　［図１３］３Ｄ共培養の７日後のヒトＮＰＣ及びＲＥＣの発現プロフィールを示す図。
（Ａ）　ＲＥＣ単離を示す概略図。ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）及びＣＤ９０（ＴＨＹ−１）について染色したヒト骨髄細胞のフローサイトメトリープロフィール。１ウェルから収集した細胞を３５ｍｍ培養皿に播種し、１４日まで増殖させて、高い分化能及び増殖能を有する均一な細胞集団を得る。
（Ｂ及びＣ）細胞選別データを用いて、ＣＦＤＡ−ＳＥ標識ＲＥＣと非標識ＮＰＣとを区別する。
（Ｂ）　Ｐ１ゲートは、死細胞及び残屑生細胞を排除する。
（Ｃ）　Ｐ２ゲートでのラベルなしＮＰＣとＰ３ゲートでのＣＦＤＡ−ＳＥ標識ＲＥＣを示す２Ｄドットプロット。
（Ｄ~Ｋ）　各細胞の遺伝子発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベルに対して正規化し、対数スケール（ｙ軸）でプロットした。４つの異なるヒトＮＰＣ株から得られたデータを平均化した。
（Ｄ）ＨＩＦ−１α，（Ｅ）ＧＬＵＴ−１，（Ｆ）ｂｒａｃｈｙｕｒｙ，（Ｇ）ＣＤＭＰ−１，（Ｈ）ＴＧＦ−β，（Ｉ）ＩＧＦ−１，（Ｊ）ＩＩ型コラーゲン、（Ｋ）アグリカン
　データは、平均±ＳＤ値（ｎ＝４）として表す。有意差は、ｐｏｓｔ　ｈｏｃ　Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定による一元配置分散分析で評価した。
　ＮＰＣ：髄核細胞
　ＲＥＣ：急速に増殖するクローン
　ＣＦＤＡ−ＳＥ：５，６−カボキシフルオレセインジアクタトスクシニミジルエステル
　ＡＮＯＶＡ：分散分析
　ＦＳＣ−Ａ：前方散乱面積
　ＦＳＣ−Ｗ：前方散乱幅
　ＳＳＣ−Ａ：側方散乱面積
　ＣＦＤＡ−ＳＥ−Ａ：ＣＦＤＡ−ＳＥ面積
　［図１４］２種類のゲルの弾性比を示す図。
（Ａ）　ＣａＣｌ_２で誘導させたゲル化（直径、４．５ｍｍ；厚さ、２ｍｍ）後の円盤状ＵＰＡＬ及びＲＥＣ＋ＵＰＡＬゲルの形成。
（Ｂ及びＣ）　引張圧縮機械試験装置。サンプルを０．５ｍｍ／分の一定速度で圧縮した。
（Ｄ）　応力歪曲線。ヤング率は、圧縮値１０~２０％の間の接線の傾きに従って計算した。４つの反復試験を行い、代表的な画像を示す。
（Ｅ）　２種類のゲルのヤング率。データは、平均±ＳＤ値（ｎ＝４）を示す。有意差はＷｅｌｃｈの検定後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔにより評価した。
　Ｎ．Ｓ：有意差なし
　ＵＰＡＬ：超精製アルギン酸塩（低エンドトキシン高純度アルギン酸塩ともいう）
　ＲＥＣ：迅速に増殖するクローン
　ＳＤ：標準偏差
　［図１５］各群の実験スケジュール及び治療の詳細を示す図。
（Ａ及びＢ）　最初の手術で２０ｍｇの新鮮なＮＰ組織を処置ＩＶＤから除去して、重度の変性ＩＶＤモデルを確立した。
（Ｃ）　最初の手術の４週間後、７０ｍｇの変性ＮＰ組織を変性ＩＶＤからさらに除去した。
（Ｄ）　変性ＮＰの除去後、ＵＰＡＬ又はＲＥＣ＋ＵＰＡＬ溶液を椎間板内の空隙に移植した。
　ＮＰ：髄核
　ＵＰＡＬ：超精製アルギン酸（低エンドトキシン高純度アルギン酸ともいう）
　ＩＶＤ：椎間板
　［図１６］埋植後４週目及び２４週目における治療したＩＶＤのＭＲＩ評価を示す図。
（Ａ）　ヒツジにおける術後４週目及び２４週目のＩＶＤのＴ２強調、正中矢状断画像。画像は、６又は８回の反復結果の代表である。
（Ｂ）ＰｆｉｒｒｍａｎｎグレードのＩＶＤ変性。
（Ｃ）　ＮＰの変性変化に対するＭＲＩ指数（ＮＰ面積×平均シグナル強度）値。数値は、無処置の対照ＩＶＤについての値に対する割合（％）として表される。
（Ｄ）　ＩＶＤ治療のための椎間板高さ指数。数値は、無処置の対照ＩＶＤの数値に対する割合（％）として示す。データは、平均±ＳＤ値として表す（無処置対照，ｎ＝６；椎間板切除，ｎ＝６；ゲル，ｎ＝８；ＲＥＣ＋ｇｅｌ，ｎ＝８）。有意差は、Ｔｕｋｅｙ‐Ｋｒａｍｅｒ検定を用いたｐｏｓｔ　ｈｏｃ解析による一元配置ＡＮＯＶＡにより評価した。
　ＮＰ：髄核
　ＭＲＩ：磁気共鳴画像法
　ＩＶＤ：椎間板
　ＡＮＯＶＡ：分散分析
　ＳＤ：標準偏差
　［図１７］埋植４週後及び２４週後の治療したＩＶＤの組織学的評価を行った結果を示す図。
（Ａ及びＢ）　Ｈ＆Ｅ又はサフラニン−０染色によって染色された処理ＩＶＤの代表的な正中矢状切片（無処置対照、ｎ＝６；椎間板切除術、ｎ＝６；ゲル、ｎ＝８；ＲＥＣ＋ゲル、ｎ＝８）。スケールバー（Ａ）；５０μｍ（上から２番目及び４番目の部分）又は１ｍｍ（上から１番目及び３番目の部分）（Ｂ）；１ｍｍ。
（Ｃ）　組織学的グレードは、改変Ｂｏｏｓ分類を介して決定した。データは平均値±標準偏差で表す。有意差はｐｏｓｔ　ｈｏｃ　Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定による一元配置分散分析で評価した。
　ＩＶＤ：椎間板
　Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン＆エオシン
　ＳＤ：標準偏差
　ＡＦ：線維輪
　ＮＰ：髄核
　［図１８］埋植４週後及び２４週後の処置ＩＶＤにおけるＩＩ型又はＩ型コラーゲン陽性細胞を示す図。
（Ａ及びＢ）　ＩＩ型コラーゲン又はＩ型コラーゲンについて染色された処置ＩＶＤの代表的な正中矢状切片（無処置対照、ｎ＝６；椎間板切除術、ｎ＝６；ゲル、ｎ＝８；ＲＥＣ＋ゲル、ｎ＝８）。スケールバー、１ｍｍ（第１及び第３のライン）又は５０μｍ（第２及び第４のライン）。
（Ｃ及びＤ）　処置されたＩＶＤ中の総細胞に対するＩＩ型又はＩ型コラーゲン陽性細胞の割合。データは平均値±標準偏差で表す。有意差はｐｏｓｔ　ｈｏｃ　Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定による一元配置分散分析で評価した。
　ＩＶＤ：椎間板
　ＲＥＣ：急速増殖クローン
　ＳＤ：標準偏差
　ＡＮＯＶＡ：分散分析
　［図１９］ＮＰ組織除去後４週目の組織学的評価を示す図。
（Ａ）　ＩＶＤから除去したＮＰ組織（無処置対照、又は２０、５０、１００、２００ｍｇ除去）の中矢状部（Ｈ＆Ｅ又はサフラニン−０で染色）。ヒツジモデルにおいて、４週間後にＮＰ組織の２０ｍｇ以上の除去に伴ってＩＶＤ変性が生じた。スケールバー；１ｍｍ（全て）。
（Ｂ）組織学的グレードは、改変Ｂｏｏｓ分類を介して決定した。データは平均値±標準偏差。
　ＮＰ：髄核
　ＩＶＤ：椎間板
　Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン
　ＳＤ：標準偏差
　［図２０］Ｔ２強調中間矢状画像を用いた、隣接する椎骨の椎間板高さに対する椎間板高さの測定結果を示す図。
ＢＣとＥＦはそれぞれ前方及び後方椎間板高であり、ＡＢとＤＥは頭側の隣接椎体高である。椎間板高さ（ＢＣ＋ＥＦ）と椎体高さ（ＡＢ＋ＤＥ）との比としてＤＨＩ値を計算し、無処置対照ＩＶＤのＤＨＩに対する処置ＩＶＤのＤＨＩの比として相対ＤＨＩ値を計算した。
　ＤＨＩ：椎間板高さ指数
　ＩＶＤ：椎間板

１．概要
　本発明は、アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞（例えばヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞）とを含有する、椎間板再生用組成物に関する。本発明の一態様において、本発明は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞（例えばヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞）とを含有する、椎間板再生用組成物に関する。本発明の組成物は、間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する。本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられる。本発明のいくつかの態様では、本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられる。

　本発明においては、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣｓ）とゲルとの併用によって、ゲル単独よりも組織修復効果が有意に促進されたことをウサギ由来の間葉系幹細胞を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ試験で実証し、そのメカニズムとして、ゲル包埋のＢＭＳＣｓと髄核細胞の共培養によって、１）成長因子産生による両細胞の相互活性化、２）ＢＭＳＣｓの髄核細胞への分化、３）両細胞からの細胞外基質産生能の向上を明らかにした。

　本発明の組成物に含まれるアルギン酸は、カジメ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される多糖類であり、カルシウムなどの２価の金属イオンを加えると架橋し硬化する性質を有する。この性質を利用して、患部で金属イオンと接触させることにより、表面を硬化させ、患部へ留めることが可能となる。本発明において、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを含む組成物をゾル状態で椎間板髄核部位に注入し、注入口に架橋剤を接触させて組成物の一部を硬化させると、髄核の変性を抑制し、髄核再生に好ましいタイプＩＩコラーゲン陽性細胞の割合を増加させ、椎間板髄核の再生を促進することを見出した。

　本発明において、間葉系幹細胞をアルギン酸（例えば低エンドトキシンアルギン酸）の１価金属塩で包埋することで、埋植された間葉系幹細胞は患部にとどまり長期的に効果を発揮する。すなわち、埋植された高純度間葉系幹細胞が成長因子や細胞外基質を産生し、髄核細胞を活性化する。そして、活性化された髄核細胞は成長因子や細胞外基質を産生する。その結果、埋植された間葉系幹細胞は髄核細胞へと分化し、髄核細胞と間葉系幹細胞との相互作用を介して障害部の再生が促進される。本発明の別の態様では、ヒアルロン酸などの生体適合性材料に細胞を包埋し得る。

　また、本発明の組成物に含まれる間葉系幹細胞において、その一態様であるヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞（ＲＥＣ）は、２種類の抗体とセルソータにより骨髄から直接分離する技術により作製される超高純度ヒト間葉系幹細胞である。セルソーターを用いた分離によって均一な細胞集団が得られるため品質管理が容易であり、かつ増殖性が極めて高いため大量培養による製剤化が可能である。

　本発明は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含有する、椎間板再生用組成物にも関する。本発明の一態様では、本発明の組成物は、未分化状態で及び／又は分化誘導の処置なしに椎間板髄核に適用される。本発明の組成物は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する。本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ得る。本発明の一態様では、本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ得る。

２．定義
　「低エンドトキシン」、「アルギン酸の１価金属塩」は後述する。
　「椎間板」は、脊椎に連なる椎骨と椎骨との間にある円柱状の組織である。椎間板は、円板状の無血管組織であり、髄核を中心にして周りを線維輪が取り巻き、さらに上下に終板が配置された構造をしている。
　「髄核」は、椎間板の中心に存在するゲル状の組織であり、髄核細胞と、主にプロテオグリカンとＩＩ型コラーゲンで構成される細胞外基質と、水を主として含有する。髄核には、自己修復能・再生能が著しく低いと考えられている。

　「髄核補填」とは、加齢、外傷、感染、およびそれらに対する外科的手術（例えば、椎間板髄核摘出（切除）術）などにより、変性、縮小、または除去した髄核の変性分、縮小分、または除去分を補填することをいう。なお、本明細書において「髄核充填」の語は、「髄核補填」と同じ意味で用いられ、本発明の「髄核補填用組成物」は「髄核充填用組成物」と同義である。
　「髄核部位」とは、髄核が存在する部位、髄核の変性若しくは縮小が生じている部位、又は、髄核の少なくとも一部を除去することで形成された髄核の欠損部をいい、髄核が存在する部位の周辺部も含む。

　「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）である。
　「適用」とは、本発明の組成物を椎間板の髄核部位の変性分、縮小分、除去分、欠損部などを埋めるのに十分な量で髄核部位に充填することを意味する。
　「包埋する」とは、生体適合性材料、好ましくは、アルギン酸の１価金属塩の溶液に細胞を懸濁又は混合することをいう。
　「一部分を硬化する」とは、後述の通りである。

　「低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する」とは、本発明の組成物が、適用された髄核部位において、髄核を再生するのに十分な量の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有することを意味する。
　「流動性を有する」とは、後述の通りである。
　「椎間板変性および／または椎間板損傷」、「治療、予防または再発抑制」とは、後述の通りである。
「椎間板性疼痛」とは、椎間板に起因して生じる疼痛のことを意味する。
「腰痛」とは、椎間板の周囲に生じる疼痛であり、背部痛・臀部痛を含む。
「慢性腰痛」とは、腰痛の発症から１２週以上続く腰痛を意味する。

　本発明の組成物は、溶媒を用いて溶液状態で提供されてもよいし、凍結乾燥体（特には、凍結乾燥粉体）などの乾燥状態で提供されてもよい。乾燥状態として提供される場合、本発明の組成物は、適用時には溶媒を用いて、溶液状などの流動性を有する状態で使用される。溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、注射用水、精製水、蒸留水、イオン交換水（または脱イオン化水）、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。好ましくは、ヒトおよび動物の治療に用いることが可能な注射用水、蒸留水、生理食塩水などである。

３．アルギン酸の１価金属塩
　本発明において、担体として使用される「アルギン酸の１価金属塩」は、アルギン酸の６位のカルボン酸の水素原子を、Ｎａ^＋やＫ^＋などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特に、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、架橋剤と混合したときにゲルを形成する。

　本発明に用いる「アルギン酸」は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とＬ−グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。

　アルギン酸の１価金属塩は高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、分子量が低すぎると粘度が低くなり、適用した部位の周辺組織への密着性が弱くなる恐れがあり、また、分子量が高すぎるものは製造が困難であるとともに、溶解性が低下する、溶液状にした際に粘度が高すぎて取扱いが悪くなる、長期間の保存で物性を維持しにくい等の問題を生じるため、一般的に重量平均分子量で１万~１０００万、好ましくは２万~８００万、より好ましくは５万~５００万の範囲である。本明細書において、「~」を用いて示された数値範囲は、「~」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。

　一方、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定した重量平均分子量は、本発明の実施例で示された効果によれば、好ましくは１０万以上、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３００万以下である。その好ましい範囲は、１０万~５００万であり、より好ましくは５０万~３５０万である。

　また、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と多角度光散乱検出器（Ｍｕｌｔｉ　Ａｎｇｌｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＭＡＬＳ）とを組み合わせたＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量（絶対分子量）は、本発明の実施例で示された効果によれば、好ましくは１万以上、より好ましくは８万以上、さらに好ましくは９万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、さらに好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万~１００万であり、より好ましくは８万~８０万であり、よりさらに好ましくは９万~７０万、とりわけ好ましくは９万~５０万である。

　通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０~２０％以上の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２~４８万、５０万であれば４０~６０万、１００万であれば８０~１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。

　アルギン酸の１価金属塩の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
　分子量測定にゲル浸透クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例に記載のとおりである。カラムは、例えば、ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用いることができ、溶離液は、例えば、２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液とすることができ、分子量標準としてプルランを用いることができる。

　分子量測定にＧＰＣ−ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例に記載のとおりである。検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。

　アルギン酸の１価金属塩は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸の１価の金属塩を製造することができる。さらに、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸の１価金属塩と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸の１価金属塩とすることも可能である。

　本発明に用いられるアルギン酸の１価金属塩は、好ましくは、アルギン酸の１価金属塩をＭｉｌｌｉＱ水に溶解して１ｗ／ｗ％濃度の溶液とし、コーンプレート型粘度計を用いて、２０℃の条件で、粘度測定を行ったときの見掛け粘度が、４０ｍＰａ・ｓ~８００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、より好ましくは、５０ｍＰａ・ｓ~６００ｍＰａ・ｓであることが望ましい。見掛け粘度の測定条件は、後述の条件に従うことが望ましい。なお、本明細書において「見掛け粘度」を単に「粘度」という場合がある。

　本発明に用いるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来であるのが好ましい。天然由来のアルギン酸としては、例えば、褐藻類から抽出されるものを挙げることができる。アルギン酸を含有する褐藻類は世界中の沿岸域に繁茂しているが、実際にアルギン酸原料として使用できる海藻は限られており、南米のレッソニア、北米のマクロシスティス、欧州のラミナリアやアスコフィラム、豪のダービリアなどが代表的なものである。アルギン酸の原料となる褐藻類としては、例えば、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）属、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）属（コンブ属）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）属、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ）属、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）属などがあげられる。

　本発明の別の態様では、細胞を包埋するための担体として、他の生体適合性材料を用いてもよい。たとえば、その薬学的に許容可能な塩（生理学的塩）を含む、ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ガラクトサミノグリシロングリカン（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃｕｒｏｎｇｌｙｃａｎ）硫酸（ＧＧＧＳ）などの１つもしくは複数の天然もしくは合成グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはムコ多糖類を、細胞を包埋するための担体として用いてもよい。本発明の別の態様では、細胞を包埋するための担体として、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、アガロース、キチン、キトサン、でんぷん、ペクチン等の多糖類、ゼラチン、コラーゲン、ポリペプチド等のタンパク質、アミノ酸誘導体およびこれらの共重合体並びにこれらの誘導体から選択されるものであって、いずれか１つもしくは複数が用いられてもよい。本発明の別の態様では、担体としてコラーゲンやゼラチン様組成物といったハイドロゲルを使用してもよい。

４．低エンドトキシン処理
　本発明で用いるアルギン酸の１価金属塩は特に限定されるものではなく、例えば低エンドトキシンのアルギン酸の１価金属塩である。本発明の一態様では、細胞を包埋するための担体は、低エンドトキシンであることが好ましい。すなわち、本発明で用いるアルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシンのアルギン酸の１価金属塩であることが好ましい。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルが低いことをいう。より好ましくは、低エンドトキシン処理されたアルギン酸の１価金属塩であることが望ましい。

　低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９−３２４００１号公報など参照）、β１，３−グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８−２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２−５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（１９９４）４０：６３８−６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５−０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類などに合わせて適宜選択するのが望ましい。

　エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。

　本発明の組成物に含有されるアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、アルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは５０ＥＵ／ｇ以下、特には３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ　Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡ^ＴＭＵＰ　ＬＶＧ（ＦＭＣ　ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
　このように低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムを、本明細書では「高純度アルギン酸ナトリウム」（ＵＰＡＬ）ともいう。

５．アルギン酸の１価金属塩の溶液の調製
　本発明の組成物は、アルギン酸の１価金属塩の溶液を用いて調製してもよい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。すなわち、本発明で用いられるアルギン酸の１価金属塩は、前述の褐藻類を用いて、酸法、カルシウム法など公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、これらの褐藻類から、炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出した後、酸（例えば、塩酸、硫酸など）を添加することによってアルギン酸を得ることができ、アルギン酸のイオン交換によりアルギン酸の塩を得ることができる。前述のとおり、低エンドトキシン処理を行う。アルギン酸の１価金属塩の溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。

　本発明の組成物が、凍結乾燥体などの乾燥状態で提供される場合にも、上記の溶媒を用いて流動性のある溶液に調製することができる。
また、本発明の組成物を得るための操作は全てエンドトキシンレベル、および、細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。

６．本発明の組成物の見掛け粘度
　本発明のいくつかの態様の組成物は、流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。本発明の組成物は、髄核部位への適用時に流動性を有する。本発明の態様の１つでは、好ましくは、本発明の組成物は、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針で注入できる流動性を有する。この態様の本発明の組成物の見掛け粘度は、本発明の効果が得られれば、特に限定されないが、粘度が低すぎると適用した部位の周辺組織への密着性が弱くなる恐れがあるため、好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１００ｍＰａ・ｓ以上、さらに好ましくは２００ｍＰａ・ｓ以上、とりわけ好ましくは５００ｍＰａ・ｓ以上である。見掛け粘度が高すぎると取扱性が悪くなる恐れがあるため、好ましくは５００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下であり、さらに好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下である。見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以下のときシリンジ等での適用がより容易に行える。しかし、見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以上であっても加圧型や電動型の充填器具やその他の手段を用いて適用可能である。本発明の組成物の好ましい範囲は、１０ｍＰａ・ｓ~５００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、１００ｍＰａ・ｓ~３００００ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは２００ｍＰａ・ｓ~２００００ｍＰａ・ｓ、またさらに好ましくは５００ｍＰａ・ｓ~２００００ｍＰａ・ｓ、とりわけ好ましくは７００ｍＰａ・ｓ~２００００ｍＰａ・ｓである。別の好ましい態様では、５００ｍＰａ・ｓ~１００００ｍＰａ・ｓ、あるいは２０００ｍＰａ・ｓ~１００００ｍＰａ・ｓであってもよい。本発明のいくつかの態様の組成物は、シリンジ等で対象に適用することもできる粘度である。

　アルギン酸類の水溶液などアルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の見掛け粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい−平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。本発明において粘度測定は２０℃の条件で行うことが望ましい。後述のように本発明の組成物が細胞など溶媒に溶解しないものを含有する場合には、粘度測定を正確に行うため、組成物の見掛け粘度は、細胞などを含有しない状態の見掛け粘度とすることが好ましい。

　本発明においては、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の見掛け粘度の測定は、特に、コーンプレート型粘度計を用いて測定することがより望ましい。例えば、以下のような測定条件で測定することが望ましい。試料溶液の調製は、ＭｉｌｌｉＱ水を用いて行う。測定温度は２０℃とする。コーンプレート型粘度計の回転数は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定時は１ｒｐｍ、２％溶液測定時は０．５ｒｐｍとし、これを目安にして決定する。読み取り時間は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定の場合は２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とする。２％溶液測定の場合は２．５分間測定し、開始０．５分から２．５分までの平均値とする。試験値は３回の測定の平均値とする。

