DE10222896A1

DE10222896A1 - Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen und flächigen Gewebetransplantats

Info

Publication number: DE10222896A1
Application number: DE10222896A
Authority: DE
Inventors: Rainer Harwardt
Original assignee: Biotissue Technologies AG
Current assignee: Biotissue Technologies AG
Priority date: 2002-05-23
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2003-12-11
Also published as: WO2003100039A1; AU2003240618A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen und flächigen Gewebetransplantats sowie ein nach diesem Verfahren hergestelltes Transplantat. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Gewebetransplantat um Knorpelersatzmaterial.

Description

Knorpeltransplantate werden heute üblicherweise zur Behandlung traumatischer und/oder degenerativer Defekte beispielsweise im Gelenkbereich verwendet. Derartige traumatische und/oder degenerative Defekte von Knorpel- aber auch von Knochengewebe ließen dem Mediziner früher nur die Wahl, das betroffene Gelenk ruhig zu stellen. Im Rahmen der modernen Transplantationsmedizin können derartige Defekte heute häufig durch Transplantation entsprechenden Gewebematerials gelindert oder behoben werden. Während man zunächst darauf angewiesen war, das benötigte Gewebe Leichen zu entnehmen, oder auf dem Patienten an anderer Stelle entnommenes Gewebe zurückzugreifen, haben sich in der jüngeren Vergangenheit Verfahren durchgesetzt, bei denen dem Patienten körpereigenes Gewebe entnommen, die Zellen hieraus gewonnen und nach Kultivierung dem Patienten als Eigengewebe wieder implantiert werden. Dies bietet den Vorteil, dass Abstoßungsreaktionen gegen das Implantat praktisch vermieden werden können.

Üblicherweise werden die Zellen bei einem derartigen Verfahren in eine dreidimensionale Trägerstruktur eingelagert, wobei die Form der Trägerstruktur meist der Form des späteren Implantates entspricht. Das US-Patent der Nr. 5 053 050 beschreibt Zusammensetzungen zur Reparatur von Knorpel oder Knochen, wobei Knorpel- oder Knochenzellen in eine biologisch resorbierbare Trägersubstanz eingebracht werden, welche Serum, Fibrinogen und Thrombin enthält. Dieser Träger ist bioresorbierbar, so dass letztlich kein Fremdmaterial im Körper des Empfängers verbleibt. Ähnlich beschreibt das US-Patent der Nr. 5 736 372 eine polymere Trägersubstanz, die Chondrozyten enthält und geeignet ist, in vivo Knorpelstrukturen zu bilden.

Gemäß der WO 94/20 151 wird als Trägerstruktur ein vorzugsweise bioresorbierbares Vliesmaterial verwendet, auf dem entsprechende Zellen kultiviert werden. Zur Stützung der Zellkultur können der Nährlösung das Zellwachstum fördernde Substanzen, Adhäsionsfaktoren usw. zugesetzt werden. Weiterhin offenbart die Druckschrift eine Kulturvorrichtung zur optimalen Besiedelung des Vliesmaterials mit den zu transplantierenden Zellen.

Schließlich beschreibt die DE 199 26 083 ein biologisches, zumindest teilweise in vitro hergestelltes Gelenkkonstrukt, das wenigstens ein bioverträgliches Trägermaterial, Knorpelgewebe, enthaltend Chondrozyten und/oder Chondroblasten und Knorpelsubstanz, Knochengewebe, enthaltend Osteoblasten und/oder Osteozyten und Knochensubstanz, umfasst, wobei Knorpel- und Knochengewebe fest miteinander verbunden sind. Das Gelenkkonstrukt kann weiterhin Bandkomponenten und/oder eine Gelenkkapsel aufweisen. Das Dokument offenbart gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung der Knorpel- und/oder Knochenkomponenten. Insbesondere wird die Knorpelkomponente durch Herstellung einer Suspension von Chondrozyten in einem Medium oder Gel oder durch Besiedlung einer bioverträglichen Trägersubstanz bereitgestellt.

