DE102010005415A1

DE102010005415A1 - Verfahren und Vorrichtung zur dynamischen Züchtung und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von suspendierten primären Zellen oder Stammzellen humanen und tierischen Ursprungs

Info

Publication number: DE102010005415A1
Application number: DE102010005415A
Authority: DE
Inventors: Hans Prof. Dr. 32549 Hoffmeister
Original assignee: Zellwerk 16727 GmbH; ZELLWERK GmbH
Current assignee: Zellwerk 16727 GmbH; ZELLWERK GmbH
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-07-28
Anticipated expiration: 2030-01-23
Also published as: DE102010005415B4

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verfahren und eine Vorrichtung zur dynamischen Züchtung und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von primären Zellen oder Stammzellen in einem Drehbett-Bioreaktor, der aus einem Reaktorgefäß mit regelbaren Zu- und Abflüssen und aus einem oder mehreren auf einer rotierbaren durch einen Magnetantrieb angetriebenen Welle als Drehbett mit speziellen, auf die jeweilige zu expandierende Zelle abgestimmten Zellträger, gegeben falls mit dicht umschließender Hülle versehen, besteht, wobei eine statische Adhärierung der in einer Kulturflüssigkeit suspendierten primären Zellen oder Stammzellen auf den auf der Welle als Drehbett angeordneten Zellträger ohne Bewegung des Drehbettes und ohne Zuführung von frischen Kulturmedium erfolgt und das sich außerhalb des Drehbettes befindliche Kulturmedium umgepumpt wird, während der nicht mit Kulturmedium gefüllte Kopfraum des Drehbett-Bioreaktors, vorzugsweise 5–10% des Volumens des Reaktorgefäßes mit einem Gasgemisch von CO2 und Luft und/oder N2 überströmt und der pH-Wert und pO2-Wert in Abhängigkeit der zu vermehrenden Zellen, insbesondere die pO2-Werte zwischen 1% und 100% eingestellt werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Entwicklung eines Verfahren und einer Vorrichtung, mit denen adhärent oder in Suspension wachsende Stammzellen und primäre Zellen aus humanen oder tierischen Quellen in einem Drehbett-Bioreaktor dynamisch und kontinuierlich im Perfusionsmodus expandiert werden können.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Vorrichtungen und Verfahren zur Züchtung und Vermehrung von primären Zellen und Stammzellen humanen und tierischen Ursprungs bekannt. Die bekannten Vorrichtungen und Verfahren zum Züchten von Zellkulturen werden nach folgenden Prinzipien unterschieden

– nach dem Prinzip der Zentrifugalbeschleunigung
– im Packbett
– zwischen zwei semipermeablen synthetischen Membranen
– in Doppelachsen-Bioreaktoren mit kontinuierlicher Strömung
– im Wirbelbett
– unter Verwendung von kapillaren Hohlfasern
– im Perfusions- oder Suspensionsverfahren

Die US 4939087 stellt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Züchtung von Zellen unter Verwendung der Zentrifugalbeschleunigung vor. Ein kontinuierlicher Fluss des Mediums wird im Reaktor aufrecht erhalten, der bewirkt, dass eine Kraft erzeugt wird, welche dem Zentrifugalkraftfeld entgegen wirkt. Der Reaktor wird auf einer horizontalen Drehplatte angeordnet und horizontal um eine Achse in der Mitte dieser horizontalen Platte gedreht. Daher wirkt die Gravitationskraft senkrecht zu den Zentrifugal- und Strömungskräften des Medium in dem Reaktor. Während einer Langzeitzentrifugierung bewirkt die Gravitationskraft, dass die Partikel sich im untersten Bereich des Reaktors absetzen.
In der JP 54114474 wird ein Rotationsbehälter mit einer perforierten Platte an seinem äußeren Rand beschrieben, wobei in der Rotationsachse des Behälters ein Ausgangsrohr angeordnet ist. Der Behälter wird gedreht, um die in seinem Inneren enthaltenen Partikel dicht gegen den äußeren Rand des Behälters zu packen. Durch das Drehen des Zentrifugalbehälters um seine in der Mitte angeordnete Drehachse wird die Zentrifugalkraft senkrecht zur Gravitationsachse erzeugt. Die Nährstoffflüssigkeit wird durch eine perforierte Platte von außen eingeleitet.
Ein weiterer nach dem Prinzip der Zentrifugalkraft arbeitender Bioreaktor wird in der EP 0820337 , in der Übersetzung DE 69628291 beschrieben, wobei der Bioreaktor die Form eines Kegelstumpfes hat und sich um eine horizontale Achse dreht. Die Medien ohne jede Gasphase strömen in die Immobilisierungskammer hinein und aus ihr auch wieder heraus. Durch die Form des Bioreaktors werden die Zellen in einer dreidimensionalen Anordnung von Partikeln geordnet, deren Dichte durch die Größe, Form, Eigendichte und durch die Auswahl von Kombinationen von leicht steuerbaren Parametern, wie beispielsweise Flüssigkeitsdurchsatz und Winkelgeschwindigkeit der Drehung bestimmt wird.
Im Packbettverfahren zur Vermehrung von lebenden Zellen werden suspendierte Zellen oder Zellen, die an Mikroträger gebunden sind, in eine starre oder halbstarre Einbettungsmasse eingeschlossen, die dann in einen Bioreaktor mit Zu- und Abflüssen für Medien angeordnet werden ( DE 19911326 ).
Weiterhin sind aus dem Stand der Technik Doppelachsen-Bioreaktoren für die massenhafte Expansion von Zellen mit kontinuierlicher Strömung bekannt. Hier wird die Drehung der Reaktorkammer um eine Achse senkrecht zur vertikalen Achse verwendet, um eine inneres Mischen der Bioreaktorinhalte zu erzielen, während die Drehung um die vertikale Achse große Partikel in radial gerichtete Abstände von der vertikalen Drehachse entfernt hält. Dieses Verfahren ist bei Expansion von Mikroorganismen mit geringer Masse, insbesondere von solchen, die gasförmige Nährstoffe erfordern und Gasabfallprodukte erzeugen, unwirksam ( EP 1 661 979 )
In der DE 89 04 976 wird ein Schüttbettreaktor beschrieben, bei dem das mit Mikroorganismen bewachsene Schüttkörperbett um seine Achse in einem Nährmedium, das verteilte und/oder gelöste Gase enthält, drehend bewegt wird.
