DE69930257T2

DE69930257T2 - Vorrichtung und verfahren zur herstellung eines implantierbaren gefässtransplantats

Info

Publication number: DE69930257T2
Application number: DE69930257T
Authority: DE
Inventors: Frederick George Cleveland Heights MUSCHLER
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: AU4271297A; ES2260913T3; EP0912205A4; EP0912205B1; ATE319390T1; WO1999059500A2; WO1998000174A3; EP1085842B1; JP2002515288A; CA2335851C; US5824084A; WO1998000174A2; AU755925B2; DK1085842T3; AU4199499A; JP2001502561A; EP1085842A4; AU714547B2; CA2335851A1; JP4184603B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Knochentransplantation wird umfassend verwendet, um Brüche und nicht vorhandene Knochenverbindungen zu behandeln und Arthrodesen zu induzieren. Autogene Substantia spongiosa des Knochens, die aus einer Stelle des Transplantationspatienten entnommen und in eine andere Stelle desselben Patienten implantiert wird, ist zur Zeit die wirksamste Form der Knochentransplantation. Autogene Substantia spongiosa liefert das Gerüst, das die Verteilung der Knochenheilungsreaktion unterstützt. Autogene Substantia spongiosa liefert auch die Bindegewebe-Vorläuferzellen, die neues Knorpel- oder Knochengewebe bilden. Die Abnahme von autogenem Knochen führt jedoch zu signifikanten Kosten sowie signifikanter Morbidität, einschließlich Narben, Blutverlust, Schmerzen, längerer Operations- und Rehabilitationszeiten und Infektionsrisiko. Darüber hinaus kann in manchen klinischen Situationen das Volumen der Transplantationsstelle das Volumen des verfügbaren Eigentransplantats übersteigen. Folglich wurden in einem Versuch, die Morbidität und Kosten von Knochentransplantationsverfahren zu reduzieren, Alternativen zu Eigentransplantaten entwickelt.
Mehrere gereinigte oder synthetische Materialien, umfassend Keramik, Biopolymere, verarbeitete Fremdtransplantatknochen und auf Collagen basierende Matrices, wurden bereits untersucht oder entwickelt, um sie als einen Ersatz für Eigentransplantate einzusetzen. Die FDA (Food and Drug Administration, USA) genehmigte eine poröse, synthetische Corallin-Hydroxyapatit-Keramik zur Verwendung bei im Knochen enthaltenen Knochendefekten. Ein gereinigtes Collagen/Keramik-Verbundmaterial ist auch zur Verwendung bei akuten Langknochenbrüchen anerkannt. Auch wenn diese Materialien die Morbidität vermeiden, die mit der Abnahme von Eigentransplantaten aus dem Transplantationspatienten einhergeht, und Probleme in Verbindung mit der limitierten Menge an verfügbarem Eigentransplantat ausräumt, ist die klinische Wirksamkeit der synthetischen Materialien im Vergleich zu Eigentransplantaten im Allgemeinen dennoch geringer.
Die synthetischen Transplantatmaterialien wurden auch als Träger für Knochenmarkzellen verwendet. Wurden solche Verbundmaterialien in Skelettdefekte implantiert, so differenzierten sich die Bindegewebe-Vorläuferzellen zu Skelettgewebe. In manchen Fällen wurden die Verbundimplantate durch Einweichen des synthetischen Transplantatmaterials in einer Zellsuspension, die aus einem Knochenmarkpfropfen gewonnen wurde, hergestellt. Die Bindegewebe-Vorläuferzellen, die die Fähigkeit besitzen, sich zu Knorpel, Knochen und anderem Bindegewebe wie Fett, Muskel und Faserbindegewebe zu differenzieren, sind jedoch in sehr geringen Mengen im Knochenmark vorhanden. Die Anzahl solcher Zellen, die in 1 ml Knochenmark vorhanden sind, variiert sehr stark von Person zu Person von etwa 100 Zellen bis 20.000 Zellen. Dies ergibt einen Mittelwert von etwa einer von 20.000 bis zu einer von 40.000 kernhältigen Zellen im Knochenmark. Somit enthält ein Verbundimplantat, das durch Einweichen eines gegebenen Volumens an synthetischem Trägertransplantatmaterial in einem vergleichbaren Volumen an frischem Knochenmark hergestellt wird, relativ wenig Bindegewebe-Vorläuferzellen.
Demgemäß wurde bereits ein Verfahren entwickelt, um die relative Konzentration an Bindegewebe-Vorläuferzellen in Verbundimplantaten zu erhöhen. Dieses Verfahren umfasst das Ausplattieren einer Suspension von Knochenmarkzellen auf Gewebekulturplatten, das Kultivieren der Zellen in einem ausgewählten Medium einen oder mehrere Tage lang, bis die Anzahl an Bindegewebe-Vorläuferzellen in der Kultur ansteigt, und anschließend das Lösen der Zellen aus den Gewebekulturplatten, um eine Zellsuspension bereitzustellen, die eine kulturerweiterte Population an Bindegewebe-Vorläuferzellen enthält. Verbundimplantate werden dann durch Einweichen von synthetischen Keramikträgern in dieser Suspension von kulturerweiterten Zellen hergestellt. Leider ist dieses Verfahren zur Herstellung von Verbundimplantaten sehr zeitaufwändig. Darüber hinaus muss, wenn die in diesem Verfahren verwendeten kulturerweiterten Zellen aus Knochenmarkpunktionen stammen, die dem Transplantationspatienten entnommen wurden, dieser Patient mehrfachen invasiven Verfahren unterzogen werden, einem, um sein oder ihr Knochenmark zu entnehmen, und einem zweiten zu einem späteren Zeitpunkt, um das Verbundimplantat zu implantie ren. Darüber hinaus kann der Transplantationspatient möglicherweise mehr als einmal eine Anästhesie bekommen.
Folglich ist es wünschenswert, über ein neues Verfahren zur Herstellung eines Knochenmark-Verbundtransplantats zu verfügen, das intraoperativ, d.h. zum selben Zeitpunkt, zu dem das Knochenmark dem Patienten entnommen wird, durchgeführt werden kann. Ein intraoperatives Verfahren zur Herstellung eines Knochenmark-Verbundtransplantats, das Knochenmarkpunktion als Quelle für die Bindegewebe-Vorläuferzellen verwendet und das in der Bildung eines Knochen-Verbundtransplantats resultiert, das eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen enthält, ist besonders wünschenswert.