　本発明の組成物の見掛け粘度は、例えば、アルギン酸の１価金属塩の濃度、分子量、又はＭ／Ｇ比等を制御することにより調整することができる。
　アルギン酸の１価金属塩の溶液の見掛け粘度は、溶液中のアルギン酸１価金属塩濃度が高い場合に粘度が高く、濃度が低い場合に粘度が低くなる。またアルギン酸１価金属塩の分子量が大きい場合に粘度が高く、分子量が小さい場合に粘度が低くなる。

　アルギン酸の１価金属塩の溶液の見掛け粘度は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受けるため、例えば、溶液の粘度等により好ましいＭ／Ｇ比を有するアルギン酸を適宜選択することができる。本発明に用いるアルギン酸のＭ／Ｇ比は、約０．１~５．０であり、好ましくは約０．１~４．０、より好ましくは約０．２~３．５である。
　前述のように、Ｍ／Ｇ比が主に海藻の種類によって決まることなどから、原料として用いられる褐藻類の種類はアルギン酸の１価金属塩の溶液の粘度に影響を及ぼす。本発明で用いられるアルギン酸としては、好ましくは、レッソニア属、マクロシスティス属、ラミナリア属、アスコフィラム属、ダービリア属の褐藻由来であり、より好ましくはレッソニア属の褐藻由来であり、特に好ましくはレッソニア・ニグレッセンズ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来である。

７．間葉系幹細胞
　本発明において使用される間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。
　間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、歯髄又は臍帯組織等の種々の組織から取得できる。その精製プロセスは、例えば以下のとおりである。
　ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマヤギ、ウサギ等）から採取した少量の脂肪片を酵素処理して得られる細胞型の混合集団から、遠心分離によって浮遊性の脂肪細胞集団を分離し、培養液を満たした培養器の天井面に接触させた状態で静置したときに下床面に沈降して増殖する線維芽様細胞を継代培養によって増殖させる。
　また、本発明においては、ｉＰＳ細胞由来の間葉系幹細胞や、市販の間葉系幹細胞を使用することも可能である。本発明において、間葉系幹細胞は、好ましくは未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに髄核に適用される。未分化状態とは、分化能を有する幹細胞が分化していない状態が維持されていることをいう。「分化誘導の処置なしに」とは、例えば、分化能を有する幹細胞を分化誘導培地を用いて特定の細胞に分化させる等の処置をしないことを指す。

８．ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞
（１）ＲＥＣクローン
　本発明者は、以前の研究により、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性の間葉系幹細胞（ＣＤ２７１＋細胞）、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の間葉系幹細胞（ＣＤ２７１＋ＣＤ９０＋細胞）の中から、増殖が早い高速増殖性の細胞クローン（Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｌｏｎｅ：ＲＥＣ）を単離することに成功した。

　このＲＥＣは、９６ウェルプレートに１個ずつ細胞を播種して培養したときに、２週間でコンフルエントに達することができる細胞であり、従来法で得た間葉系幹細胞と比較し、増殖能、分化能及び遊走能の全てが１０００倍以上の能力を有する。そして、特に遊走能を保持しているため、経静脈内投与が可能となり、骨・軟骨形成不全症等の重篤な全身性疾患への応用が期待できる。
　本発明においては、上記ＲＥＣクローンのうち、分化能や増殖能においてばらつきの少ない細胞クローンを使用することができる。

　本発明の細胞クローンを含む細胞集団は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であり、かつ、増殖が早い間葉系幹細胞クローンの集団であり、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である。
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である。

（２）ヒト間葉系幹細胞濃縮方法
　本発明において、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の間葉系幹細胞を得るには、例えばＷＯ２００９／３１６７８号に記載の方法に従うことができる。
　その方法の概要は以下の通りである。

　まず、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性（ＣＤ２７１＋）、又はＣＤ２７１及びＣＤ９０が共陽性（ＣＤ２７１＋ＣＤ９０＋）の細胞分画を選別することにより、間葉系幹細胞を高度に濃縮する。なお、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団に血球系細胞が含まれる場合は、非血球系の細胞を選別するために、ＣＤ４５及びＣＤ２３５ａが共陰性（ＣＤ４５−ＣＤ２３５ａ−）の細胞を選別する工程を加えてもよい。

　間葉系幹細胞が含まれる細胞集団は、フローサイトメトリーやアフィニティー・クロマトグラフィーによって調製することができる。
　この細胞集団を得るための材料は特に限定されないが、例えば、骨髄、脂肪組織、臍帯血、末梢血（Ｇ−ＣＳＦ投与後の末梢血を含む）等が挙げられる。なお、骨髄は、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いればよい。また、細胞として、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を挙げることもできる。

　細胞調製の際、材料が間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、必要により、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、トリプシン、コラゲナーゼ等による酵素処理を行うことができる。また、材料に赤血球が混入している場合には、予め赤血球を溶血しておくことが好ましい。
　上記の通り調製された細胞集団を用い、ＣＤ２７１＋細胞又はＣＤ２７１＋ＣＤ９０＋細胞を選別する。

　ＣＤ２７１＋細胞又はＣＤ２７１＋ＣＤ９０＋細胞を選別する方法としては、例えば、抗体を用いる方法が挙げられる。
　抗体は、ＣＤ２７１＋細胞又はＣＤ２７１＋ＣＤ９０＋細胞を選別することが可能な、抗ＣＤ２７１抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体である。選別にフローサイトメトリーを用いる場合には、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ等の異なる蛍光色素で標識された抗ＣＤ２７１抗体、又は抗ＣＤ２７１抗体と抗ＣＤ９０抗体を、適宜組み合わせて用いることにより、生細胞を短時間で選別することが可能になる。また、フローサイトメトリー以外にも、磁気ビーズを用いる方法やアフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法によって、ＣＤ２７１＋ＣＤ９０＋細胞を選別することが可能である。
　なお、これらの方法を用いる前に、予め、死細胞を染色する蛍光色素（例えば、ＰＩ）を細胞集団と反応させ、蛍光で染色された細胞を除去することにより、死細胞を除去してもよい。

（３）ＲＥＣ細胞濃縮
　次に、選別したＬＮＧＦＲ陽性細胞、又はＬＮＧＦＲ及びＴｈｙ１共陽性細胞を単一細胞（クローン）培養し、増殖が速いロットを選択することで、増殖能・分化能・遊走能にすぐれた高純度ヒト間葉系幹細胞（ＲＥＣ：Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｌｏｎｅ）を得る。

　ヒト骨髄又は脂肪・胎盤絨毛膜から単核細胞を調製し、骨髄単核細胞を抗ＬＮＧＦＲ単独、又は抗ＬＮＧＦＲ及び抗Ｔｈｙ１で染色する。次に、フローサイトメトリー（セルソータ）を用い、ＬＮＧＦＲ陽性細胞、又はＬＮＧＦＲ陽性及びＴｈｙ１陽性細胞を９６穴培養プレートにクローンソートする。すなわち、１ウェルに細胞１個ずつ播種する。単一細胞培養２週間後に培養プレートを顕微鏡下で撮影し、コンフルエント又はセミコンフルエントになったウェルを選別し、当該ウェルに含まれる細胞をＲＥＣとする。

　ここで、「増殖が速い」、「高速増殖性」とは、９６穴培養プレートの１ウェルに細胞１個ずつ播種して培養したときに、培養開始２週間後又はそれ以前に培養プレートがコンフルエント又はセミコンフルエントになる程度の増殖速度（倍加時間（ダブリングタイム）が２６±１時間）を有することを意味する。

　コンフルエントとは、培養容器表面（培養面）の９０％以上を培養細胞が覆っている状態である。また、セミコンフルエントとは、培養容器表面（培養面）の７０~９０％を培養細胞が覆っている状態である。使用する培養器具のサイズ及び種類は、細胞の増殖速度に応じ適宜変更可能である。遅れて増殖している細胞（Ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ／Ｓｌｏｗｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ）、すなわち単一細胞培養２週後になってもセミコンフルエント又はコンフルエントにならなかった細胞は破棄する。ＲＥＣとして選別した各ウェルから回収したＲＥＣを各ウェル毎に培養フラスコに移入し、さらにコンフルエントになるまで培養する（拡大培養）。その後、拡大培養した細胞を別々に回収する。１ウェル由来のＲＥＣを１ロットとする。

　本発明において使用されるＲＥＣは、１ウェルに細胞１個ずつ播種するクローンソートにより得られたものであるから、増殖した細胞同士の遺伝形質はすべて同じである。従って、本発明においては細胞集団全体を「クローン」と言うことも、細胞集団を構成する個々の細胞を「クローン」ということもある。

　また、本発明において、選別に使用するためのＲＥＣは、ＲＥＣマーカー（抗Ｒｏｒ２）により予め評価しておくこともできる。例えば、前記拡大培養後、全ロットから付着増殖した細胞を回収し、各ロットの一部（１~３×１０^５個程度）の細胞をとりわけて、抗Ｒｏｒ２に対するモノクローナル抗体で単一染色を行う。抗Ｒｏｒ２に対するモノクローナル抗体で単一染色を行う手法は公知である（ＷＯ２０１６／１７７９５）。要約すると、ＲＥＣマーカーを用いたフローサイトメトリー解析により、回収細胞におけるＲＥＣマーカー陽性細胞の比率を求める。比率は、定量的ＰＣＲを用いてＲｏｒ２のｍＲＮＡ発現を定量してもよいし、顕微鏡により同比率をマニュアルにより求めてもよい。上記陽性比率が一定値（例えば６５％）以上のロット（細胞集団）を合格とし、これを後述の選別に使用することもできる。

（４）幹細胞集団の選別
　本発明においては、個々のロットのＲＥＣクローンについて、細胞の増殖能、脂肪分化能、ＲＥＣ特異的マーカー発現量、細胞サイズの均一性を調べ、それぞれの相関性を解析することにより、高純度でより細胞性能の高いＲＥＣを選別することが可能となった。
　本発明においては、前方散乱光の変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＶ値）及び細胞の平均サイズを選別の指標とする。
　前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ）とは、レーザー光の軸に対して前方向の小さい角度で散乱する光である。前方散乱光は、細胞表面で生じるレーザー光の散乱光、回折光及び屈折光からなり、サンプルの大きさに関する情報が得られる。

　変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＶ）は、標準偏差を平均値で割った値のことで、単位の異なるデータのばらつきや、平均値に対するデータとばらつきの関係を相対的に評価する際に用いる数値である。
　本発明においては、上記ＣＶ値が４０％以下、好ましくは３５％以下のものを選別する。ＣＶ値が４０％以下の細胞集団、より好ましくは３５％以下の細胞集団は、大きさが均一な細胞により構成されている細胞集団である。好ましくは、ＣＶ値は３０％以下、２５％以下、又は２０％以下である。　また、本発明により選別された細胞集団における細胞の平均サイズは、２０μｍ以下である。好ましくは１８μｍ以下であり、１４μｍ~１８μｍの範囲の大きさである。

　本発明は、ＬＮＧＦＲ陽性細胞、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団の品質を評価する方法も提供する。本発明においては、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴、好ましくは両方の特徴を満たす細胞集団を、高品質であると判定する。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である。
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である。
　このようにして評価及び選別された細胞集団は、当該集団を構成する細胞クローンの数が限定されるものではなく、例えば１ｍｌの溶液に０．８Ｘ１０^７~１．２Ｘ１０^７個程度の細胞を有する。

また、本発明の好ましい態様においては、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴、好ましくは両方の特徴を満たす細胞集団を、高品質であると判定する。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が３５％以下である。
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である。
　このようにして評価及び選別された細胞集団は、当該集団を構成する細胞クローンの数が限定されるものではなく、例えば１ｍｌの溶液に０．８Ｘ１０^７~１．２Ｘ１０^７個程度の細胞を有する。

９．本発明の組成物の調製
　本発明の組成物は、例えば低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩、及び上記間葉系幹細胞を有効成分として含有することを特徴とする。本発明者らは、本発明の組成物を生体の髄核部位に充填した場合に、アルギン酸の１価金属塩自体が髄核組織の再生または治療効果を発揮することを初めて見出した。有効成分として含有するとは、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩が患部に適用された際に、髄核組織の再生または治療効果を発揮できる量で含有されていればよく、少なくとも、組成物全体の０．１ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは、１ｗ／ｖ％である。本発明の組成物中の好ましいアルギン酸の１価金属塩濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｖ％~５ｗ／ｖ％、より好ましくは１ｗ／ｖ％~５ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは、１ｗ／ｖ％~３ｗ／ｖ％で、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｖ％~２．５ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、本発明の組成物中のアルギン酸の１価金属塩濃度は、好ましくは、０．５ｗ／ｗ％~５ｗ／ｗ％、より好ましくは１ｗ／ｗ％~５ｗ／ｗ％であり、さらに好ましくは、１ｗ／ｗ％~３ｗ／ｗ％で、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｗ％~２．５ｗ／ｗ％であってもよい。

　好ましいエンドトキシンレベルを示すまで精製したアルギン酸の１価金属塩を用いて、上記のように組成物を作製した場合には、組成物のエンドトキシン含有量は、通常、５００ＥＵ／ｇ以下であり、より好ましくは３００ＥＵ／ｇ以下、さらに好ましくは１５０ＥＵ／ｇ以下であり、とりわけ好ましくは１００ＥＵ／ｇ以下である。

　本発明の組成物中に含有させる細胞数（細胞濃度）は、例えば、１×１０^４個／ｍｌ以上、または１×１０^５個／ｍｌ以上、好ましくは、１×１０^４個／ｍｌ~１×１０^７個／ｍｌの細胞である。

　本発明の組成物は、細胞の成長を促進する因子を含ませることもできる。そのような因子としては、例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１，ＰＤＧＦ，ＣＤＭＰ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ−ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ），ＣＳＦ，ＥＰＯ、ＩＬ、ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｒｉｃｈ　Ｐｌａｓｍａ）、ＳＯＸおよびＩＦ等が挙げられる。これらの因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。尚、本発明のいくつかの態様の組成物は、これらの成長因子を含まない。成長因子を含まない場合でも、髄核の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞の成長を促す場合と比較してより安全性も高い。

　本発明の組成物は、細胞死を抑制する因子を含ませることもできる。細胞死を引き起こす因子としては、例えば、Ｃａｓｐａｓｅ、ＴＮＦα等が挙げられ、これらを抑制する因子としては、抗体やｓｉＲＮＡ等が挙げられる。これらの細胞死を抑制する因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。尚、本発明のいくつかの態様の組成物は、これらの細胞死を抑制する因子を含まない。細胞死を抑制する因子を含まない場合でも、髄核の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較してより安全性も高い。

　尚、本発明の１つの態様では、本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩以外に、椎間板の髄核組織に対し薬理作用を発揮する成分を含まない。低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のみを有効成分として含有する組成物においても、充分な髄核の再生または治療効果を発揮しうる。
　本発明のいくつかの態様では、必要に応じて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤等、通常医薬に用いられる成分を本発明の組成物に含有させることもできる。

１０．本発明の組成物の硬化
　本発明の組成物は、髄核部位への適用後に一部分を硬化するように用いられる。
　「一部分を硬化する」とは、流動性を有する本発明の組成物の一部分に架橋剤を接触させて、架橋剤と接触した組成物の全体ではなく一部分をゲル化し、固めることをいう。好ましくは、流動性を有する本発明の組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させることで本発明の組成物の一部分を硬化する。本発明では、使用する担体に適した架橋剤や硬化手段を選択できる。

　本発明のいくつかの態様では、「組成物を髄核部位への適用後に一部分を硬化させる」とは、髄核部位への充填と同様の架橋剤の使用方法および使用比率を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、直径６ｍｍの試験管に低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム５００μＬおよび架橋剤を充填して１時間静置後に、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割はゲル化しておらず、ゲル化していない部分は、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシリンジで吸引できることで示されてもよい。

　組成物が髄核部位への充填後にもこのような性状を示すことにより、充填後に椎間板の頭尾側から圧縮力をかけた場合でも組成物が逸脱することがないと考えられる。「組成物の表面の少なくとも一部分」は、例えば、髄核へつながる椎間板の表面の開口部であり、好ましくは、髄核部位に組成物を適用するのに使用した椎間板の表面の開口部、すなわち組成物の充填口である。組成物の表面の少なくとも一部分をゲル化して固めることで、椎間板から組成物が漏れ出すのを効果的に防ぐことができる。椎間板表面の組成物の充填口は、例えば、椎間板の表面にシリンジの針やメスで作製した組成物の充填に用いられた開口部、あるいは、椎間板ヘルニア摘出時にメス等により作製された椎間板表面の開口部であることが好ましい。この態様における椎間板とは好ましくは線維輪である。

　本発明の組成物は、好ましくは、対象の髄核部位に適用する前に、組成物を硬化させる量の架橋剤を含有しない。このため、本発明の組成物には、一定時間経過後も組成物を硬化させない量の架橋剤が含まれていてもよい。ここでの一定時間とは、特に限定されないが、好ましくは３０分~１２時間程度である。「組成物を硬化させる量の架橋剤を含有しない」ことは、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針をつけたシリンジで注入できることで示されてもよい。本発明のいくつかの態様の組成物には、架橋剤が含まれていない。

　架橋剤としては、アルギン酸の１価金属塩の溶液を架橋することにより、その表面を固定化することができるものであれば、特に限定されない。架橋剤として、例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋などの２価以上の金属イオン化合物、分子内に２~４個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イオン化合物として、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＣａＳＯ_４、ＢａＣｌ_２等を、分子内に２~４個のアミノ基を有する架橋性試薬として、窒素原子上にリジル（ｌｙｓｙｌ）基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２）を有することもあるジアミノアルカン、すなわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形成している誘導体が包含され、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、Ｎ−（リジル）−ジアミノエタン等を挙げることができるが、入手しやすいこと、ゲルの強度等の理由から、特に、ＣａＣｌ_２溶液とするのが好ましい。

　本発明のいくつかの態様の１つでは、本発明の組成物の表面に架橋剤を接触させるタイミングは、好ましくは、本発明の組成物を髄核部位へ適用した後である。本発明の組成物の一部分に架橋剤（例えば、２価以上の金属イオン）を接触させる方法としては、特に限定されないが、例えば、シリンジ、噴射器（スプレー）などで、２価以上の金属イオンの溶液を組成物表面にかける方法などを挙げることができる。例えば、架橋剤は、ゆっくりと数秒~１０数秒、椎間板に形成された組成物の充填口にかけ続けてもよい。その後は、必要に応じて、充填口付近に残存する架橋剤を除去する処理を加えてもよい。架橋剤の除去は、例えば、生理食塩水等による適用部位の洗浄であってもよい。

　架橋剤の使用量は、本発明の組成物の適用量、椎間板表面の組成物の充填口の大きさ、椎間板の髄核の適用部位サイズ、などを考慮して適宜調節するのが望ましい。組成物の充填口の周囲組織に架橋剤の影響を強く及ぼさないためには、架橋剤の使用量を過剰にならないよう調節する。２価以上の金属イオンの使用量としては、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の表面を固めることができる量であれば、特に限定されない。しかし、例えば、１００ｍＭのＣａＣｌ_２溶液を用いる場合には、椎間板の表面の充填口が直径１ｍｍ程度の場合には、ＣａＣｌ_２溶液の使用量は０．３ｍｌ~５．０ｍｌ程度であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｌ~３．０ｍｌ程度である。椎間板表面の充填口が椎間板ヘルニア摘出時にメス等により作製され、辺縁が５ｍｍ×１０ｍｍ程度の場合には、１００ｍＭのＣａＣｌ２溶液の使用量は、０．３ｍｌ~１０ｍｌ程度であることが好ましく、より好ましくは、０．５ｍｌ~６．０ｍｌ程度である。適用部位における本発明の組成物の状態を見ながら、適宜増減できる。

　架橋剤にカルシウムが含まれる場合、カルシウムの濃度が高い方が、ゲル化が早く、また、より硬いゲルを形成することができることが知られている。しかし、カルシウムには細胞毒性があるため、濃度が高すぎると、本発明の組成物の椎間板の髄核再生作用に悪影響を及ぼす恐れもある。そこで、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の表面を固めるのに、例えばＣａＣｌ_２溶液を用いる場合には、好ましくは、２５ｍＭ~２００ｍＭ、より好ましくは、５０ｍＭ~１５０ｍＭの濃度とするのが望ましい。

　本発明においては、好ましくは、組成物に架橋剤を添加後、一定時間静置した後に、添加した部位に残存する架橋剤を洗浄などにより除去することが望ましい。静置する一定時間は特に限定されないが、好ましくは、約１分間以上、より好ましくは約４分間以上静置して組成物の表面をゲル化させることが望ましい。あるいは、約１分~約１０分間、より好ましくは約４分~約１０分間、約４分間~約７分間、さらに好ましくは約５分間静置することが好ましい。この一定時間の間は、組成物と架橋剤とを接触させた状態にすることが望ましく、組成物の液面が乾かないように、架橋剤を適宜追加してもよい。

　例えば、アルギン酸ナトリウム溶液をＣａＣｌ_２溶液中に滴下し、ゲル化して作成したものにアルギン酸ビーズがある。しかし、アルギン酸ビーズは、適用部位に押し付けて適用する必要があるが、適用部位の大きさにあったものを作成する必要があり、実際の臨床で使うには、技術的に困難である。また、ＣａＣｌ_２溶液を架橋剤として用いた場合、ビーズ表面のＣａイオンが周囲組織に接触するため、カルシウムの細胞毒性の問題もある。これに対して、本発明の組成物は、溶液状であるから、いずれの形状の適用部位へも容易に適用することができるし、適用部位の全体を本組成物で覆うことができ、周囲組織への密着性も良い。本発明の組成物の周囲組織に接触する部分は、カルシウム濃度を低く保つことが可能であり、カルシウムの細胞毒性の問題も少ない。本発明の組成物の周囲組織に接触する部分は、架橋剤の影響が少ないから、本発明の組成物は、容易に適用部位の細胞や組織にコンタクトできる。好ましくは、本発明の組成物は、髄核部位に適用した後、約４週間も経過すれば、適用した部位において識別できなくなるほど生体の組織と融合し、生体への親和性も高い。