Ein entsprechender Gelenkknorpelersatz, bestehend aus einem flächigen, dreidimensionalen Gewebetransplantat auf Basis eines bioresorbierbaren Vliesmaterial, auf dem die autologen Knorpelzellen kultiviert werden, wird üblicherweise durch Einbettung der Chondrozyten in die Matrix beispielsweise durch Beimpfen oder Einwalken sowie eine anschließende einwöchige Vorkultivierung erzeugt. Die Vorkultur erfolgt dabei üblicherweise in Petrischalen, wobei das Transplantat mit einer Fläche auf dem Boden der Petrischale aufliegt. Zur Verbesserung der Stabilität kann das Vlies außerdem mit Hilfe von Fibrin vernetzt werden.

Während der Transplantation des Gewebetransplantats ist es für den Operateur notwendig, dieses zu handhaben, das heißt in den Händen zu halten, um Befestigungsmittel anzubringen, das Transplantat an den Wundort einzuführen, und dort zu befestigen. Während dieser Handhabung ist das Transplantat entsprechenden mechanischen Belastungen wie Zug und Druck durch Einbringen des Vlieses wie auch durch Spülungen des Gelenks nach erfolgter Transplantation ausgesetzt. Diese Belastungen ergeben sich sowohl bei einer offenen Operation als auch im Rahmen der Athroskopie. Bei letzterer ist das Transplantat jedoch höheren Belastungen ausgesetzt.

Durch die genannten mechanischen Belastungen wie auch durch das Spülen oder Waschen des Transplantats kommt es häufig zu Beschädigungen entweder der gesamten Matrixstruktur oder der hierauf angewachsenen Chondrozyten. Jegliche Beschädigung führt jedoch mindestens zu einem langsameren Anwachsen des Transplantats bzw. einer verlangsamten Gewebeneubildung, kann jedoch im Extremfall zum Gesamtverlust des Transplantats führen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein dreidimensionales, flächiges Gewebetransplantat, vorzugsweise für Knorpelgewebe, bereitzustellen, das gegenüber mechanischen Belastungen durch Handhabungen während der Transplantation selbst stabiler ist. Gleichzeitig liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Transplantats bereitzustellen.

Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionales und flächiges Gewebetransplantats, und das so hergestellte Gewebetransplantat. Das Verfahren umfasst die Schritte:

a) Beimpfen eines dreidimensionalen, flächigen Polymervlieses mit einer Zellsuspension von Zellen des gewünschten Gewebetyps in einer Fibrinogen enthaltenden Kulturflüssigkeit;
b) Überführen des inokulierten Polymervlieses in ein Kulturbehältnis, das eine Thrombin enthaltende Lösung auf einer Fläche dasselbe enthält, wobei das Polymervlies auf einer ersten Fläche desselben mit der Thrombin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird;
c) Auftragen einer zweiten Thrombin enthaltenden Lösung auf eine zweite Fläche des Polymervlieses, die der ersten Fläche im wesentlichen gegenüber liegt;
d) In Kontakt bringen der zweiten Fläche des Polymervlieses mit einer glatten Oberfläche eines Deckmaterials und anschließendes Auspolymerisieren des Fibrins;
e) Entfernen des Deckmaterials; und
f) Kultivieren der Zellen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Gewebetransplantate weisen auf beiden flächigen Oberflächen deutlich verringert Oberflächenrauheiten auf Dementsprechend bieten sie bei mechanischen Belastungen weniger Ansatz für Beschädigungen, beispielsweise durch Auslösen von Matrix- oder Zellbestanteilen während des Spülens. Weiterhin weisen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vliese eine höhere Zug- und Druckbelastbarkeit als Vliese auf, die nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Ohne hierdurch gebunden sein zu wollen, beruht die Verbesserung vermutlich darauf, dass bereits während der Herstellung eine gewisse Druckbelastung auf das Vliesmaterial aufgebracht und durch In Kontakt bringen mit einer glatten Oberfläche des Deckmaterials für eine substantielle Glättung und dadurch Vermeidung von Ansatzpunkten für mechanische Beschädigung der zweiten Oberfläche gesorgt werden kann.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein dreidimensionales, flächiges Gewebetransplantat hergestellt. Wie er hierin verwendet wird meint der Begriff eines dimensionalen, flächigen Gewebetransplantats ein Transplantat, bei dem die dritte Dimension gegenüber beiden anderen Dimensionen erheblich kleiner ist. Üblicherweise beträgt die dritte Dimension in ihrer Abmessung weniger als 10%, stärker bevorzugt weniger als 5% der beiden anderen Dimensionen. Weiterhin ist impliziert, dass die Flächen des Transplantats im wesentlichen parallel sind, obwohl dies nicht zwingend erforderlich ist.