In der DE 4206585 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Immobilisierung von Zellen durch das Eingrenzen der gewünschten Zellen, insbesondere von Hepatozyten zwischen zwei semipermeablen, synthetischen Membranen (hier Kollagenschichten) beschrieben. Die Zellkulturträgerplatten werden dann mit Abständen in einen Bioreaktor so angeordnet, dass unterhalb bzw. oberhalb dieser Zellkulturträgerplatten Spalträume entstehen, durch die dann die Nährflüssigkeit mit Sauerstoff im Kreislauf geführt wird.
Die aufgeführten Verfahren und deren Vorrichtungen, insbesondere solche, die auf die Vermehrung von aerob wachsenden prokaryotischen Zellen zielen, dienen vorwiegend zur Herstellung rekombinanter Proteine. Probleme bereitet dabei die Tatsache, dass oft keine ausreichenden Mengen an gelösten Gasen, insbesondere Sauerstoff zu Verfügung stehen, was zu niedrigen Produkterträgen führt. Außerdem können solche Verfahren nur über einen begrenzten Zeitraum ablaufen, bevor sich ausgeschiedene Abfälle aufbauen und zum Prozessabbruch führen.
Ein weiteres Verfahren für die Massenvermehrung von lebenden Zellen erfolgt in Wirbelbett-Bioreaktoren ( DE 27 22 921 ). Hier sind die Zellkulturträger in Suspension im Reaktor angeordnet und die Gase, insbesondere Luft oder Sauerstoff werden in Blasenform durch den Reaktor geleitet. Über dem Reaktorvolumen wird ein Gas-Flüssigkeits-Trennfläche angeordnet. Durch die Existenz der Gasblasen wird die Fluiddynamik unterbrochen und es treten Ausschäumungen, Zellzerstörungen und Denatuierung von Zellen, Nährstoffen und Produkten an diesen Gas-Flüssigkeits-Trennflächen auf. Ein Auswaschen von Zellen ist bei kontinuierlichem Betrieb unvermeidlich.
In der US 4804628 wird eine Hohlfaser-Bioreaktor beschrieben, wobei innerhalb des Reaktors kapillare Hohlfasern (normalerweise in länglichen Bündeln von vielen Fasern ausgestaltet) angeordnet sind, durch die die wässrigen Nährstofflösungen fließen und durch das Kapillarvolumen und den hydrostatischen Druck des Flusses sich eine nach außen dieser Hohlfaser gerichtete, radiale Perfusion der Nährstoffe ergibt. Die Zellen wachsen außerhalb der Kapillaren entweder im freien Nährmedium oder durch Adhärieren an die Kapillaraußenwände der Fasern. Der Sauerstoff wird durch Einleiten in das Kulturmedium über einen weiteren Außenbehälter in diesem gelöst und zusammen mit dem Nährmedium dem Bioreaktor zugeführt.
In der DE 20 2005 009 425 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Zellkultivierung in einem Kulturgefäß beschrieben, wo ein Pendelrührer mit einem Membrankorb über einen Magnetantrieb in Pendelbewegung versetzt wird. Der Membrankorb besteht aus einem Träger und einem mikroporösen Schlauch als Begasungsmembran, die am Träger zuerst geradlinig von oben am Träger angeordneten Gaszufuhr nach unten zum Bodenverschluss und danach wieder wendelförmig zur oben am Träger angeordneten Gasabfuhr führt. Der Träger weist zusätzlich zu dieser Begasungsmembran noch eine mikropoöse membranartige Ummantelung als mikroporöses Filtergewebe auf, durch das sowohl Sauerstoff als auch das Nährmedium diffundieren können. Dieser Träger mit der Begasungsmembran, der mikroporösen Ummantelung, dem Deckelelement und dem Bodenverschluss bilden den Behälter für das Zellträgermaterial, wobei nach dem Befüllen des Membrankorbes mit Zellträgermaterial dieses direkt durch eine zentrale Schlauchverbindung mit den zu kultivierenden Zellen beimpft wird. Die Zellen können nun unmittelbar an die Mikroträger adhärieren und mit ihrer Wachstumsphase beginnen. Über die Begasungsmebran werden die Zellen mit Sauerstoff, der durch die Hohlfaserwände und das Filtergewebe des Membrankorbes in das Korbinnere diffundiert, versorgt. Das Filtergewebe des Membrankorbes ist für das Kulturmedium zur Versorgung der Zellen mit Nährstoffen durchlässig, aber nicht für die zu züchtenden Zellen innerhalb des Korbes.
Die DE 195 46 542 zeigt eine Verfahren zur Kultivierung adhärenter Zellen auf einem flächenhaft ausgebildeten innerhalb einer Zellkulturkammer angeordneten Träger, an dem entlang ein flüssiges Versorgungsmedium bewegt wird, wobei der Träger die Form eines zu einer Spirale aufgewickelten Spule aus einer Membran oder Gewebe bestehenden Bandes aufweist, die Zellkulturkammer mit dem Versorgungsmedium derart aufgefüllt ist, dass der Träger vollständig mit Medium bedeckt ist und die Spirale um ihre zentrale Achse rotiert. Die zu kultivierenden Zellen werden im Perfusionsreaktor, insbesondere handelsübliche Rollerflaschen auf den spiralförmigen Träger geimpft und nach dem sich die Zellen am Träger festgesetzt haben, werden diese kontinuierlich mit dem Versorgungsmedium umspült. Die Spirale wird durch Verkleinerung ihres eigentlichen Durchmessers in die Rollerflasche verbracht, kann sich dann in dieser Rollerflasche entfalten und dabei wieder einen größeren Außendurchmesser einnehmen.
Aus der DE 2236240 wird eine Vorrichtung zur Züchtung von Gewebezellen und Mikroorganismen im Suspensionsmodus auf einer rotierenden Fläche beschrieben. Die Vorrichtung besteht aus einem Behälter und einem spiralförmigen, horizontal drehbaren Zellträger, wobei die Spiralwindungen durch zwei seitlich angeordnete Deckel auf einen bestimmten Abstand gehalten werden. Der Abstand der einzelnen Spiralwindungen ist so zu wählen, dass der Raum zwischen zwei benachbarten Windungen immer abwechselnd mit Medium und Gas gefüllt ist. Hier besteht das Problem, dass nur ein verhältnismäßig kleiner Teil der eigentlichen, eine große Zellkulturfläche bietenden, spiralförmigen Zellträgerfläche mit Medium oder Gas in Berührung kommt und so der Zellkultur keine Möglichkeit zum flächenmäßigen, zusammenhängenden und dichten Wachsen bietet. Außerdem erfolgt die Vermehrung der Zellen sehr langsam.