　本発明の組成物を髄核部位に適用する際に、架橋剤により一部分をゲル化させると、本発明の組成物は患部で一部分が硬化し、周囲組織に密着した状態で局在し、髄核部位からの漏出を防ぐことができる。加えて、本発明の組成物が周囲組織に密着することにより、本発明の組成物の髄核再生効果がより強力に発揮される。

　髄核部位へ充填した補填材全体をゲル化させ硬化させた場合には、椎間板に頭尾側から圧縮力をかけると椎間板表面の組成物充填口から硬化ゲルが逸脱する現象がみられたのに対し、本発明の溶液状の組成物を髄核部位に充填した場合には、頭尾側から圧縮力をかけた場合にも椎間板表面の充填口からの逸脱はない。すなわち、実際に本発明の組成物により髄核補填を行った場合、椎間板に対する上下からの圧力に対しても、補填した組成物が漏れ出る恐れが低いといえる。

　また、硬化したゲルを髄核部位へ充填する場合には、硬化したゲルが脊柱管内に突出し、重大な神経障害を引き起こす危険性がある。一方、本発明の溶液状の組成物は、そのような危険性は低く、合併症発症の危険が低い。

本発明の一態様では、細胞を包埋する担体を硬化せず用いてもよい。臨床症状や損傷部の大きさ・形状に合わせて、架橋剤を用いずに適用することもできる。

１１．本発明の組成物の適用
　本発明の組成物は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）の椎間板の髄核部位に適用し、髄核の再生を促進するために用いられる。

　本発明の組成物の形態は、好ましくは流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。本発明において「流動性を有する」とは、その形態を不定形に変化させる性質を持つことを意味し、例えば溶液のように、常に流れ動く性質を持つことを必要としない。好ましくは、例えば、組成物をシリンジなどに封入し、椎間板の髄核部位へ注入することができるような流動性を有することが望ましい。また、本発明のいくつかの態様の１つでは、組成物を２０℃で１時間静置した後に、１４Ｇ~２６Ｇの注射針をつけたシリンジで椎間板の髄核部位へ注入できるような流動性を有することが望ましく、さらに好ましくは２１Ｇの注射針で注入できることが望ましい。本発明の組成物が凍結乾燥体などの乾燥状態で提供される場合には、適用時に溶媒などを用いて上述のような流動性のある組成物とすることができる。

　溶液状である本発明の組成物は、シリンジ、ゲル用ピペット、専用注射器、専用注入器、充填器具などで椎間板の髄核部位に容易に適用することができる。
本発明の組成物の粘度が高い場合には、シリンジで適用するのが困難になるため、加圧型や電動型などのシリンジを用いてもよい。シリンジなどを使用しなくても、例えば、へら、棒などで髄核部位の欠損部へ適用してもよい。シリンジで注入する場合、例えば、１４Ｇ~２７Ｇまたは１４Ｇ~２６Ｇの針を使用するのが好ましい。

　本発明の組成物の髄核部位への適用方法は、特に限定されないが、好ましくは、公知の外科的手法により患部を直視下に露出した後に、あるいは、顕微鏡下又は内視鏡下で、シリンジ、充填器具等を用いて、本発明の組成物を髄核部位に適用することができる。好ましい態様の一つでは、例えば、線維輪表面から髄核部位へ向かって充填器具の針などを挿入し、本発明の組成物を適用してもよい。

　本発明の組成物は溶液状であるため、髄核の縮小、髄核部位の空洞や欠損部など、いずれの形状の髄核部位にも適合することができ、髄核の縮小、空洞または欠損部の全体を充填することもできる。髄核の縮小、髄核部位の空洞や欠損部は、椎間板の変性または損傷により生じたものであり得るし、あるいは、外科的手術で髄核の少なくとも一部を除去または吸引することにより生じたものでもあり得る。好ましくは、髄核の少なくとも一部を除去することで形成した髄核欠損部に、本発明の組成物を適用することが望ましい。

　髄核の少なくとも一部の除去は、特に限定されず、例えば、直視下、経皮的、顕微鏡視下、又は内視鏡的に行われる椎間板髄核摘出術等であってもよい。また例えば、背中に２ｃｍ~１０ｃｍの切開を加え、筋肉を椎弓という脊椎の後方要素後面から剥離し、椎弓間の靭帯を切除し、神経と椎間板ヘルニアを確認し、神経を圧迫しているヘルニアを摘出する方法（ラブ法）であってもよい。また、髄核にレーザーを照射し、髄核の容量を減少させる方法であってもよい。

　本発明の組成物の髄核部位への適用後は、前術のとおり、架橋剤により組成物の一部を硬化させることができる。
　本発明の組成物の適用量は、適用する対象の髄核の適用部位の容積に応じて決めれば良く、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｌ~１０ｍｌ、より好ましくは、０．１ｍｌ~５ｍｌであり、さらに好ましくは０．２ｍｌ~３ｍｌである。本発明の組成物を髄核欠損部に適用する場合は、髄核部位の欠損部容積を十分に満たすように注入されるのが望ましい。

　本発明の組成物の適用回数・頻度は、症状と効果に応じて増減可能である。例えば、１回のみの適用であってもよいし、１月~１年に１回の適用を継続して行ってもよい。
アルギン酸は動物の体内に元来存在しない物質であるため、動物はアルギン酸を特異的に分解する酵素を保有していない。アルギン酸は動物体内においては、通常の加水分解により徐々に分解されるが、ヒアルロン酸等のポリマーに比べ体内の分解が緩やかであり、また髄核内には血管が存在しないため、髄核内に充填した場合、長期間の効果持続が期待できる。

　本発明の組成物が、前述のような細胞や成長因子とともに提供されない場合でも、本発明の組成物が髄核部位へ適用される際に、前述の細胞や成長因子、細胞死抑制因子、後述の他の薬剤などが併用して用いられてもよい。
　本発明の組成物は、髄核部位へ適用することにより、椎間板組織全体及び髄核の変性変化を抑制し、再生を促進する効果を発揮する。そのため、本発明の組成物は、椎間板の髄核補填用組成物として好ましく用いられる。

　本発明の組成物の好ましい態様の１つは、椎間板の変性抑制のための組成物、より好ましくは、椎間板髄核の変性抑制のための組成物である。「椎間板又は髄核の変性」とは、加齢などにより椎間板の細胞数、水分含有量、細胞外マトリックス（タイプＩＩコラーゲン、アグリカン等）等が低下して形態的な変化が生じ、機能低下をきたす状態をいい、進行すると椎間板のショック吸収体としての機能が果たせなくなる。本明細書において「変性の抑制」は、未処置の場合と比較して、変性変化が抑制されていればよく、必ずしも変性のない状態にすることを意味するものではない。

　本発明の組成物の態様の１つは、髄核再生のための組成物である。髄核再生とは、線維芽様細胞の集積を防ぎ、髄核細胞の比率が高い髄核が再生されることを目的とするものであり、ＩＩ型コラーゲンやプロテオグリカンに富む髄核組織が再生されることを意図するものである。この髄核再生の語には、髄核の変性を抑制することも包含される。本発明の好ましい態様のひとつは、本発明の組成物を適用して再生された髄核の組成が、天然の正常な髄核の組成に近いことが望ましい。

　また、本発明の好ましい態様の組成物は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のために用いられる。本明細書において「治療、予防または再発抑制」は、治療、予防、再発抑制、低減、抑制、改善、除去、発症率の減少、発症時期の遅延、進行抑制、重症度の軽減、再発率の低下、再発時期の遅延、臨床症状の緩和等を含む。本明細書において「治療、予防または再発抑制」は、（慢性的な）疼痛の緩和を含む。本発明の組成物の好ましい態様、特に細胞を包埋する担体を硬化せずに用いる場合は、椎間板変性および／または椎間板損傷に伴う（慢性的な）疼痛（特に腰痛）を抑制するために用いられる。

　これらの本発明の組成物の好ましい態様、組成物の使用方法等は、前記の記載に従う。
　椎間板変性および／または椎間板損傷は、例えば、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、椎間板損傷、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症ともいう）からなる群から選択される少なくとも１種の状態または疾患である。椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、腰痛を伴うものであってもよい。
本発明の組成物は、臨床症状や損傷部の大きさ・形状に合わせて、細胞を包埋する担体を硬化せず用いてもよく、そのような態様において、椎間板変性および／または椎間板損傷に伴う疼痛、特に慢性的な腰痛を抑制するために用いられる。

１２．治療方法
　本発明は、前記本発明の組成物を用いる、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法を提供する。好ましくは、本発明の治療方法は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した前記組成物の一部分を硬化することを含む。

　本発明の治療方法は、本発明の組成物を髄核部位へ適用する前に、髄核の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。
　前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、例えば、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種の状態または疾患である。本発明のいくつかの態様の治療方法では、前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、椎間板ヘルニアであり、特には、腰椎椎間板ヘルニアである。本発明のいくつかの態様の治療方法では、前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症ともいう）である。椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛であってもよい。椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、これらの状態または疾患の組み合わせであってもよい。

　また、本発明のいくつかの態様の１つでは、前記本発明の組成物を用いる、椎間板の変性変化を抑制する方法を提供する。また、本発明の好ましい態様の１つでは、前記本発明の組成物を用いる、椎間板の髄核を再生する方法を提供する。
　これらの方法は、間葉系幹細胞及び低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、椎間板変性抑制または髄核再生を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化することを含む。前記の方法は、本発明の組成物を髄核部位へ適用する前に、髄核の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。

　本発明の組成物の好ましい態様、具体的な椎間板の髄核部位への適用方法、組成物の硬化方法、用語の意義等は、前述のとおりである。他の椎間板の治療方法や治療薬を適宜組み合せて本発明の治療方法を行ってもよい。

　また、髄核部位に本発明の組成物を適用する前に、あるいは同時に、あるいは後で、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬、タンパク分解酵素、副腎皮質ステロイド薬、シンバスタチン、ロバスタチン等のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤等の併用薬を充填するようにしても良い。これらの薬剤は本発明の組成物に混入して用いてもよい。または、経口あるいは非経口で併用して投与されてもよい。その他、筋弛緩薬、オピオイド鎮痛薬、神経性疼痛緩和薬等が必要に応じて経口あるいは非経口で併用して投与されてもよい。

　本発明は、本発明の組成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の使用にも関する。
　本発明の使用は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための組成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の使用であって、前記組成物が、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する。

　本発明は、さらに、間葉系幹細胞及び低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化する、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制において使用されるための低エンドトキシンアルギン酸の１価の金属塩を提供する。

１３．本発明の組成物の評価
　本発明の組成物は、発明者らが新たに確立したヒツジ重度椎間板変性モデルを用いて評価することができる。重度椎間板変性モデルは、（ａ）１回目の手術において、ヒツジ椎間板からヒツジ体重の０．００００４％~０．００００５％に相当する量の髄核組織を除去し、変性椎間板を作製すること、および（ｂ）１回目の手術の４週間後に、（ａ）で作製した変性椎間板からさらにヒツジ体重の０．０００１４％~０．０００１７５％に相当する量の髄核組織を除去することで、重度椎間板変性ヒツジモデルを作製することができる。

好ましい態様では、体重４０~５０ｋｇのヒツジに対して、（ａ）１回目の手術において、ヒツジ椎間板から２０ｍｇの髄核組織を除去し、変性椎間板を作製すること、および（ｂ）１回目の手術の４週間後に、（ａ）で作製した変性椎間板からさらに７０ｍｇの髄核組織を除去することで、重度椎間板変性ヒツジモデルを作製することができる。
本発明の組成物は、下記の（ａ）~（ｄ）の手順で評価することができる。（ａ）１回目の手術において、ヒツジ椎間板から２０ｍｇの髄核組織を除去し、変性椎間板を作製すること、（ｂ）２回目の手術として、１回目の手術の４週間後に、（ａ）で作製した変性椎間板からさらに７０ｍｇの髄核組織を除去することで重度椎間板変性ヒツジモデルを作製すること（ｃ）２回目の手術の後、生じた空隙に対象の組成物を投与すること、および（ｄ）組成物の投与後に、変性モデルから採取した椎体及び椎間板に対してＭＲＩ、組織染色、免疫組織染色（ＩＨＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの評価方法にて、椎間板の再生を評価する。

従前の大型動物モデルでは、正常椎間板を部分摘出することで椎間板変性モデルを作製していたため椎間板が自然治癒する可能性があった。しかし、既に変性した椎間板を部分摘出するこの動物モデルによって、ヒトの変性椎間板に対する本実施例の効果をより正確に評価することができる。

　実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］

　ウサギ椎間板障害モデルにおける椎間板障害治療試験
　本実施例では、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）と生体吸収性超精製アルギン酸塩（低エンドトキシン高純度アルギン酸塩、ＵＰＡＬともいう）ゲルとを含む組成物を用いて、椎間板（ＩＶＤ）を切除した後の変性ＩＶＤに対するＢＭＳＣの移植の再生効果を試験した。
１．材料及び方法
１．１．動物実験
　すべての動物に対する処置は、北海道大学の動物管理使用委員会（承認番号：１３−００５１）によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施した。オスの日本白色ウサギ（２０週齢、３．２~３．５ｋｇ）は、三共ラボサービス株式会社（東京、日本）から入手した。

１．２．ウサギ髄核細胞（ＮＰＣ）の調製
　髄核（ＮＰ）試料は、４匹のウサギを、静脈内ペントバルビタール過剰投与を介して安楽死させた後、腰部ＩＶＤ（Ｌ１／２からＬ５／６まで；全部で２０のＩＶＤ）から得た。ＮＰＣを髄核（ＮＰ）組織から単離し、既報の方法で培養した［２，５，７，８］。具体的には、無菌条件下で、ゼラチン状ＮＰ組織を、マイクロ鉗子を用いて線維輪（ＡＦ）から分離した。組織標本は、１０％ウシ胎仔血清（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１．２５ｍｇ／ｍｌファンギゾン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）をダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有する培養培地に入れた。外因性成長因子は使用しなかった。試料を、０．２５％コラゲナーゼを補充した培地（和光純薬工業、大阪、日本）に再懸濁し、振盪インキュベーター中、３７℃、２０％　Ｏ_２及び５％　ＣＯ_２で４時間インキュベートし、酵素消化により単離した。ＮＰ組織から分離した細胞を培養皿中で増殖させ、加湿大気中、２０％　Ｏ_２及び５％　ＣＯ_２を含む３７℃で上記培地で培養した。培地は週２回交換し、ＮＰＣは継代２で使用した。

１．３．ウサギ同種ＢＭＳＣの調製
　ウサギ同種ＢＭＳＣとして、Ｃｙａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号：ＲＢＸＭＸ−０１，００１、ロット番号：１５１１１４Ｉ３１）から購入したＯｒｉＣｅｌｌ^ＴＭウサギ間葉系幹細胞を使用した。これらの細胞は、特徴、解凍後の生存性、細胞周期、未分化状態の検証、並びに骨形成、軟骨形成、及び脂肪形成系統に沿った多能性分化能について試験されている。ＢＭＳＣは製造業者の説明書に従って培養し、培地は週２回交換し、ＢＭＳＣを継代２で使用した。

１．４．ＵＰＡＬゲル及び三次元（３Ｄ）培養物の調製
　本実施例では、ＵＰＡＬゲル（Ｍｏｃｈｉｄａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を３Ｄ培養のためのアルギン酸塩足場として使用した［２］。ＵＰＡＬゲルの精製プロセスは、既報の通りである［２］。具体的には、海藻中のアルギン酸塩を、清澄化手順［２］によって水溶性アルギン酸ナトリウムに変換することによって抽出した。このアルギン酸塩溶液は、高粘性であったため大量の水で希釈した［２］。次に、抽出物を濾過して、繊維状残渣からアルギン酸ナトリウム溶液を分離した［２］。高品質のアルギン酸を単離するため、この溶液に酸を添加した［２］。

　リン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業）及び１０２ｍＭ　ＣａＣｌ_２に溶解した２％（ｗ／ｖ）ＵＰＡＬ液をゲル化用に調製した。３Ｄ培養前に、最終濃度２０ｍＭの５，６カボキシフルオレセインジアクテートコハク酸イミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ；ＣＦＤＡ−ＳＥ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ；ＢＩＯ　ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造業者の説明書に従ってＢＭＳＣを蛍光標識した［９］。続いて、標識ＢＭＳＣ及び非標識ＮＰＣを、１：１（それぞれ１×１０^６細胞／ｍｌ）［１，１０］の比率でＵＰＡＬ液中に包埋し、２×１０^６細胞／ｍｌの最終細胞濃度を得た［９，１０］。ＵＰＡＬ／細胞混合物は、ゲル化のため、１０２ｍＭ　ＣａＣｌ_２に２２ゲージ針を通して入れた。ゲルビーズは、低酸素条件（５％　Ｏ_２及び５％　ＣＯ_２）下で７日間、上記培地で培養した［１０］。さらに、ＮＰＣ及びＢＭＳＣを、１×１０^６細胞／ｍｌの細胞濃度でＵＰＡＬ液中に別々に包埋した。細胞濃度は、各群において異なる総細胞数を用いて効果を比較する既報の例［１１］に基づいて設定した。ゲル化後、ゲルビーズを前記と同様に低酸素条件下で培養した。実験群は以下の通りである：（ａ）ＮＰＣ単培養；（ｂ）ＢＭＳＣ単培養；及び（ｃ）ＮＰＣ＋ＢＭＳＣ共培養。

　培養０日及び７日後に、全てのゲルビーズを、既報の方法［８］に従いゲル及び細胞が分離されるまで５５ｍＭクエン酸ナトリウムに溶解した。ＮＰＣ＋ＢＭＳＣ共培養群では、回収した細胞を、Ｄｉｖａソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ７．０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を有するＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩＩ　Ｈｉｇｈ　ｓｐｅｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒを使用して選別した［１，１２］。死細胞及び残渣を除去し、５３０ｎｍで蛍光を発する細胞をＢＭＳＣとして同定し、非蛍光細胞をＮＰＣとして同定した。

１．５．ＲＮＡ抽出及びリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
　回収したＮＰＣ及びＢＭＳＣを１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ^（ＴＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）に溶解し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてサンプルから全ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ^ＴＭ遺伝子表現アッセイとカスタムＴａｑＭａｎ^ＴＭ遺伝子表現アッセイ（表１）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。各試料についてサイクル閾値（Ｃｔ）を得、２^−ΔＣｔ方法を用いて、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ値を基準とした各標的遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を計算した［１］。

１．６．ウサギ変性ＩＶＤモデルを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ試験
　Ｉｎ　ｖｉｖｏ試験には合計４８匹のウサギを用いた。サンプルサイズは、採用した２つの時点の各々について、以前の報告［２，７，８］に基づいて決定した。４８匹のウサギのうち３２匹を無作為に選択して、ＩＶＤ変性の定性分析（磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、組織学、免疫組織化学（ＩＨＣ））を行い、計８０のＩＶＤを、無傷対照（Ｉｎｔａｃｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ）群、穿刺（Ｐｕｎｃｔｕｒｅ）群（変性作成のための穿刺のみ）、椎間板切除（Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）群（変性ＩＶＤに対して空洞を作るための部分的椎間板切除）、ゲル群（変性ＩＶＤに対する部分的椎間板切除及びＵＰＡＬゲル埋植）、ＢＭＳＣ＋ゲル群（変性ＩＶＤに対する部分椎間板切除及びＢＭＳＣとＵＰＡＬゲルの埋植）に、無作為に割り付けた（各群８のＩＶＤ）。

４匹のウサギＮＰ組織の凍結切片を用いて、移植したＢＭＳＣの生存評価を行い、合計８匹のＩＶＤを、無傷対照群及びＢＭＳＣ＋ゲル群（１群あたり４匹のＩＶＤ）に無作為に割り当てた。残りの１２匹のウサギを用いて、ＨＩＦ−１ａ、ＧＬＵＴ−１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現評価を行った。これらのマーカーは、健康なヒトＮＰＣに発現する主要なマーカーとして提唱されている［１３］（ウサギＮＰ組織のパラフィン切片のＩＨＣを用いている）。計３６のＩＶＤを無作為に、無傷対照群、椎間板切除群、ＢＭＳＣ＋ゲル群（各群４のＩＶＤ）に割り付けた。

１．７．ＵＰＡＬ溶液中のＢＭＳＣ標識及び包埋
　Ｉｎ　ｖｉｖｏ実験において、移植細胞としてｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験と同様のＯｒｉＣｅｌｌ^ＴＭウサギ間葉系幹細胞を継代２で用いた。ＢＭＳＣは、移植前にＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、２％　ＵＰＡＬ液中に包埋し、１×１０^６細胞／ｍｌの最終細胞濃度に調製した［１４］。

１．８．ＩＶＤ変性の作成及び細胞移植
　２０週齢ウサギは、高齢のヒト集団の状態を模倣するのに十分に老化しておらず、均一な老化を有する高齢ウサギを得ることは困難である。そこで本実施例では、変性ＩＶＤを得るためにウサギ椎間板の線維輪（ＡＦ）穿刺モデルを使用した［８，１５，１６］。ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射により全身麻酔を行い、自発換気でセボフルラン（２~３％）と混合したＯ_２及び空気（３．０１／分）で麻酔維持した。ＩＶＤ変性は、Ｌ２／３及びＬ４／５　ＩＶＤで１８ゲージ針を使用するＡＦ穿刺によって作成した。Ｌ３／４　ＩＶＤは、対照として無処置とした。

　ＩＶＤ穿刺の４週間後、ＢＭＳＣを含有するＵＰＡＬ溶液を、Ｌ２／３及びＬ４／５の変性ＩＶＤの部位に移植した［８］。全身麻酔下に、前外側後腹膜アプローチで脊椎を露出させた。椎間板切除群、ゲル群、及びＢＭＳＣ＋ゲル群では、１８ゲージ針を穿刺して刺入口を作成した後、変性ＮＰ組織を１０ｍｌシリンジを用いて吸引し、残りのＮＰ組織をマイクロ鉗子（Ｎａｇａｓｈｉｍａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてＬ２／３及びＬ４／５　ＩＶＤ（ＩＶＤ当たり約１０~１２ｍｇ湿重量）で除去して、ＩＶＤ空洞を作製した。Ｌ３／４　ＩＶＤは、対照として無処置とした。