Die WO 98/00174 beschreibt Verfahren zur Herstellung von Knochentransplantat, die die folgenden Schritte umfassen: (a) Bereitstellen einer Knochenmarkpunktionssuspension; und (b) Durchfließenlassen der Knochenmarkpunktionssuspension durch ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat; sowie ein Set zur Herstellung eines Knochenmark-Verbundtransplantats aus einer Knochenmarkpunktionssuspension, umfassend: (a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat; und (b) ein Behältnis zur Aufnahme dieses Substrats, worin das Behältnis so konfiguriert ist, dass das Substrat zurückgehalten und ein Fluss der Knochenmarkpunktionssuspension durch dieses ermöglicht wird, wobei das Behältnis zwei Enden aufweist, wobei jedes der Enden eine Öffnung definiert. Blutplättchen, die aus kontaminierendem peripheren Blut stammen, werden als Beispiele für kernhältige Zellen genannt, die keine Bindegewebe-Vorläuferzellen sind und im Knochentransplantat vorhanden sind (siehe Seite 19, Zeilen 14-23, und Seite 6. Zeilen 11-14 darin).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betriff ein Set zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats aus einer Knochenmarkpunktionssuspension, umfassend:

(a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat mit Blutplättchen auf einer Oberfläche davon, das mittels Durchfließenlassen eines Blutplättchenkon zentrats, das ein Antikoagulans enthält, oder eines isolierten Blutplättchenkonzentrats durch das Substrat erhältlich ist; und
(b) ein Behältnis zur Aufnahme dieses Substrats, worin das Behältnis so konfiguriert ist, dass das Substrat zurückgehalten und ein Fluss der Knochenmarkpunktionssuspension durch dieses ermöglicht wird, wobei das Behältnis eine innere Oberfläche und zwei Enden aufweist, wobei jedes dieser Enden eine Öffnung definiert.

In einer Ausführungsform weist das Substrat Antikörper auf, die sich an Oberflächenantigene binden, die an der Oberfläche von Bindegewebe-Vorläuferzellen oder Blutplättchen exprimiert werden, worin die Antikörper an eine zugängliche Oberfläche des Substrats gebunden sind.
In einer Ausführungsform sind die Antikörper aus STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20 und Antikörpern gegen alkalische Phosphatase ausgewählt.
In einer Ausführungsform ist das Substrat steril.
In einer Ausführungsform umfasst das Set weiters:
einen an einem Ende des Behältnisses anbringbaren Strömungsregler zur Regulierung der Durchflussgeschwindigkeit der Knochenmarkpunktionssuspension durch das Substrat.
In einer Ausführungsform umfasst das Set weiters:

(a) einen Speicherbehälter zur Aufnahme der Knochenmarkpunktionssuspension; und
(b) einen am Speicherbehälter anbringbaren Strömungsregler zur Regulierung des Flusses der Knochenmarkpunktionssuspension vom Speicherbehälter in das Behältnis.

In einer Ausführungsform umfasst das Set weiters:
einen Ausfluss-Sammelbehälter zur Aufnahme eines Ausflusses der Knochenmarkpunktionssuspension aus dem Behältnis.
In einer Ausführungsform weist das Substrat äußere Dimensionen und eine zugängliche Gesamtoberfläche auf, die zumindest fünfmal größer ist als die Oberfläche eines festen Gegenstands, der dieselben äußeren Dimensionen aufweist.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus Keramik, die Calciumphosphat oder Bioglas umfasst.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus einem Material, ausgewählt aus Collagen, mineralisiertem Knochen und entmineralisiertem Knochen.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus Hyaluronsäure oder einem synthetischen Biopolymer.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus einem synthetischen Biopolymer.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus Hyaluronsäure.
In einer Ausführungsform weist das Substrat an eine seiner Oberflächen gebundene Adhäsionsmoleküle auf.
In einer Ausführungsform weist das Substrat an eine seiner Oberflächen gebundene Wachstumsfaktoren auf.
In einer Ausführungsform weist das Substrat Poren oder Kanäle mit einem Durchmesser von über 40 μm auf.
In einer Ausführungsform umfasst das Behältnis weiters einen porösen Teil zum Zurückhalten des Substrats innerhalb des Behältnisses.
In einer Ausführungsform besteht das Behältnis aus einem Material, das bioverträglich ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Knochenmark-Verbundtransplantat, umfassend:

(a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat mit Blutplättchen auf einer Oberfläche davon, das mittels Durchfließenlassen eines Blutplättchenkonzentrats, das ein Antikoagulans enthält, oder eines isolierten Blutplättchenkonzentrats durch das Substrat erhältlich ist;
(b) eine heterogene Population kernhältiger Knochenmarkzellen; und
(c) eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung eines implantierbaren Transplantats, insbesondere eines Knochen-Verbundtransplantats, bereit. Wie hierin nachstehend verwendet, bezieht sich "Knochentransplantat" auf ein Transplantat, das Bindegewebe-Vorläuferzellen umfasst und daher in der Lage ist, sich zu Knorpel- oder Knochengewebe zu differenzieren. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Knochenmarkpunktionssuspension und das Durchfließenlassen der Knochenmarkpunktionssuspension durch ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat, um ein Knochen-Verbundtransplantat bereitzustellen, das eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen aufweist. Da das Verfahren vorzugsweise intraoperativ unter Verwendung einer Knochenmarkpunktion aus dem Transplantationspatienten durchgeführt wird, vermindert es Zeit und Kosten, die für die Transplantatvorbereitung erforderlich sind, wodurch der Patient auch weniger häufig in den Operationssaal muss und invasiven Eingriffen ausgesetzt ist. Das durch das vorliegende Verfahren hergestellte, verbesserte Knochen-Verbundtransplantat enthält eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen und zahlreichere Bindegewebe-Vorläuferzellen pro Volumeneinheit als jene, die in der ursprünglichen Knochenmarkpunktion zu finden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Knochenmark-Verbundtransplantat, das gemäß dem vorliegenden Verfahren hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set bereit, das die Vorrichtung zur Herstellung eines implantierbaren Transplantats, insbesondere eines Knochen-Verbund transplantats, umfasst. Das Set umfasst ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat und ein Behältnis, das so konfiguriert ist, dass das Substrat zurückgehalten und ein Fluss einer Zellsuspension, insbesondere einer Knochenmarkpunktionssuspension, durch dieses ermöglicht wird. Vorzugsweise ist das Substrat steril.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung, die zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
2a ist ein Diagramm, das die Wirkung einer Steigerung der Konzentration an kernhältigen Zellen in der Knochenmarkpunktionssuspension auf die Anzahl kernhältiger Zellen, die an einem Knochen-Verbundtransplantat, das ein Hydroxyapatitsubstrat umfasst, zurückgehalten werden, zeigt. Die Daten fassen die Resultate von neun menschlichen Probanden unter Einsatz identischer Bedingungen zusammen.
