CN103013910A - 人退变椎间盘软骨终板干细胞、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从人退变椎间盘软骨终板中分离、纯化出具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞与骨髓间充质干细胞生物学特性相似，经诱导能向骨、软骨及脂肪等方向分化，而且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。软骨终板干细胞经动物体内试验证实其具有显著的髓核再生能力和阻止椎间盘退变的作用，且不存在明显免疫排斥反应，在椎间盘退变性疾病的生物治疗中具有良好的应用前景和价值。

Description

人退变椎间盘软骨终板干细胞、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及人退变椎间盘软骨终板干细胞在临床治疗椎间盘退变性疾病及其它生物治疗中的应用。 

背景技术

下腰痛是临床常见病和多发病，是引起劳动力丧失和残疾的最常见病因之一。一般认为椎间盘退行性改变是引起下腰痛最常见的原因，因此对椎间盘退行性疾病的预防和治疗具有重要的意义。 

目前椎间盘退变相关疾病的治疗手段主要包括保守治疗、手术治疗和生物治疗。保守治疗为对症治疗，以缓解症状为目的，属于阶梯治疗的第一步。椎间盘髓核摘除术或脊柱节段融合内固定等手术治疗方式只是解决了椎间盘突出所致的神经受压及脊柱节段不稳的问题，不能从根本上解决椎间盘退行性改变。此外，单纯椎间盘髓核摘除会引起椎间隙塌陷，脊柱节段不稳从而产生腰痛等症状，且有一定的复发率；内固定的使用会加速邻近椎体节段的退变，从而产生新的临床症状。因此，手术治疗的长期效果仍然不是十分理想，而且治疗费用高，手术所带来的相关并发症较多。目前，生物治疗方式包括基因治疗、生长因子治疗、细胞治疗和组织工程等。椎间盘退行性疾病的生物治疗作为一种新兴的治疗手段，还没有普遍应用于临床，但是生物治疗的应用前景广泛，有望成为手术治疗和保守治疗的有效补充，延缓甚至逆转椎间盘退变的生物学过程，以改善患者的临床症状。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从人退变椎间盘软骨终板中分离、纯化出具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞与骨髓间充质干细胞生物学特性相似，能向骨、软骨及脂肪等方向诱导分化，而且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。其具体特征为:①在标准的培养条件下能贴塑料瓶壁生长；②细胞表面标志物能表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19及HLA-DR表面分子； ③在体外培养能向骨细胞、软骨细胞 及脂肪细胞方向分化。 

本发明还提供一套较为完整的人软骨终板干细胞获取、筛选、纯化和扩增方法，包括以下步骤： 

步骤1：制定标本来源的病例纳入标准:经患者知情并同意，年龄小于70岁，大于40岁；无结核、肝炎、肿瘤、糖尿病等传染性疾病及自身免疫性疾病；行颈椎、胸椎和腰椎融合手术。 

步骤2：将手术中遗弃的软骨终板标本，在无菌条件下用解剖显微镜对软骨终板标本进行分离，去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，用尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的髓核，剩下透明状的软骨终板。机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞,并以台盼蓝测定细胞活力。将获取到的原代细胞置37℃、5%CO₂、95%湿度条件下孵箱培养，倒置相差显微镜每天观察细胞生长情况，每3天换液1次。 

步骤3：将长满近90%培养瓶的软骨终板干细胞用胰蛋白酶消化传代时，以琼脂糖筛选系统筛选干细胞，挑选细胞克隆, 置培养于培养瓶置37℃、5%CO₂孵箱培养扩增、传代。 

步骤4：将传至第3代的干细胞进行冻存备用，需要应用时将该细胞复苏。 

步骤5：复苏后，将该细胞体外培养扩增，将生物学性能稳定的细胞复合海藻酸钠，术中X线引导下向目标椎间盘穿刺注射。 

本发明提供了人软骨终板干细胞在防止椎间盘退变性疾病的应用，主要可应用治疗的疾病范围包括：1.椎间盘源性腰痛或椎间盘源性颈肩痛病例，经磁共振及椎间盘封闭等手段可明确责任椎间盘。2.腰椎间盘或颈椎间盘髓核摘除术后病例，术后残留腰痛及颈肩痛且可以明确手术椎间盘为责任椎间盘。3.其它可以采用人软骨终板干细胞治疗的椎间盘退变性疾病。 