ゲル群では２７ゲージ針を装着したマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ＩＶＤ欠損を２０μｌの２％　ＵＰＡＬ溶液で満たし、ＢＭＳＣ＋ゲル群ではＩＶＤ欠損をＢＭＳＣを含有するＵＰＡＬ溶液で満たした。特に、２６ゲージ針が細胞生存率又は組織変性に影響を及ぼさないことが示されているので、２７ゲージ針を用いた［２，７，８，１７］。次に、１ｍＬの１０２ｍＭ　ＣａＣｌ_２をＵＰＡＬ液の上に散布してゲル化を誘導した。５分後、手術創を生理食塩水で洗浄し閉じた。穿刺群では偽手術を行った。ＩＶＤ変性の分析のために手術の４週後と１２週後、又はＮＰＣマーカーの発現評価のために、手術の１日後、７日後、及び２８日後に、ウサギを静脈内ペントバルビタール過量投与により屠殺した。ヒトＢＭＳＣがウサギＩＶＤに及ぼす効果を評価するため、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号：Ｃ−１２９７４、ロット番号：４１２Ｚ０２２．４）を用いて同様の埋植実験も行った。

１．９．移植されたＢＭＳＣ生存の評価
　埋植後４週目と１２週目に、ＣＦＤＡ−ＳＥ蛍光標識［１８，１９］に基づいて埋植ＢＭＳＣの生存確認した。ＩＶＤ（無傷対照群及びＢＭＳＣ＋ゲル群）を半分に水平切断し、液体窒素中で凍結し、５ｍｍスライスに切片化し、次いで対比染色として４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｐ３６９３５）で染色した。特に、ＤＡＰＩ陽性細胞は生存対死滅のＮＰＣ及びＢＭＳＣを特定できないため、移植ＢＭＳＣの生存率を定量することはできなかった。

１．１０．ＭＲＩ解析
　術後４週目と１２週目に、７．０−Ｔ　ＭＲスキャナー（Ｖａｒｉａｎ　Ｕｎｉｔｙ　Ｉｎｏｖａ；Ｖａｒｉａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＩＶＤのＴ２強調正中矢状断像を得た［２，８，１６］。Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類（グレード５は重度変性として分類した）を用いて、ＩＶＤ変性をグレード化した［２０］。ＭＲＩｉｎｄｅｘを算出するために、分析ソフトウェアバージョン１２．０（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ　Ｐａｒｋ，ＫＳ，ＵＳＡ）を用いて定量分析も行った。ＭＲＩｉｎｄｅｘ（ＮＰ面積と平均信号強度との積）をＮＰの変性の定量化に適用し、定量データは、未処置対照ＩＶＤで得られたＭＲＩｉｎｄｅｘ（相対ＭＲＩｉｎｄｅｘ）に対するパーセンテージとして表した［２，８，１６］。

１．１１．組織学的分析
　ＭＲＩ分析後、各ＩＶＤを組織学的染色のために処理した。プロテオグリカン発現を評価するため、正中矢状断切片（５ｍｍ厚）をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにサフラニンＯ−ファストグリーンによって染色した［８］。ＩＶＤの半定量分析を行い、０（正常）から５（高度変性）に等級分けした［２１，２２］。具体的には、この組織学的尺度はＡＦ構造の形態学的変化に焦点を当てている。

１．１２．ＩＨＣ分析
　術後４週目及び１２週目にＩ型及びＩＩ型コラーゲンを検出するために免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を行い［８］、術後１日目、７日目、２８日目にＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１及びＢｒａｃｈｙｕｒｙを検出した。Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン染色には、Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ２４５６，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６８３６）及びＩＩ型コラーゲン（Ｋｙｏｗａ　Ｐｈａｒｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ；Ｆ−５７）に対するマウスモノクローナル抗体を適用した。染色は、対比染色として３，３’−ジアミノベンジジン塩酸塩（Ｄａｋｏ）及びＭａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて展開した。ＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１、及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ染色については、ＨＩＦ−１αに対するＤｙＬｉｇｈｔ　５５０結合ウサギポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ，ＵＳＡ；ＮＢ１００−４７９Ｒ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１６４２２６７）、ＧＬＵＴ−１に対するＰＥ結合ウサギポリクローナル抗体（ＬＳ　Ｂｉｏ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ；ＬＳ−Ａ１０９３４２−１００）、及びＢｒａｃｈｙｕｒｙに対する非結合ウサギポリクローナル抗体（ＬＳ　Ｂｉｏ；ＬＳ−Ｃ３１１７９−１００，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿９１１１１８）を適用した。さらに、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４結合ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ３２７４０）をＢｒａｃｈｙｕｒｙの二次抗体として使用した。染色は、対比染色としてＤＡＰＩを用いて展開した。

　Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン、ＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１及びＢｒａｃｈｙｕｒｙの陽性細胞は、独立した無作為に選択した５視野で別々に計測した［２，８］。視野は、深い領域及び表面領域の両方を含むＮＰの幅に及ぶ。数値は、すべての評価項目における総細胞数に対する陽性細胞の割合で、また、ＮＰＣマーカー評価のためのＣＦＤＡ−ＳＥ陽性細胞数に対する割合で表される。すべての実験は、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン評価のために８個のＩＶＤ、及び各処置群からのＮＰＣマーカー評価のために４個のＩＶＤについて、それぞれの時点で行った。

１．１３．統計解析
　全てのデータは、平均±標準誤差（ＳＥ）として示される。多群比較についてはＯｎｅ−ｗａｙ分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を行った。２群比較についてはＰａｉｒｅｄ　ｔ検定を行った。すべての統計計算は、有意閾値ｐ＜０．０５で、ＪＭＰ　Ｐｒｏ−ｖｅｒｓｉｏｎ　１４．０統計ソフトウェア（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて行った。

２．結果
２．１．ＮＰＣ及びＢＭＳＣ共培養は、ＢＭＳＣのＮＰＣへの分化並びに成長因子及びＥＣＭの産生を促進する
　各細胞型に対するＮＰＣ及びＢＭＳＣ共培養の効果を調べるために、非標識ＮＰＣ及びＣＦＤＡ−ＳＥ標識ＢＭＳＣを、３Ｄ培養のためにＵＰＡＬゲル中に包埋した。本発明者は、共培養群において、細胞ソーターを用いて両方の細胞型を収集した。リン酸緩衝食塩水／細胞懸濁液分析は、前方散乱及び側方散乱を用いて行った。Ｐ１ゲートは２Ｄドットプロット（図１ａ）で描き、死細胞及び残渣を除外した。非標識ＮＰＣ及びＣＦＤＡ−ＳＥ標識ＢＭＳＣを、蛍光対側方散乱ドットプロットにおいて異なるゲートを用いて選別した（図１ｂ）。従って、Ｐ２ゲートを非標識細胞の上に設定し、Ｐ３ゲートをＣＦＤＡ−ＳＥ標識細胞の上に設定し、交差汚染を回避するために２つのゲートの間に間隙を設けた［１］。ゲル溶解及び細胞選別に続いて、（ａ）ＮＰＣ対照（ｄａｙ０）、（ｂ）ＮＰＣ単培養、（ｃ）ＮＰＣ共培養、（ｄ）ＢＭＳＣ対照（ｄａｙ０）、（ｅ）ＢＭＳＣ単培養、及び（ｆ）ＢＭＳＣ共培養の６つのタイプの細胞を得た。ＢＭＳＣ分化の解析については、６種類の細胞において、ＮＰＣマーカーとしてＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１及びＢｒａｃｈｙｕｒｙの遺伝子発現、成長因子としてＣＤＭＰ−１、ＴＧＦ−β及びＩＧＦ−１の遺伝子発現、そして細胞外マトリックス（ＥＣＭ）としてタイプＩＩコラーゲン及びアグリカンの遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。

　ＮＰＣ共培養におけるＨＩＦ−１αの遺伝子発現は、ＮＰＣ対照と比較して有意に増加し（ｐ＝０．０２１８、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、ＢＭＳＣ共培養ではＢＭＳＣ対照（ｐ＝０．００４１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）及び単培養（ｐ＝０．００４１、０．０１１６、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）と比較して有意に増加した（図１ｃ）。
　ＮＰＣ共培養におけるＧＬＵＴ−１の発現は、ＮＰＣ対照（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）及び単培養（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意な増加を示し、ＮＰＣ単培養では、ＮＰＣ対照（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意な増加を示した。ＢＭＳＣ共培養では、ＢＭＳＣ対照（ｐ＝０．０１８９、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）と比較してＧＬＵＴ−１発現の有意な増加を示した（図１ｄ）。これに対し、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの遺伝子発現は、３種類のＮＰＣ間で統計的有意差を示さなかった。さらに、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの遺伝子発現は、ＢＭＳＣ共培養においてのみ観察され、ＢＭＳＣ対照及び単培養のいずれにおいても観察されなかった（図１ｅ）。

　ＮＰＣ共培養におけるＣＤＭＰ−１、ＴＧＦ−β及びＩＧＦ−１の遺伝子発現は、ＮＰＣ対照（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．０００２、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）及び単培養（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．００８２、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加し、ＮＰＣ単培養における発現は、ＮＰＣ対照（ｐ＝０．０１７９、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．００７９、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加した。ＢＭＳＣ共培養における発現は、ＢＭＳＣ対照（ｐ＝０．００１１、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）及び単培養（ｐ＝０．００１５、ｐ＝０．０３８６、ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加した（図１ｆ−ｈ）。

　ＮＰＣ共培養及び単培養におけるＩＩ型コラーゲンの発現は、ＮＰＣ対照（ｐ＝０．００３６、ｐ＝０．００３５、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加し、ＢＭＳＣ共培養における発現は、ＢＭＳＣ対照（ｐ＝０．００４、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）及び単培養（ｐ＝０．０２２６、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加した（図１ｉ）。アグリカンについては、ＮＰＣ共培養における遺伝子発現は、ＮＰＣ対照（ｐ＝０．００４７、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）及び単培養（ｐ＝０．０３９２、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加し、単培養における発現はＮＰＣ対照（ｐ＝０．０２７４、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）と比較して有意に増加した。特に、アグリカンはＢＭＳＣ共培養でのみ発現されたが、ＢＭＳＣ対照又は単一培養では発現しなかった（図１ｊ）。

２．２．移植ＢＭＳＣの生存
　Ｉｎ　ｖｉｖｏ試験において、ＢＭＳＣ＋ゲル群ではＣＦＤＡ−ＳＥ標識ＢＭＳＣが観察されたが、術後４週目と１２週目では無傷対照群では観察されなかった（図２）。ヒトＢＭＳＣ群もＢＭＳＣ＋ゲル群（ウサギＢＭＳＣ）と同様の所見を示し、移植されたＢＭＳＣが移植後１２週目にＩＶＤで生存したことが確認された。切開すると、ゲルの押し出しは認められなかった。

２．３．ＢＭＳＣとＵＰＡＬゲルの併用は、変性ＩＶＤにおける椎間板切除後のＩＶＤ再生を促進する
　治療されたＩＶＤにおける変性変化をＭＲＩによって定性的に分析し、Ｔ２強調正中矢状断画像を捕捉した（図３ａ）。ＢＭＳＣ＋ゲル群におけるＰｆｉｒｒｍａｎｎグレードは、４週目に椎間板切除群より有意に低く（ｐ＝０．００３、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、１２週目に穿刺群と椎間板切除群で有意に低かった（ｐ＝０．０００９，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）。さらに、ゲル群の変性度も１２週目に椎間板切除群より有意に低かった（ｐ＝０．００２８、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）（図３ｂ）。ゲル群とＢＭＳＣ＋ゲル群との間に有意差は観察されなかった。ＢＭＳＣ＋ゲル群のＭＲＩｉｎｄｅｘは、４週で椎間板切除群（ｐ＝０．００８５、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）及び１２週での穿刺、椎間板切除及びゲル群（ｐ＝０．０００２，ｐ＜０．０００１，ｐ＝０~０２４８，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ試験）よりも有意に高かった。また、１２週後ではゲル群のｉｎｄｅｘが椎間板切除群よりも有意に高かった（ｐ＝０．００９２、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）（図３ｃ）。特に、ウサギＢＭＳＣ群とヒトＢＭＳＣ群との間では、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎグレード又はＭＲＩｉｎｄｅｘのいずれにおいても有意差は観察されなかった。

　組織学的変性度分類の前に、ＮＰ及びＡＦを含むＩＶＤの全体構造を評価し、群間で肉眼的な違いを観察した。ＩＶＤの組織学的評価の結果、無傷の対照標本は、内部ＡＦの構造的崩壊を伴わず、ＮＰ組織は典型的な楕円形を示した（図４ａ及びｂ）。椎間板切除群では、内側はＡＦが崩壊し、ＮＰ組織の線維性変化が４週目と１２週目の両方で観察された。しかしながら、ＢＭＳＣ＿＋ゲル群における内側ＡＦは、ＮＰ組織の線維性変化は最小に止まり、４週目と１２週目の両方の時点で良好に保存されているようであり、ゲル群における内側ＡＦもまた、比較的良好に保存されているようであった（図４ａ及びｂ）。ＢＭＳＣ＋ゲル群の組織学的変性スコアは、４週目及び１２週目ともに、穿刺群（ｐ＝０．０００６、ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、椎間板切除群（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、ゲル群（ｐ＝０．００，１３４、ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）よりも有意に低く、１２週目にゲル群の変性のスコアは椎間板切除群よりも有意に低かった（ｐ＝０．０００６、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）。また、ウサギＢＭＳＣ群とヒトＢＭＳＣ群との間に有意差は認められなかった。骨棘形成はいずれの群でも認められなかった。

２．４．ＢＭＳＣとＵＰＡＬゲルの併用は、変性したＩＶＤにおけるＥＣＭ産生を促進する
　次に、本発明者はＩＶＤにおけるＥＣＭ産生を評価した。特に、ＩＩ型コラーゲンはＩＶＤ機能に必要な必須成分であるが、ＩＶＤ変性過程ではＩ型コラーゲン合成の増加が観察される［２３］。ＩＩ型コラーゲン陽性細胞の割合は、ＢＭＳＣ＋ゲル群では４週目において穿刺群及び椎間板切除群に比べ有意に高く（ｐ＝０．０００１，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、１２週目において穿刺群、椎間板切除群及びゲル群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１，ｐ＜０．０００１，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）。また、ゲル群は、４週目において椎間板切除群と比較して有意に高い割合を示し（ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、１２週目において穿刺群及び椎間板切除群と比較して有意に高かった（ｐ＝０．０２３１，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）（図５）。

　一方、Ｉ型コラーゲン陽性細胞の割合は、４週目及び１２週目のいずれも、ＢＭＳＣ＋ゲル群は穿刺群（ｐ＜０．０００１，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、椎間板切除群（ｐ＜０．０００１，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、ゲル群（ｐ＜０．０００１，ｐ＜０．０００１，Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）より有意に低かった。また割合は、４週ではゲル群が椎間板切除群よりも有意に低く（ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）、１２週では穿刺群及び椎間板切除群よりも有意に低かった（ｐ＝０．０００７、ｐ＜０．０００１、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定）。ＩＨＣ分析による両評価において、ウサギＢＭＳＣ群とヒトＢＭＳＣ群との間に有意差は観察されなかった。

２．５．変性ＩＶＤにおける移植ＢＭＳＣのＮＰＣへの分化
　最後に、ＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ陽性細胞を経時的に観察し、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて移植ＢＭＳＣがＮＰＣに分化するメカニズムを検討した（図６ａ−ｃ）。無傷対照群では、ほとんどすべての細胞がすべての時点で３つのＮＰＣマーカーについて陽性であった。ＢＭＳＣ＋ゲル群ではＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ陽性細胞が１日目に低レベルで観察されたが、陽性細胞数は経時的に増加した。全細胞数に対する３種類のＮＰＣマーカー陽性細胞の割合は、１日目及び７日目と比較して２８日目で有意に高かった（ｐ＜０．０００１，ｐ＜０．０００１，Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。これに対し、椎間板切除群では、約２０％の細胞が全ての時点で陽性であった（図６ｄ−ｆ）。同様に、ＣＦＤＡ−ＳＥ陽性細胞数（移植ＢＭＳＣを表す）に対する３種類のＮＰＣマーカー陽性細胞の割合は、１日目及び７日目と比較して２８日目で有意に高かった（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）（図６ｇ−ｉ）。

３．考察
　ＩＶＤの再生能は著しく低いため、椎間板切除により生じた欠損は組織修復が不十分であり、さらなるＩＶＤ変性につながる可能性がある［２］。本実施例において、ＵＰＡＬゲル単独でも椎間板切除後と比較してＩＶＤ変性を抑制したが、ＢＭＳＣとＵＰＡＬゲルとを併用すると、ＩＶＤ再生を誘導するより強力な効果を発揮した。さらに、ヒトＢＭＳＣとウサギＢＭＳＣでは、ＩＶＤ再生は両群間で同等に観察された。いくつかの以前の研究においても、変性ＩＶＤにおける種々のＢＭＳＣの再生能力が実証されている［１８、２４、２５］。さらに、ＵＰＡＬゲルは、高い生体適合性及び十分な生体力学的特性を示し内因性修復治療戦略を支持するため［２］、変性ＩＶＤ部位にＢＭＳＣを移植した後のＩＶＤ再生及びさらなる変性予防のための最適な環境を提供する。

本実施例では、ＮＰＣマーカー、成長因子及びＥＣＭの遺伝子発現は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの各３Ｄ単培養と比較して、ＮＰＣとＢＭＳＣとの３Ｄ共培養で有意に増加した。これらの結果は、ＮＰＣとＢＭＳＣとの共培養がＮＰＣへのＢＭＳＣ分化を導き、その結果、ＮＰＣとＢＭＳＣとの間の相互活性を導き、両細胞型におけるＥＣＭ産生の増強をもたらすことを示す。このことは、ＮＰＣとＢＭＳＣとの共培養がＢＭＳＣを刺激してＮＰＣ様表現型に分化させることを示している他のいくつかのｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究の知見とも一致しており［１，１２，２６］、成長因子の産生［１，１１，２７］及びＥＣＭ合成のアップレギュレーションを介したＮＰＣとＢＭＳＣと間の相互活性化を支持する［１，５，１０，２６］。

さらに、埋植されたＢＭＳＣにおけるＮＰＣマーカーの発現の経時的増加、及び椎間板切除単独後の結果と比較してＥＣＭ産生の増強を示す同様の結果が、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験において観察された。我々の知る限りでは、アルギン酸塩及びＢＭＳＣをｉｎ　ｖｉｖｏで移植したときのＢＭＳＣがＮＰＣに分化する際のメカニズムを検討した報告はないが、ある研究において、アテロコラーゲンに埋め込まれた移植されたＭＳＣがＮＰＣに分化できることが実証された［２８］。具体的には、緑色蛍光タンパク質で標識した自家ＢＭＳＣを成熟ウサギＩＶＤに移植し、ＩＨＣ分析により移植細胞の分化を測定した。移植後４８週目に、移植ＢＭＳＣはＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１及びＭＭＰ−２が陽性であることが示され、これは、ＢＭＳＣがＮＰＣの代表的表現型の特徴のいくつかを発現する細胞に分化したことを意味する［２８］。

Ｉｎ　ｖｉｖｏ試験では、組織学的解析により、ゲル単独の移植は椎間板切除後と比較してＩＶＤ変性を予防すること、及びＢＭＳＣ＋ゲルの併用は変性の予防により強力な効果を発揮することがさらに示された。これは、ゲル単独では椎間板切除術と比較してＩＶＤの含水量を保存するが、ＢＭＳＣ＋ゲルの組み合わせでは含水量保存に対してより強力な効果をもたらすことを示唆するＭＲＩ所見と一致する。ＩＨＣの結果はさらに、ＢＭＳＣ＋ゲルの組み合わせは、変性ＮＰ組織におけるＥＣＭ合成を促進することを示唆し、これは適切なＩＶＤ機能に重要であり、Ｉ型コラーゲンの産生の低下を介する変性進行の予防につながる。さらに、穿刺群（椎間板切除を伴わない変性ＩＶＤ）と比較したＢＭＳＣ＋ゲルの組織学的結果は、ＢＭＳＣ移植がＩＶＤ再生につながることを示唆した。合わせて、これらの結果は、移植されたＢＭＳＣが経時的にＮＰＣに分化し、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＩＶＤ再生を生じることを示す。

ＡＦ再生に関しては、ゲル群及びＢＭＳＣ＋ゲル群は、ＮＰにおけるコラーゲンＩ産生を有意に減少させたが、ゲル及びＢＭＳＣ＋ゲルの充填で穿刺によるＡＦ欠損は修復された。ＩＶＤ変性はＮＰ細胞外マトリックスの分解によって特徴づけられるため［２］、本実施例では主にＮＰの保存／再生に焦点を当てた。

椎間板細胞治療においては、移植細胞の椎間板内での生着が得られず、注入部位から移植細胞が漏出するリスクが報告されており、その結果、骨棘が形成されるという報告もある［５，２９，３０］。従って、椎間板切除後のＢＭＳＣ移植の場合、細胞漏出を防止するために担体材料が必要である。本発明においては、ＢＭＳＣ＋ゲル群で骨棘形成は観察されなかった。ＵＰＡＬゲルとＢＭＳＣとを組み合わせて使用すると即時硬化性という重要な特徴を有し、その結果、細胞漏出を防ぐという点で臨床的に有用である。

本発明の結果と以前の報告［１，１１，１２，２６−２８］に基づき、本発明者は、ＩＶＤ再生のメカニズムは以下の通りであると考えた。
１）埋植されたＢＭＳＣは、ＵＰＡＬゲル中への包埋を介して、椎間板外へ漏れることなくＩＶＤの空洞内に局在化することができる。
２）埋植されたＢＭＳＣは、成長因子及びＥＣＭを産生し、既存のＮＰＣの活性化をもたらす。
３）活性化したＮＰＣはまた、成長因子及びＥＣＭの産生を増加させる。
４）その結果、埋植されたＢＭＳＣはＮＰＣに分化する。
５）さらに、ＢＭＳＣ及び既存のＮＰＣは互いに活性化し、ＩＶＤ再生を生じる（図７）。

今回のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験においてＢＭＳＣとＮＰＣが細胞融合していれば、細胞の分離が不可能であったと考えられるため、ＩＶＤ変性の主な作用機序を細胞結合作用が構成している可能性は低いと考える。また、ＢＭＳＣとＮＰＣはｉｎ　ｖｉｖｏで直接接触は認められなかった。従って、作用の基礎となるメカニズムは、成長因子及び／又はＢＭＳＣとＮＰＣとの間の相互作用を調節するいくつかの重要な液性因子に起因し得る。