2b ist ein Diagramm, das die Wirkung einer Steigerung der Konzentration an kernhältigen Zellen in der Knochenmarkpunktionssuspension auf die Anzahl an Bindegewebe-Vorläuferzellen, die an einem Knochen-Verbundtransplantat, das ein Hydroxyapatitsubstrat umfasst, zurückgehalten werden, zeigt. Die Daten fassen die Resultate von neun menschlichen Probanden unter Einsatz identischer Bedingungen zusammen.
3a ist ein Diagramm, das die Wirkung einer Steigerung der Konzentration von kernhältigen Zellen in Knochenmarkpunktionssuspension auf die Konzentration kernhältiger Zellen, die an einem Knochen-Verbundtransplantat zurückgehalten werden, das ein Substrat aus entmineralisierter menschlicher Substantia spongiosa umfasst, zeigt.
3b ist ein Diagramm, das die Wirkung einer Steigerung der Konzentration von kernhältigen Zellen in Knochenmarkpunktionssuspension auf die Konzentration von Bindegewebe-Vorläuferzellen, die an einem Knochen-Verbundtransplantat zurückge halten werden, das ein Substrat aus entmineralisierter menschlicher Substantia spongiosa umfasst, zeigt. Die Daten fassen die Resultate von drei menschlichen Probanden unter Einsatz identischer Bedingungen zusammen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats bereit. Das Verfahren umfasst das Entnehmen einer Knochenmarkspunktion aus einem Spender, vorzugsweise in Gegenwart eines Antikoagulans, um eine Knochenmarkpunktionssuspension bereitzustellen, und das Durchfließenlassen der Knochenmarkpunktionssuspension durch ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat. Vorzugsweise ist das Substrat steril. Vorzugsweise wird das Verfahren intraoperativ unter Verwendung einer Knochenmarkspunktion vorzugsweise aus dem Transplantationspatienten durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines implantierbaren Transplantats bereit, das an seiner Oberfläche Blutplättchen aufweist. Das Verfahren umfasst das Durchfließenlassen einer Blutplättchensuspension durch ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat. Geeignete Suspensionen umfassen beispielsweise Knochenmark, isoliertes Blutplättchenkonzentrat und Blut, das ein Antikoagulans enthält.
Herstellung einer Knochenmarkpunktionssuspension
Knochenmarkspunktion enthält Plasma, kernhältige Bindegewebe-Vorläuferzellen, kernhältige blutbildende Zellen, Endothelzellen und Zellen, die aus verunreinigendem peripherem Blut stammen, einschließlich rote Blutkörperchen und Blutplättchen. Da die Knochenmarkspunktion auch peripheres Blut enthält, wird bevorzugt, dass das Knochenmark in einer Spritze abgenommen wird, die ein Antikoagulans enthält. Geeignete Antikoagulanzien umfassen beispielsweise Heparin, Natriumcitrat und EDTA. Vorzugsweise wird die Knochenmarkspunktion mit einer sterilen isotonischen Lösung vermischt, um eine Konzentration im Bereich von etwa 10 Millionen bis etwa 300 Mil lionen kernhältige Zellen/ml, vorzugsweise von etwa 20 Millionen bis etwa 250 Millionen kernhältige Zellen/ml, noch bevorzugter von etwa 50 Millionen bis etwa 200 Millionen kernhältige Zellen/ml, bereitzustellen. Geeignete isotonische Lösungen umfassen beispielsweise isotonische gepufferte Salzlösungen, wie Hank's Balanced Salt Solution (Salzlösung) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung, und Gewebekulturmedium wie Minimalmedium (MEM). Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Knochenmarkpunktionssuspension" auf eine Knochenmarkspunktion, die mit einer isotonischen Lösung vermischt wurde.
Substrat
Das Substrat besteht aus bioverträglichem, implantierbarem Transplantatmaterial. Vorzugsweise weist das Material eine geladene Oberfläche auf. Beispiele für bioverträgliche, implantierbare Transplantatmaterialien mit einer geladenen Oberfläche umfassen Keramiken, umfassend Calciumphosphat, wie beispielsweise Hydroxyapatit- oder Tri-Calciumphosphat; sowie entmineralisierte Knochenmatrix; oder mineralisierte Knochenmatrix. Andere geeignete Transplantatmaterialien umfassen Biopolymere wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polygalactaruronsäure, Polycaprolacton, Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, Polysulfon, Polyethylen und Polypropylen. Andere geeignete Transplantatmaterialien sind Hyaluronsäure, die mit oder ohne Vernetzung gereinigt werden kann, Bioglas und Collagen.
Noch bevorzugter sind Zelladhäsionsmoleküle an die Oberfläche des Substrats gebunden. Die Bezeichnung "Zelladhäsionsmoleküle" bezieht sich insgesamt auf Laminine, Fibronectin, Vitronectin, vaskuläre Zelladhäsionsmoleküle (V-CAM), intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (I-CAM), Tenascin, Thrombospondin, Osteonectin, Osteopontin, Knochensialoprotein und Collagene.
Gegebenenfalls weist das Substrat Wachstumsfaktoren auf, die an seine Oberfläche gebunden sind. Wie hierin verwendet umfasst die Bezeichnung "Wachstumsfaktoren" jegliches Zellprodukt, das das Wachstum oder die Differenzierung anderer Zellen, insbesondere von Bindegewebe-Vorläuferzellen, moduliert. Wachstumsfaktoren um fassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Isoformen von aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktoren (PDGF), Fibroblastenwachstumsfaktoren, Epithelwachstumsfaktoren, Isoformen von transformierendem Wachstumsfaktor Beta, insulinähnliche Wachstumsfaktoren und morphogenetische Knochenproteine.