Weiterhin ist aus dem Stand der Technik eine Drehbett-Bioreaktor, der im Perfusionsmodus arbeitet, bekannt, bei dem das Drehbett horizontal im Reaktor angeordnet ist, durch einen Magnetantrieb berührungslos in Rotation versetzt wird und so den Zellträger abwechselnd durch das Medium und die Overlay-Atmosphäre bewegt. Das Drehbett besteht aus einer Vielzahl von, auf einer axial im Bioreaktor angeordneten, rotierenden Hohlwelle befestigten Zellträger aus makroporigen keramischen „Sponceram”-Scheiben, die aus Oxidkeramiken bestehen. (Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, Nr.: 12, S 1803–1807). Diese hochporöse Keramik erlaubt eine maximale dreidimensionale Zellhaftung, ein gutes Zellwachstum und eine schonende Ablösung von diesen Zellträgern. Die auf diesen Zellen verankerten Zellen expandieren schnell, bilden eine zellthypische, extrazelluläre Matrix aus, wachsen gewebeartig dicht und bleiben über viele Monate vital.
Diese Lösung erlaubt die dreidimensionale Vermehrung von adhärenten Zellen und Stammzellen humanen und tierischen Ursprungs. Die hochporösen keramischen Zellträger sind aber nicht geeignet für eine kontinuierliche Vermehrung von einigen häufig verwendeten Stammzellen und primären Zellen. Aus weiteren wissenschaftlichen Arbeiten ist bekannt, dass raue und porige Oberflächen u. a. die Differenzierung von Stammzellen befördern und eine starke Bildung von Extrazellulär-Matrix das Wachstum hemmt.
In der DE 3932633 wird ein Bioreaktor zu Durchführung von in-vito Prozessen, insbesondere Zellkultivierungen beschreiben, wobei der Bioreaktor aus einem zylindrischen Reaktionsgefäß besteht, in dessen Gefäßachse eine drehbare Trägerwelle angeordnet ist, die mehrere, in bestimmten Abständen parallel zu einander befestigte Haltesiebe aufweist, die mit einem als Zellkulturträger dienendes Perlpolymerisat mit einer Perlgröße von > 40 μ bis 300 μ angefüllt sind. Die Schichtdicke der paketförmigen Scheiben beträgt bevorzugt 1000 μ bis 2000 μ. Die Mikroträger werden in einer Vielzahl von auf einer Trägerwelle angeordneten scheibenförmigen Haltesiebe getragen, bilden damit eine Art poröser Zellkulturträger mit einer kleinen Porenstruktur und weisen damit die Mängel dieser Träger beim Züchten und Wachsen dreidimensionaler Zellstrukturen in ihrer Größe, Dichte und Anzahl für die weitere Anwendung in der Zelltherapie und im Tissue Engineering auf.
Weiterhin sind aus dem Stand der Technik verschiedene Bioreaktoren bekannt, in denen rotierende senkrechte Achsen mit daran parallel angeordneten Scheiben aus nichtrostendem Stahl als Zellkulturfläche für die Zellvermehrung angeordnet sind. Gleichzeitig dienen diese Scheiben auch als Rührorgane für die Medien. Der Bioreaktor ist weiterhin mit Zu- und Abführungen für Medien, wie Kultur- oder Nährstoffflüssigkeiten sowie Gase versehen ( DE 3031671 ).
Die Scheiben können in ihrer Oberflächenbeschaffenheit mit Strukturen modifiziert sein, die größer als der Durchmesser der zu züchtenden Zellen sind ( US 3976547 ). Die Versorgung der zu züchtenden Zellen erfolgt mittels Nährflüssigkeit und darin verteilten und/oder gelösten Gasen.
In der DE 4200446 wird eine Bioreaktor beschrieben, bei dem kreisförmige Zuschnitte mit gleichem Durchmesser als Zellkulturträger parallel auf einer rotierenden horizontalen Achse mit einem Abstand angeordnet sind, wobei der Abstand so bemessen ist, dass zwischen diesen Zuschnitten ein Wachsen bzw. Kultivieren von Zellen und der Durchfluss einer Behandlungsflüssigkeit, beispielsweise eine Nährstoffflüssigkeit möglich ist. Durch diese dichte, lamellenartige Anordnung der kreisförmigen Zellkulturträger und die damit verbundene Kapillarwirkung wird die Behandlungsflüssigkeit, beispielsweise die Nährstoffflüssigkeit an den anhaftenden Zellen vorbei geführt. Der lamellenartige Zellkulturträger ist drehbar im Bioreaktor angeordnet und so kann der Luft- oder Gasaustausch über die kreisförmigen Membranen bzw. Zuschnitte erfolgen und nicht über das Behandlungsmedium.
Weiterhin wird in der DE 4206585 ein Bioreaktor mit über einander angeordneten und durch Abstandshalter von einander getrennten Platten aus Sintermetall oder aus nicht toxischen Kunststoffen, wie Polypropylen oder Silkonfolien beschrieben. Auf diesen Platten wird auf der Oberseite zuerst eine Kollagenschicht, dann eine Zellkulturschicht und danach nochmals eine Kollagenschicht aufgetragen. Die Nährstoffflüssigkeit und die Gase werden durch die in die Platten verbrachten Bohrungen, die wiederum mit entsprechenden Zuführungen und Abflüssen verbunden sind, in die Abstände zwischen den Platten geleitet und die Zellkulturen werden mittels Gas- und Nährstoffdiffusion durch die Kollagenschicht vermehrt. Die Dicken und die Abstände der einzelnen Schichten sind in Abhängigkeit von den zu züchtenden Zellkulturen zu wählen. Für die Kultivierung von beispielsweise Hepatozyten haben sich Dicken für die Zellkulturträger von 0,5 mm, für die Gas durchlässiges Oberschicht von 0,1 mm, für die beiden Kollagenschichten von 0,4 bis 0,6 mm, für die Zellkulturschicht 0,002 bis 0,03 mm und für den Spaltraum wenige zehntel Millimeter als günstig erwiesen. Um mit diesem Bioreaktor auf eine für das Tissue Engineering geeignete Dichte und Anzahl von Zellen, beispielsweise zu Schaffung einer künstlichen Leber, zu erzielen, wären ca. 2000 über einander liegende Platten erforderlich, die, wenn sie in 4 Säulen als Kleeblattstruktur angeordnet wären, eine Höhe von 80 bis 100 cm ergeben würden.