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
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［２５］Ｏｍｌｏｒ　ＧＷ，Ｌｏｒｅｎｚ　Ｓ，Ｎｅｒｌｉｃｈ　ＡＧ，Ｇｕｅｈｒｉｎｇ　Ｔ，Ｒｉｃｈｔｅｒ　Ｗ．Ｄｉｓｃ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ．Ｅｕｒ　Ｓｐｉｎｅ　Ｊ　２０１８；２７（１０）：２６３９−４９．
［２６］Ｒｉｓｂｕｄ　ＭＶ，Ａｌｂｅｒｔ　ＴＪ，Ｇｕｔｔａｐａｌｌｉ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏｗａｒｄｓ　ａ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ−ｌｉｋｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ　Ｐａ　１９７６）２００４；２９（２３）：２６２７−３２．
［２７］Ｙａｎｇ　ＳＨ，Ｗｕ　ＣＣ，Ｓｈｉｈ　ＴＴ，Ｓｕｎ　ＹＨ，Ｌｉｎ　ＦＨ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐａｒａｃｒｉｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ　Ｐａ　１９７６）２００８；３３（１８）：１９５１−７．
［２８］Ｓａｋａｉ　Ｄ，Ｍｏｃｈｉｄａ　Ｊ，Ｉｗａｓｈｉｎａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｏ　ａ　ｒａｂｂｉｔ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｃ　ｍｏｄｅｌ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｄ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｄｉｓｃ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ　Ｐａ　１９７６）２００５；３０（２１）：２３７９−８７．
［２９］Ｌｉ　ＹＹ，Ｄｉａｏ　ＨＪ，Ｃｈｉｋ　ＴＫ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｔｏ　ｒａｂｂｉｔ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｃ：ｒｅｄｕｃｅｄ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　Ｐａｒｔ　Ａ　２０１４；２０（９　１０）：１３７９−９１．
［３０］Ｖａｄａｌａ　Ｇ，Ｓｏｗａ　Ｇ，Ｈｕｂｅｒｔ　Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ　ＬＧ，Ｄｅｎａｒｏ　Ｖ，Ｋａｎｇ　ＪＤ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ：ｃｅｌｌ　ｌｅａｋａｇｅ　ｍａｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　Ｒｅｇｅｎ　Ｍｅｄ　２０１２；６（５）：３４８−５５．
［３１］Ｄｏｍｉｎｉｃｉ　Ｍ，Ｌｅ　Ｂｌａｎｃ　Ｋ，Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｎｉｍａｌ　ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ　２００６；８（４）：３１５−７．
［３２］Ｒａｙｎａｕｄ　ＣＭ，Ｍａｌｅｋｉ　Ｍ，Ｌｉｓ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ　ａｎｄ　ｆｅｔａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｏｓｔｅｏａｃｔｉｖｉｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｔ　２０１２；２０１２：６５８３５６．
［３３］Ｓｅｒｉｇａｎｏ　Ｋ，Ｓａｋａｉ　Ｄ，Ｈｉｙａｍａ　Ａ，Ｔａｍｕｒａ　Ｆ，Ｔａｎａｋａ　Ｍ，Ｍｏｃｈｉｄａ　Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｃａｎｉｎｅ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ．Ｊ　Ｏｒｔｈｏｐ　Ｒｅｓ　２０１０；２８：１２６７−７５．
［実施例２］

　髄核細胞（ＮＰＣ）と高純度間葉系幹細胞（ＲＥＣ）の共培養（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）による遺伝子発現の変化
１．材料と方法
１．１．ヒトの健常椎間板髄核細胞（ＮＰＣ）
　ヒトの健常椎間板髄核細胞（ＮＰＣ）は、北海道大学病院における思春期特発性側弯症の若年患者（１５．３±３．３歳）の脊椎前方固定術の際に得られた細胞を用いた。

１．２．高度に均一性を有する高純度間葉系幹細胞の調製
（１）フローサイトメトリーによる前方散乱光（ＦＳＣ）のＣＶ値測定
　公知方法（ＷＯ２０１６／１７７９５）により予め調製しておいた複数のＲＥＣクローンを、フローサイトメトリーによる前方散乱光のＣＶ値測定に用いた。
　フローサイトメトリーにおけるＦＳＣは細胞の表面積又は大きさに比例する。本実施例では、ＦＳＣのＣＶ値を指標として細胞サイズのばらつきを評価した。
（ａ）個々のＲＥＣクローンに対してＰＩ染色を行い、ＰＩ陰性の生細胞集団にゲートを設定して、死細胞を解析の対象から除外した。
（ｂ）ＰＩ陰性の生細胞集団をＦＳＣ／ＳＳＣのサイトグラムで展開し、メインの細胞集団にゲート（Ｐ１）を設定して、ゴミやノイズを解析の対象から除外した。
（ｃ）Ｐ１ゲート内の細胞集団をＦＳＣのヒストグラムで展開し、マーカー（Ｍ１）を設定して、ＣＶ値を計測した。

（２）細胞増殖能及び脂肪分化能の評価
　細胞増殖能の評価のため、１ｘ１０^５個のＲＥＣ細胞を１００ｍｍ培養皿に播種して、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で５日間培養し、その後、セルカウンターを用いて細胞数及び平均細胞サイズを計測した。
　培養液は、ＦＢＳ、ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ、Ｈｅｐｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＤＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社）を用いた。
　また、脂肪分化能の評価のため、５ｘ１０^４個のＲＥＣ細胞を２４穴プレートに播種して、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２日間培養し、その後、脂肪分化誘導培地に置換して、さらに１４日間培養した。培養１４日後にオイルレッド０染色を行い、画像解析により脂肪滴面積を算出した。なお、脂肪分化誘導培地は、上記培養培地にＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、ＩＢＭＸを添加した培地を用いた。

（３）網羅的解析
　複数のＲＥＣクローンについて、ＦＳＣのＣＶ値、細胞増殖率（増殖能）、平均細胞サイズ、脂肪分化能を調べたところ、ＦＳＣのＣＶ値が低いＲＥＣクローン（ＣＶ＝３５％以下）は、増殖能、分化能が共に高く、平均細胞サイズが小さいことがわかった（平均細胞サイズ：２０μｍ以下）（図８）。

　一方で、ＦＳＣのＣＶ値が高いＲＥＣクローン（ＣＶ＝３５％以上）は、増殖能、分化能が共に低く、平均細胞サイズが大きいことがわかった。
　ＣＶ値３０％~３５％のクローンの平均増殖率は６．４であり、ＣＶ値２５％~３０％のクローンの平均増殖率は９．２、ＣＶ値２５％以下のクローンの平均増殖率は１５．１であった。また平均細胞サイズが１８μｍ~２０μｍのクローンの平均増殖率は７．０であり、平均細胞サイズが１６μｍ~１８μｍのクローンの平均増殖率は１２．７、平均細胞サイズが１６μｍ以下のクローンの平均増殖率は２１．３であった。
　以下、本実施例ではＦＳＣのＣＶ値が低いＲＥＣクローン（ＣＶ＝２５％以下）を使用した。

１．３．ＲＥＣを含むＵＰＡＬ組成物の調製
　ＮＰＣと蛍光標識された高純度間葉系細胞（ＲＥＣ）を各単独群と混合群に群分けし、超高純度アルギン酸（ＵＰＡＬ：持田製薬提供）の３次元ゲル中で共培養又は単独培養し、培養前（ｄａｙ０）と培養７日後に、３次元ゲルを溶解後、セルソーターで下記の細胞に分離した。
（ａ）ＮＰＣ対照群（ｄａｙ０）
（ｂ）ＮＰＣ単独培養群
（ｃ）ＮＰＣ共培養群
（ｄ）ＲＥＣ対照群（ｄａｙ０）
（ｅ）ＲＥＣ単独培養群
（ｆ）ＲＥＣ共培養群

上記６群の細胞につき定量的ＰＣＲ解析（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により下記の遺伝子発現を測定した。
髄核細胞のマーカー
　ＨＩＦ−１α
　ＧＬＵＴ−１
　Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ
成長因子
　ＣＤＭＰ−１
　ＴＧＦ−β
　ＩＧＦ−１
細胞外基質
　ＴｙｐｅＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ
　ａｇｇｒｅｃａｎ
遺伝子発現量の測定法は、実施例１に準じて行った。

２．結果
　ＲＥＣと髄核細胞を共培養すると、単独培養した場合と比較して分化指標（ＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１，Ｂｒａｃｈｒｕｒｙ）が髄核細胞、間葉系幹細胞の双方で上昇した（図９）。
　成長因子（ＣＤＭＰ−１，ＴＧＦβ、ＩＧＦ−１）、及び細胞外基質（ＴｙｐｅＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ａｇｇｒｅｃａｎ）についても同様であった。
　髄核細胞と高純度間葉系幹細胞は相互作用して活性化し、間葉系幹細胞は髄核細胞へと分化していくことが示唆される。
［実施例３］

　ヒツジ椎間板変性モデルにおける再生促進効果（ＭＲＩ解析）と組織学的解析
１．材料と方法
　７頭のヒツジ（４０−５０ｋｇ）はＧＬＰ準拠で施術した。
　椎間板Ｌ１／Ｌ２（第１腰椎と第２腰椎の間の椎間板）、椎間板Ｌ２／Ｌ３（第２腰椎と第３腰椎の間の椎間板）、椎間板Ｌ３／Ｌ４（第３腰椎と第４腰椎の間の椎間板）、および椎間板Ｌ４／Ｌ５（第４腰椎と第５腰椎の間の椎間板）を以下の４群に分けた。
　対照群（ｎ＝６）：無処置群
　Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群（ｎ＝６）：髄核組織の摘出のみ
　ゲル群（ｎ＝８）：髄核組織の摘出後、アルギン酸ゲルを埋植
　ＲＥＣ＋ゲル群（ｎ＝８）：髄核組織の摘出後、ＲＥＣとアルギン酸ゲルを埋植

　無処置群を除いて、各群の椎間板から２０ｍｇの髄核組織を麻酔下に摘出し、重度の椎間板変性を生じさせた。
　最初の髄核組織摘出から４週間後、さらに７０ｍｇの髄核組織を麻酔下に摘出し、椎間板内の空隙に、最終細胞濃度１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌ（１００μｌ）でＵＰＡＬに懸濁されたＲＥＣ（実施例２、１．２項で調製したＲＥＣ）を注入した。
　埋植手術の４週間後、ヒツジを安楽死させた。
　処置椎間板の変性定量評価目的に３テスラの磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて分析し、その後、椎間板はＨ＆Ｅ染色およびサフラニン−０染色による組織学的評価、また免疫組織化学的評価によるＴｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ発現の評価を行った。
　すべてのデータは平均±標準誤差で示し、各群間の差は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ　ｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔで検定した。

２．結果
　ヒツジ椎間板の患部にゲルおよびＲＥＣ＋ゲルを埋植後、４週間後にＭＲＩで椎間板変性を評価した結果、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類では無治療群（Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群）に比較してゲルおよびＲＥＣ＋ゲル群で有意に低く、またＭＲＩ　ｉｎｄｅｘでは無治療群（Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群）に比較してＲＥＣ＋ゲル群で有意に高かった（図１０）。組織染色による組織学的変性スコア（Ｂｏｏｓ分類）は無治療群（Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群）に比較してゲルおよびＲＥＣ＋ゲル群で有意に低く、またゲル群とＲＥＣ＋ゲル群の比較ではＲＥＣ＋ゲル群が有意に低かった（図１１）。免疫組織化学分析では、ＩＩ型コラーゲン陽性細胞の割合が無治療群（Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群）およびゲル群よりもＲＥＣ＋ゲル群で有意に高かった（図１２）。

　ＲＥＣを含むＵＰＡＬゲルを埋植すると、高度に変性したＩＶＤでは椎間板切除後のＩＶＤ変性を抑制し、ｔｙｐｅ　ＩＩコラーゲン陽性細胞はＲＥＣ＋ゲル群で有意に高かった。従って、ＵＰＡＬゲルを併用したＲＥＣは、自発的ＩＶＤ再生を促進することが示された。さらに、本発明者は、ＲＥＣとＵＰＡＬゲルとの併用が成長因子及びＥＣＭ産生とともに内因性ＮＰＣ活性化を促進し、ＮＰＣへの分化を促進し、ＩＶＤ再生を増強することを実証した。
［実施例４］

　本実施例では、重度のＩＶＤ変性を示すヒツジモデルにおいて、骨髄由来高純度間葉系幹細胞（ＲＥＣ）とＵＰＡＬゲルとの組み合わせが、椎間板切除後（２４週まで）ｉｎ　ｓｉｔｕでＩＶＤ再生を増強することを実証した。さらに、本実施例では、健康なヒトＮＰＣ及びＲＥＣを、ＵＰＡＬゲル中の３Ｄシステム中で共培養して、ＩＶＤ再生の基礎をなすメカニズムを評価した。またＮＰＣ及び市販のＢＭＳＣの共培養およびＮＰＣとＲＥＣ細胞の共培養を行い、ＮＰＣに対するＲＥＣ及び市販のＢＭＳＣの効果を比較した。本発明者らの知見は、変性ヒトＩＶＤにおけるヘルニアの治療のための、ＲＥＣとｉｎ　ｓｉｔｕ硬化性ゲルとの組み合わせの臨床応用性を示唆するものである。

１．材料及び方法
１．１．試験デザイン
　本実施例における試験デザインは、以下の内容で行った。
　（ｉ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトＮＰＣとＲＥＣの３Ｄ共培養を介したＩＶＤ再生のメカニズムの検討
　（ｉｉ）ＲＥＣ及び市販ヒトＢＭＳＣとＮＰＣとの３Ｄ共培養を介した、ＮＰＣに対するＲＥＣと市販ヒトＢＭＳＣの効果の比較
　（ｉｉｉ）ＵＰＡＬとＲＥＣ＋ＵＰＡＬゲルの力学特性の測定
　（ｉｖ）ｉｎ　ｖｉｖｏでの椎間板切除後の重度変性ＩＶＤの再生能力の評価
　（ｖ）移植ＩＶＤにおける腫瘍形成の評価

　本発明者らは、椎間板切除後にＵＰＡＬゲル中に包埋されたＲＥＣを移植することにより、自発的なＩＶＤ再生を促進すると仮定した。
　北海道大学大学院医学研究科の倫理委員会により、健康なヒトＩＶＤの使用が承認された。動物実験手順は、北海道大学及びＨａｍｒｉ株式会社（茨城県）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、これらの委員会によって推奨されるガイドラインに従って実施した。

　健康なヒトＮＰＣ及びＲＥＣを、ＵＰＡＬゲル中の３Ｄシステム中で共培養して、ＩＶＤ再生の基礎をなすメカニズムを評価した。培養０日後及び７日後に、ＮＰＣマーカー（ＨＩＦ‐１α、ＧＬＵＴ‐１、及びｂｒａｃｈｙｕｒｙを含む）、成長因子（ＣＤＭＰ‐１、ＴＧＦ‐β、及びＩＧＦ‐１を含む）、ならびにＥＣＭ成分（ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンを含む）の発現を、ｑＲＴ‐ＰＣＲ（ｎ＝４）を用いて全細胞タイプにおいて分析した（２，９，３０，３１）。さらに、ＮＰＣ及び市販のＢＭＳＣを共培養して、ＮＰＣに対するＲＥＣ及び市販のＢＭＳＣの効果を比較した。

　次に、非拘束圧縮試験を用いて、ＵＰＡＬ及びＲＥＣ＋ＵＰＡＬゲルの力学特性を評価した。円板状ゲルを０．５ｍｍ／分の一定速度で圧縮し、ヤング率を計算した（ｎ＝４）（３、１５、３２、３３）。動物実験では、ヒツジ１４頭（計５６回のＩＶＤ）を以下の４群に分類した。４週間の結果は実施例３にも記載している。
　無処置対照群（４週間、ｎ＝６；２４週間、ｎ＝６）：無処置群
　Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群（４週間、ｎ＝６；２４週間、ｎ＝６）：髄核組織の摘出のみ、椎間板切除群ともいう
　ゲル群（４週間、ｎ＝８；２４週間、ｎ＝８）：髄核組織の摘出後、アルギン酸ゲルを埋植
　ＲＥＣ＋ゲル群（４週間、ｎ＝８；２４週間、ｎ＝８）：髄核組織の摘出後、ＲＥＣとアルギン酸ゲルを埋植

　重度に変性したＩＶＤを作製するために、本発明者らは、処置したＩＶＤから２０ｍｇのＮＰ組織を除去した。本発明者らはさらに、最初の手術の４週間後に、変性ＩＶＤから７０ｍｇのＮＰ組織を除去した。予備実験では、ヒツジモデルにおいて２０ｍｇ以上のＮＰ組織を除去すると４週間後にＩＶＤ変性が生じたため、除去する組織の初期量を２０ｍｇに設定した（図１９）。第２回目の除去量は、以前のウサギモデルでの実験（２、３）による正常及び変性ＩＶＤの除去量の比に基づいて、７０ｍｇに設定した。２回目の椎間板切除後、ＵＰＡＬ又はＲＥＣとＵＰＡＬとの組み合わせを含有する溶液を椎間板内の空隙に移植した。ヒツジは、移植の４週後（実施例３）及び２４週後に安楽死させた。ＩＶＤ変性を評価するために、３．０−Ｔ　ＭＲＩ（２，３，１５，３７，３８）を用いてＩＶＤを定性的に分析した。その後、組織学的分析のためにＩＶＤをＨ＆Ｅ及びサフラニン−０で染色し、ＥＣＭ成分の分析のために、ＩＩ型及びＩ型コラーゲンのレベルをＩＨＣにより評価した。最後に、組織標本（２，３，１５）を用いて腫瘍形成解析を行った。

１．２．統計解析
　定量データのためのサンプルサイズは、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定を用いて、αレベル０．０５及び０．８のパワーでパワー分析によって決定した。統計解析はＪＭＰ　Ｐｒｏ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１４．０ソフトウェア（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて行い、値は、ｐ＜０．０５である場合に有意であるとみなした。全てのデータは、平均±ＳＤ値として示される。多群比較のために一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を行った。２群間比較にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定又はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定及びＷｅｌｃｈの検定を用いた。本発明者らは試料の無作為化を行い、試験される試料に対して盲検化した。

１．３．ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＲＥＣ及び市販ヒトＢＭＳＣとヒトＮＰＣの３Ｄ共培養
　ＲＥＣの調製
　本試験では、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリングから提供された凍結ＧＭＰ準拠ＲＥＣを使用した。ＲＥＣ及び市販のヒトＢＭＳＣの比較分析において、ＲＥＣの３つのクローン、すなわちＲＥＣ‐０２プロトタイプ＃００３‐Ｐ６‐１９１２２０、ＲＥＣ‐０２　ＨＬＷＦ‐１‐Ｐ６‐２１０１１４、及びＲＥＣ‐０２　ＱＲＫＦ‐１‐Ｐ６‐２１０２１０を継代６で調製した。細胞は、３Ｄ培養の前に３７℃の温浴中で解凍した。

　市販のヒトＢＭＳＣの調製
　市販のヒトＢＭＳＣ（ｈＭＳＣ−ＢＭ；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｃ−１２９７４、ロット番号：４１２Ｚ０２２．４）は、既報に従い入手した（２）。骨形成、軟骨形成及び脂肪生成系統に属するこれらの細胞の特性、解凍後の生存性、細胞周期、未分化状態、多分化能を試験した。ＢＭＳＣは、完全培養培地、すなわち、２０％　ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｃｙｔｉｖａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１．２５ｍｇ／ｍＬファンギゾン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１％　ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び０．１％　ｂＦＧＦ（Ｋａｋｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を補充した、Ｌ−グルタミン及びフェノールレッド（ＤＭＥＭ；ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（低グルコースレベル；２ｍｇ／ｍＬ）を用い、製造業者の指示書に従って培養した。培地は週に２回交換し、第４継代プロセスからのＢＭＳＣを使用した（合計６継代はＲＥＣと同様であった）。

　ＵＰＡＬゲル及び３Ｄ培養物の調製
　ＵＰＡＬゲル（Ｍｏｃｈｉｄａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、３Ｄ培養のためのアルギン酸塩足場として使用した（２，３）。
　リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）に溶解した２％（ｗ／ｖ）ＵＰＡＬ溶液を調製し、ＣａＣｌ_２溶液（１０２ｍＭ）を用いてゲル化した。ＲＥＣ又は市販のＢＭＳＣを、１×１０^６細胞／ｍＬ（２、３１、４９）の最終細胞濃度でＵＰＡＬ溶液と混合した。細胞−ＵＰＡＬ混合溶液を、ゲル化のために２２ゲージ針を使用して、１０２ｍＭ　ＣａＣｌ_２溶液中にピペットで入れた。ビーズ状に得られた２種類のゲルを、培地とともに加湿環境（２０％　Ｏ_２、５％　ＣＯ_２、３７℃）中で７日間培養した。培地は３日毎に交換した。３Ｄ培養の７日後に細胞を回収するために、既報の通り（２、３、３５）、５５ｍＭクエン酸ナトリウムを使用して溶解し、遠心分離（４℃で１０分間１１０×ｇ）した後、ゲルビーズから細胞を回収した。さらに、前述のように、正常条件下で７日間平面培養（２Ｄ培養）として調製したＲＥＣ及び市販のＢＭＳＣを対照群として使用した（すなわち、以下の４群を実験群として設定した：１）２Ｄ培養ＲＥＣ、２）３Ｄ培養ＲＥＣ、３）２Ｄ培養ＢＭＳＣ、及び４）３Ｄ培養ＢＭＳＣ）。

　細胞増殖能の解析
　２Ｄ又は３Ｄ培養の７日後、得られた４種類の細胞を二次培養のために再度播種した。細胞を集密状態となった段階で回収し、細胞数が倍加するのに必要な時間として定義される倍加時間（Ｔｄ）に基づいて細胞増殖能を評価した。Ｔｄは、以下の式を用いて計算した。
　Ｔｄ＝（ｔ２−ｔ１）×ｌｎ（２）／ｌｎ（Ｎ２／Ｎ１）
（ここで、Ｎ２及びＮ１は時間ｔ２及びｔ１におけるセル数である。）