Gegebenenfalls weist das Substrat Antikörper auf, die Affinität zu Bindegewebe-Vorläuferstammzellen aufweisen, die an die Oberfläche davon gebunden sind. Geeignete Antikörper umfassen beispielsweise STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20 und Antikörper gegen alkalische Phosphatase. Solche Antikörper werden in Haynesworth et al., Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone 13, 69-80 (1992a); S. Bruder et al., Identification and characterization of a cell surface differentiation antigen on human osteoprogenitor cells. Trans Ortho Res Soc 21, 574 (1996); S.E. Haynesworth et al., Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone 13, 69-80 (1992); K. Stewart et al., Co-expression of the STRO-1 antigen and alkaline phosphatase in cultures of human bone and marrow cells. J Bone Miner Res 11 (Beilage), 142 (1996); JE Flemming et al., Monoclonal Antibody Against Adult Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Recognizes Developing Vasculature in Embryonic Human Skin. Developmental Dynamics 212, 119-132 (1998); und S.P. Bruder et al., Monoclonal Antibodies Reactive With Human Osteogenic Cell Surface Antigens. Bone 21(3), 225-235 (1997), beschrieben.
Vorzugsweise weist das Substrat eine ausreichende Anzahl an Poren oder Kanälen auf, sodass die zugängliche Gesamtoberfläche des Substrats zumindest fünfmal größer ist als ein fester Gegenstand, der dieselben äußeren Dimensionen aufweist. Somit kann die bevorzugte Gesamtoberfläche unter Verwendung eines Substrats erreicht werden, das eine Pulvermasse, eine Granulatmasse, eine Fasermasse oder einen stark porösen Block aus Substratmaterial umfasst. Vorzugsweise beträgt die Größe der Poren im Substrat mehr als 20 μm, noch bevorzugter mehr als 40 μm, am meisten bevorzugt mehr als 100 μm. Besonders nützliche Transplantatmaterialien umfassen beispielsweise isolierte mineralisierte Spongiosa-Schnitte, Pulver oder Granulate aus mineralisiertem Knochen, entmineralisierte Spongiosa-Schnitte, Pulver oder Granulate aus entmineralisiertem Knochen, Guanidin-HCl-extrahierte, entmineralisierte Knochenmatrix, gesinterte(n) Kortexknochen oder Spongiosa, Corallin-Hydroxyapatit, vertrieben von Interpore unter dem Handelsnamen Interpore 500 oder Interpore 200, und gekörnte Keramiken wie jene, die in den Knochentransplantatersatz Collagraft eingebunden sind, der von Zimmer vertrieben wird, oder filamentöse Schwämme, wie jene, die Orquest aus Collagen herstellt.
Substratbehältnis
Vorzugsweise wird das Substrat in einem Behältnis aufbewahrt, das so konfiguriert ist, dass das Substrat im Behältnis zurückgehalten und ein Fluss der Knochenmarkzellen durch das Behältnis ermöglicht wird. Dies erfolgt unter Verwendung eines Behältnisses mit zwei Öffnungen an jedem Ende davon, das ein Element mit einer oder mehreren Poren umfasst, die zwischen dem Substrat und einer der Öffnungen angebracht sind. Vorzugsweise weisen die Poren des Elements einen Durchmesser mit ausreichender Größe auf, um den Fluss von Fluid und Zellen der Knochenmarkpunktionssuspension durch diese Poren zu ermöglichen und das Substrat im Behältnis zurückzuhalten. Vorzugsweise ist die Länge des Behältnisses größer als die Breite des Behältnisses, um die Verweilzeit der Suspension im Substrat zu erhöhen.
Vorzugsweise besteht das Behältnis aus einem Material, das bioverträglich und pyrogenfrei ist. Geeignete Behältnismaterialien umfassen beispielsweise Glas, Kunststoff oder Metall. Auch wenn das Behältnis zwei Strömungsregler umfassen kann, die die Öffnungen an beiden Enden des Behältnisses blockieren, wird ein Strömungsregler vorzugsweise an zumindest einem Ende des Behältnisses angebracht, um den Fluss der Knochenmarkpunktionssuspension durch das Substrat zu regulieren.
Bedingungen
Um die Implantierung des Transplantats in einen Patienten zu ermöglichen, wird bevorzugt, dass das Substrat steril ist und dass die innere Oberfläche des Behältnis ses, das das Substrat enthält, ebenfalls steril ist. Vorzugsweise wird die Knochenmarkpunktionssuspension unter hydrostatischem Druck, der durch äußere Kräfte oder durch die Schwerkraft erzeugt werden kann, durch das sterile Substrat fließen gelassen. Vorzugsweise liegt die lineare Elutionsgeschwindigkeit der Suspension durch das Substrat zwischen 2 und 500 mm/min, noch bevorzugter zwischen 5 und 200 mm/min, am meisten bevorzugt zwischen 10 und 100 mm/min.
Gegebenenfalls wird der Ausfluss auf sterile Weise in einem Ausfluss-Sammelbehälter gesammelt und durch das Substrat einmal oder mehrere Male wieder verwertet, um die Anzahl an Bindegewebe-Vorläuferzellen im Knochen-Verbundtransplantat zu erhöhen.
Gegebenenfalls wird, nachdem die ursprüngliche Knochenmarkpunktionssuspension und jeglicher Ausfluss durch das Substrat durchfließen gelassen wurde, eine Waschlösung durch das Substrat durchfließen gelassen. Vorzugsweise umfasst die Waschlösung eine sterile, isotonische, gepufferte Lösung mit einem pH im Bereich von 7,3 bis 7,5. Geeignete Waschlösungen umfassen beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Hank's Salzlösung und Minimalmedium (MEM).
