JP2001502561A - 複合骨移植片の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、複合骨移植片を調製するための新しくかつ改善された方法を提供する。本方法は、骨髄吸引物懸濁液を提供する工程、およびその骨髄吸引物懸濁液を、多孔性で生体適合性の移植可能な基体を通して通過させ、結合組織前駆細胞の富化集団を有する複合骨移植片を提供する工程を包含する。本方法は、好ましくは、手術中に実施されるので、本方法は、被移植者が受けなければならない侵襲性手順の機会の回数を低減する。本発明はまた、本発明の方法に従って調製される改善された複合骨移植片に関する。改善された複合移植片は、結合組織前駆細胞の富化集団および最初の骨髄吸引物に見い出されるよりも多い数の単位容量あたりの結合組織前駆細胞含む。本発明はまた、複合骨移植片を調製するために使用される装置を含むキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 複合骨移植片の調製方法 発明の背景 骨移植は、骨折、偽関節を処置するため、および関節固定を誘導するために広 範に使用される。被移植者の一部から採取され、そして被移植者の別の部位に移 植される自己海綿状骨（autogenous cancellous bone）は、現在最も効果的な骨 移植片である。自己海綿状骨は、骨治癒応答の分布を支持する骨格を提供する。 自己海綿状骨はまた、新しい軟骨または骨を形成する結合組織前駆細胞を提供す る。しかし、自己骨の採取は、かなりの費用および裂傷、血液減少、疼痛、長期 の手術および回復期間、ならびに感染の危険を含む罹患率を生じる。さらに、い くつかの臨床設定において、移植部位の容量が、利用可能な自己移植片の容量を 超過し得る。従って、自己移植片に対する代替物が、骨移植手順の罹患率および 費用を低減させる試みにおいて開発されてきている。 セラミックス、ポリマー、処理した同種異系移植片骨、およびコラーゲンベー スのマトリックスを含むいくつかの精製材料または合成材料が、自己移植片の代 替物として供させるために調査または開発されてきている。FDAは、含まれる限 定的な骨の欠損における使用について珊瑚由来の多孔性合成ヒドロキシアパタイ トセラミックを承認した。精製コラーゲン／セラミック複合材料もまた、急性長 骨骨折における使用について承認した。これらの材料は、被移植者からの自己移 植片を採取する際に関与する罹患性を回避し、そして利用可能な自己移植片の限 定された量に伴う問題を除去するが、合成材料の臨床的な有効性は一般に自己移 植片よりも劣ったままである。 合成移植片材料はまた、骨髄細胞のための担体として使用されてきている。こ のような複合材料が骨格欠損部へと移植された場合、結合組織前駆細胞が骨格組 織へと分化した。いくつかの場合、複合インプラントは、合成移植片材料を骨髄 栓から得られた細胞懸濁液中に浸漬することにより作製される。しかし、軟骨、 骨、および他の結合組織（例えば、脂肪、筋肉、および繊維状組織）へと分化す る能力を有する結合組織前駆細胞は、極微量でしか骨髄中に存在しない。1mlの 骨髄中に存在するこのような細胞の数は、約100細胞〜約20,000細胞と被験体ご とに広範に変化する。これは、平均して骨髄中の有核細胞20,000あたり約１細胞 〜40,000あたり約１細胞を表す。従って、所定の容量の合成担体移植片材料が匹 敵する容量の新鮮な骨髄中に浸漬することにより作製される複合プラントは、比 較的少ない結合組織前駆細胞を含有する。 従って、複合インプラントにおける結合組織前駆細胞の相対濃度を増加させる 技術が以前に開発されてきた。この技術は、組織培養ディッシュに骨髄細胞の懸 濁液をプレートし、培養物中の結合組織前駆細胞の数が増大するまで選択培地中 で１日以上細胞を培養し、次いで組織培養ディッシュから細胞を剥離して、培養 的に増殖させた結合組織前駆細胞の集団を含む懸濁液を提供することを含む。次 いで、複合インプラントは、この培養的に増殖させた細胞の懸濁液中に合成セラ ミック担体を浸漬することにより作製される。不幸にも、複合インプラントを調 製するこの方法は、非常に時間がかかる。