　フローサイトメトリー解析
　ＰＢＳ（２％のＦＢＳを含む）を４つのタイプの細胞の各々に添加して、１×１０^６細胞／ｍＬの最終密度で細胞懸濁液を調製した。次いで、細胞を抗ＣＤ９０抗体（ＰＥ抗ヒトＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）及び抗ＣＤ４５抗体（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４５、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色した。また、陰性対照としてマウスＩｇＧ１抗体（マウスＩｇＧ１−ＰＥ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて染色を行った。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて死細胞を検出した。フローサイトメトリー分析は、ＣｙｔｏＦＬＥＸ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行い、細胞生存率ならびに各細胞表面抗原の均一性及び陽性を評価した。データの分析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用した。

　健康なヒトＮＰＣの調製
　北海道大学病院で思春期特発性側弯症のため脊椎前方固定術を受けた９人の患者（平均年齢±ＳＤ、１５．３±３．３歳）からヒトＮＰサンプルを得た。本研究に参加した参加者からインフォームドコンセントを取得し、同意書を作成し、保存した。サンプルは、外科手術の際に取得した。すべてのＩＶＤはＭＲＩを介して手術前に分析し、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類（３６）を用いて変性変化について評価した。全てのＩＶＤはグレード１に分類され、全てのサンプルが非変性ＩＶＤであることが示唆された。

　細胞をヒトＮＰサンプルから単離し、既報の通り培養した（２、３）。まず、各ゲル様ＮＰを解剖顕微鏡下でＡＦから分離し、組織標本を培地中に置いた。調製物を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、３分）により２回洗浄し、０．２５％コラゲナーゼを補った培地に再懸濁した。細胞単離のために、調製物を振盪インキュベーター中でインキュベートし（３７℃、４時間）、次いで遠心分離（１，０００ｒｐｍ、３分）を２回行った。マトリックスから分離した細胞を１０ｃｍの組織培養皿に入れ、上記と同様にインキュベートした。培地は週に２回交換し、第４継代からのＮＰＣを使用した。

　ＲＥＣ及び市販ヒトＢＭＳＣの調製
　上記ＲＥＣ（ＲＥＣ−０２＿プロトタイプ＃００３−Ｐ６−１９１２２０）及び市販のヒトＢＭＳＣもまた、３Ｄ共培養に使用した。２つのタイプの細胞を、上記２Ｄ培養と同じ方法により製造業者の指示に従って培養した。培地は週に２回交換した。第２継代由来の細胞（ＲＥＣ、合計８継代；ＢＭＳＣ、合計４継代）の両方を使用した。

　３Ｄ共培養と単培養
　本発明者らは２％　ＵＰＡＬ溶液を調製し、既報の通り（２、３）、ゲル化のためにＣａＣｌ_２溶液（１０２ｍＭ）を使用した。３Ｄ培養の前に、ＲＥＣ及びＢＭＳＣを、製造業者のマニュアル（２、１５、２９）を参照して、２０ｍＭ　ＣＦＤＡ−ＳＥ（ＣＦＤＡ−ＳＥ細胞増殖アッセイキット；ＢＩＯ　ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で蛍光標識した。その後、標識細胞及び非標識ＮＰＣをＵＰＡＬ溶液と同じ比率（各細胞１×１０^６細胞／ｍＬ）（２、３１、４９）で混合し、最終細胞濃度を２×１０^６細胞／ｍＬとした。細胞−ＵＰＡＬ混合溶液は、２２ゲージ針を用いて１０２ｍＭのＣａＣｌ_２溶液に入れてゲル化させた。得られたゲルを、低酸素条件（５％　Ｏ_２及び５％　ＣＯ_２）（２、４９）下で７日間培養した。さらに、３つのタイプの細胞を、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度でそれぞれ別々にＵＰＡＬ溶液中に混合した。細胞濃度は、既報の結果（２）に基づいて選択した。ゲル化後、ゲルビーズを低酸素条件下で上記と同じ方法で培養し、以下の実験群を使用した（１群あたりｎ＝４）。
　（ａ）単培養ＮＰＣ
　（ｂ）単培養ＢＭＳＣ
　（ｃ）単培養ＲＥＣ
　（ｄ）共培養ＮＰＣ＋ＢＭＳＣ
　（ｅ）共培養ＮＰＣ＋ＲＥＣ。

　培養初日及び７日後に、全てのゲルビーズを５５ｍＭクエン酸ナトリウムに溶解し、ゲルを細胞から分離させた。共培養群では、回収した細胞を、Ｄｉｖａソフトウェアバージョン７．０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用するＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩＩ　Ｈｉｇｈ　ｓｐｅｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒを使用して選別した（２，３１）。残渣及び死細胞を除去した後、５３０ｎｍの蛍光細胞をＲＥＣ及びＢＭＳＣとして選択し、非蛍光細胞をＮＰＣとして選択した。

　ＲＮＡ抽出とｑＲＴ−ＰＣＲ
　回収した１０種類の細胞タイプ（対照ＮＰＣ、単培養ＮＰＣ、市販のＢＭＳＣと共培養したＮＰＣ、ＲＥＣと共培養したＮＰＣ、対照ＢＭＳＣ、単培養ＢＭＳＣ、共培養ＢＭＳＣ、対照ＲＥＣ、単培養ＲＥＣ、及び共培養ＲＥＣ）を、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて試料から全ＲＮＡを抽出した。リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（表３）を用いて行った。各サンプルについてサイクル閾値（Ｃｔ）値を得た。さらに、各標的遺伝子、ＮＰＣマーカー、増殖因子、及びＥＣＭ成分の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを２−ΔＣｔ法（２）を介して計算した。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（２，３１）の発現量により標準化した。

１．４．非拘束圧縮試験を用いたゲルの弾性分析
　ＵＰＡＬ及びＲＥＣ−ＵＰＡＬゲルの力学特性を、非拘束圧縮試験を用いて評価した。直径４．５ｍｍ、厚さ２ｍｍの２種類の円盤状ゲルを作製した（図１４（ａ））。サンプルを引張−圧縮機械試験機（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ　ＡＧ−Ｘ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）に入れ、ゲルが潰れるまで、１００　Ｎロードセルを用いて０．５ｍｍ／分の一定速度で圧縮した（図１４、Ｂ及びＣ）（３、１５）。ヤング率は、得られた応力−歪曲線（図１４Ｄ）に基づき、圧縮値１０~２０％（ｎ＝４ゲル／群）の間の近似直線を用いて計算した（図１４Ｅ）（３、１５、３２、３３）。

１．５．変性ＩＶＤのヒツジモデルにおけるｉｎ　Ｖｉｖｏ試験
　本実施例では、ヒツジモデルを含む全ての手順を、医薬品ＧＬＰ適合実験室（Ｈａｍｒｉ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で行った（３）。１４頭の雄、サフォークヒツジ（２歳、体重４０~６０ｋｇ）を用い、ＩＶＤ変性の定性分析を行った（３）。全部で５６のＩＶＤを無作為に無処置対照（４週、ｎ＝６；２４週、ｎ＝６）、椎間板切除（４週、ｎ＝６；２４週、ｎ＝６）、ゲル（４週、ｎ＝８；２４週、ｎ＝８）、及びＲＥＣ＋ゲル（４週、ｎ＝８；２４週、ｎ＝８）群に割り当てた。まず、ＮＰ組織除去手術を行い、重度に変性したＩＶＤモデルを作成した。ケタミン（０．２ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）の４：１混合物を０．５ｍＬ／ｋｇの速度で筋肉内注射することによって麻酔誘導を行い、吸入麻酔（イソフルラン）によって麻酔の維持を達成した。手術は右側方後腹膜アプローチで行い、Ｌ１からＬ５までの椎体とＩＶＤを露出した。固形海綿質スクリュー（ＺＩＭＭＥＲ　ＢＩＯＭＥＴ，Ｗａｒｓａｗ，ＩＮ，ＵＳＡ）を、椎骨目印としてＬ２椎体に挿入した。椎間板切除群、ゲル群、ＲＥＣ＋ゲル群ではＡＦ切開（５×３ｍｍ）後にＮＰ組織２０ｍｇを摘出し、ＩＶＤ変性を惹起した（図１５，Ａ，Ｂ）（３，８）。

　変性したＮＰ組織の除去と移植
　初回手術から４週間後、同じアプローチを用いて椎体とＩＶＤを露出した。本発明者らはさらに、上記のように、ＡＦ切開後にＩＶＤ空洞を作製するために、３つの処置群から得られた変性ＩＶＤから７０ｍｇのＮＰ組織を抽出した（図１５Ｃ）。椎間板切除後、椎間板内の空隙にゲル群には２％　ＵＰＡＬ溶液１１０~１２０μＬを移植し、ＲＥＣ＋ゲル群には、ＲＥＣとＵＰＡＬ溶液との混合物（最終濃度、１×１０^６細胞／ｍＬ）１１０~１２０μＬを移植した（図１５Ｄ）（２）。直ちに１０２ｍＭのＣａＣｌ_２溶液を混合物の表面に注入し、５分後にゲル化を確認した。埋植４週及び２４週後に、ペントバルビタールを用いてヒツジを安楽死させ、腰部脊柱を一塊として摘出した（３）。

　ＭＲＩ
　３．０−Ｔ　ＭＲスキャナ（ＭＡＧＮＥＴＯＭ　Ｐｒｉｓｍａ；Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｔ２強調正中矢状切片画像を得た。処置されたＩＶＤのシグナル変化を評価するために、本発明者らは、５つのグレード（１：正常~５：高度に変性）を含むＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類（３６）を使用して、ＩＶＤ変性の程度をスコア化した。さらに、Ａｎａｌｙｚｅ　１４．０ソフトウェア（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ　Ｐａｒｋ，ＫＳ，ＵＳＡ）を使用して、ＭＲＩ指数値（ＮＰの平均シグナル強度とＮＰ面積との積）を測定し、ＮＰ組織の輝度を定量化した。さらに、３つの処置群（２、３、１５、３７、３８）のすべてにおいて、無処置対照群におけるＭＲＩインデックスの比率である相対的ＭＲＩインデックスを評価した。頭蓋側の隣接する椎体の高さに対する椎間板の高さの比であるＤＨＩも測定した（４、３９）。無処置対照群のＤＨＩのパーセンテージ値である相対ＤＨＩを決定した。

　組織学的分析
　ＭＲＩ撮影後、サンプルを１０％ホルムアルデヒド中で固定し、１０％　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で脱塩し、パラフィン中に包埋した。矢状５マイクロメートル厚のパラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、アルコールで処理し、水ですすぎ、Ｈ＆Ｅ及びサフラニン−０で染色した。ＩＶＤ変性の程度を、改変Ｂｏｏｓ’分類（３、４０、４１）を使用して、０（正常）から３６（高度に変性）までスコア化した。

　ＩＨＣ
　ＩＶＤ中のＩＩ型及びＩ型コラーゲンの発現は、ＩＨＣにより決定した。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、抗原活性化のために０．１％トリプシンで３０分間処理した。次いで、切片をメタノール中の３％　Ｈ_２Ｏ_２で１０分間処理し、続いて、タンパク質ブロック無血清溶液（ＤＡＫＯ，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して３０分間タンパク質のブロッキングを行った。ヤギ抗Ｉ型コラーゲン（１：４０；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を抗Ｉ型コラーゲン抗体と共に使用し、抗ｈＣＬ（ＩＩ）及び精製ＩｇＧ（１：４００；Ｋｙｏｗａ　Ｐｈａｒｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）を抗ＩＩ型コラーゲン抗体と共に一次抗体として使用した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＩＩ型コラーゲンのためのＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ標識ポリマー抗マウス（ＤＡＫＯ）、及びＩ型コラーゲンのためのＨｉｓｔｏｆｉｎｅ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｔａｉｎ　Ｍａｘ　ＰＯ（Ｇ）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を二次抗体として使用した。最後に、切片をＤＡＢ（ＤＡＫＯ）及びヘマトキシリンで染色した。ＩＩ型及びＩ型コラーゲン陽性細胞の数を、５つの無作為に選択した視野で決定し、全細胞における陽性細胞率を計算した（２、３、１５）。

　腫瘍形成分析
　移植ＩＶＤにおける移植細胞及び既存細胞の腫瘍形成を評価するために、（ｉ）浸潤性増殖、（ｉｉ）核分裂、（ｉｉｉ）二核細胞、及び（ｉｖ）核小体の評価を行った。
　２４週間の評価期間中、無処置対照及びＲＥＣ＋ゲル群におけるＨ＆Ｅ染色標本を使用して、陽性細胞の総数を、１５の無作為に選択された視覚化視野（４００倍の倍率で１５の視覚化視野；２６．５の視覚化視野、総計５ｍｍ^２）において決定し、平方ミリメートル当たりの数を計算した。

２．結果
２．１．ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＲＥＣ及び市販ヒトＢＭＳＣとヒトＮＰＣの３Ｄ共培養の結果
　ＲＥＣと市販のヒトＢＭＳＣとの比較
　ゲルに組み込む前後のＲＥＣ及び市販のヒトＢＭＳＣについての安定性確認の結果の詳細を表２及び３に示す。

　細胞の総数に対するＰＩ−未染色細胞の比率を、細胞生存率として定義した。ＲＥＣとＢＭＳＣとの間の比に有意差はなかった（ｐ＝０．６０８７、表２）。セル径に比例する前方散乱光の変動係数（ＣＶ）を計算し、セルサイズの均一性を評価した。％ＣＶ値は、ＢＭＳＣよりもＲＥＣにおいて有意に低かった（ｐ＝０．０３６６、表２）。細胞増殖能は、Ｔｄを計算することによって評価した。Ｔｄは、ＢＭＳＣよりもＲＥＣにおいて有意に短かった（ｐ＝０．００７４、表２）。細胞表面抗原確認試験は、ＣＤ９０陽性細胞の割合がＢＭＳＣよりもＲＥＣにおいて有意に高いことを示した（ｐ＝０．０００４）。群間でＣＤ４５陽性細胞に有意差は認められなかった（ｐ＝０．０９０７、表２）。

　本発明者らはさらに、１週間の培養後にＲＥＣ及び市販のＢＭＳＣを比較した（表３）。２Ｄ及び３Ｄ培養後のＴｄに関して、ＲＥＣとＢＭＳＣとの間に有意差はなかった（それぞれ、ｐ＝０．３３３９、ｐ＝０．６９９６）。しかしながら、ＣＤ９０陽性細胞率は、２Ｄ及び３Ｄ培養共に、ＢＭＳＣよりもＲＥＣで有意に高かった（それぞれ、ｐ＝０．００３９、ｐ＝０．０００７）。ＣＤ４５陽性細胞に関しては、その割合は２Ｄ培養後のＢＭＳＣよりＲＥＣで有意に低かった（ｐ＝０．００３８）。３Ｄ培養後のＲＥＣとＢＭＳＣの間に有意差はなかった（ｐ＝０．３２２１）。椎間板内移植後の細胞環境をｉｎ　ｖｉｔｒｏで模倣した状態であるアルギン酸塩との３Ｄ培養環境下において、ＲＥＣはＢＭＳＣに比べて間葉系幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現が維持されていたことから、ＲＥＣはアルギン酸塩環境下においても安定的に間葉系幹細胞の形質を維持していることを示している。

　データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。Ｐ値はスチューデントｔ検定により決定した。

　データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。Ｐ価値はスチューデントｔ検定により決定した。

　ＲＥＣとヒトＮＰ細胞（ＮＰＣ）との共培養
　本発明者らは、ＲＥＣとヒトＮＰＣとの共培養の効果、及び異なる細胞型である市販のヒトＢＭＳＣとヒトＮＰＣとの共培養の効果を検討し、両者を比較した。５，６−カボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）で標識したＲＥＣ又はＢＭＳＣ、及び非標識ＮＰＣを、ＵＰＡＬゲルに包埋し、３次元（３Ｄ）培養を行った（２，１５，２７）。７日間の培養後、ゲルを溶解し、細胞選別機を用いて残渣及び死細胞を除去した。次いで、細胞をＣＦＤＡ−ＳＥ陽性細胞、ＲＥＣ、ＢＭＳＣ、非標識細胞、及びＮＰＣに分類した。細胞選別後、以下の１０種類の細胞を得た。
　（ａ）対照ＮＰＣ（非培養）
　（ｂ）単培養ＮＰＣ
　（ｃ）市販のＢＭＳＣと共培養したＮＰＣ
　（ｄ）ＲＥＣと共培養したＮＰＣ
　（ｅ）対照ＢＭＳＣ（非培養）
　（ｆ）単培養ＢＭＳＣ
　（ｇ）共培養ＢＭＳＣ
　（ｈ）対照ＲＥＣ（非培養）
　（ｉ）単培養ＲＥＣ
　（ｊ）共培養ＲＥＣ

　ＢＭＳＣ及びＲＥＣの分化、細胞間相互作用、並びにＥＣＭ産生を分析するために、ＮＰＣマーカー（ＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１、ｂｒａｃｈｙｕｒｙを含む）、増殖因子（ＣＤＭＰ−１、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１を含む）及びＥＣＭ成分（ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンを含む）発現を、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定した（表４）（２、９、３０、３１）。

　ＲＥＣと共培養したＮＰＣにおいて、３つのＮＰＣマーカーであるＨＩＦ−１α、ＧＬＵＴ−１、及びｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現レベルは、対照ＮＰＣ、単一培養ＮＰＣ、及び市販ＢＭＳＣと共培養したＮＰＣにおける発現レベルよりも有意に高かった。ＧＬＵＴ−１発現レベルは、市販ＢＭＳＣと共培養したＮＰＣにおいて、対照ＮＰＣよりも有意に高かった（図１３、Ｄ~Ｆ）。ＣＤＭＰ−１及びＩＧＦ−１の発現レベルは、ＲＥＣと共培養したＮＰＣにおいて、対照ＮＰＣ、単一培養ＮＰＣ、及び市販ＢＭＳＣと共培養したＮＰＣと比較して有意に増加した。ＴＧＦ−β発現レベルは、ＲＥＣと共培養したＮＰＣにおいて、対照及び単一培養ＮＰＣにおける発現レベルと比較して有意に増加した。市販のＢＭＳＣと共培養したＮＰＣは、対照ＮＰＣ及び単培養ＮＰＣと比較して、ＣＤＭＰ−１及びＩＧＦ−１発現の有意な増加を示した（図１３、Ｇ~Ｉ）。ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンの発現レベルは、ＲＥＣと共培養したＮＰＣにおいて、対照及び単培養ＮＰＣよりも有意に高く、市販のＢＭＳＣと共培養したＮＰＣにおける発現レベルも、対照及び単培養ＮＰＣにおける発現レベルよりも有意に高かった（図１３、Ｊ及びＫ）。

共培養ＲＥＣにおける３つのＮＰＣマーカーすべての発現量は、対照及び単培養ＲＥＣに比べて有意に高かった（図１３、Ｄ~Ｆ）。ＣＤＭＰ−１、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１の発現量も、共培養ＲＥＣでは対照及び単培養ＲＥＣに比べて有意に増加していた（図１３、Ｇ~Ｉ）。同様に、ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンの発現レベルは、対照及び単培養ＲＥＣよりも共培養ＲＥＣにおいて有意に高かった（図１３、Ｊ及びＫ）。

２．２．非拘束圧縮試験を用いたゲルの弾性分析の結果
　ＵＰＡＬゲルに埋め込まれたＲＥＣの効果
　ＲＥＣ−ＵＰＡＬ及びＵＰＡＬゲルの力学特性を評価及び比較するために、非拘束圧縮試験を行った（３、１５、３２、３３）。２種類の円筒状ゲルサンプル（直径４．５ｍｍ、厚さ２ｍｍ）を調製し、軸圧縮応力対歪みの比（図１４、Ａ~Ｃ）を計算した。圧縮レベル１０~２０％で、ヤング率は、ＵＰＡＬ及びＲＥＣ−ＵＰＡＬゲルでそれぞれ１８．０±３．５ｋＰａ及び１８．８±２．１ｋＰａであり、２群間で力学特性に有意差はなかった（ｐ＝０．６９４２）（図１４、Ｄ及びＥ）。さらに、これらの２つの値は正常なヒトＮＰ組織の値（３、３２）と同等であった。

２．３．変性ＩＶＤのヒツジモデルにおけるｉｎ　Ｖｉｖｏ試験の結果
　ＲＥＣとＵＰＡＬゲルとの併用はＩＶＤ再生を高める
　ＩＶＤの再生能力は、ゲル、又はＲＥＣ＋ゲルの移植後のヒツジモデルで評価した（図１５）。ヒツジは、生体材料を含む椎間板切除後のＩＶＤ研究に広く使用されている（３、３４、３５）。１４頭のヒツジ由来の５６のＩＶＤを以下の群に分けた。
　無処置対照群（ｎ＝６　ＩＶＤ）
　Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群（椎間板切除群）（ｎ＝６　ＩＶＤ）
　ゲル群（ｎ＝８　ＩＶＤ）
　ＲＥＣ＋ゲル群（ｎ＝８　ＩＶＤ）

　ＩＶＤ変性モデルを作製するために、最初の手術中に２０ｍｇのＮＰ組織を除去し（図１５、Ａ及びＢ）、予備実験の結果に基づいて、除去すべき量を２０ｍｇに設定した（図１９）。最初の手術の４週間後（変性変化の観察後）に、ＮＰ組織を再び除去した（図１５Ｃ）。次いで、ＩＶＤ欠損にＵＰＡＬ又はＲＥＣ＋ＵＰＡＬ溶液を移植し、第２の椎間板切除後に１０２ｍＭのＣａＣｌ_２を曝露してゲル化させた（図１５Ｄ）。移植した腰椎を、移植の４週間後及び２４週間後に種々の分析のために採取した。

　治療されたＩＶＤにおける変性変化は、ＭＲＩを介して得られたＴ２強調中央矢状断面画像を用いて評価した（図１６Ａ）。ＩＶＤの形態学的分析のために、埋め込みＩＶＤ（２、３、１５、３６~３８）、及び椎間板高指数（ＤＨＩ）における信号の変化を評価するために、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎスコア及びＭＲＩ指数を評価した。Ｐｆｉｒｒｍａｎｎスコアに基づくと、ゲル群の変性スコアは２４週目でＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群よりも有意に低く、ＲＥＣ＋ゲル群の変性スコアは、４週目及び２４週目ともにＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群、ゲル群よりも有意に低かった（図１６Ｂ）。