Gegebenenfalls werden Wachstumsfaktoren oder zusätzliche Zellen, die Wachstumsfaktoren sekretieren oder aufweisen (d.h. an ihrer Oberfläche exprimieren), vor der Verwendung, d.h., bevor, während oder nach dem Zeitpunkt, zu dem die Knochenmarkpunktionssuspension durch das Substrat durchfließen gelassen wird, zum Knochen-Verbundtransplantat zugesetzt. Wachstumsfaktoren, die zugesetzt werden können, umfassen beispielsweise Isoformen von aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren, Epithelwachstumsfaktoren, transformierenden Wachstumsfaktor Beta, insulinähnliche(n) Wachstumsfaktor(en), Parathormon (PTH) oder PTH-verwandtes Peptid und morphogenetische Knochenproteine. Vorzugsweise werden Wachstumsfaktoren durch Durchfließenlassen einer Lösung, die die Wachstumsfaktoren enthält, durch das Substrat, nachdem alle vorangehenden Suspensionen und Lösungen durch das Substrat durchfließen gelassen wurden, zugesetzt. Alternativ dazu werden Wachstumsfaktoren durch Inkorporation in die Waschlösung zugesetzt. Blutplättchen, die dafür bekannt sind, Wachstumsfaktoren zu sekretieren und an negativ geladene Oberflächen anzuhaften, werden zum Transplantat mittels Durchfließenlassen einer Blutplättchensuspension, wie Blut- oder Blutplättchenkonzentrat, das ein Antikoagulans enthält, durch das Substrat zugesetzt.
Die folgenden Beispiele für Verfahren zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats sollen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen:
Beispiel 1
Das vorliegende Verfahren zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats kann leichter unter Bezugnahme auf 1 verstanden werden, die eine bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens darstellt. Die Vorrichtung, die allgemein als 10 gezeigt wird, umfasst ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat 12, ein Behältnis 14 zur Aufnahme des Substrats 12, einen Speicherbehälter 16 zur Aufnahme der Knochenmarkpunktionssuspension, einen ersten Strömungsregler 18, einen zweiten Strömungsregler 20 und einen Ausfluss-Sammelbehälter 22. Vor der Herstellung des Knochen-Verbundtransplantats werden alle Komponenten der Vorrichtung sterilisiert.
Nach Abnehmen des Deckels 23 wird die Knochenmarkpunktionssuspension in den Speicherbehälter 16 eingeführt. Dann wird der Strömungsregler 18 geöffnet, um die Knochenmarkpunktionssuspension aus dem Speicherbehälter 16 hinaus und in die Öffnung 30 des abnehmbaren Deckels 24 von Behältnis 14 und auf das Substrat 12 fließen zu lassen.
Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Suspension in das Substrat 12 eindringt, wird der Strömungsregler 20, der an der Spitze von Behältnis 14 angebracht ist, geöffnet, um die Knochenmarkpunktionssuspension durch das poröse Element 32, durch die Öffnung 36 von Behältnis 14 und in den Ausfluss-Sammelbehälter 22 fließen zu lassen.
Der Speicherbehälter 16 und der abnehmbare Deckel 24 werden dann vom Behältnis 14 abgenommen, und das verbesserte Knochenmark-Verbundtransplantat wird aus dem Behältnis 14 entfernt. Das verbesserte Knochen-Verbundtransplantat, das Substrat 12, eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen und eine heterogene Population anderer kernhältiger Knochenmarkzellen, Blutzellen und aus dem Knochen und Blut stammende adhärente Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle umfasst, ist zur Verwendung als Implantat oder zur Verwendung in vitro bereit.
Beispiel 2
Neun zylindrische Scheiben von Corallin-Hydroxyapatit (HA), die einen Durchmesser von 13 mm und eine Dicke von 5 mm aufweisen, wurden von Interpore, Inc., Irvine, Kalifornien, erhalten. Jede Scheibe wurde in der Spitze eines vertikal angeordneten 10-cm³-Spritzenzylinders gegeben, der mit einem Absperrhahn ausgestattet war. Knochenmarkproben wurden aus dem vorderen Darmbeinkamm von neun freiwilligen menschlichen Probanden mittels Punktion entnommen. Die Proben wurden unter Verwendung einer Lee-Lok-Knochenmarkpunktionsnadel und einer 10-cm³-Spritze, die 1 ml normale Kochsalzlösung und 1.000 Einheiten Natriumheparin enthielt, abgenommen. 2 ml Knochenmark wurden aus jeder Stelle punktiert. Knochenmarkproben wurden in α-MEM suspendiert, um eine Suspension aus Knochenmarkzellen herzustellen, die 50 Millionen kernhältige Zellen pro ml enthielt. 2 ml der Knochenmarkzellsuspension wurden in die Spitze der Spritze eingeführt, und der Absperrhahn wurde so eingestellt, dass die Knochenmarkzellsuspension durch die Scheibe bei 2 ml/min eluieren konnte. Jede Ausflussprobe wurde dreimal durch die Scheibe rezykliert. Nachdem der Ausfluss abgenommen worden war, wurde die Scheibe mit 6 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 2 ml/min gewaschen, um lose anhaftende Zellen zu entfernen.
Die Anzahl an kernhältigen Zellen in der anfänglichen Suspension, der Ausfluss und die Waschlösungen wurden unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt, um die Anzahl an kernhältigen Zellen zu bestimmen, die in den resultierenden Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden. Um die Anzahl an Bindegewebe-Vorläufern, die in den resultierenden Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, zu bestimmen, wurde die Anzahl an Bindegewebe-Vorläufern in den anfänglichen Suspensionen, im Ausfluss und in den Waschlösungen durch Koloniezählung an Gewebekulturkunststoff getestet. Zur Koloniezählung wurden 500.000 kernhältige Zellen aus der ursprünglichen Suspension, dem Ausfluss und der Waschlösung in getrennten Gewebekulturwells mit einem Durchmesser von 35 mm ausplattiert und in α-MEM, das Dexamethason (10^-8 M) und Ascorbat (50 mg/ml) enthielt, 9 Tage lang kultiviert. Die kultivierten Zellen wurden auf Aktivität alkalischer Phosphatase unter Verwendung von N',N'-Dimethylnaphthol-M-X-Phosphat als Substrat und Texas Fast Red als Farbstoff gefärbt. Aktivität alkalischer Phosphatase ist ein Hinweis auf osteoblastische Differenzierung. Somit spiegelt die Anzahl an Kolonien, die sich bezüglich Aktivität alkalischer Phosphatase positiv färben, die Anzahl an Bindegewebe-Vorläufern, die in der ursprünglichen Suspension, dem Ausfluss und der Waschlösung vorhanden sind, wider.