さらに、この方法で使用した培養的に 増殖させた細胞が、被移植者から得られた骨髄吸引物由来である場合、被移植者 は複数の侵襲性手順（その骨髄を取り出す手順および後日複合インプラントを移 植する手順）を受けなければならない。さらに、被移植者は１回より多くの麻酔 に曝露され得る。 従って、手術中（すなわち、被移植者から骨髄が採取されるのと同時）に実施 され得る複合骨髄移植片の新しい調製方法を有することが望ましい。結合組織前 駆細胞の供給源として骨髄吸引物を使用し、そして結合組織前駆細胞の富化集団 を含有する複合骨移植片の形成を生じる、複合骨髄移植片の手術中の調製方法が 特に望ましい。 発明の要旨 本発明は、新しく、かつ改善された複合骨移植片の調製法を提供する。本明細 書中以下で使用される用語「骨移植片」は、結合組織前駆細胞を含み、そしてそ れゆえ軟骨または骨に分化し得る移植片をいう。本方法は、骨髄吸引物懸濁液を 提供する工程、および多孔性で生体適合性の移植可能な基体（substrate）を通 して骨髄吸引物懸濁液を通過させて結合組織前駆細胞の富化集団を有する複合骨 移植片を提供する工程を包含する。本方法は、好ましくは、被移植者からの骨髄 吸引物を使用して手術中に実施されるので、移植片調製に必要とされる時間およ び費用、ならびに被移植者が手術室に入り、侵襲性手順を受けなければならない 回数をも低減させる。本発明によって調製される改善された複合骨移植片は、結 合組織前駆細胞の富化集団、および最初の骨髄吸引物中に見い出されるより多数 の単位容量あたりの結合組織前駆細胞を含有する。 本発明はまた、本発明に従って調製される複合骨髄移植片およびその複合骨移 植片を調製するための装置を含むキットに関する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に従って複合骨移植片を調製するために使用される装置の、い くらか模式的な図である。 図2aは、ヒドロキシアパタイト基体を含む複合骨移植片上に保持された有核細 胞の数に対する、骨髄吸引物懸濁液中の有核細胞の濃度を増大することの効果を 示すグラフである。 図2bは、ヒドロキシアパタイト基体を含む複合骨移植片状に保持された結合組 織前駆細胞の数に対する、骨髄吸引物懸濁液中の有核細胞の濃度を増大すること 効果を示すグラフである。 図3aは、鉱物質除去（demineralized）ヒト海綿状骨マトリックス基体を含む 複合骨移植片上に保持された有核細胞の濃度に対する、骨髄吸引物懸濁液中の有 核細胞の濃度を増大することの効果を示すグラフである。 図3bは、鉱物質除去ヒト海綿状骨マトリックス基体を含む複合骨移植片上に保 持された結合前駆細胞の数に対する、骨髄吸引物懸濁液中の有核細胞の濃度を増 大することの効果を示すグラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、複合骨移植片を調製するための、新規なおよび改善された方法を提 供する。本方法は、骨髄吸引物を、好ましくは抗凝固剤の存在下でドナーから採 取して骨髄吸引物懸濁液を提供する工程、および骨髄吸引物懸濁液を多孔質で生 体適合性の移植可能な基体を通して通過させる工程を包含する。好ましくは、本 方法は、手術時に、好ましくは被移植者（graftee）由来の骨髄吸引物を用いて 実施される。 骨髄吸引物懸濁液の調製 骨髄吸引物は、血漿、有核結合組織前駆細胞、造血起源の他の有核細胞、有核 上皮細胞、および混入した末梢血に由来する細胞を含有する。骨髄吸引物はまた 、末梢血を含むので、骨髄が抗凝固剤を含むシリンジ中に採取されることが好ま しい。適切な抗凝固剤は、例えば、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、EDTA、およ びデキストランを含む。好ましくは、骨髄吸引物は、滅菌等張溶液と混合されて 、約1000万〜約3億の有核細胞／ml、好ましくは約2000万〜約2億5000万の有核細 胞／ml、より好ましくは約5000万〜約2億の有核細胞／mlの範囲の濃度を提供す る。適切な等張溶液は、例えば、等張緩衝化塩溶液（例えば、Hank's Balanced Salt Solutionおよびリン酸緩衝化生理食塩水）、および組織培養培地（例えば 、最小必須培地）を含む。