将上述干细胞复合海藻酸钠凝胶植入新西兰大白兔退变椎间盘模型中，六个月后观察检测结果，发现该细胞支架复合物能够显著阻止椎间盘的退变，且髓核再生能力明显强于骨髓间充质干细胞组。此外，该动物实验属于异种移植，组织学检测未见明显免疫排斥反应。 

综上所述，椎间盘软骨终板干细胞经动物体内试验证实其显著的髓核再生能力， 且不存在明显免疫排斥反应。因此，软骨终板干细胞在椎间盘退变性疾病的生物治疗中具有良好的应用价值。 

附图说明

图1所示为人软骨终板大体标本。 

图2所示为人软骨终板干细胞相差显微镜下形态。 

图3所示为琼脂糖筛选系统中软骨终板干细胞集落。 

图4 所示为流式细胞术检测软骨终板干细胞免疫标志物结果。符合国际细胞治疗学会（the International Society for Cellular Therapy, ISCT)所定义的间充质干细胞（MSCs）标准。 

图5 所示为人软骨终板干细胞在相应的诱导液诱导下，能向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化。图5A为非诱导对照组，茜素红染色不着色，而诱导组经茜红素染色着色，证实有骨矿化结节生成。图5B为非诱导对照组经油红O染色不着色，图5E为诱导组油红O染色着色，证实有脂滴形成。图5C为非诱导细胞团，阿利新蓝染色不着色，图5F为诱导后细胞团，阿利新蓝染色呈蓝染，证实有细胞团内有大量蛋白聚糖产生，经诱导后的细胞具有软骨细胞的生物学性能。 

图6所示为软骨终板干细胞与骨髓间充质干细胞体外进行细胞聚集成团试验,等量细胞经诱导向软骨细胞分化,分别在第1,2,3周时,都显示软骨终板干细胞比骨髓间充质干细胞所成细胞团更大,显示的分泌的蛋白聚糖更多,成软骨的能力更强。 

图7所示为分别植入人骨髓间充质干细胞-海藻酸钠复合物组、人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物组和海藻酸钠植入组术后第6月磁共振检查结果图（箭头所指为手术椎间盘，箭头以上为正常对照椎间盘）。可见人软骨终板干细胞组手术椎间盘信号强度(亮度)及髓核再生能力明显强于骨髓间充质干细胞组,而单纯海藻酸钠植入组中实验椎间盘显著退变，磁供振T2信号显著降低，且邻近的下位椎间盘也信号强度降低，发生退变。 

图8 所示为人骨髓间充质干细胞-海藻酸钠复合物组、人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物组和单纯海藻酸钠植入组在植入手术后第6月X线检查结果图（箭头所指为手术椎间盘，箭头以上为正常对照椎间盘）。可见人软骨终板干细胞组维持椎间隙高度的能力强于骨髓间充质干细胞组，而单纯海藻酸钠植入组中实验椎 间盘显著退变,椎间隙变窄，且临近椎间盘也发生高度丢失。 

图9示X线引导下行椎间盘穿刺注入人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物模式图，此图为椎间盘造影病例。 