Die Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindgewebe-Vorläuferzellen, die am Substrat nach jedem Schritt zurückgehalten wurden, wurde durch Subtrahieren der Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die im Ausfluss oder der Waschlösung zu finden waren, von der Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen in der anfänglichen Suspension berechnet. Die mittlere Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den neun Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, und der Prozentsatz an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 3
Knochen-Verbundtransplantate wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, außer dass Knochenmarkproben aus dem vorderen Darmbeinkamm von drei verschiedenen, freiwilligen menschlichen Probanden entnommen wurden und die ver wendeten Substrate zylindrische Scheiben aus entmineralisierter menschlicher Spongiosa-Matrix, erhalten bei Life Net, Virginia Beach, Virginia, waren.
Die Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, wurde wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Die mittlere Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, und der Prozentsatz an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Zurückhaltung von Zellen in Knochen-Verbundtransplantaten, die unter Verwendung von Scheiben aus Hydroxyapatit oder entmineralisierter menschlicher Spongiosa hergestellt wurden

CTPC = Bindegewebe-Vorläuferzellen

Wie in Tabelle 1 gezeigt, hielten Verbundtransplantate, die mit einem Substrat aus Hydroxyapatit oder entmineralisierter menschlicher Substantia spongiosa hergestellt wurden, einen signifikanten Prozentsatz der kernhältigen Zellen (47 % bzw. 24 %) und sogar einen noch höheren Prozentsatz der Bindegewebe-Vorläuferzellen (66 % bzw. 44 %) aus der ursprünglichen Suspension zurück. Aus Tabelle 1 ist ebenfalls ersichtlich, dass das Waschen von Substraten aus Substantia spongiosa oder Corallin-Hydroxyapatit zur Entfernung eines Mittelwerts von 16,2 % (Bereich 10 % bis 33 %) der kernhältigen Zellen, die anfänglich in Corallin-HA-Substraten zurückgehalten wurden, und von 39,45 % (Bereich 33 % bis 86 %) der Zellen, die in entmineralisierten Spongiosa-Matrixsubstraten zurückgehalten wurden, führte.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, hielten die Verbundtransplantate entweder mit Hydroxyapatit oder mit entmineralisierter menschlicher Substantia spongiosa die Bindegewebe-Vorläuferzellen im Vergleich zu anderen, aus dem Knochenmark abstammenden, kernhältigen Zellen selektiv zurück. Dieses selektive Zurückhalten zeigt sich im Verhältnis (>1) von 1 % zurückgehaltener Bindegewebe-Vorläuferzellen zu den % kernhältiger Zellen, die am Substrat zurückgehalten wurden. Somit umfassen die Knochen-Verbundtransplantate, die entweder mit den Hydroxyapatitscheiben oder mit den entmineralisierten menschlichen Spongiosa-Scheiben hergestellt wurden, eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen.
Die Konzentration der oben genannten Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in der ursprünglichen Knochenmarkprobe zu finden sind, wird durch Dividieren der Anzahl an zurückgehaltenen Bindegewebe-Vorläuferzellen durch das Volumen der Scheiben (0,63 cm³) veranschaulicht. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die mittlere Konzentration von Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den HA-Scheiben umfassenden Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, 2,8-mal größer als die Konzentration in der ursprünglichen Knochenmarkprobe. In ähnlicher Weise war die mittlere Konzentration von Bindgewebe-Vorläuferzellen, die in den entmineralisierte Spongiosa-Matrix umfassenden Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, 1,3-mal größer als die ursprüngliche Knochenmarkprobe.
Beispiel 4
Fünfundvierzig Knochen-Verbundtransplantate wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, außer dass die Konzentration von kernhältigen Zellen in der Knochenmarksuspension zwischen den einzelnen neun menschlichen Spendern zwischen 5, 10, 20, 40 und 50 Millionen Zellen/ml variierte. Die Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die an jedem der resultierenden Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Die Resultate sind in den 2a und 2b gezeigt.
Wie in den 2a und 2b gezeigt ist, stieg die Anzahl an kernhältigen Zellen und die Anzahl an Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, auf im Wesentlichen lineare Weise, wenn die Anzahl an Knochenmarkzellen, die durch das Hydroxyapatitsubstrat durchfließen gelassen wurden, stieg, was darauf hinweist, dass es zu keiner Sättigung des Hydroxyapatitsubstrats an aus Knochenmark stammenden Zellen über den bewerteten Bereich von Zellen zu Substratvolumen kam.
Beispiel 5
Fünfzehn Knochen-Verbundtransplantate wurden unter Verwendung von Scheiben von entmineralisierter Spongiosa-Matrix, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt, außer dass die Konzentration an kernhältigen Zellen in der Knochenmarksuspension zwischen den einzelnen drei menschlichen Spendern zwischen 5, 10, 20, 40 und 50 Millionen Zellen/ml variierte. Die Daten, die die Anzahl an kernhältigen Zellen und die Anzahl an Bindegewebe-Vorläuferkolonien, die in den resultierenden Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, widerspiegeln, sind in den 3a und 3b gezeigt.
Wie in den 3a und 3b gezeigt ist, stieg die Anzahl an kernhältigen Zellen und die Anzahl an Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, auf im Wesentlichen lineare Weise, wenn die Anzahl an Knochenmarkzellen, die durch das entmineralisierte Spongiosa-Matrixsubstrat durchfließen gelassen wurden, stieg, was darauf hinweist, dass es zu keiner Sättigung des Substrats an aus Knochenmark stammenden Zellen über den bewerteten Bereich von Zellen zu Substratvolumen kam.
Beispiel 6
Ein Knochen-Verbundtransplantat wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung einer 2-cm³-Knochenmarksuspension, die 5 Millionen kernhältige Zellen/ml enthielt, hergestellt, außer dass das Substrat nach dem Laden nicht mit 6 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen wurde. Verglichen mit einer identischen Scheibe, die auf identische Weise geladen und in Beispiel 2 gewaschen worden war, hielt die ungewaschene Scheibe dieselbe Anzahl an Bindegewebevorläufern (1.000 im gezeigten Fall) und eine große Anzahl an aus Knochenmark stammenden, kernhältigen Zellen (2,2 Millionen gegenüber 1,2 Millionen in der gewaschenen Probe) zurück. Nach Kultivierung über 24 Tage in vitro führte die Anwesenheit dieser zusätzlichen Zellen zu höherer Proliferation und Differenzierung der Bindegewebevorläufer. Dies zeigte sich in einer größeren Oberfläche, die von Zellen bedeckt war, die Aktivität alkalischer Phosphatase exprimierten, was ein Hinweis auf osteoblastische Differenzierung ist.