　ＭＲＩ　ｉｎｄｅｘは、４週目でＲＥＣ＋ゲル群がＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群より有意に高値であった。２４週目では、Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群に比べゲル群のＭＲＩ　ｉｎｄｅｘが有意に高く、ＲＥＣ＋ゲル群はＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群、ゲル群に比べて有意に高かった（図１６Ｃ）。
　さらに、治療されたＩＶＤの椎間板高さを、ＭＲＩ画像を用いて測定した。椎間板の高さの、上部隣接椎体の高さに対する比、すなわちＤＨＩを、ＩＶＤの前方及び後方で測定した。次いで、相対ＤＨＩ、すなわち無処置対照群のＤＨＩ値に対する３つの処置群のＤＨＩ値の比を決定した（図２０）（４、３９）。３つの処置群のＤＨＩ値は、４週目及び２４週目の両方で、無処置対照群のＤＨＩ値よりも有意に低かった。埋植４週後では３群間に有意差はなかったが、埋植２４週後ではゲル群のＤＨＩはＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群より有意に高く、ＲＥＣ＋ゲル群はＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群、ゲル群より有意に高かった（図１６Ｄ）。

　組織学的分析は、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）及びサフラニン−０染色を用いて行った。無処置対照群における４週間及び２４週間の両方で、ＩＶＤは紡錘形を示し、ＮＰ組織における線維性変化はなく、線維輪（ＡＦ）は同心構造であり、サフラニン−０で均一に染色された。Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群では、顕著な瘢痕組織、線維性変化、組織欠損、終板の崩壊・破壊が認められ（図１７，Ａ，Ｂ）、ゲル群の改変Ｂｏｏｓ’分類（３，４０，４１）に基づいて判定した組織学的変性度は、４週、２４週ともにＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群より有意に低く、４週、２４週ともにＲＥＣ＋ゲル群がＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群、ゲル群より有意に低かった（図１７Ｃ）。

　治療したＩＶＤにおけるＩＩ型及びＩ型コラーゲンの発現レベルを免疫組織化学法（ＩＨＣ）により評価した（図１８、Ａ及びＢ）。無作為に選択された５つの視覚化視野における、細胞の総数におけるＩＩ型及びＩ型コラーゲン陽性細胞率を、ＮＰ組織において評価した（２、３、１５）。ＩＩ型コラーゲンはＮＰ組織における必須のＥＣＭ成分であり、変性の進行に伴い、Ｉ型コラーゲンによって置換される。ＩＩ型コラーゲンの分析では、ＮＰ組織が無処置対照群において均一に染色されたが、ＲＥＣ＋ゲル群においては、わずかに減少していた。ゲル群では非染色領域が点在することが観察され、Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群では広範な非染色領域が観察された。ＩＩ型コラーゲン陽性細胞の割合は、４週、２４週ともにＲＥＣ＋ゲル群がゲル群、Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群より有意に高く、２４週ではゲル群がＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群より有意に高かった（図１８Ｃ）。反対に、Ｉ型コラーゲン陽性細胞の割合は、４週間の評価期間においてＲＥＣ＋ゲル群がＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群より有意に低く、２４週間の評価期間においてＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群、ゲル群より有意に低かった。また、これらの細胞の割合は、２４週ではゲル群がＤｉｓｃｅｃｔｏｍｙ群に比べて有意に低かった（図１８Ｄ）。

　ＲＥＣ＋ゲル注入のＩＶＤに及ぼす影響
　２４週間の評価期間中、無処置対照とＲＥＣ＋ゲル群の組織学的標本で腫瘍形成を分析した。両群の全標本において、核分裂とともに浸潤性増殖を評価し、二核細胞数と平方ミリメートルあたりの核小体数を測定した。両群とも浸潤性増殖、核分裂像、核小体は認められなかった。無処置対照群及びＲＥＣ＋ゲル群の二核細胞数はそれぞれ０．０３±０．０７及び０．２３±０．２５であった。すなわち、値は＜１／ｍｍ２であり、群間に有意差は観察されなかった（ｐ＝０．３３１１）（表５）。

　データは平均値士標準偏差であり、Ｗｅｌｃｈ検定の後、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定によりＰ値を求めた。

３．考察
　本実施例では、細胞増殖能、細胞サイズ均一性、及び細胞表面抗原の発現に関して、市販品として入手可能なヒトＢＭＳＣと比較して、ＲＥＣの優れた特性が示された。さらに、本実施例は、ＮＰＣマーカー、成長因子、及びＥＣＭ成分の発現レベルに関し、市販のＢＭＳＣとのＮＰＣの３Ｄ共培養において観察される発現レベルと比較して、ヒトＮＰＣ及びＲＥＣの３Ｄ共培養において有意に増加したことを実証した。ＲＥＣとＵＰＡＬゲルとの併用の有効性は、ヒツジ腰椎モデルのＩＶＤ変性部位で観察された。ＵＰＡＬゲル単独では、椎間板切除群と比較してＩＶＤ変性を抑制したが、ＲＥＣとゲルとの併用はＩＶＤ再生をより効果的に増強した。

　本実施例において、ＲＥＣのＮＰＣとの共培養によりＲＥＣのＮＰＣへの分化をもたらし、それによって両方の細胞型におけるＥＣＭ成分産生を改善することが示唆された。ウサギにおける結果（実施例１）でも同様の結果が観察されている。すなわち、実施例１ではＵＰＡＬゲル中に包埋されたＢＭＳＣの移植後にＮＰＣマーカーの発現が増加したこと、及び椎間板切除群と比較して、ＢＭＳＣ＋ＵＰＡＬゲル群ではＥＣＭの産生が増加していたことが明らかになった（２）。

　上記結果及び以前の研究（２、３１、４７、４８、５０~５２）の結果に基づくと、ＵＰＡＬゲル中に包埋されたＲＥＣの移植によるＩＶＤ再生の基礎をなすメカニズムとして、以下の可能性が示唆された。
　１）ＲＥＣがゲルに包埋されてＩＶＤ欠損に移植され得る。
　２）ＲＥＣは成長因子及びＥＣＭ成分を産生し、それによって、既存のＮＰＣを活性化する（パラクリンメカニズム）。
　３）ＮＰＣはより多くのＥＣＭ及び成長因子を産生する。
　４）結果として、ＲＥＣはＮＰＣに直接分化する。
　５）最後に、ＲＥＣ及びＮＰＣはＩＶＤ再生をもたらす正の細胞間フィードバックループを有する。

　ＩＶＤ修復に使用される生体材料／ヒドロゲルは、生物学的及び機械的に適したものである必要がある。
　本実施例では、腰部ＩＶＤの生体力学と幾何学的配置がヒトのものと同等であることから（３，４，３４）、候補ヒドロゲルを前臨床動物モデルに移植するためのヒツジ腰椎モデルを選択した。本発明者らは、これまでに、椎間板切除後のヒツジ腰部ＩＶＤに埋め込んだＵＰＡＬゲルが適切な生体力学的特性を示し、材料の突出をもたらさず、椎間板切除後のＡＦの縫合を必要としないことを示した（３）。本実施例において、非拘束圧縮試験はＵＰＡＬ群とＲＥＣ−ＵＰＡＬ群との間のヤング率に有意差がないことを明らかにし、ＵＰＡＬゲルに埋め込まれたＲＥＣがゲルの力学特性を変化させなかったことを示した。迅速な治癒をもたらすその決定的な能力のために、ＵＰＡＬゲルとＲＥＣとの組み合わせは、ＡＦを縫合することなく細胞漏出を防ぐという点で臨床的利点を提供する。

　ＵＰＡＬゲルを移植した（及び移植しなかった）動物におけるＭＲＩ及び組織学的評価は、ＵＰＡＬゲル単独の移植後にＩＶＤ変性が抑制されたことを示す。さらに、ＲＥＣとＵＰＡＬゲルの組み合わせは、ＵＰＡＬゲル単独と比較し、さらに効果的に変性を防止した。また、無処置群とＲＥＣ＋ゲル群の間で二核細胞数に有意差はなく、ＲＥＣとゲルの組み合わせは腫瘍形成を誘導しないことが示唆された。さらに、ＩＨＣの結果は、ＲＥＣとゲルの併用が正常なＩＶＤの機能に必須であるＥＣＭ合成を増強し、Ｉ型コラーゲンの産生を抑制することによってＩＶＤ変性の進行を抑制したことを示唆する。これらの結果は、ＩＶＤ変性のウサギモデルを用いて得られた結果（実施例１）と一致し、ＵＰＡＬゲル中に包埋されたＢＭＳＣがより効果的に変性を抑制したことを実証した（２）。実施例１でも、ＡＦ針穿刺を介して変性したＩＶＤを作成した椎間板切除を受けなかった動物と比較して、ＢＭＳＣ＋ＵＰＡＬゲル移植後の変性の組織学的悪性度スコアが低いことが示された。これは、ＢＭＳＣ移植がＩＶＤ再生をもたらしたことを示唆する（２）。総合すると、本発明者らの知見は、ＵＰＡＬゲル中に包埋されたＲＥＣの移植がｉｎ　ｖｉｖｏでのＩＶＤ再生を増強することを示すものである（２）。

　実施例４における参照文献
１．Ｊ．Ｎ．Ｋａｔｚ，Ｌｕｍｂａｒ　ｄｉｓｃ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ａｎｄ　ｌｏｗ−ｂａｃｋ　ｐａｉｎ：Ｓｏｃｉｏｅｃｏｎｏｍｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８８，２１−２４（２００６）．
２．Ｄ．Ｕｋｅｂａ，Ｈ．Ｓｕｄｏ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ｕｒａ，Ｋ．Ｙａｍａｄａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｇｅｌ　ａｓ　ａ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ　ｆｏｒ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃｓ．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ　５３，１０２６９８（２０２０）．
３．Ｔ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｈ．Ｓｕｄｏ，Ｍ．Ｔｏｄｏｈ，Ｋ．Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｎ．Ｈｉｒｏｈａｍａ，Ｔ．Ｎｏｎｏｙａｍａ，Ｄ．Ｕｋｅｂａ，Ｋ．Ｕｒａ，Ｙ．Ｍ．Ｉｔｏ，Ｎ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ａｎ　ａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ　ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｇｅｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｒｅｐａｉｒ：Ａ　ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ　ｓｔｕｄｙ．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ　３７，５２１−５３４（２０１８）．
４．　Ｓ．Ｒ．Ｓｌｏａｎ　Ｊｒ，Ｃ．Ｗｉｐｐｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｋｉｒｎａｚ，Ｒ．Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｆ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｔ．Ｐａｎｎｅｌｌｉｎｉ，Ａ．Ｓｃｈｉａｖｉｎａｔｏ，Ｒ．Ｈａｒｔｌ，ｌ．Ｊ．Ｂｏｎａｓｓａｒ，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｎｕｌｕｓ　ｆｉｂｒｏｓｕｓ　ｒｅｐａｉｒ　ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ａｃｕｔｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１２，ｅａａｙ２３８０（２０２０）．
５．　Ｐ．Ｈｅｉｎｄｅｌ，Ａ．Ｔｕｃｈｍａｎ，Ｐ．Ｃ．Ｈｓｉｅｈ，Ｍ．Ｈ．Ｐｈａｍ，Ａ．Ｄ’Ｏｒｏ，Ｎ．Ｎ．Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｍ．Ｊａｋｏｉ，Ｒ．Ｈａｈ，Ｊ．Ｃ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｂｕｓｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｒｅｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｖｅｌ　ｌｕｍｂａｒ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ．Ｓｐｉｎｅ　４２，Ｅ４９６−Ｅ５０１（２０１７）．
６．Ｊ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｃａｕｔｈｅｎ，Ｄ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｂｕｒｎｓ，Ｎ．Ｌ．Ｒｅａｖｅｎ，Ｓ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｅｃｏｎｏｍｉｃ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｏｕｔｃｏｍｅｓ　ｏｆ　ｌｕｍｂａｒ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ．Ｓｐｉｎｅ　Ｊ．１０，１０８−１１６（２０１０）．
７．Ｐ．Ｋａｍｂｉｎ，Ｌ．Ｆ．Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｓｐｏｎｄｙｌｏｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｕｍｂａｒ　ｓｐｉｎｅ　ａｆｔｅｒ　ｐａｒｔｉａｌ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｌａｍｉｎｏｔｏｍｙ，ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ，ａｎｄ　ｐｏｓｔｅｒｏｌａｔｅｒａｌ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ．Ｓｐｉｎｅ　２０，５９９−６０７（１９９５）．
８．Ｄ．Ｏｅｈｍｅ，Ｐ．Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．Ｓｈｉｍｍｏｎ，Ｊ．Ｗｕ，Ｃ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｍ．Ｔｒｏｕｐｉｓ，Ｔ．Ｇｏｌｄｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｊ．Ｖ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｇ．Ｊｅｎｋｉｎ，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｎｔｏｓａｎ　ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ　ｍｅｄｉａｔｉｎｇ　ｄｉｓｃ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ：ａ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎ　ａｎ　ｏｖｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｓｐｉｎｅ　２０，６５７−６６９（２０１４）．
９．Ｓ．Ｍ．Ｎａｑｖｉ，Ｃ．Ｔ．Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ａｎｄ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ａｎｄ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ　Ａ　２１，２８８−９９（２０１５）．
１０．Ｄ．Ｃ．Ｎｏｒｉｅｇａ，Ｆ．Ａｒｄｕｒａ，Ｒ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒａｍａｊｏ，Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ−Ｆｅｒｒｅｒｏ，Ｉ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｌｉｔｅ，Ｂ．Ｔｏｒｉｂｉｏ，Ｍ．Ａｌｂｅｒｃａ，Ｖ．Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｍ．Ｍｏｒａｌｅｄａ，Ａ．Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｊ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｎｃｈｏ，Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｒｅｐａｉｒ　ｂｙ　ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌｓ：Ａ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｒｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　１０１，１９４５−１９５１（２０１７）．
１１．Ｒ．Ｄ．Ｂｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｈ．Ｇｅｂｈａｒｄ，Ｒ．Ｈａｒｔｌ，Ｌ．Ｊ．Ｂｏｎａｓｓａｒ，Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃｓ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｎｅｗ　ｍａｔｒｉｘ，ｍａｉｎｔａｉｎ　ｄｉｓｃ　ｈｅｉｇｈｔ，ａｎｄ　ｒｅｓｔｏｒｅ　ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｏｄｅｎｔ　ｓｐｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８，１３１０６−１３１１１（２０１１）．
１２．Ｐ．Ａ．Ｒｅｖｅｌｌ，Ｅ．Ｄａｍｉｅｎ，Ｌ．Ｄｉ　Ｓｉｌｖｉｏ，Ｎ．Ｇａｕｒａｖ，Ｃ．Ｌｏｎｇｉｎｏｔｔｉ，Ｌ．Ａｍｂｒｏｓｉｏ，Ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｉｇ　ｕｓｉｎｇ　ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．１８，３０３−３０８（２００７）．
１３．Ｉ．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｓ．Ｒ．Ｓｌｏａｎ，Ｃ．Ｗｉｐｐｌｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｍ．Ｚｕｂｋｏｖ，Ｅ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋｉｒｎａｚ，Ｌ．Ｊ．Ｂｏｎａｓｓａｒ，Ｒ．Ｈａｒｔｌ，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ　ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ　ｆｏｒ　ａｎｎｕｌａｒ　ｒｅｐａｉｒ：６−ｗｅｅｋ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｓｈｅｅｐ　ｍｏｄｅｌｓ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ　８５，Ｅ３５０−Ｅ３５９（２０１８）．
１４．Ｂ．Ｐｅｎｎｉｃｏｏｋｅ，Ｉ．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｃ．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．Ｓｌｏａｎ，Ｂ．Ｂｏｒｄｅ，Ｙ．Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｇ．Ｌａｎｇ，Ｒ．Ｎａｖａｒｒｏ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｊ．Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｌ．Ｊ．Ｂｏｎａｓｓａｒ，Ｒ．Ｈａｒｔｌ，Ａｎｎｕｌｕｓ　ｆｉｂｒｏｓｕｓ　ｒｅｐａｉｒ　ｕｓｉｎｇ　ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ：Ａｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｏｖｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ．Ｓｐｉｎｅ　４３，Ｅ２０８−Ｅ２１５（２０１８）．
１５．Ｄ．Ｕｋｅｂａ，Ｋ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ｕｒａ，Ｔ．Ｎｏｎｏｙａｍａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．Ｓｕｄｏ，Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ａｓｐｉｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ　ｇｅｌ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ．Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ．Ａｍ．１０３，ｅ３１（２０２１）．
１６．Ｋ．Ｕｒａ，Ｋ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｄ．Ｕｋｅｂａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．Ｓｕｄｏ，Ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｇｅｌ　ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｌｅｖｅｌｓ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ａｃｕｔｅ　ｐａｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．１１，６３８（２０２１）．
１７．Ａ．Ｊ．Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｕ．Ｆ．Ｄｅｒｉｇｌａｓｏｖａ，Ｎ．Ｎ．Ｋｕｌａｇｉｎａ，Ａ．Ｆ．Ｐａｎａｓｕｋ，Ｓ．Ｆ．Ｒｕｄａｋｏｗａ，Ｅ．Ａ．Ｌｕｒｉａ，Ｉ．Ａ．Ｒｕａｄｋｏｗ，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ　ｆｏｒ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｏｌｏｎｙ　ａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２，８３−９２（１９７４）．
１８．Ｙ．Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｓ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．Ｈａｒａｄａ，Ｋ．Ｎｉｉｂｅ，Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｆ．Ｒｅｎａｕｌｔ−Ｍｉｈａｒａ，Ｄ．Ｄ．Ｈｏｕｌｉｈａｎ，Ｃ．Ａｋａｚａｗａ，Ｈ．Ｏｋａｎｏ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ＬＮＧＦＲ（＋）ＴＨＹ−１（＋）ＶＣＡＭ−１（ｈｉ＋）　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｖｅａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．１，１５２−１６５（２０１３）．
１９．Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｍａｃｋａｙ，Ｓ．Ｃ．Ｂｅｃｋ，Ｒ．Ｋ．Ｊａｉｓｗａｌ，Ｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｄ．Ｍｏｓｃａ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｏｒｍａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ，Ｓ．Ｃｒａｉｇ，Ｄ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，１４−１４７（１９９９）．
２０．Ｊ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｃｈｏｉ，Ｋ．Ｓ．Ｃｈｏｉ，Ｋ．Ｄ．Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｈ．Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｋ．Ｓｅｏｎｇ，Ｈ．Ｋ．Ｍｉｎ，Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３２，１１７−１２６（２００９）．
２１．Ｗ．Ｊ．Ｃ．Ｒｏｍｂｏｕｔｓ，Ｒ．Ｅ．Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｐｒｉｍａｒｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ＭＳＣ　ｓｈｏｗ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｈｏｍｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｂｕｔ　ｌｏｓｅ　ｈｏｍｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１７，１６０−１７０（２００３）．
２２．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．ＭｃＫｅｅ，Ｓ．Ｂａｋｓｈｉ，Ｋ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｅ．Ｈａｋｍａｎ，Ｓ．Ｈａｌａｓｓｙ，Ｄ．Ｓｖｉｎａｒｉｃｈ，Ｒ．Ｄｏｄｄｓ，Ｃ．Ｋ．Ｇｏｖｉｎｄ，Ｇ．Ｒ．Ｃｈａｕｄｈｒｙ，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：Ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．１３，１７３８−１７５５（２０１９）．
２３．Ｔ．Ｓｑｕｉｌｌａｒｏ，Ｇ．Ｐｅｌｕｓｏ，Ｕ．Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｒｉａｌｓ　ｗｉｔｈ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：Ａｎ　ｕｐｄａｔｅ．Ｃｅｌｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５，８２９−８４８（２０１６）．
２４．Ｓ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｙ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｙ．Ｎａｇａｉ，Ｋ．Ｎｉｉｂｅ，Ｅ．Ｈｉｒａｔｓｕ，Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｃ．Ｍ．−Ｈａｒａ，Ｎ．Ｎａｇｏｓｈｉ，Ｔ．Ｓｕｎａｂｏｒｉ，Ｓ．Ｓｈｉｍｍｕｒａ，Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｓｕｄａ，Ｈ．Ｏｋａｎｏ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓｙｔｅｍｉｃ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１，２４８３−２４９６（２００９）．
２５．Ｄ．Ｄ．Ｈｏｕｌｉｈａｎ，Ｙ．Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｓ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｎｉｉｂｅ，Ｄ．Ａｒａｋｉ，Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．Ｏｋａｎｏ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｃａ−１　ａｎｄ　ＰＤＧＦＲ−α．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７，２１０３−２１１１（２０１２）．
２６．Ｙ．Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｉｄｅｎｔ　ａｄｕｌｔ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｏｒｇａｎｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１０３，１３８−１４４（２０１６）．
２７．Ｓ．Ｈａｒａｄａ，Ｙ．Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｊ．Ｋｏｈｙａｍａ，Ｄ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｄ．Ａｒａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｙａｍａ，Ｍ．Ｋａｊｉｋａｗａ，Ｃ．Ａｋａｚａｗａ，Ｈ．Ｏｋａｎｏ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ＦＺＤ５　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　３９，３１８−３３０（２０２１）．
２８．Ｋ．Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｍ．Ｉｔｏ，Ｆ．Ｉｎａｇｅ，Ｔ．Ｉｓｏｅ，Ｎ．Ｙｏｋｏｔａ，Ｏ．Ｓｕｇｉｔａ，Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｋ．Ｔｈａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．Ｓｕｄｏ，Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｒｉａｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓａｆｅｔｙ　ａｎｄ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｄＭＤ−００１　ｉｎ　ｌｕｍｂａｒ　ｄｉｓｃ　ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ：Ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ａ　ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ　ｐｉｌｏｔ　ｓｔｕｄｙ．Ｃｏｎｔｅｍｐ　Ｃｌｉｎ　Ｔｒｉａｌｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２３，１００８０５（２０２１）．
２９．Ｍ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ａ．Ｒ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｈ．Ｂａｂａ，Ｄｉｒｅｃｔ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｋｎｅｅ　ｊｏｉｎｔｓ　ｏｆ　Ｈａｒｔｌｅｙ　ｓｔｒａｉｎ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ　ｗｉｔｈ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１４，Ｒ３１（２０１２）．
３０．Ｍ．Ｖ．Ｒｉｓｂｕｄ，Ｚ．Ｒ．Ｓｃｈｏｅｐｆｌｉｎ，Ｆ．Ｍｗａｌｅ，Ｒ．Ａ．Ｋａｎｄｅｌ，Ｓ．Ｇｒａｄ，Ｊ．Ｃ．Ｉａｔｒｉｄｉｓ，Ｄ．Ｓａｋａｉ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｙｏｕｎｇ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｃｅｌｌｓ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｐｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　Ｇｒｏｕｐ　ａｔ　ｔｈｅ　２０１４　ａｎｎｕａｌ　ＯＲＳ　ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｊ　Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３３，２８３−２９３（２０１５）．
３１．Ｓ．Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｓ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｙｌａｎｄ．Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｈｕｍａｎ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｃｅｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．５，７０１−７１１（２０１０）．
３２．Ｊ．Ｃ．Ｉａｔｒｉｄｉｓ，Ｍ．Ｗｅｉｄｅｎｂａｕｍ，Ｌ．Ａ．Ｓｅｔｔｏｎ，Ｖ．Ｃ．Ｍｏｗ，Ｉｓ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ａ　ｓｏｌｉｄ　ｏｒ　ａ　ｆｌｕｉｄ？　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ　２１，１１７４−１１８４（１９９６）．
３３．Ｙ．Ｚｅｎｇ，Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｌｉｕ，Ｑ．Ｆｕ，Ｚ．Ｈａｎ，Ｙ．Ｌｉ，Ｓ．Ｆｅｎｇ，Ｘ．Ｌｉ，Ｃ．Ｑｉ，Ｊ．Ｗｕ，Ｄ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｂ．Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｒｕａｎ，Ｙ．Ｄｕ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ　ｍｉｃｒｏｃｒｙｏｇｅｌｓ　ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｌｅａｋ−ｐｒｏｏｆ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ａｎｄ　ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｉｎｅ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　５９，５３−６５（２０１５）．
３４．Ｓ．Ｒｅｉｔｍａｉｅｒ，Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｉｈｌｅｒ，Ｔ．Ｋｏｃａｋ，Ｎ．Ｇｒａｆ，Ａ．Ｉｇｎａｔｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．Ｗｉｌｋｅ，Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ　ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄａｉｌｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ：ａｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｓｔｕｄｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｒｉｎｏ　ｓｈｅｅｐ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　８，ｅ６９６１０（２０１３）．
３５．Ａ．Ａ．Ｈｅｇｅｗａｌｄ，Ｆ．Ｍｅｄｖｅｄ，Ｄ．Ｆｅｎｇ，Ｃ．Ｔｓａｇｏｇｉｏｒｇａｓ，Ａ．Ｂｅｉｅｒｆｕβ，Ｇ．Ａ．Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｍ．Ｔｒｕｎｋ，Ｃ．Ｋａｐｓ，Ｄ．Ｓ．Ｍｅｒｎ，Ｃ．Ｔｈｏｍｅ，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ａｎｎｕｌｕｓ　ｆｉｂｒｏｓｕｓ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ：Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｂｉｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　ａｎｎｕｌｕｓ　ｉｍｐｌａｎｔ　ｉｎ　ａｎ　ｉｎ−ｖｉｖｏ　ｏｖｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．９，４０５−４１４（２０１５）．
３６．Ｃ．Ｗ．Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ，Ａ．Ｍｅｔｚｄｏｒｆ，Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｊ．Ｈｏｄｌｅｒ，Ｎ．Ｂｏｏｓ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｍｂａｒ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ　２６，１８７３−１８７８（２００１）．
３７．Ｈ．Ｓｕｄｏ，Ａ．Ｍｉｎａｍｉ，Ｃａｓｐａｓｅ　３　ａｓ　ａ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．６３，１６４８−１６５７（２０１１）．
３８．Ｋ．Ｕｒａ，Ｈ．Ｓｕｄｏ　Ｈ，Ｋ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ　Ｔ，Ｄ．Ｕｋｅｂａ，Ｎ．Ｉｗａｓａｋｉ　Ｎ，Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｃａｌ　ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃｓ　ｏｎ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ．Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３７，１９６３−１９７１（２０１９）．
３９．Ｄ．Ｓ．Ｌｕ，Ｙ．Ｓｈｏｎｏ，Ｉ．Ｏｄａ，Ｋ．Ａｂｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｎｅｄａ，Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ　ＡＢＣ　ａｎｄ　ｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎ　ｏｎ　ｓｐｉｎａｌ　ｍｏｔｉｏｎ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．Ａｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ，ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ　ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ　ｃａｎｉｎｅ　ｓｔｕｄｙ．Ｓｐｉｎｅ　２２，１８２８−１８３４（１９９７）．
４０．Ｎ．Ｂｏｏｓ，Ｓ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｈ．Ｒｏｈｒｂａｃｈ，Ｃ．Ｗｅｉｌｅｒ，Ｋ．Ｆ．Ｓｐｒａｔｔ，Ａ．Ｇ．Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｌｕｍｂａｒ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃｓ：２００２　Ｖｏｌｖｏ　Ａｗａｒｄ　ｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｓｐｉｎｅ　２７，２６３１−２６４４（２００２）．
４１．Ｓ．Ｒｅｉｔｍａｉｅｒ，Ｌ．Ｋｒｅｊａ，Ｋ．Ｇｒｕｃｈｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ｋａｎｔｅｒ，Ｊ．Ｓｉｌｖａ−Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｒ．Ｌ．Ｒｅｉｓ，Ｖ．Ｐｅｒｕｇｉｎｉ，Ｍ．Ｓａｎｔｉｎ，Ａ．Ｉｇｎａｔｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．Ｗｉｌｋｅ，Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ　ｆｏｒ　ｄｉｓｃ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ　Ｊ．２３，１９−２６（２０１４）．
４２．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｂ．Ｈｕａｎｇ，Ｌ．−Ｔ．Ｌｉｕ，Ｍ．−Ｈ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｑ．Ｌｉ，Ｚ．−Ｆ．Ｚｈａｎｇ，Ｔ．−Ｗ．Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｊ．Ｘｉｏｎｇ，Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ　Ａ　２０，９０８−９２０（２０１４）．
４３．Ｆ．Ｗａｎｇ，Ｌ．−Ｐ．Ｎａｎ，Ｓ．−Ｆ．Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｌｉｕ，Ｚ．−Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｊ．−Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｘ．−Ｍ．Ｆｅｎｇ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｉｎ　ｒａｔｓ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｔ．２０１９，８４９６０２５（２０１９）．
４４．Ｇ．Ｗ．Ｏｍｌｏｒ，Ｓ．Ｌｏｒｅｎｚ，Ａ．Ｇ．Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ｔ．Ｇｕｅｈｒｉｎｇ，Ｗ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｄｉｓｃ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｄｉｓｃ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ．Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ　Ｊ．２７，２６３９−２６４９（２０１８）．
４５．Ｍ．Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｋ．Ｌ．Ｂｌａｎｃ，Ｉ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｉ．Ｓｌａｐｅｒ−Ｃｏｒｔｅｎｂａｃｈ，Ｆ．Ｍａｒｉｎｉ，Ｄ．Ｋｒａｕｓｅ，Ｒ．Ｄｅａｎｓ，Ａ．Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｄ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｅ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｉｎｉｍａｌ　ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ　８，３１５−３１７（２００６）．
４６．Ｃ．Ｍ．Ｒａｙｎａｕｄ，Ｍ．Ｍａｌｅｋｉ，Ｒ．Ｌｉｓ，Ｂ．Ａｈｍｅｄ，Ｉ．Ａｌ−Ａｚｗａｎｉ，Ｊ．Ｍａｌｅｋ，Ｆ．Ｆ．Ｓａｆａｄｉ，Ａ．Ｒａｆｉｉ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ　ａｎｄ　ｆｅｔａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｏｓｔｅｏａｃｔｉｖｉｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｔ．２０１２，６５８３５６（２０１２）．
４７．Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｊ．Ｍｏｃｈｉｄａ，Ｄ．Ｓａｋａｉ，Ｔ．Ｎａｋａｉ，Ｋ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．Ｋａｗａｄａ，Ｔ．Ｈｏｔｔａ，Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｒｅｃｔ　ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ　ｃｏｎｔａｃｔ　ｉｎ　ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｐｉｎｅ　２９，１５０８−１５１４（２００４）．
４８．Ｓ．−Ｈ．Ｙａｎｇ，Ｃ．−Ｃ．Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．−Ｆ．Ｓｈｉｈ，Ｙ．−Ｈ．Ｓｕｎ，Ｆ．−Ｈ．Ｌｉｎ，Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐａｒａｃｒｉｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ　３３，１９５１−１９５７（２００８）．
４９．Ａ．Ｏｕｙａｎｇ，Ａ．Ｅ．Ｃｅｒｃｈｉａｒｉ，Ｘ．Ｔａｎｇ，Ｅ．Ｌｉｅｂｅｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ａｌｌｉｓｔｏｎ，Ｚ．Ｊ．Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｌｏｔｚ，Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ａｎａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　ｃａｔａｂｏｌｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　３Ｄ　ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３５，６１−７３（２０１７）．
５０．Ｍ．Ｖ．Ｒｉｓｂｕｄ，Ｔ．Ｊ．Ａｌｂｅｒｔ，Ａ．Ｇｕｔｔａｐａｌｌｉ，Ｅ．Ｊ．Ｖｒｅｓｉｌｏｖｉｃ，Ａ．Ｓ．Ｈｉｌｌｉｂｒａｎｄ，Ａ．Ｒ．Ｖａｃｃａｒｏ，Ｉ．Ｍ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏｗａｒｄｓ　ａ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ−ｌｉｋｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｐｉｎｅ　２９，２６２７−２６３２（２００４）．
５１．Ｓ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．Ｖ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｓ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｎ．Ｐ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｈｕｎｔ，Ａ．Ｊ．Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２４，７０７−７１６（２００６）．
５２．Ｄ．Ｓａｋａｉ，Ｊ．Ｍｏｃｈｉｄａ，Ｔ．Ｉｗａｓｈｉｎａ，Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．Ｎａｋａｉ，Ｋ．Ａｎｄｏ，Ｔ．Ｈｏｔｔａ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｏ　ａ　ｒａｂｂｉｔ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｃ　ｍｏｄｅｌ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｄ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｄｉｓｃ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ　３０，２３７９−２３８７（２００５）．
５３．Ｔ．Ｊ．ＤｉＳｔｅｆａｎｏ，Ｊ．Ｏ．Ｓｈｍｕｋｌｅｒ，Ｇ．Ｄａｎｉａｓ，Ｊ．Ｃ．Ｉａｔｒｉｄｉｓ，Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ａｎｎｕｌｕｓ　ｆｉｂｒｏｓｕｓ　ｒｅｐａｉｒ：ｂｒｉｄｇｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｗｉｔｈ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｏｕｔｃｏｍｅｓ．ＡＣＳ　Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．６，６５５６−６５８６（２０２０）．
５４．Ｔ．Ｃ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｅ．Ｓａｌｚｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｃｒｉｓｐｉｍ，Ｇ．Ｔ．Ｆａｂｒａ，Ｃ．ＬｅＶｉｓａｇｅ，Ａ．Ｐａｎｄｉｔ，Ｍ．Ｔｒｙｆｏｎｉｄｏｕ，Ｃ．Ｌ．Ｍａｉｔｒｅ，Ｋ．Ｉｔｏ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｉｎｔｅｎｄｅｄ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ　ｄｉｓｃｓ．Ａｃｔａ　Ｂｉｏｍａｔｅｒ．１１４，１−１５（２０２０）．５７３
［実施例５］