Damit ist mit dieser Lösung keine effiziente Züchtung von gewebeartigen, dreidimensionalen Zellstrukturen in der für die Zelltherapie und Tissue Engineering geeigneten Anzahl und Dichte möglich. Die Wachstumgsgeschwindigkeit der primären Zellen ist vergleichsweise gering.
Ein weitere Zellkulturträger wird in der EP 0402272 in der Übersetzung DE 69022778 beschrieben, wobei der Zellkulturträger aus zwei hochmolekularen Membranen besteht, zwischen denen ein einen Strömungsweg bildendes Teil, wie ein Vlies oder Netz liegt, das die Funktion eines Platzhalters zwischen diesen Membranen erfüllt. Dieser Zellkulturträger ist mit einer Vielzahl von Bohrungen versehen, die die Zirkulation einer Flüssigkeit, wie Kultur- oder Nährstoffflüssigkeit ermöglicht. Diese Membranen bestehen aus (CO) Polymere eines ethylenischen ungesättigen Monomers und können mit einer Vielzahl von Noppen mit einer definierten Größe versehen sein, die als Abstandshalter beim Einbau dieser Zellkulturträger in einen Bioreaktor wirken. Die Höhe der Noppen beträgt 0,02 bis 1 mm, vorzugsweise 0,06 bis 0,2 mm. Das Verhältnis der von diesen Noppen eingenommenen Fläche zu gesamten Oberfläche des Zellkulturträgers beträgt 0,5 bis 50%, vorzugsweise 1,0 bis 20%. Die Zellkulturträger sind hierbei nicht als Drehbett aufgebaut, sondern sind in dem Bioreaktor als senkrechter Stapel mit dem durch die Noppen bestimmten Abstand angeordnet. Die Medien fließen durch eine Vielzahl von Bohrungen und verteilen sich sowohl durch die in den einzelnen Zellkulturträger gebildeten Strömungswege als auch durch die von den Noppen gehaltenen Abstände über die Membranen. Sowohl durch die Noppen als auch durch das Vlies, das zum Aufbau der Strömungswege zwischen den beiden Membranen angeordnet ist, entstehen Turbulenzen und unkontrollierte Strömungen, was zu Scherkräften führt und einen dichten und gleichmäßigen Bewuchs der Zellträger über längere Kultivierungszeiten nicht ermöglicht.
Aus der DE 19725602 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten von Zellen dargestellt, bei der im Reaktionsgefäß eine Vielzahl von flachen, aufrecht stehenden, glatten Platten als Zellkulturträger mit Abständen angeordnet sind. Diese Platten können aber auch netz- bzw. gitterartige Platten oder Einbettungsmaterialien sein, die herkömmlicher weise zum Anhaften und Fixieren von Zellen verwendet werden. Die abwechselnde Versorgung der zu züchtenden Zellen mit Nährstoffen und Gasen erfolgt hierbei durch Absenken und Heben des Flüssigkeitsspiegels im Reaktionsgefäß. Mit diesem Verfahren und Vorrichtung ist eine kontinuierliche und längere Vermehrung von Zellen, insbesondere von dreidimensionalen Strukturen nicht möglich, da diese nur diskontinuierlich mit Nährstoffen und Gasen versorgt und die Abfallprodukte auch nur diskontinuierlich entsorgt werden und so die Zellen auch nur über einen kurzen Zeitraum vital sind.
Die DE 35 41 738 zeigt eine Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem Hohlfaserreaktor, wobei das Kulturmedium, in dem die zu kultivierenden Zellen suspendiert sind, vom Nährmedium durch eine semipermeable Membran getrennte Strömungswege strömt und die semipermeable Membran für Nährstoffe und Abfallprodukte der Zellen durchlässig und für höher molekulare Bestandteile des Kulturmediums undurchlässig ist.
In der DE 101 04 008 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Züchten und Behandeln von Zellen auf einer modellierbaren Trägerstruktur beschrieben, wobei die Zellen zur Bildung einer Zellschicht in einen Zellkulturraum zwischen der Trägerstruktur oder einer auf der Trägerstruktur aufgebrachten Folie und einer zweiten Folie eingebracht, dort mit Sauerstoff und Nährmedien versorgt werden und der Zellkulturraum durch eine Gasmedium wechselnden Druckbelastungen ausgesetzt wird. Die Vorrichtung besteht dabei aus einem in einem Gasraum angeordneten Zellkulturraum, wobei der Gasraum mit einem Druckanschluss zur Verbindung mit einer Druckquelle versehen ist.
Die DE 100 46 175 beschreibt ein dynamisches Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten und Behandeln von Zellen mit einer Zellkulturplatte, die eine Vielzahl von auf der Oberseite dieser Zellkulturplatte offenen und auf der Unterseite geschlossenen Bohrungen aufweist, in denen Zellen aufgenommen und die Zellen in diesen Zellkulturräumen mit einer dynamischen Zufuhr von Sauerstoff und/oder Nährstoffen kontinuierlich oder diskontinuierlich versorgt werden.
Weiterhin wird in der DE 195 04 958 ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen auf einem Träger durch Bereitstellung eine dreidimensionalen Trägers in Form von Mikroträger und/oder dreidimensionalen zusammenhängenden Netzwerken für die zu kultivierende Zellen in einem rotierenden Kulturgefäß veröffentlicht. Die Versorgung der Zellkultur mit Nährstoffen und Sauerstoff geschieht durch Umspülen mit einer Nährstoffe und Sauerstoff enthaltenen Nährstofflösung, wobei der Träger in einer verschließbaren Zellkulturkammer bereitgestellt wird, die Versorgung mit Sauerstoff durch eine die Zellkulturkammer begrenzende gasdurchlässige Gasaustauschermembran und die Versorgung mit Nährstoffen durch eine die Zellkulturkammer begrenzende Dialysemembran, durch die die Nährstoffe transportiert und die Stoffwechselprodukte abtransportiert werden, erfolgt. Die zu kultivierende Zellen werden in einem flüssigen Medium in die Zellkulturkammer eingefüllt und wenn sich diese festgesetzt haben, werden die Zellen kontinuierlich mit dem Versorgungsmedium umspült.