Beispiel 7
Ein Knochen-Verbundtransplantat wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, außer dass die Knochenmarksuspension nur einmal und nicht dreimal über die Hydroxyapatitscheibe rezykliert wurde. Dies reduzierte die Anzahl an Zellen und Bindegewebevorläufern, die an die Scheibe aus Corallin-Hydroxyapatit anhaften blieben.
Beispiel 8
Drei Knochen-Verbundtransplantat wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, außer dass die Konzentration von kernhältigen Zellen in der Knochenmarksuspen sion von 100 auf 150 Millionen kernhältige Zellen pro ml erhöht wurde. Diese Steigerung der Anzahl an Zellen, die durch die Hydroxyapatitscheiben durchfließen gelassen wurden, erhöhte die Anzahl an kernhältigen Zellen und Bindegewebe-Vorläuferzellen, die in den Knochen-Verbundtransplantaten zurückgehalten wurden, um einen Mittelwert von 66,84 % bzw. 52,0 %. Diese Suspensionen mit hohem Zellgehalt zeigten gesteigerte Viskosität und geringere Elutionsfließgeschwindigkeiten.
Beispiel 9
Heparinisierte menschliche Knochenmarkproben wurden unter Zustimmung der vorab informierten Probanden während fakultativer orthopädischer Verfahren durch wiederholte Punktion von 2-cm³-Proben aus separaten Stellen entlang des vorderen Darmbeinkammes abgenommen. Sterile Proben aus menschlichem Fremdtransplantat-Knochenmatrixpulver (425-850 m Durchmesser, 0,1 ml Volumen) (Musculoskeletal Transplant Foundation, USA) wurden in 1-ml-Spritzen geladen. Ein Sieb hielt die Partikel in der Spritze zurück. Proben aus Knochenmarkzellsuspensionen wurden durch das Fremdtransplantatpulver bei definierten Konzentrationen und Durchflussgeschwindigkeiten durchfließen gelassen. Knochenmarkproben wurden auf Zellanzahl und CFU-Os unter Verwendung anerkannter Verfahren vor und nach dem Durchfließen durch die Matrix getestet. Die Anzahl an Zellen und CFU-Os, die in der Matrix zurückgehalten wurden, wurde berechnet. Eine Selektionsverhältnis für CFU-Os gegenüber kernhältigen Zellen wurde ebenfalls berechnet (CFU-Os zurückgehalten/CFU-Os geladen, Zellen zurückgehalten/Zellen geladen). Ein Selektionsverhältnis über 1,0 weist darauf hin, dass CFU-Os gegenüber anderen, aus Knochenmark stammenden, kernhältigen Zellen positiv selektiert wurden.
Die Resultate wiesen darauf hin, dass Zellen- und CFU-O-Zurückhaltung an entmineralisiertem Transplantatpulver anstieg, wenn die Anzahl an geladenen Zellen von 25 Millionen Zellen auf 200 Millionen Zellen anstieg, wobei Sättigung auftrat (Durchflussgeschwindigkeit 30 mm/min). Gesättigte Matrices hielten im Mittel 80 × 10⁶ kernhältige Zellen (Bereich von 20 bis 140 × 10⁶) und 3.800 CFU-Os (Bereich 500 bis 6.600) zurück. Diese mittlere Konzentration von CFU-Os von 38.000/ml war 19-mal höher als die mittlere Konzentration von CFU-Os in der ursprünglichen Punktion. Das mittlere Selektionsverhältnis bei einer Ladungsdichte von 25 Millionen Zellen betrug 2,4, fiel jedoch bei einer Ladungsdichte von 200 Millionen Zellen auf 1,4, was darauf hinweist, dass sich CFU-Os selektiv an die Matrixoberfläche binden, sobald jedoch die Matrixoberfläche mit Zellen gesättigt ist, ist weitere Ansammlung von Zellen in der Leerräumen der Matrix viel weniger selektiv. Ein Vergleich der Durchflussgeschwindigkeiten von 15 mm/min bis 60 mm/min zeigte keinen Einfluss der Durchflussgeschwindigkeit in diesem Bereich auf die Anzahl an zurückgehaltenen Zellen oder CFU-Os. Das Rezyklieren von Proben durch die Matrix bis zu dreimaliger Wiederholung erhöhte das Zurückhalten von Zellen oder CFU-Os nicht. Wie in diesem Beispiel gezeigt wird, können aus menschlichem Knochenmark stammende, osteoblastische Vorläufer, die durch Punktion abgenommen wurden, in Fremdtransplantatmatrix durch die Verwendung eines raschen Verfahrens, das zur intraoperativen Verwendung geeignet ist, 19fach konzentriert werden.
Diese Verfahren zur Herstellung von Knochenmark-Verbundtransplantaten benötigten insgesamt typischerweise weniger als sechzig Minuten. Somit können diese Verfahren durchgeführt werden, während sich der Knochenmarkspender/Transplantationspatient im Operationssaal befindet. Folglich kann unter Verwendung dieser Verfahren die Anzahl der invasiven Eingriffe, denen ein Transplantationspatient unterzogen werden muss, um ein Knochen-Verbundtransplantat zu erhalten, reduziert werden.
Die verbesserten, gemäß diesen Verfahren hergestellten Knochen-Verbundtransplantate enthalten ein bioverträgliches, implantierbares Substrat und eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen. Wie hierin verwendet bedeutet die Bezeichnung "angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen", dass der Prozentsatz an Bindegewebe-Vorläuferzellen bezogen auf alle kernhältigen Knochenmarkzellen im Knochenmark-Verbundtransplantat höher als in der ursprünglichen Knochenmarkpunktion ist. Darüber hinaus war die Konzentration der Bindegewebe-Vorläuferzellen in den verbesserten Knochenmark-Verbundtransplantaten etwa zweimal höher als die Konzentration dieser Zellen in der ursprünglichen Punktion.