Die Grundform des Gewebetransplantats ist grundsätzlich frei wählbar und kann beispielsweise dem Transplantationsort angepasst sein. Typischerweise wird die Grundform rund, oval, rechteckig, quadratisch oder ein anderer regelmäßiger oder unregelmäßiger Polyeder sein. Die Dimensionen des Transplantats sind grundsätzlich den Dimensionen der Läsion angepasst, liegen üblicherweise aber im Bereich von 0,5 × 0,5 cm bis 5 × 5 cm, bevorzugt 2 × 3 cm bzw. 1 × 1 cm. Die Dicke des Transplantats beträgt üblicherweise 0,5 bis 3,5 mm, vorzugsweise 1,0 bis 3,0 mm, am meisten bevorzugt 1,0 bis 2,0 mm.

Das Gewebetransplantat gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein dreidimensionales, flächiges Polymervlies als Matrix desselben, das im wesentlichen die Dimensionen des Gewebetransplantats vorgibt. Dieses Polymervlies als Matrix ist vorzugsweise im transplantierten Zustand resorbierbar. Dies bedeutet, dass die Matrix bzw. das Polymervlies nach Transplantation in den Organismus vorzugsweise nach und nach abgebaut wird, und zwar in dem Maße, in dem sich neues Gewebe bildet. Das Polymervlies umfasst daher vorzugsweise ein resorbierbares Material. Dieses ist stärker bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hyaluronsäure, Gelatine, Polyglycolid, Polylactid, Copolymeren von Polyglycolid und Polylactid, Blockpolymeren aus Polyglycolid und Polylactid, Fibrin, Kollagen und Mischungen bzw. Copolymeren derselben. Am meisten bevorzugt ist ein Copolymer oder Blockcopolymer aus Polyglycolid/Polylactid, welches sich in den geeigneten Dimensionen leicht in der gewünschten Stärke, Porosität und Resorbierbarkeit herstellen lässt.

Das Polymervlies weist eine interkonnektierende Porosität auf, was bedeutet, dass die Matrix aus diesem Polymervlies möglichst wenige geschlossenzellige, d. h. von außen nicht zugängliche Hohlräume enthält. Derartige Hohlräume sind einem Flüssigkeitsaustausch und der Besiedlung durch die gewünschten Zellen nicht zugänglich, sodass sie möglichst vermieden werden sollten. Üblicherweise wird das Polymervlies eine Porosität von 10 bis 90% aufweisen. Um eine optimale Strömung von Flüssigkeiten und ein angemessenes Zellwachstum zu gestatten, weist das Polymervlies weiterhin üblicherweise Poren mit einem mittleren Durchmesser von zwischen 1 und 5.000 µm auf. Insbesondere kann das Polymervlies vorteilhafterweise eine Mischung von Makroporen und Mikroporen mit einem Durchmesser von 100 bis 1.500 µm bzw. 1 bis 100 µm aufweisen.

Gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das dreidimensionale, flächige Polymervlies mit einer Zellsuspension beimpft. Diese Zellsuspension enthält Zellen des gewünschten Gewebetyps in einer geeigneten Kulturflüssigkeit. Geeignete Kulturflüssigkeiten sind selbstverständlich vom gewünschten Zelltyp abhängig und können vom Fachmann anhand seiner Fachkenntnisse ohne weiteres im Rahmen von Routineversuchen aufgefunden werden. Die Kulturflüssigkeit enthält weiterhin Fibrinogen. Das Fibrinogen ist in der Kulturflüssigkeit in einer solchen Konzentration enthalten, dass eine Endkonzentration in der Zellsuspension resultiert, mit der ein gleichmäßiges Auspolymerisieren des Fibrins über die Gesamtfläche des Polymervlieses möglich ist. Typischerweise wird die Endkonzentration des Fibrinogens in der Zellsuspension zwischen 50 mg/ml und 150 mg/ml, bevorzugt 70-110 mg/ml liegen.

Das Fibrinogen kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von humanem, rekombinanten Fibrinogen zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen. Ein derartiges Material ist beispielsweise von der Firma Baxter AG unter der Bezeichnung Tissucol Duo 0,5 ml Immuno erhältlich.

Die Zellen, welche in dem erfindungsgemäßen, dreidimensionalen und flächigen Gewebetransplantat enthalten sind, können grundsätzlich von jedem geeigneten Typ sein. Bevorzugt handelt es sich um Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Chondroblasten, Osteoblasten, Osteozyten, Fibrinozyten, Adipozyten und Keratozyten. Ganz besonders bevorzugt sind Chondrozyten. Im letzteren Fall handelt es sich bei dem dreidimensionalen, flächigen Gewebetransplantat um ein Knorpeltransplantat. Obwohl auch allogene Zellen verwendet werden können, handelt es sich bei den Zellen bevorzugt um autologe Zellen des Empfängers, d. h. zuvor dem Empfänger selbst entnommene und dann kultivierte Zellen. Die Verwendung autologer Zellen hilft Abstoßungsreaktionen zu vermeiden und sorgt so filz eine bessere Einheilung des Gewebetransplantats.

Die Zellen sind in der Suspension in zur Beimpfung geeigneter Anzahl enthalten. Üblicherweise wird die Zellzahl der Suspension zwischen 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁷ Zellen/ml liegen.

Das dreidimensionale, flächige Polymervlies wird mit der Zellsuspension beimpft. Dieses kann über jedes geeignete Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann das Beimpfen durch Auftragen der Zellsuspension mit Hilfe einer Spritze oder eines anderen geeigneten Überführungsmittels, durch Einwalken der Zellsuspension in das Polymervlies oder auf andere Weise erfolgen. Wesentlich ist, dass das Beimpfen unter sterilen Bedingungen erfolgt und nicht zu Beschädigungen sowohl von Polymervlies als auch der Zellen führt.

Gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das inokulierte bzw. beimpfte Polymervlies in ein Kulturbehältnis überführt. Dieses Kulturbehältnis enthält eine Thrombin enthaltende Lösung auf einer Fläche derselben. Das Polymervlies wird mit einer ersten Fläche desselben mit der Thrombin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht. Üblicherweise erfolgt dies durch Auflegen des Polymervlieses auf eine mit der Thrombin enthaltenden Lösung beschichteten Fläche des Kulturbehältnis. Bei dem Kulturbehältnis kann es sich grundsätzlich um jedes geeignete Kulturbehältnis wie eine Flasche, eine Petrischale usw. handeln. Bevorzugt handelt es sich um eine Petrischale, auf deren Boden die Thrombin enthaltende Lösung aufgeschichtet ist.

Bei der Thrombin enthaltenden Lösung kann es sich grundsätzlich um jede physiologisch geeignete, das Thrombin stabilisierende und in seiner Enzymaktivität nicht wesentlich behindernde Lösung handeln. Geeignet ist beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung oder das mit Thrombin angereicherte Kulturmedium ohne Fibrinogen. Weitere geeignete Lösungen können vom Fachmann anhand seiner Fachkenntnisse mit Hilfe von Routineexperimenten leicht aufgefunden werden. Die Thrombin enthaltende Lösung enthält üblicherweise 10 mg/ml bis 90 mg/ml, vorzugsweise 20 bis 50 mg/ml Thrombin. Eine geeignete Lösung wird beispielsweise von der Fa. Baxter AG vertrieben. Diese Lösung wird in einer solchen Menge verwendet, dass sie die Oberfläche sowohl des Kulturbehältnisses als auch des beimpften Polymervlieses benetzt. Geringere Mengen an Thrombin enthaltender Lösung sind nicht wünschenswert, da sie ein Auspolymerisieren des in der Kulturflüssigkeit enthaltenden Fibrinogens verzögern, wenn überhaupt zum Abschluss bringen. Dagegen sind größere Mengen der Thrombin enthaltenden Lösung ebenfalls unerwünscht, da dies zum einen die Produktionskosten erhöht, zum anderen möglicherweise Bestandteile des Polymervlieses ausgewaschen werden und/oder das Polymervlies nicht mehr mit der glatten Wandung des Kulturbehältnisses in Kontakt steht.