Die DE 34 09 501 beschreibt ein Verfahren zum Kultivieren von tierischen, humanen, pflanzlichen Zellen, Hybridzellen und Mikroorganismen, wobei sich diese Zellen in Kammern befinden, die zumindest teilweise durch flächige Membranen begrenzt sind und durch diese Membranen ein Stoffaustausch zur Ver- und Entsorgung der Zellen mit gelösten bzw. gasförmigen Nährstoffen bzw. Stoffwechselprodukten erfolgt und die Zellen durch diese Membranen im wesentlichen zurückgehalten werden
In der DE 199 15 610 wird ein Verfahren zur Besiedlung von Substraten mit lebenden biologischen Zellen und eine Besiedlungsvorrichtung beschrieben, wobei wenigstens eine Besiedlungs- und wenigstens eine Perfusionsphase vorgesehen ist. Während der Besiedlungsphase wird das Substrat mit der Zellsuspension durch ständiges Drehen in verschiedene Raumrichtungen in Kontakt gehalten. Die dazugehörige Besiedlungsvorrichtung besteht aus einem rotierbaren Behälter und einen darin angeordneten heraus nehmbaren Einsatz mit einer Einspannvorrichtung für das zu besiedelnde Substrat, das insbesondere aus einer Kunststoff- oder Collagenmatrix besteht.
In der DE 101 28 811 wird ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen, wobei die Zellen wenigstens einer bestimmten Art jeweils eine Kultur in einer definierten Umgebung ausgesetzt und die Zellen der betreffenden Kultur mit zugeordneten, flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen und dergleichen nach einer Kombination folgender Verfahrensschritte versorgt werden, veröffentlicht:

– Ansetzen wenigstens einer Zellkultur innerhalb einer Zellkulturkammer eines Zellkultursystems
– Ingangsetzen eines Flusses frei wählbarer, definierter, flüssiger Medien in die Zellkulturkammer zur kontinuierlichen Versorgung der Zellkultur
– geregeltes Beheizen der Zellkulturkammer zur Erzielung einer konstanten Temperatur
– permanentes mikroskopisches Beobachten und Entnahme von Proben
– permanentes Messen sämtlicher relevanter Zellkulturparameter mittels integrierter Sensoren.

In einer weiteren Ausführung dieses Verfahrens werden sämtliche Daten, die durch das permanente mikroskopische Beobachten, das permanente Messen der relevanten Zellkulturparameter, wie pH-Wert, Lactatkonzentration, Elektrodenpotential, Temperatur und dergleichen, gewonnen werden zu einem computergesteuerten Überwachungs- und Steuerungssystem zur dortigen Weiterverarbeitung übertragen.
Die DE 102 22 896 beschreibt ein Verfahren zur Herstelluung eines dreidimensionalen und flächigen Gewebetransplantats, insbesondere eines Knorpeltransplantats mit Chondrozyten autologen Ursprungs, nach folgenden Schritten:

– Beimpfen eines dreidimensionalen, flächigen Polymervlieses mit einer Zellsuspension der zu züchtenden Zellen in einer Fibrinogen enthaltenden Kulturflüssigkeit,
– Überführen des inokulierten Polymervlieses in ein Kulturbehältnis, vorzugsweise eine Schale, das eine Thrombin enthaltende Lösung auf einer Fläche desselben enthält, wobei das Polymervlies auf einer ersten Fläche desselben mit der Thrombin enthaltenen Lösung in Kontakt gebracht wird,
– Auftragen einer zweiten Thrombin enthaltenen Lösung auf einer zweiten Fläche des Polymervlieses, die der ersten Fläche im wesentlichen gegenüber liegt,
– In-Kontakt-bringen der zweiten Fläche des Polymervlieses mit einer glatten Oberfläche eines Deckmaterials, vorzugsweise aus Kunststoff, Metall, Keramik, Glas oder Mischungen davon und anschließenden Auspolymerisierens des Fibrins,
– Entfernen des Deckmaterials und
– Kultivieren der Zellen, vorzugsweise für 3 bis 8 Tage

Die EP 0 904 353 in der Übersetzung der DE 697 23 264 stellt ein Verfahren zur in-vitro Kultivierung von Zellen, vorzugsweise von Primär- oder Tumorzellen und/oder Zelllinien humanen oder tierischen Ursprungs vor, bei dem vor der Phase der Kultivierung in einem Kultivierungsmedium mindestens eine vorübergehende Inkubationsphase der genannten, vorzugsweise in einem Inkubationsmedium isolierten Zellen während eines vorbestimmten Zeitraumes, vorzugsweise von 5 bis 60 min. durchgeführt wird, wobei das Inkubationsmedium eine Kalzium-Endkonzentration im Bereich von 0 bis 1 mM, vorzugsweise 0 bis 100 μM aufweist. Nach dieser Inkubationsphase werden die Träger mit ihren anhaftenden Zellen zur Kultivierung in eine Kulturmedium zurückgeführt. Die Inkubation erfolgt auf einer oszillierenden Platte, wobei als Träger jeder klassische Träger wie Petrischalen, Well-Platten oder Kulturflaschen aus Glas oder Plastik verwendet werden kann.
Den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Vorrichtung ist eigen, dass die Zellträger oft technisch aufwändig sind oder aufwändig vorbehandelt werden müssen. Die Vorrichtungen eignen sich nur in wenigen Fällen für die Kultivierung in kontrollierten, GMP-konformen Prozessen in steriltechnisch geschlossenen Systemen. Bei der Mehrzahl der Vorrichtungen ist auch nicht gewährleistet, dass die Versorgung mit Nährstoffen und Gasen gleichmäßig und für die Bedürfnisse der jeweiligen Zellart gesteuert erfolgen kann. Insbesondere stehen keine großen Oberflächen zur Verfügung, auf denen große Mengen an Stammzellen oder primäre Zellen stressfrei und optimal mit entsprechenden Nährstoffen und Gasen ohne zwischenzeitliches Passagieren versorgt werden können, um so den Bedingungen der in vivo-Züchtung mit natürlicher Vaskularisierung nahe zu kommen. Die Produktion größerer Zellenmengen, die in Hinblick auf Morphologie, Differenzierung und Vitalität den Anforderungen an Zellen für Zwecke der Zelltherapie und des Tissue Engineering genügen, ist damit nicht möglich. Weiter sind auch die Bedingungen von GMP nur bei wenigen Vorrichtungen erfüllt.