本明細書中では、用語「骨髄吸引物懸濁液」は、等張 溶液と混合されていない骨髄吸引物、および等張溶液と混合されている骨髄吸引 物をいう。 基体 基体は、生体適合性の移植可能な移植片材料から作製される。好ましくは、材 料は、荷電した表面を有する。荷電した表面を有する生体適合性の移植可能な移 植片材料の例は、リン酸カルシウムを含む合成セラミックス、数種のポリマー、 鉱物質除去骨マトリックス、または鉱化骨マトリックスを含む。 より好ましくは、細胞接着分子は、基体の表面に結合される。用語「細胞接着 分子」は、集合的に、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血管細胞 接着分子（V-CAM）、ならびに細胞間接着分子（I-CAM）およびコラーゲンをいう 。 好ましくは、基体は、基体の総表面積が、同じ外部寸法を有する固体物体より も少なくとも５倍大きいように、十分な数の孔または通路を有する。従って、好 ましい総表面積は、粉末の塊、顆粒の塊、繊維の塊、または基体物質の高多孔性 ブロックを含む基体を用いることにより達成され得る。好ましくは、基体中の孔 のサイズは、20μより大きく、より好ましくは40μより大きく、最も好ましくは 100μより大きい。 特に適切な移植片材料は、例えば、単離された鉱化海綿状骨切片、鉱化骨の粉 末または顆粒、鉱物質除去海綿状骨切片、鉱物質除去骨の粉末または顆粒、グア ニジン-HCl抽出鉱物質除去骨マトリックス、焼結皮質骨または焼結海綿状骨、商 品名Interpore 500の下でInterporeにより販売される珊瑚質ヒドロキシアパタイ ト、および顆粒状セラミックス（例えば、Zimmerにより販売されるCollagraftを 置換する骨移植片中に取り込まれる顆粒状セラミックス）、または繊維状スポン ジ（例えば、Orquestによるコラーゲンにより作製される繊維状スポンジ）を含 む。 基体容器 好ましくは、基体は、容器内で基体を保持し、そして液体および骨髄細胞が容 器を通って流れるのを可能にするように容器内に配置される。このことは、その いずれかの末端に２つの開口部を有し、そして基体と開口部の１つとの間に配置 された１つ以上の孔を有する部材を含む容器を用いて達成される。好ましくは、 部材の孔は、液体および細胞がそれを通じて流れ、そして容器内に基体を保持す るのを可能にするのに十分なサイズの直径を有する。好ましくは、容器の長さは 、容器の幅より長く、基体内での懸濁液の滞留時間を増加させる。 好ましくは、容器は、生体適合性で、そして発熱物質を含まない材料から作製 される。適切な容器材料は、例えば、ガラス、プラスチック、または金属を含む 。容器は、容器のいずれかの末端で開口部をブロックする、２つの液流制限物（ fluid flow restrictor）を含み得るが、好ましくは液流調節物（fluid flow re gulator）は、容器の少なくとも一端に取り付けられて、基体を通しての骨髄吸 引物懸濁液の流れを調節する。条件 好ましくは、骨髄吸引物懸濁液は、外力または重力により生じ得る静水圧の下 で基体を通して流れるのを可能にされる。好ましくは、基体を通しての懸濁液の 線状溶出速度は、２mm/分と500mm/分との間、より好ましくは５mm/分と200mm/分 との間、最も好ましくは10mm/分と100mm/分との間である。 必要に応じて、溶出液は、溶出液収集器中に無菌的に収集され、そして基体を 通して１回以上再利用されて複合骨移植物中の結合組織前駆細胞の数を増加させ る。 必要に応じて、最初の骨髄吸引物懸濁液および任意の溶出液が基体を通って通 過した後に、洗浄溶液を、基体を通して通過させる。好ましくは、洗浄溶液は、 7.3〜7.5のpH範囲を有する、無菌で等張な緩衝化溶液を含む。適切な洗浄溶液は 、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、および最小必須培地 を含む。 必要に応じて、増殖因子または増殖因子を分泌するさらなる細胞を、使用の前 に複合骨移植片に添加する。添加され得る増殖因子は、例えば、線維芽細胞増殖 因子、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、インスリン様増殖因子 、および骨誘導因子（bone morphogenic protein）を含む。