Nach in Kontakt bringen des Polymervlieses mit der ersten Fläche des Kulturbehältnisses bzw. der darauf aufgeschichteten Thrombin enthaltenden Lösung wird auf die zweite Fläche des Polymervlieses, die der ersten Fläche im Wesentlichen gegenüber liegt, gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine zweite Thrombin enthaltende Lösung aufgetragen. Vorzugsweise sind die erste und zweite Thrombin enthaltende Lösung identisch. Die aufgetragenen Menge an zweiter Thrombin enthaltender Lösung ist diese so bemessen, dass die Oberfläche des Polymervlieses ausreichend benetzt wird, ohne dass wesentlich überschüssige Mengen an zweiter Thrombin enthaltender Lösung verwendet werden.

Nach Auftrag der zweiten Thrombin enthaltenden Lösung wird gemäß Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens die zweite Fläche des Polymervlieses mit einer glatten Oberfläche eines Deckmaterials in Kontakt gebracht. Anschließend wird durch Einwirkung des Thrombins das im Polymervlies enthaltende Fibrinogen zu Fibrin umgewandelt, und dieses polymerisiert aus. Erfindungsgemäß wesentlich ist die Verwendung eines Deckmaterials mit einer glatten Oberfläche, die mit der zweiten Fläche des Polymervlieses in Kontakt gebracht wird. Das Deckmaterial kann in Form eines Plättchens, einer Folie oder eines Blockes vorliegen. Die Grundform des Deckmaterials ist frei wählbar, solange das Deckmaterial im wesentlichen die Gesamtfläche des Polymervlieses bedeckt. Vorzugsweise handelt es sich um ein Plättchen, dessen Fläche größer oder gleich der Fläche des Polymervlieses ist.

Als Deckmaterial kann jedes geeignete Material verwendet werden, vorausgesetzt, dieses weist eine ausreichend glatte Oberfläche auf, wirkt nicht zytotoxisch und lässt sich sterilisieren. Vorzugsweise ist das Deckmaterial ein Material, ausgewählt unter Kunststoff, Metall, Keramik, Glas oder Mischungen derselben. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Deckmaterial um sterile Glas- oder Plastikplättchen.

Nach dem Aufbringen bzw. Abdecken der zweiten Fläche des Polymervlieses mit dem Deckmaterial polymerisiert das Fibrin aus. Das Deckmaterial muss also unmittelbar nach Auftragen der zweiten Thrombin enthaltenden Lösung in Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens und in jedem Fall vor dem Auspolymerisieren des aus dem Fibrinogen unter Thrombineinwirkung entstandenen Fibrins aufgebracht werden. Während des Auspolymerisierens kann auf das Deckmaterial ein leichter Druck ausgeübt werden. Der ausgeübte Druck ist in keinem Fall so stark, dass das Gewebetransplantat schädlichen Druckbelastungen ausgesetzt wird und/oder die Zellen hierdurch beschädigt werden. Üblicherweise reicht der durch das Gewicht des Deckmaterials selbst ausgeübte Druck aus.