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur statischen Adhäsion und zur dynamischen Expansion von primären Zellen oder Stammzellen sowie eine entsprechende Vorrichtung zu schaffen, die die Nachteile des bekannten Standes der Technik beseitigt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Adhäsion und anschließende dynamischen Züchtung, Vermehrung und/oder Differenzierung von suspendierten primären Zellen oder Stammzellen humanen und tierischen Ursprungs in einem unter Bedingungen von GLP, GCP, GTP und GMP arbeitenden Drehbett-Bioreaktor mit als rotierbare Drehbetten ausgebildete spezielle Zellträger erfolgt. Die in einem Kulturmedium suspendierten primären Zellen oder Stammzellen humanen oder tierischen Ursprungs werden im geschlossenen System eines Drehbett-Bioreaktors statisch auf die als Drehbett ausgebildeten Zellträger adhäriert und anschließend mittels alternierender Bewegung der als Drehbett ausgebildete Zellträger durch ein Kulturmedium und durch die Overlay-Atmosphäre dynamisch gezüchtet und expandiert, wobei die Adhäsion ohne Bewegung der das Drehbett bildende Zellträger über einen Zeitraum von 1 bis 12 h, vorzugsweise 3 bis 6 h, jeweils nacheinander auf beiden Seiten der Zellträger und ohne Zuführung von frischen Kulturmedium erfolgt und wobei das außerhalb des Drehbettes im Reaktorgefäß befindliche kleine Medium-Volumen umgepumpt wird.
Während des Adhäsionsphase bleibt ein geringes Teilvolumen des Reaktorgefäßes, insbesondere 5–10% frei von Medium. Dieser Overlay-Raum des Reaktors wird dabei mit Gasgemisch aus CO₂ und Luft und/oder N₂ überströmt, wobei pH-Wert und pO₂-Wert, wie in der Control Unit der Reaktoranlage vorgewählt, geregelt werden. Insbesondere werden pO₂-Werte zwischen 1% und 100% eingestellt. Die Medien-Anteile innerhalb und außerhalb der Räume zwischen den Zellträgern vermischen sich schnell und bleiben homogen zusammengesetzt. Gradienten bei den Nährstoffen und Gasen, die das Zellwachstum behindern könnten, bilden sich nicht aus. In einer weiteren Auslegung der Erfindung erfolgt die Adhäsion innerhalb einer die Zellträger des Drehbettes dicht umschließende Hülle, aus vorzugsweise hochmolekularen semipermeablen, für die primären Zellen oder Stammzellen undurchlässigen Gewebe oder Membranen mit einer Poren- oder Maschenweite von 3 bis 15 μm, vorzugsweise von 5 bis 10 μm. Die semipermeable Membran kann gemäß einer weiteren Auslegung der Erfindung aus polymeren Materialien wie Polyester, Polyamid, Polyäthylen oder ähnlichen Polymeren bestehen, die gegeben falls Plasma behandelt sind.
Überraschend wurde gefunden, dass eine Reihe von adhärent wachsenden humanen Stammzellen, die besondere Bedeutung für die Therapie besitzen (z. B. mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark, Whartonscher Sulz, Plazenta, Fettgewebe) sich nur dann in undifferenzierter Form kultivieren und zu größeren Mengen expandieren lassen, wenn mehrere Bedingungen erfüllt sind, wie sie in dieser Erfindung verwirklicht sind. Besonders wichtig ist, dass die auf den Zellträgern adhärierten Zellen stark vereinzelt sind und während der Expansion viel freie Oberfläche in ihrer Umgebung zur Verfügung haben, um keine Kontaktinhibierung zu erfahren. Die genannten Stammzellen vermehren sich unter dieser Bedingung stark gespreitet und bilden wenig extrazelluläre Matrix aus.
Nach der Adhäsion der primären Zellen oder Stammzellen auf die als Drehbett ausgebildeten Zellträger erfolgt eine dynamische Züchtung und Vermehrung und/oder Differenzierung dieser, wobei wobei das Bioreaktorgefäß mit 50 bis 90%, vorzugsweise mit 50 bis 60% mit Medium befüllt ist und der Drehbett Bioreaktor im sterilen und geregelt temperierten Arbeitsraum des GMP Breeders der Reaktoranlage dynamisch betrieben wird. Dazu wird das Drehbett mit den auf den Zellträgern adhärierten Zellen mittels rotierender Bewegung alternierend durch ein Kulturmedium und durch die Overlay-Atmosphäre geführt. Das gilt für alle Ausführungen des Drehbettes mit darin angeordneten Zellträgern, auch für aus dem Stand der Technik bekannte spiralförmige Zellträger. Die Zellen werden so dynamisch gezüchtet und vermehrt und/oder differenziert. Das Kulturmedium wird umgepumpt, anteilig werden Kulturmedium und Overlay-Atmosphäre kontinuierlich zu- und abgeführt, die Parameter des Kulturmediums und der Overlay-Atmosphäre werden kontinuierlich kontrolliert und geregelt. Bei der Vermehrung von Suspensionszellen (z. B. von hämatopoetischen Stammzellen) entfällt die Adhäsionsphase. Das mit einer Hülle versehene Drehbett wird in diesem Fall mit Zellsuspension gefüllt und von Beginn an in Rotation versetzt. Für eine gute Versorgung der Stammzellen auf den Scheibenoberflächen mit homogenem Medium und mit Gasen und damit für schnelles Wachstum der Zellen ist eine weitere Bedingung, dass eine sehr langsame und gleichmäßige Durchströmung der Zwischenräume der Zellträgerscheiben mit Medium stattfindet. Das wird verwirklicht durch die Oberflächenspannung, die bedingt, dass das Medium sich bei sehr langsamer Scheibenrotation nur langsam zwischen den eng stehenden Scheiben bewegt. bzw. als dünne Schicht auf den Oberflächen fließt, wenn die Scheiben sich durch den Overlay-Raum bewegen, der 50 bis 90%, vorzugsweise 50 bis 60% des Reaktorvolumens ausmacht. Das gleichzeitige Umpumpen des Mediums quer zur Scheibenrotation und gegebenenfalls außerhalb der Hülle sorgt bei diesem Bewegungsablauf für ausreichenden Austausch zwischen den Mediumkompartimenten.
Für die schnelle und undifferenzierte Expansion der aufgeführten Stammzellen und auch vieler primärer Zellen ist die Kultivierung unter Hypoxämie erforderlich. Der für eine Zellart optimale pO₂ im Medium wird im Reaktor durch die Bewegung des Drehbettes durch die Overlay-Atmosphäre präzis erzeugt und gehalten werden. Wenn eine Differenzierung von Stammzellen erfolgen soll, wird von Anbeginn oder auch erst gegen Ende eines Kultivierungslaufes ein mit den bekannten Supplementen versetztes Medium zugeführt. Primäre, bereits differenzierte Zellen werden von Anbeginn in solchen Medien adhäriert und expandiert.