好ましくは、増殖因 子は、全ての以前の懸濁液および溶液を基体を通して通過させた後に、増殖因子 を含む溶液を、基体を通して通過させることにより添加される。あるいは、増殖 因子は、洗浄溶液中に取り込ませることにより添加される。 複合骨移植片の調製方法の以下の実施例は、本発明を例示することを意図する が、本発明を限定することを意図しない：実施例１ 複合骨移植片を調製するための本方法は、本方法を実施するための装置の好ま しい実施態様を示す図１を参照することにより、さらに容易に理解され得る。本 装置は、10として一般的に示されるように、多孔性で生体適合性の移植可能な基 体12、基体12を保持するための容器14、骨髄吸引物懸濁液を保持するためのレザ ーバー16、第１の液流調節物18、第２の液流調節物20、および溶出液収集器22を 備える。複合骨移植片の調製の前に、装置の全ての構成要素を滅菌する。頂部23 の除去の後に、骨髄吸引物懸濁液をレザーバー16中に導入する。次いで、液流調 節物18を開いて、骨髄吸引物懸濁液がレザーバー16から流れ出て、容器14の除去 可能な頂部24における開口部30に入り、そして基体12の上に流れるのを可能にす る。 懸濁液が基体12中に入ったとき、容器14のチップ34に取り付けられた液流調節 物20は開いて、骨髄吸引物懸濁液の溶出液が多孔性部材32を通って、容器14の開 口部36を通って、そして溶出液収集器22に流入するのを可能にする。 次いで、レザーバー16および除去可能な頂部24を容器14からはずし、そして次 いで改善された複合骨髄移植片を容器14から取り出す。基体12、結合前駆細胞の 富化集団、および他の有核骨髄細胞の不均一集団を含む改善された複合骨移植片 は、インプラントとしてまたはインビトロでの使用の用意ができている。実施例２ 直径13mmおよび厚さ５mmの寸法の珊瑚質ヒドロキシアパタイト（HA）の９つの 円筒状ディスクを、Interpore，Inc.，Irvine，Californiaから入手した。各デ ィスクを、ストップコックを取り付けた、垂直に取り付けた10ccシリンジバレル のチップに配置した。骨髄サンプルを、９人の自発的なヒト被験体から吸引によ り前腸骨稜から採取した。サンプルを、Lee-Lok骨髄吸引針、ならびに１mlの正 常生理食塩水および1000ユニットのSodium-Heparinを含有する10ccシリンジを用 いて採取した。２mlの骨髄を、各部位から吸引した。骨髄サンプルをα-MEM中に 懸濁して、１mlあたり5000万の有核細胞を含有する骨髄細胞の懸濁液を調製した 。２mlの骨髄細胞懸濁液をシリンジの頂部に導入し、そしてストップコックを調 節して骨髄細胞懸濁液がディスクを通して２ml/分で溶出するのを可能にした。 溶出液の各サンプルを、ディスクを通して３回再利用した。溶出液を収集した後 、ディスクを、６mlリン酸緩衝化生理食塩水で、２ml/分の溶出速度で洗浄し、 緩く接着した細胞を除去し、そして複合骨移植片を生成した。 初めの懸濁液、溶出液、および洗浄液中の有核細胞の数を、血球計算板を用い て計数して、得られた複合骨移植片中に保持された有核細胞の数を決定した。得 られた複合骨移植片中に保持された結合組織前駆体の数を決定するために、初め の懸濁液、溶出液、および洗浄液中の結合組織前駆体の数を、組織培養プラスチ ック上でのコロニー計数によりアッセイした。コロニー計数のために、最初の懸 濁液、溶出液、および洗浄液からの500,000の有核細胞を、別々の直径35mmの組 織培養ウェル中にプレートし、そしてデキサメタゾン（10^-8M）およびアスコル ベート（50mg/ml）を含有するα-MEM中で９日間培養した。次いで、培養した細 胞を、N',N',ジメチルナフトールM-Xホスフェートを基質として、そしてTexas F ast Redを計数染料として用いてアルカリホスファターゼ活性について染色した 。アルカリホスファターゼ活性は、造骨分化のマーカーである。従って、アルカ リホスファターゼ活性について陽性に染色されるコロニーの数は、最初の懸濁液 、溶出液、および洗浄液中に存在する結合組織前駆体の数を反映する。 