Nach dem Auspolymerisieren des Fibrins wird das Deckmaterial in Schritt (e) entfernt und das dreidimensionale, flächige Gewebetransplantat entnommen. Das Transplantat wird in ein geeignetes Kulturmedium überführt. Anschließend werden die Zellen des Gewebetransplantats in Schritt (f) unter üblichen Bedingungen, wie sie beispielsweise in der DE 199 26 083, DE 44 31 598 oder DE 199 57 388 beschrieben sind, kultiviert. Die Kultur wird üblicherweise bis zum Erhalt der gewünschten Zelldichte bzw. Konfluenz fortgesetzt. Je nach Transplantatgröße sind hierzu zwischen 4 und 10 Tagen, bevorzugt 5 und 7 Tage erforderlich.

Nach Abschluss der Kultur und Erhalt der gewünschten Zelldichte ist das Gewebetransplantat nach Spülung desselben zur Transplantation fertig und geeignet. Es kann zum Transport in geeignete sterile und temperierte Behälter überführt und im Operationsraum hieraus entnommen werden.

Durch die sandwichartige Anordnung des erfindungsgemäßen dreidimensionalen, flächigen Gewebetransplantats während des Auspolymerisierens des Fibrins wird eine überraschend stabilere Struktur desselben erzielt. So betrifft die vorliegende Erfindung in einer zweiten Ausführungsform einen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes dreidimensionales, flächiges Gewebetransplantat. Bevorzugt handelt es sich hier um ein Transplantat von bezüglich des Empfängers autologen Zellen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um ein Knorpeltransplantat.

Das vorliegende Beispiel soll das erfindungsgemäße Verfahren veranschaulichen, dieses jedoch nicht beschränken.

Beispiel

Einem Patienten wurde aus einem unbelasteten Bereich des Kniegelenkknorpels ein Biopsat entnommen und unter sterilen Bedingungen gelagert. Der biopsierte Knorpel wird in 1 mm³ große Stückchen zerkleinert und in einer Enzymlösung aus Kollagenasen und Hyaluronidasen für mehrere Stunden verdaut. Hierdurch werden die Knorpelzellen (Chondrozyten) aus ihrer natürlichen Umgebung der Knorpelmatrix herausgelöst.

Nach Filtern und mehrmaligem Waschen der Zellen mit einer geeigneten Pufferlösung (beispielsweise PBS) wurden die Zellen bei 37°C in einem geeigneten Kulturmedium (beispielsweise das Medium RPMJ 1640 der Fa.Lifetechnologies, zuzüglich 10% autologes Humanserum) kultiviert. Nach 2-5 Passagen und Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 100% wurden die Zellen abgeerntet, die Zellzahl bestimmt (Sollwert: 24 × 10⁶/ml ± 25%) in 800 µl Medium resuspendiert und zu 400 µl einer Fibrinogensuspension mit 90 mg/ml Fibrinogen gegeben. Diese Zellsuspension wird dann in ein PgA/PglA-Vlies von 2 × 3 cm eingewalkt. Das beimpfte Vlies wurde in eine sterile Petrischale überführt, in der sich eine der Vliesform und -größe entsprechend verteilte, 10 mg/ml Thrombin enthaltende Lösung auf dem Boden aufgeschichtet befand.

Anschließend wurde auch auf die Vliesoberseite nochmals Thrombin-Lösung gegeben. Schließlich wurde das Vlies zusätzlich mit einem sterilen Glasplättchen abgedeckt. Bei Kontakt des Fibrinogens mit Thrombin polymerisiert ersteres zu Fibrin aus. Nach Auspolymerisieren wird das Plättchen entfernt und das Vlies in ein Kulturmedium (RPMJ 1640 der Fa. Lifetechnologies, zuzüglich 5% autologes Humanserum) überführt und dort bis zum Erhalt der gewünschten Zellzahl belassen. Das Medium RPMJ 1640 enthält übliche anorganische Salze, Aminosäuren, Vitamine, Zucker, Glutathion, Phenol rot, HEPES und wird durch 5 bzw. 10% autologes Humanserum komplettiert.

Als Kontrolle wurden parallele Vliese hergestellt, ohne jedoch dieselben während des Auspolymerisierens mit sterilen Glasplättchen abzudecken.