Gemäß einer weiteren Auslegung der Erfindung erfolgt die Züchtung, Vermehrung und/oder Differenzierung von in Kulturmedien suspendierten primären Zellen oder Stammzellen in einer Vorrichtung, die aus einem Reaktorgefäß (1) mit wenigstens einem demontierbaren Verschlussdeckel (13), regelbaren Port A (11) und B (19) für die Zu- und Abflüssen von Medien und Port C (9) und Port D (12) für die Zu- und Abführung von Overlay-Atmosphäre und eine im Reaktorgefäß (1) axial angeordnete, über einen Magnetantrieb berührungslos angetrieben rotierenden Welle (8) besteht, wobei auf der Welle (8) ein oder mehrere aus Zellträger bestehende Drehbetten angeordnet sind, die mittels des berührungslosen Magnetantriebes alternierend durch ein Kulturmedium (16) und durch die sich im Kopfraum des Reaktorgefäßes (1) befindliche Overlay-Atmosphäre (14) bewegt wird. Die rotierbare Welle (8) ist im Reaktorgefäß (1) auf der einen Seite lösbar und auf der anderen Seite des Reaktorgefäßes (1) in einem vom Reaktorgefäß demontierbaren Deckel (13) gelagert.
Das erfindungsgemäße Drehbett besteht aus einem Paket von übereinander, mit einem definiertem Abstand zueinander, parallel zur Welle (8) des Drehbettes angeordneten Zellträger (2) von rechteckigen Scheiben unterschiedlicher, jeweils dem Durchmesser des Reaktorgefäßes (1) angepassten Breite, wobei die runden Stirnscheiben des Drehbettes (18, 19) entsprechend dimensionierte Rillen zur Fixierung der Scheiben enthalten. Die rechteckigen Zellträger (2) füllen das Reaktorvolumen so aus, dass nur ein so geringer Abstand zur Wand des Reaktorgefäßes (1) bleibt, der ein unbehindertes Rotieren des Drehbettes ermöglicht. Die Zellträger (2) besitzen eine Dicke von 0,2 mm bis 2 mm, vorzugsweise von 0,5 bis 1 mm. Sie sind in einem definierten Abstand von 0,2 mm bis 4 mm, bevorzugt von 0,4 mm bis 0,8 mm zueinander angeordnet, was bei geringen Zwischenräumen durch entsprechende Noppen auf den Scheibenflächen präzise gewährleistet wird.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung besteht das Drehbettes aus Zellträger (5, 15) als Paket von runden Scheiben mit definierten Zwischenräumen, die auf der Welle (8) des Drehbettes stehend angeordnet sind. Die Zellträgerscheiben füllen das Reaktorvolumen so aus, dass nur ein geringer Abstand zur Wand des Reaktorgefäßes bleibt und ein unbehindertes Rotieren des Drehbettes gewährleistet ist. Die Zellträger-Scheiben besitzen eine Dicke von 0,2 mm bis 2 mm, vorzugsweise von 0,5 bis 1 mm. Sie sind in einem definierten Abstand von 0,2 mm bis 4 mm, bevorzugt von 0,4 mm bis 0,8 mm angeordnet, was bei geringen Zwischenräumen durch entsprechende Noppen auf den Scheibenflächen präzise gewährleistet ist. Die realisierbaren Besiedlungsflächen pro Drehbettvolumen sind ähnlich groß wie bei Drehbettausführung mit rechteckigen Scheiben.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung sind die Zellträger (2, 5, 15) der beiden vorstehend beschriebenen Bettformen mit einer äußeren Hülle (17) versehen, die verhindert, das die Zellen in das kleine, außerhalb der Zellträger-Pakete vorhandene Reaktorvolumen gelangen und beschädigt werden, wenn das Medium umgepumpt wird. In dieser Ausführung besitzen die runden Zellträgerscheiben (5, 15) zusätzlich Löcher, durch die die Zellsuspension bei der Inokulation fließen und sich zwischen den Scheiben verteilen kann.
Die Außenscheiben des mit runden Scheiben ausgerüsteten Drehbettes besitzt bei der umhüllten Ausführung des Drehbettes je einen Port (3, 4)) mit elastischer Silikonmembran, durch die zu inokulierende Zellsuspension eingebracht und nach der Vermehrung zu erntende Zellsuspension ausgetragen wird.
Die Hülle (17), die die Zellträger (2, 5, 15) im Drehbett dicht umschließt, besteht aus hochmolekularen, semipermeablen, für die primären Zellen oder Stammzellen undurchlässigen Geweben oder Membranen mit einer Poren- oder Maschenweite von 3 bis 15 μm, vorzugsweise von 5 bis 10 μm. Die semipermeable Membran kann gemäß einer weiteren Auslegung der Erfindung aus polymeren Materialien wie Polyester, Polyamid, Polyäthylen oder ähnlichen Polymeren bestehen.
Reaktoren mit einem Drehbett, dass parallel zur Drehachse angeordnete Zellträger (2) besitzt, werden während des Adhärierens der Zellen horizontal aufgestellt. Die Reaktoren mit einem Drehbett aus runden Zellträger-Scheiben (5, 15) werden während des Adhärierens vertikal aufgestellt. Die Zellen adhärieren jeweils gleichmäßig verteilt auf der Oberfläche der Träger.
Für die Zellträger werden Materialien benutzt, auf denen Zellen bekanntermaßen gut ahärieren, vorzugsweise übliche, Plasma-behandelte, glatte Polystyrol-Zuschnitte, solche aus anderen Polymermaterialien oder dichte Oxidkeramik mit geschliffener Oberfläche vom Sponceram^®-Typ.
Die Zellträger können auch aus einem Siebgewebe mit einer Maschenweite von 01, bis 2 mm, vorzugsweise 0,4 bis 1 mm bestehen. Die Zellträger können dabei aus Polymeren wie Polystyrol, Polyester, Polyethylene, Polypropylene und anderen Polymeren gefertigt sein.
Das Drehbett aus den oben beschriebenen Zellträgern kann gemäß einer weiteren Auslegung der Erfindung nur aus Scheiben mit glatter Obeflächen oder aus abwechselnd angeordneten Scheiben aus glattem Material und aus Siebgewebe oder nur aus Siebgewebe-Scheiben aufgebaut sein.