各工程の後に基体上に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、溶 出液または洗浄液中に見出された有核細胞および結合前駆細胞の数を、初めの懸 濁液中の有核細胞および結合組織前駆細胞の数から引くことにより計算した。９ つの複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の平均数、な らびに複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞のパーセン トを、表１に示す。実施例２ 複合骨移植片を、骨髄サンプルを３人の異なる自発的なヒト被験体の前腸骨稜 から採取したこと、および用いた基体がLife Net，Virginia Beach，Virginiaか ら入手したヒト鉱物質除去海綿状骨マトリックスの円筒状ディスクであったこと 以外は、実施例１に記載されたように調製した。 複合移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、実施例１ に上記のように決定した。複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組織 前駆細胞の平均数、ならびに複合骨移植片中に保持された有核細胞および結合組 織前駆細胞のパーセントを、表１に示す。 表１ ヒドロキシアパタイトまたはヒト鉱物質除去海綿状骨のディスク を用いて作製された複合骨移植片中の細胞の保持 CTPC＝結合組織前駆細胞 表１に示すように、ヒドロキシアパタイトまたはヒト鉱物質除去海綿状骨の基 体で作製した複合移植片は、有意なパーセントの有核細胞（それぞれ、47％およ び24％）およびさらに大きなパーセントの結合組織前駆細胞（それぞれ、66％お よび44％）を、最初の懸濁液中に保持した。表１にまた示すように、海綿状骨ま たは珊瑚質ヒドロキシアパタイトの基体を洗浄することにより、珊瑚質HA基体中 に最初に保持された有核細胞の平均16.2％（10％〜33％の範囲）および鉱物質除 去海綿状骨マトリックス基体中に保持された細胞の39.45％（33〜86％の範囲） が除去された。 表１に示すように、ヒドロキシアパタイトまたはヒト鉱物質除去海綿状骨のい ずれかで作製された複合移植片は、他の骨髄由来有核細胞と比較して結合組織前 駆細胞を選択的に保持した。この選択的保持は、保持された結合組織前駆細胞 の％の、基体上に保持された有核細胞の％に対する比（＞１）により示される。 従って、ヒドロキシアパタイトディスクまたはヒト鉱物質除去海綿状骨ディスク のいずれかで調製された複合骨移植片は、結合前駆細胞の富化集団を含む。 最初の骨髄サンプル中に見出される濃度より上の結合組織前駆細胞の濃度は、 保持された結合組織前駆細胞の数を、ディスクの容量（.63cm³）で割ることによ り示される。表１で示すように、HAディスクを含む複合骨髄移植片中に保持され た結合組織前駆細胞の平均濃度は、最初の骨髄サンプル中の濃度より2.8倍大き かった。同様に、鉱物質除去海綿状骨マトリックスを含む複合骨移植片中に保持 された結合組織前駆細胞の平均濃度は、最初の骨髄サンプルにおいてよりも1.3 倍大きかった。実施例３ 45の複合骨移植片を、骨髄懸濁液中の有核細胞の濃度が９人のヒトドナーの各 々で500万、1000万、2000万、4000万、および5000万の細胞/mlの間で変化したこ と以外は、実施例１に記載のように調製した。得られた複合骨移植片の各々の上 で保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、実施例１に記載されたよ うに決定した。結果を図2aおよび2bに示す。 図2aおよびbに示すように、複合骨移植片中に保持された有核細胞の数および 結合組織前駆細胞の数は、ヒドロキシアパタイト基体を通過した骨髄細胞の数が 増加するにつれて、本質的に線状の様式で増加した。このことは、骨髄由来細胞 でのヒドロキシアパタイト基体の飽和が、評価した基体容量に対する細胞の範囲 にわたって生じなかったことを示す。実施例４ 15の複合骨移植片を、骨髄懸濁液中の有核細胞の濃度が、３人のヒトドナーの 各々で500、1000、2000、4000、および5000万の細胞/mlの間で変化したこと以外 は、実施例２に記載されたように鉱物質除去海綿状骨マトリックスのディスクを 用いて調製した。