Um mögliche Belastungen eines beimpften Vlieses während einer Operation zu simulieren, wurden sowohl die erfindungsgemäßen als auch die Kontrollvliese manipuliert, indem sie mehrere Minuten mit den Fingern gehalten und leicht gedrückt oder in mehreren 100 ml Pufferlösung bzw. Kulturmedium durch starkes Schütteln gespült wurden.

Überraschenderweise stellte sich heraus, dass die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vliese deutlich stabiler gegenüber der mechanischen Belastung waren als die herkömmlich hergestellten Vliese. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vliese wiesen darüber hinaus eine höhere Zug- und Druckbelastbarkeit auf. Durch das Spülen entstand nur ein leichter, oberflächlicher Schaden, d. h. die Fibrinmatrix und die darin enthaltenen Chondrozyten blieben intakt.

Aufgrund dieser geringeren Beschädigungen sind die erfindungsgemäßen Vliese insbesondere für die Verwendung in der Athroskopie unter den dort auftretenden höheren Belastungen geeignet. Die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Transplantate im Rahmen der Athroskopie zu verwenden, gestattet es, offene Operationen zu vermeiden, was wiederum zu einer schnelleren Abheilung der Wunde und damit einer verbesserten Patientencomplience und Verringerung der Komplikationsrate in Folge der Operation führt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen und flächigen Gewebetransplantats, umfassend die Schritte:

a) Beimpfen eines dreidimensionalen, flächigen Polymervlieses mit einer Zellsuspension von Zellen des gewünschten Gewebetyps in einer Fibrinogen enthaltenden Kulturflüssigkeit;

b) Überführen des inokulierten Polymervlieses in ein Kulturbehältnis, das eine Thrombin enthaltende Lösung auf einer Fläche desselben enthält, wobei das Polymervlies auf einer ersten Fläche desselben mit der Thrombin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird;

c) Auftragen einer zweiten Thrombin enthaltenden Lösung auf eine zweite Fläche des Polymervlieses, die der ersten Fläche im wesentlichen gegenüber liegt;

d) In-Kontakt-bringen der zweiten Fläches des Polymervlieses mit einer glatten Oberfläche eines Deckmaterials und anschließendes Auspolymerisieren des Fibrins;

e) Entfernen des Deckmaterials; und

f) Kultivieren der Zellen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Polymervlies aus einem bioresorbierbaren Material ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polylactid, Polyglykolid und Mischungen und Copolymeren derselben.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chondrozyten, Osteoblasten, Fibrinozyten, Adipozyten und Keratozyten, vorzugsweise Chondrozyten.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellsuspension autologe Zellen des Empfängers enthält.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Deckmaterial in Form eines Plättchens, einer Folie oder eines Blockes vorliegt.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Deckmaterial ein Material ist, ausgewählt aus Kunststoff, Metall, Keramik, Glas oder Mischungen derselben.

7. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen und flächigen Knorpeltransplantats, umfassend die Schritte:

a) Beimpfen eines dreidimensionalen, flächigen Polymervlieses aus bioresorbierbarem Material mit einer Chondrozyten-Suspension in einer Fibrinogen enthaltenden Kulturflüssigkeit;

b) Überführen des inokulierten Polymervlieses in eine Schale, die eine Thrombin enthaltende Lösung enthält, wobei das Polymervlies auf einer ersten Fläche desselben mit der Thrombin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird;

d) Abdecken der zweiten Fläches des Polymervlieses mit einem Plättchen oder einer Folie aus Kunststoff, Glas, Keramik oder Metall und anschließendes Auspolymerisieren des Fibrins;

e) Entfernen des Plättchens; und

f) Kultivieren der Zellen für 3 bis 8 Tage.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Chondrozyten in Bezug auf den Empfänger autologen Ursprungs sind.

9. Dreidimensionales, flächiges Gewebetransplantat, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Dreidimensionales, flächiges Gewebetransplantat nach Anspruch 9, enthaltend Chondrozyten.

11. Gewebetransplantat nach Anspruch 9 oder 10, enthaltend Zellen, die in Bezug auf den Empfänger autologen Ursprungs sind.