具体实施方式

本发明公开了人软骨终板干细胞的制备及其临床治疗的应用。本发明的方法及应用已经通过较佳实施进行了描述，来实现和应用本发明技术。 

下面结合实施例，进一步阐述本发明： 

实施例1人退变软骨终板干细胞的获取及筛选纯化 

将手术中遗弃的椎间盘标本，无菌状态下在无菌操作台紫外灯照射30分钟杀菌，以含1%庆大霉素的磷酸盐缓冲液漂洗标本组织直到无血迹，在解剖显微镜下对椎间盘标本组织进行分离，去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，用尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的髓核组织，剩下透明状的软骨终板。眼科剪将剩下的软骨终板剪至1mm×1mm×1mm大小，将剪醉的组织用0.25%II型胶原酶于37℃消化6小时或先于摇床1小时，再于37℃消化4小时。将软骨终板组织消化液经孔径为100um或200目的滤网过滤，滤液在1000转/分钟条件下离心5分钟，所得沉淀用含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基洗涤3遍，再以该培养基悬浮细胞，吹打使其成单细胞悬液，取10ul细胞悬液以怠盼蓝测定细胞活力。剩下的细胞悬液接种于培养瓶，在37℃、5%CO₂、95%湿度条件下孵箱培养，倒置相差显微镜每天观察细胞生长情况，每3天换液1次。将长满近90%培养瓶的软骨终板干细胞吸弃培养基，加入磷酸缓冲液漂洗2遍，加入胰蛋白酶消化细胞约3-5分钟，显微镜下观察见少量细胞脱落时加入1ml含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使细胞脱离瓶底，将细胞吸取移入离心管以1000转/分钟，离心5分钟，弃上清，磷酸盐缓冲液漂洗2遍，用含10%胎牛血清培养基轻轻吹打使细胞变成单细胞悬液，取10ul悬液进行细胞计数，用培养基调整为3×10⁴/ml。将1%琼脂加热融化，于45℃水浴中温育，同时将培养基也置于45℃水浴中预温。将细胞：琼脂：培养基（含血清）（1:1:1）混匀后立即倒入24孔板或35mm平皿中，10-14天后肉眼可以观察到白色细胞团。待观察到大量细胞克隆形成后，解剖镜下挑取单个细胞集落吹散，将细胞接种至96孔板或24 孔板进行于37℃、5%CO₂孵箱条件下扩大培养。 

实施例2冻存人软骨终板干细胞 

将增殖状态良好的细胞，吸弃培养液，加入适量经37℃预温的0.25%胰蛋白酶溶液，消化3-5分钟分散细胞。加入2-4ml含血清的培养液终止胰蛋白酶的消化作用。吹打分散细胞，移入离心管中，平衡后以（800-1000）r/min离心5-10分钟，弃上清液。加1-2ml培养液重新悬浮细胞，用细胞计数板计算细胞密度，用培养液将细胞浓度调整到（2-5）×10⁶/ml,放置冰浴中。将同样含10%胎牛血清的培养基制成含20%二甲基亚砜（DMSO）或制成含20%甘油的冷冻保护液，将等量的冷冻保护液滴加于等量的细胞悬液中，轻轻吹打均匀，制成含10%DMSO或甘油的冷细胞悬液，细胞浓度为（1-2）×10⁶/ml。将细胞悬液分别移到冷冻管中，每管1-1.5ml（事先在管上标明细胞名称、日期、密度），旋紧管盖。将冷冻管先置于4℃冰箱0.5-1小时，再移至-20℃低温冰箱1-2小时，然而置于-70℃低温冰箱中过夜，再投入液氮中。 

实施例3复苏人软骨终板干细胞 

迅速将冷冻管取出，立即投入38-40℃温水中，并充分摇动，使其迅速融化，一般1分钟左右完成。在超净工作台内，将细胞悬液移至含5ml培养液的离心管内，1000r/min离心5分钟，弃上清液，加入5ml培养液，吸管轻轻吹打悬浮细胞。将细胞悬液移入培养瓶内，置37℃培养箱，次日更换一次培养液后，待用。 