得られた複合骨移植片中に保持された有核細胞の数および結合 組織前駆体コロニーの数を反映するデータを、図3aおよび3bに示す。 図3aおよび3bに示すように、複合骨移植片中に保持された有核細胞の数および 結合組織前駆細胞の数は、鉱物質除去海綿状骨マトリックス基体を通過した骨髄 細胞の数が増加するにつれて、本質的に線状の様式で増加した。このことは、骨 髄由来細胞での基体の飽和が、評価した基体容量に対する細胞の範囲にわたって 生じなかったことを示す。実施例５ 複合骨移植片を、ローディングの後に６mlのリン酸緩衝化生理食塩水で基体が 洗浄されなかったこと以外は、実施例１に記載されたように、500万の有核細胞/ mlを含有する骨髄懸濁液２ccを用いて調製した。実施例１においてのように洗浄 されたのと同一の様式でローディングされた同一のディスクと比較して、非洗浄 ディスクは、同数の結合組織前駆体（示した場合は1000）およびより大きな数の 骨髄由来有核細胞（洗浄した実施例において120万に対して、220万）を保持して いた。インビトロで24日間の培養後、これらのさらなる細胞の存在は、結合組織 前駆体のより大きな増殖および分化をもたらした。このことは、造骨分化のマー カーである、アルカリホスファターゼ活性を発現した細胞により覆われた、より 大きな表面積により明示される。実施例６ 複合骨移植片を、骨髄懸濁液がヒドロキシアパタイトディスクを３回ではなく １回のみにわたって再利用されたこと以外は、実施例１に記載されたように調製 した。このことは、珊瑚質ヒドロキシアパタイトのディスクに付着したままであ る細胞および結合組織前駆体の数を低減した。実施例７ ３つの複合骨移植片を、骨髄懸濁液中の有核細胞の濃度を、１mlあたり１億か ら１億5000万の有核細胞に増加させたこと以外は、実施例１に記載されたように 調製した。ヒドロキシアパタイトディスクを通過した細胞の数の増加は、複合骨 移植片中に保持された有核細胞および結合組織前駆細胞の数を、それぞれ、平均 66.84％および52.0％増加させた。これらの高細胞性懸濁液は、増加した粘度お よびよりゆっくりな溶出流速を示した。 複合骨髄移植片を調製するこれらの方法は、代表的には、完了するまで60分間 も必要としなかった。従って、これらの方法は、骨髄ドナー／被移植者が手術室 にいる間に実施され得る。従って、複合骨移植片を得るために被移植者が侵襲的 手順を経験しなければならない機会の数は、これらの方法を用いることにより低 減され得る。 これらの方法に従って調製される改善された複合骨移植片は、生体適合性の移 植可能な基体および結合組織前駆細胞の富化集団を含んでいた。本明細書中で用 いる用語「結合組織前駆細胞の富化集団」は、全ての有核骨髄細胞と比較した場 合の結合組織前駆細胞のパーセントが、最初の骨髄吸引物においてよりも複合骨 髄移植片においてより大きいことを意味する。さらに、改善された複合骨髄移植 片における結合組織前駆細胞の濃度は、最初の吸引物におけるこれらの細胞の濃 度よりも約２倍大きかった。 改善された複合骨移植片はまた、結合組織前駆細胞以外の有核細胞（骨髄由来 の上皮細胞および造血細胞を含む）の集団ならびに末梢血由来の血小板の集団を 含んでいた。骨髄吸引物懸濁液中の赤血球および血漿は、複合骨移植片中に選択 的に保持されず、従って改善された複合骨移植片は、代表的には、５％未満の赤 血球を最初の懸濁液中に含む。 改善された複合骨移植片は、骨髄吸引ドナー中への、または免疫学的に適合性 の宿主中への移植のために適切である。改善された複合骨移植片はまた、インビ トロでの結合組織前駆細胞の増殖および分化に対するサイトカイン、ホルモン、 および他の生化学的分子の効果を評価するために有用である。 本発明はまた、骨髄細胞の単離集団中の結合組織前駆細胞の濃度を増加させる ための方法を提供する。本方法は、骨髄吸引物懸濁液を、多孔性で生体適合性の 移植可能な移植片材料を通して通過させ、そこに化学的に結合した有核骨髄細胞 を有するマトリックスを提供する工程、マトリックスと有核骨髄細胞との間の化 学的結合を破壊し得る溶液で有核骨髄細胞をマトリックスから分離する工程、次 いで解離した細胞を収集する工程を含む。