ラット椎間板髄核欠損モデルにおけるアルギン酸ナトリウムおよび間葉系幹細胞の補填による炎症抑制および疼痛抑制効果
１．ラット椎間板穿刺変性モデルの作成
ラット椎間板穿刺変性モデル（Ｍｏｈｄ　Ｉｓａ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ａｄｖ　２０１８）を被験物質投与に係る実験（ＩＨＣ分析、組織学的分析、疼痛関連行動分析）に使用する。計６０匹の１２週齢雌ＳＤラット（２６０−３００ｇ）を、皮膚切開のみの群（ｓｈａｍ群）、椎間板穿刺のみの群（ｐｕｎｃｈ群）、椎間板穿刺後にＵＰＡＬを埋植する群（ＵＰＡＬ群）、椎間板穿刺後にＵＰＡＬとＲＥＣを埋植する群（ＲＥＣ群）に無作為に割り付ける（ｎ＝３、各時点・各群）。５％　ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ吸入による麻酔導入の後に、ｋｅｔａｍｉｎｅとｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅの混合物（ｋｅｔａｍｉｎｅ：ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ＝７５ｍｇ／ｋｇ：０．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔を維持する。鉗子を用いた尾部つまみ試験で麻酔深度を確認した後、Ｃｏ４／５　−５／６の背側皮膚を切開する。結合組織を剥離してＣｏ４／５　−５／６を露出し、１９　Ｇ針を用いてＣｏ４／５　−５／６の椎間板を損傷する（径１ｍｍ、深さ２ｍｍ）。

Ｇｅｌ群、ＲＥＣ群においては、乾燥した繊維状のＵＰＡＬ（４００−６００ｍＰａ／ｓ，Ｍｏｃｈｉｄａ　Ｐｈａｒｍａ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を生理食塩水（０．９％，Ｏｔｓｕｋａ）に溶解して２％（ｗ／ｖ）に調製し、４μｌのＵＰＡＬ溶液を２６　Ｇ針を取り付けたマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて穿刺部とは別の経路で椎間板内中心部に注入する。ＲＥＣ群は濃度を１ｘ１０^６／ｍｌに設定する。手術部位を生理食塩水で洗浄し、筋膜、結合組織、皮膚を縫合閉鎖する。

２．免疫組織学的評価
ラット椎間板の免疫組織学的評価を実施し、術後１、４、７および２８日後のＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＴｒｋＡ陽性細胞を検出する。ラット（各時点・各群ｎ＝３）をｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ吸入によって深く麻酔し、頸椎脱臼で安楽死させる。

尾全体（Ｃｏ　４／５−Ｃｏ　５／６）を外科的に摘出し、無菌条件下で軟部組織を除去して尾椎と椎間板のみを採取する。採取した椎間板は、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し（室温で４８時間）、パラフィンに包埋する。椎間板中央で検体を横断し、冠状断中央の横断面切片（厚さ５μｍ）を得る。切片をｘｙｌｅｎｅで脱パラフィン化した後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｄａｋｏ，Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で培養する（３７℃、１５分間）。続いて、１％過酸化水素メタノール（ｗ／ｖ）でブロッキングし（３７℃、３０分間）、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン中で培養（室温、３０分間）した後、一次抗体と４℃で一晩培養する。抗ＴＮＦ−αマウスモノクローナル抗体（ａｂ２２０２１０、Ａｂｃａｍ）、抗ＩＬ−６マウスモノクローナル抗体（ａｂ９３２４、Ａｂｃａｍ）、抗ＴｒｋＡウサギモノクローナル抗体（ａｂ８６４７４、Ａｂｃａｍ）を用いる。

発色には、ＴＮＦ−α分析ではＨｉｓｔｏｆｉｎｅ（登録商標）Ｆａｓｔ　Ｒｅｄ　ＩＩ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−６分析ではＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｃｏｓｍｏ　Ｂｉｏ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＴｒｋＡ分析ではＨｉｓｔｏｆｉｎｅ（登録商標）ＤＡＢ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いる。視認性を向上させる目的で細胞核の対比染色を行い、ＴＮＦ−αまたはＴｒｋＡ染色ではヘマトキシリンを、ＩＬ−６染色ではファストレッドをそれぞれ使用する。光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＴｒｋＡ陽性細胞を無作為に選択された５視野で個別に計数し、各染色における陽性髄核または線維輪細胞数を、視野中の全髄核または線維輪細胞数に対する百分率として計算する。全評価は、盲検化された２人の独立した観察者によって行う。各観察者は、１検体について３回の評価を実施して検体ごとの平均値を算出し、各群間の比較を行う。

３．組織学的評価
術後２８日の椎間板組織変性を評価する。ラット（ｎ＝３）を免疫組織学的評価と同じ方法で安楽死させ、椎間板を採取する。採取した椎間板を４％（ｗ／ｖ）ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで４８時間固定し、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ脱灰液で２週間脱灰した後、水道水で２４時間洗浄し、パラフィン包埋する（Ｍｏｈｄ　Ｉｓａ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ａｄｖ　２０１８）。ラット椎間板の矢状断正中標本（厚さ５μｍ）を用いて組織学的スコア（Ｒｕｔｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈ　Ｃａｒｔｉ　２０１３）を評価するためにヘマトキシリン＆エオジン、サフラニン０、または、アルシアンブルー（ＡＢ）で染色する。ＡＢ染色は点数に直接関与しないが、細胞外基質の評価に適した染色であるため補助目的に実施する。全ての評価は、盲検化された２人の独立した観察者によって行う。各観察者は、１検体について３回の評価を実施して個体の平均値を算出した上で、各群間を比較する。

４．疼痛関連行動分析
免疫組織学的評価で術後２８日目まで生存させたラット１２匹（各群ｎ＝３）、および、組織学的分析に使用したラット１２匹（各群ｎ＝３）の、計２４匹のラット（各群ｎ＝６）を疼痛関連行動分析に使用する。全ラットにＨａｒｇｒｅａｖｅｓ、ｖｏｎ　Ｆｒｅｙ、ｔａｉｌ　ｆｌｉｃｋ試験を実施する。各試験の２４時間前および試験直前に、２０分間各ラットを個別に試験環境で過ごさせて環境に慣れさせる。全ての試験は、盲検化された同一の検者によって行う。各ラットで複数回の測定を行って平均値を算出し、得られた結果を群間で比較する。

４．１　Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験装置（Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｍｏｎｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を使用して、術前２日目（Ｄａｙ−２）と術後２、７、１４、２７日目に実施する（Ｍｏｈｄ　Ｉｓａ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ａｄｖ　２０１８）。ラットはガラス板（Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に四方および上方を囲われた個別の小部屋（上方に空気孔あり）に入れる。熱刺激として赤外線ビームを皮膚切開部の腹側に照射する。熱刺激に対する逃避行動を示すまでの潜時を記録する。ビームの強度は最大出力の５０％に設定する。組織損傷を防ぐ目的で、カットオフ時間を２０秒間に設定する。同一ラットにおいて各時点で４回の測定を実施するが、各測定間に少なくとも１分の休憩を挟む。

４．２　ｖｏｎ　Ｆｒｅｙ試験
ｖｏｎ　Ｆｒｅｙ試験は、ｄｙｎａｍｉｃ　ｐｌａｎｔａｒ　ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、術前２日目（Ｄａｙ−２）と術後２、７、１４、２７日目に実施する。金網の上にＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験で用いたものと同じ小部屋を設置してラットを入れる。直径０．５ｍｍのフィラメントを皮膚切開部の腹側に当て、０ｇから開始して５ｇまで直線的に増加する力を１０秒間かけて加えていき、その後は５ｇの力を試験開始から３０秒後まで一定の力で加える。ラットが何らかの逃避行動を示すまでの潜時を記録する。同一ラットにおいて各時点で５回の測定を実施するが、各測定間に少なくとも１０秒の休憩を挟む。

４．３　ｔａｉｌ　ｆｌｉｃｋ試験
ｔａｉｌ　ｆｌｉｃｋ試験はｈｅａｔ　ｆｌｕｘ　ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行う。Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験と同一日程で施行されたことによる過度の熱刺激による組織損傷を避けるために、術前１日目（Ｄａｙ−１）と術後３、８、１５、２８日目に実施する（Ｍｏｈｄ　Ｉｓａ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ａｄｖ　２０１８）。各ラットをタオルにくるんだ状態で１０分間落ち着かせた後、体部はタオルで覆ったまま尾だけを装置の上に置き、尾の遠位端から５ｃｍ近位部腹側に赤外線ビームを照射する。熱刺激に対する尾振り払い反応までの潜時を記録する。組織損傷を防ぐ目的で、カットオフ時間を２０秒間に設定する。同一ラットにおいて各時点で４回の測定を実施するが、各測定間に少なくとも１５秒の休憩を挟む。

５．統計分析
　全てのデータは、平均±標準誤差（ＳＥ）として表記する。多群間比較にはｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡを使用する。２群比較には対応のないＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用いる。すべてのＡＮＯＶＡの結果は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ　ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いてさらに評価する。差については、５％の有意水準で統計的に有意とみなす（Ｐ＜０．０５）。

６．結果
ＵＰＡＬとＲＥＣを埋植する群（ＲＥＣ群）において、疼痛抑制効果が確認されうる。

Claims

アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物。
間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、請求項１に記載の組成物。
前記間葉系幹細胞が、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞である請求項１又は２に記載の組成物。
前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項３に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項３又は４に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
対象の椎間板に適用し、適用後に組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ、当該適用時には流動性を有する、請求項１~５のいずれか１項に記載の組成物。
椎間板の髄核部位に適用するための請求項６に記載の組成物。
前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、請求項７に記載の組成物。
前記架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、請求項６~８のいずれか１項に記載の組成物。
前記アルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、請求項１~９のいずれか１項に記載の組成物。
前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、請求項１~１０のいずれか１項に記載の組成物。
アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％~５．０ｗ／ｗ％である、請求項１~１１のいずれか１項に記載の組成物。
椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、請求項１~１２のいずれか１項に記載の組成物。
前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１３に記載の組成物。
アルギン酸の１価金属塩とヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞とを含む椎間板再生用組成物であって、対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用されるための椎間板再生用組成物。
対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる請求項１５に記載の椎間板再生用組成物。
前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、請求項１５又は１６に記載の組成物。
前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される請求項１５~１７のいずれか１項に記載の組成物。
前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項１５~１８のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、ＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）が陽性、又はＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項１５~１９のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が４０％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが２０μｍ以下である
前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、請求項１５~２０のいずれか１項に記載の組成物。
前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、請求項１５~２１のいずれか１項に記載の組成物。
前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％~５．０ｗ／ｗ％である、請求項１５~２２のいずれか１項に記載の組成物。
椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、請求項１５~２３のいずれか１項に記載の組成物。
前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、慢性腰痛、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２４に記載の組成物。
前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、請求項２４又は２５に記載の組成物。
椎間板性疼痛を抑制するために用いる、請求項１５~２３のいずれか１項に記載の組成物。