实施例4 制备人软骨终板干细胞藻酸盐复合物 

海藻酸钠，一种天然多糖，是从褐藻类海洋生物中提取的一种线型阴离子天然多糖，是由甘露糖醛酸残基和古洛糖醛酸残基以均聚物和杂聚物排列的共聚物，其均聚物部分可在遇到二阶阳离子（如Ca²⁺）时，通过离子交联发生凝胶化，形成网状藻酸钙离子水凝胶。具有一般药物制剂辅料所需要的稳定性、溶解性、粘性和安全性。将长满近90%培养瓶的软骨终板干/祖细胞吸弃培养基，加入磷酸缓冲液冲洗2遍，加入胰蛋白酶消化细胞约3-5分钟，显微镜下观察见少量细胞脱落时加入含10%胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶的消化，轻轻吹打细胞，将细胞吸取移入离心管离心5分钟，弃上清，磷酸盐缓冲液漂洗2遍，含10%胎牛血清培养基轻轻吹打使细胞变成单细胞悬液，再次离心将上清液吸弃，剩下细胞团。以质量浓度1.2%的海藻酸钠加入细胞团块，轻轻软打混匀，制成3×10⁶/ml密度的藻酸盐细胞复合物。 

实施例5选取符合适合治疗的病例 

可应用治疗的疾病范围包括：1.椎间盘源性腰痛或椎间盘源性颈肩痛病例，经磁共振及椎间盘封闭等手段可明确责任椎间盘。2.腰椎间盘或颈椎间盘髓核摘除术后病例，术后残留腰痛及颈肩痛且可以明确手术椎间盘为责任椎间盘。3.其它可以采用人软骨终板干细胞治疗的椎间盘退变性疾病。 

实施例6 人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物的植入治疗 

在适合治疗的病例中，术中在X线引导下行目标椎间盘穿刺，向椎间盘注入适量体积的人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物，再从原通道注入上述凝胶复合物1/3体积的35g/L氯化钙溶液完成体内的交联过程，置入穿刺针芯封住注入通道30秒，拔出穿刺针完成操作。 

实施例7椎间盘退变的治疗效果验证 

术后定期进行腰椎正侧位、动力位X线片，腰骶椎椎间盘MRI扫描观察；术前及术后各时间点进行VAS，JOA，ODI评分对比，判断治疗效果。 

以上所述仅是本发明的基本内容，应当指出，在不脱离本发明的前提下，其它科技人员可以对软骨终板干细胞做出基因转染和修饰等改进，但只要涉及运用人软骨终板干细胞用于治疗等商业目的，这些改进和修饰及其治疗等行为都应视为本发明的保护范围。 

Claims (6)

1.一种人软骨终板干细胞，其是从人退变椎间盘软骨终板中分离出的具有多向分化潜能的干细胞，其特征在于:①在标准的培养条件下能贴塑料瓶壁生长；②细胞表面标志物能表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19及HLA-DR表面分子； ③在体外培养能向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞方向分化，且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。

2.权利要求1所述干细胞的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：对软骨终板标本组织进行分离获得软骨终板，用机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞,体外扩增时并筛选、纯化，将获取到的细胞置孵箱培养，每3天换液1次；

步骤2：待细胞融合达90%时,对软骨终板细胞消化传代,运用琼脂糖筛选系统筛选细胞,得到较高纯度的软骨终板干细胞，再置于孵箱培养，进行扩增；

步骤3：将传至第3代的细胞进行冻存备用，需要应用时将该细胞复苏即可。

3.权利要求1所述人软骨终板干细胞在制备治疗椎间盘退变性疾病的组织工程髓核中的应用。

4.权利要求1所述人软骨终板干细胞在制备治疗椎间盘退变性疾病的组织工程髓核中的应用，所述组织工程髓核是将人软骨终板干细胞与支架材料复合而获得，人软骨终板干细胞的用量为>1×10⁵/ml。

5.根据权利要求3或4所述人软骨终板干细胞的应用，其特征在于：所述椎间盘退变性疾病包括椎间盘源性腰痛、椎间盘源性颈肩痛，还可用于经磁共振及椎间盘封闭等手段可明确责任椎间盘病例、腰椎间盘或颈椎间盘髓核摘除术后病例、术后残留腰痛及颈肩痛且可以明确手术椎间盘为责任椎间盘病例。

6.根据权利要求4所述人软骨终板干细胞的应用，其特征在于：所述组织工程髓核是将人软骨终板干细胞体外培养扩增并经筛选后，复合海藻酸钠而形成，在X线引导下行目标椎间盘穿刺注射。

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