有核骨髄細胞をマトリックスから解離 するために適切な溶液は、例えば、トリプシンを含む培地、例えば、EGTAのよう なキレーターを含む増殖培地を含む。有核骨髄細胞の単離集団中の結合組織前駆 細胞の相対濃度をさらに増加させるために、洗浄溶液を、細胞がそこから解離さ れる前にマトリックスを通して通過させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．改善された複合骨移植片の調製方法であって、以下の工程： （a）骨髄吸引物懸濁液を提供する工程；および （b）該骨髄吸引物懸濁液を、多孔性で生体適合性の移植可能な基体を通して 通過させる工程を包含する、方法。 ２．前記骨髄吸引物懸濁液が抗凝固剤を含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記基体を通った前記骨髄吸引物懸濁液の溶出液を再利用する工程をさらに 包含する、請求項２に記載の方法。 ４．前記骨髄吸引物懸濁液が前記基体を通って通過した後に該基体を洗浄する工 程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。 ５．前記溶出液が前記基体を通して再利用された後に該基体を洗浄する工程をさ らに包含する、請求項３に記載の方法。 ６．前記基体が、リン酸カルシウムを含む合成セラミック、鉱化骨、鉱物質除去 骨、およびコラーゲンからなる群から選択される移植片材料を含む、請求項１に 記載の方法。 ７．前記基体が外部寸法を有し、そして同じ外部寸法を有する固体物体よりも少 なくとも５倍大きい総表面積を有する、請求項１に記載の方法。 ８．増殖因子を含む溶液を前記基体を通して通過させる工程をさらに包含する、 請求項１に記載の方法。 ９．前記基体が、その表面に結合した細胞接着分子を含む、請求項７に記載の方 法。 １０．工程（a）の前に等張液を前記骨髄吸引物に添加して、約1000万の有核細 胞／ml〜約３億有核細胞／mlの範囲の濃度を有する骨髄吸引物液懸濁液を提供す る、請求項１に記載の方法。 １１．前記基体を通しての前記骨髄吸引物懸濁液の直線的溶出速度が、約2mm／ 分〜約500mm／分である、請求項１に記載の方法。 １２．複合骨髄移植片であって、以下： （a）多孔性で生体適合性の移植可能な基体； （b）有核骨髄細胞の不均一集団；および （c）結合組織前駆細胞の富化集団、 を含む、複合骨髄移植片。 １３．骨髄吸引物懸濁液から複合骨髄移植片を調製するためのキットであって、 以下： （a）多孔性で生体適合性の移植可能な基体；および （b）該基体を保持するための容器であって、該容器は該基体を保持し、そし てそこを通しての骨髄吸引物懸濁液の流れを可能にするように形成され、該容器 が２つの端を有し、該端の各々が開口部を規定する、容器、 を含む、キット。 １４．前記基体を通しての前記骨髄吸引物懸濁液の流速を調節するために、前記 容器の１端に取り付け可能な液流調節器をさらに含む、請求項１２に記載のキッ ト。 １５．さらに、 （a）前記骨髄吸引物懸濁液を保持するためのレザーバー；および （b）該リザーバーから前記容器への該骨髄吸引物懸濁液の流れを調節するた めに、該リザーバーに取り付け可能な液流調節器、 を含む、請求項１２に記載のキット。 １６．前記容器からの前記骨髄吸引物懸濁液の溶出液を受けるための溶出液レシ ーバーをさらに含む、請求項１２に記載のキット。 １７．前記基体が、外部寸法を有し、そして同じ外部寸法を有する固体物体表面 積よりも少なくとも５倍大きい総表面積を有する、請求項１２に記載のキット。 １８．前記基体が、リン酸カルシウムを含むセラミック、コラーゲン、鉱化骨、 鉱物質除去骨からなる群から選択される材料から形成される、請求項１２に記載 のキット。 １９．前記基体が、その表面に化学結合した細胞接着分子を含む、請求項１５に 記載のキット。 ２０．骨髄細胞の単離集団中の結合組織前駆細胞の濃度を増加させるための方法 であって、以下： （a）骨髄吸引物懸濁液を、多孔性で生体適合性の移植可能な基体を通して通 過させ、そこに化学結合した有核骨髄細胞を有するマトリックスを提供する工程 ； （b）該有核骨髄細胞を該マトリックスから解離させる工程；および （c）該解離した骨髄細胞を収集する工程、 を包含する、方法。