Die verbesserten Knochen-Verbundtransplantate umfassten auch eine Population kernhältiger Zellen, die keine Bindegewebe-Vorläuferzellen waren, einschließlich Endothelzellen und blutbildende Zellen, die aus Knochenmark stammten, und eine Population von Blutplättchen, die aus peripherem Blut stammten. Die Erythrozyten und das flüssige Plasma in der Knochenmarkpunktionssuspension werden in den Knochen-Verbundtransplantaten nicht selektiv zurückgehalten, und somit enthalten die verbesserten Knochen-Verbundtransplantate typischerweise weniger als 5 % der Erythrozyten aus der ursprünglichen Suspension. Proteine und Adhäsionsmoleküle, die im Plasma vorhanden sind, werden als eine kombinierte Funktion ihrer Konzentration im Plasma und ihrer relativen Affinität zur Substratoberfläche auch an der Oberfläche des Substrats konzentriert.
Das verbesserte Knochen-Verbundtransplantat ist zur Implantierung in den Knochenmarkpunktionsspender oder in einen immunologisch verträglichen Wirt geeignet. Das verbesserte Knochen-Verbundtransplantat ist auch für die Bewertung der Wirkung exogener Cytokine, Hormone und anderer bioaktiver Moleküle auf die Proliferation und Differenzierung von Bindegewebe-Vorläuferzellen in vitro nützlich.

Claims

Set zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats aus einer Knochenmarkpunktionssuspension, umfassend: (a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat mit Blutplättchen auf einer Oberfläche davon, das mittels Durchfließenlassen eines Blutplättchenkonzentrats, das ein Antikoagulans enthält, oder eines isolierten Blutplättchenkonzentrats durch das Substrat erhältlich ist; und (b) ein Behältnis zur Aufnahme dieses Substrats, worin das Behältnis so konfiguriert ist, dass das Substrat zurückgehalten und ein Fluss der Knochenmarkpunktionssuspension durch dieses ermöglicht wird, wobei das Behältnis eine innere Oberfläche und zwei Enden aufweist, wobei jedes dieser Enden eine Öffnung definiert.
Set nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats aus einer Knochenmarkpunktionssuspension, umfassend: (a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat mit Blutplättchen auf einer Oberfläche davon, das mittels Durchfließenlassen eines Blutplättchenkonzentrats, das ein Antikoagulans enthält, durch das Substrat erhältlich ist; und (b) ein Behältnis zur Aufnahme dieses Substrats, worin das Behältnis so konfiguriert ist, dass das Substrat zurückgehalten und ein Fluss der Knochenmarkpunktionssuspension durch dieses ermöglicht wird, wobei das Behältnis eine innere Oberfläche und zwei Enden aufweist, wobei jedes dieser Enden eine Öffnung definiert.
Set nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Knochen-Verbundtransplantats aus einer Knochenmarkpunktionssuspension, umfassend: (a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat mit Blutplättchen auf einer Oberfläche davon, das mittels Durchfließenlassen eines isolierten Blutplättchenkonzentrats durch das Substrat erhältlich ist; und (b) ein Behältnis zur Aufnahme dieses Substrats, worin das Behältnis so konfiguriert ist, dass das Substrat zurückgehalten und ein Fluss der Knochenmarkpunktionssuspension durch dieses ermöglicht wird, wobei das Behältnis eine innere Oberfläche und zwei Enden aufweist, wobei jedes dieser Enden eine Öffnung definiert.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Substrat Antikörper aufweist, die sich an Oberflächenantigene binden, die an der Oberfläche von Bindegewebe-Vorläuferzellen oder Blutplättchen exprimiert werden, worin die Antikörper an eine zugängliche Oberfläche des Substrats gebunden sind.
Set nach Anspruch 4, worin die Antikörper aus STRO-1, SH-2, SH-3, SH-4, SB-10, SB-20 und Antikörpern gegen alkalische Phosphatase ausgewählt sind.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Substrat steril ist.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiters umfassend: einen an einem Ende des Behältnisses anbringbaren Strömungsregler zur Regulierung der Durchflussgeschwindigkeit der Knochenmarkpunktionssuspension durch das Substrat.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiters umfassend: (a) einen Speicherbehälter zur Aufnahme der Knochenmarkpunktionssuspension; und (b) einen am Speicherbehälter anbringbaren Strömungsregler zur Regulierung des Flusses der Knochenmarkpunktionssuspension vom Speicherbehälter in das Behältnis.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiters umfassend: einen Ausfluss-Sammelbehälter zur Aufnahme eines Ausflusses der Knochenmarkpunktionssuspension aus dem Behältnis.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Substrat äußere Dimensionen und eine zugängliche Gesamtoberfläche aufweist, die zumindest fünfmal größer ist als die Oberfläche eines festen Gegenstands, der dieselben äußeren Dimensionen aufweist.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Substrat aus Keramik besteht, die Calciumphosphat oder Bioglas umfasst.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Substrat aus einem Material, ausgewählt aus Collagen, mineralisiertem Knochen und entmineralisiertem Knochen, besteht.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Substrat aus Hyaluronsäure oder einem synthetischen Biopolymer besteht.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Substrat aus einem synthetischen Biopolymer besteht.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Substrat aus Hyaluronsäure besteht.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Substrat an eine seiner Oberflächen gebundene Adhäsionsmoleküle aufweist.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Substrat an eine seiner Oberflächen gebundene Wachstumsfaktoren aufweist.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Substrat Poren oder Kanäle mit einem Durchmesser von über 40 μm aufweist.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das Behältnis weiters einen porösen Teil zum Zurückhalten des Substrats innerhalb des Behältnisses umfasst.
Set nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin das Behältnis aus einem Material besteht, das bioverträglich ist.
Knochenmark-Verbundtransplantat, umfassend: (a) ein poröses, bioverträgliches, implantierbares Substrat mit Blutplättchen auf einer Oberfläche davon, das mittels Durchfließenlassen eines Blutplättchenkonzentrats, das ein Antikoagulans enthält, oder eines isolierten Blutplättchenkonzentrats durch das Substrat erhältlich ist; (b) eine heterogene Population kernhältiger Knochenmarkzellen; und (c) eine angereicherte Population von Bindegewebe-Vorläuferzellen.