Der Bioreaktor mit den neuartige Drehbetten und den darin angeordneten Zellträgern wird in einer Zellkultivierungs-Anlage betrieben, die zusätzlich einen GMP Breeder zur Aufnahme des Reaktors und eine Control Unit mit zugehöriger Software für Steuerung, Regelung und Dokumentation des Kultivierungsprozesses umfasst (siehe Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, S. 1803–1807).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen können adhärent wachsende (autologe oder allogene) Stammzellen undifferenziert und ohne zwischenzeitliches Passagieren in großen Mengen nach den Anforderungen von GMP erzeugt werden, was bei therapeutischer Verwendung der Zellen notwendig ist. Mittels entsprechend supplementierter Medien und Zellträger-Oberflächen kann die Vermehrung der Stammzellen auch unter Differenzierungsdruck erfolgen. Primäre Zellen können nach diesem Verfahren und mit dieser Vorrichtung ebenfalls eine optimale Zahl von Teilungen erreichen und in großen Mengen erzeugt werden. Die vorstehend beschriebene Ausführung eines Bioreaktors mit Drehbetten und eng darin angeordneten Stapeln von Zellträger-Scheiben ermöglicht unter den beschriebenen Kultivierungsbedingungen Expansionen der genannten humanen Stammzellen oder weiterer primärer Zellen ohne zwischenzeitliches Passagieren im geschlossenen System einer Bioreaktor-Anlage. Dabei werden schnelle Verdopplungszeiten erreicht und eine Zahl von Verdopplungen, die in entsprechenden Flaschenkulturen und auch sonst wie nicht realisiert werden konnten. Beispielweise wurden je nach Stammzelltyp aus Besiedlungen des Drehbettes mit 10^6 Zellen 3 × 10^8 bis 5 × 10^9 nicht differenzierte Zellen geerntet.
Durch dichtes Einschließen des Drehbettes mit den Zellträgern in eine Hülle aus Polymergeweben mit Maschenweiten, die von Stammzellen und primären Zellen nicht passiert werden können (alternativ sind als Hülle auch entsprechend porige Polymermenbranen geeignet), lassen sich nach diesem Verfahren und mit dieser Vorrichtung auch Suspensionszellen vermehren (z. B. hämatopoetische Stammzellen) sowie auch Suspensionszellen gemeinsam mit adhärenten Zellen züchten und expandieren (z. B. die Gesamtfraktion der Mononuklearzellen aus Knochenmark). Die Erfindung soll nun an Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden, wobei die
1 eine schematische Darstellung des Drehbett-Bioreaktors mit
Bezugszeichenliste

1: Reaktorgefäß
5: Zellträger aus runden glatten Scheibenflächen
6: Magnetträger für den berührungslosen Magnetantriebes
7: Lager für Welle
8: Welle
9: Port C für die Zuführung von Overlay-Atmosphäre
10: Port B für die Abführung von Kulturmedium
11: Port A für die Zuführung von Kulturmedium
12: Port D für die Abführung von Overlay-Atmosphäre
13: demontierbarer Deckel mit Lager für Hohlwelle 8
14: Overlay-Atmosphäre
15: Zellträger aus Siebgewebe
16: Kulturmediums
b: Füllhöhe des Kulturmediums
d: Abstand der Zellkulturträgerscheiben

zeigt.
2 zeigt die gleiche schematische Darstellung vom Drehbett-Bioreaktor, nur wird hier das Paket aus mehreren Zellkulturträgerscheiben (5) mit glatter Oberfläche und Zellkulturträgerscheiben (15) aus Siebgewebe dargestellt.
3 zeigt eine schematische Darstellung einer Zellträger (15) aus Siebgewebe mit einer Maschenweite (c)
4 zeigt eine schematische Darstellung der auf der Hohlwelle (8) angeordneten Zellkulturträgerscheiben (5, 15) mit den auf den Außenscheiben angeordneten Ports (3, 4) mit elastischer Silikonmembran in der Hülle (17).
5 zeigt eine schematische Darstellung eines Drehbett-Bioreaktors, bei dem das Drehbett aus einer oder mehreren übereinander angeordneten flachen, parallel zur Welle (8) angeordneten Zellträger (2), die durch seitlich angeordnete Deckel (18, 19) versehen mit Schlitzen zur Aufnahme der Zellträger (2), gehalten werden.
Ausführungsbeispiel 1:
Die Fraktion mit mesenchymalen Stammzellen wird nach einem üblichen Protokoll aus humanem Knochenmarkaspirat gewonnen, in Alpha MEM suspendiert, das 10% Humanserum und 2 mg/l Gentamycin enthält und in Flaschenkultur soweit vermehrt, dass eine Menge an Stammzellen geerntet werden kann, die genügt, um ein Drehbett mit 200 Zellen pro cm² zu besiedeln. Die erste Hälfte der aus der Flaschenkultur geernteten Stammzellen aus humanem Knochenmark werden in Alpha MEM suspendiert, das 10% Humanserum und 2 mg/l Gentamycin enthält. Die Suspension wird über den Port A (11) in den Bioreaktor mit Drehbett aus parallel zur Welle (8) angeordneten rechteckigen flachen Zellträger (2) gemäß 5 einlaufen gelassen. Die Menge an Zellsuspension wird so gewählt, dass der Reaktorraum (1) zu 90% mit Zellsuspension gefüllt ist. Der Reaktor wird im GMP Breeder, angeschlossen an die Control Unit, mit einer auf 37°C geregelten Temperatur im Kulturmedium betrieben. Die noch in Suspension befindlichen Stammzellen werden zunächst durch vorsichtiges Schwenken des aus dem Antrieb genommenen Reaktors gleichmäßig im Rektorraum (1) verteilt. Der Reaktor wird sodann so in Aufnahme des Magnetantriebs eingebracht, dass die Flächen der Zellträger, die parallel zur Reaktorwelle angeordneten sind, horizontal stehen. Das Drehbett wird 4 h lang keiner Bewegung unterworfen. Ebenso wird für den Zeitraum des Adhärierens kein frisches Kulturmedium hinzu gegeben, um so ein statisches, stressfreies Adhärieren zu gewährleisten. Das Kulturmedium wird mit 5 bis 10 ml pro min über die Ports A (11) und B (10) in Längsrichtung durch das kleine Volumen außerhalb der Zellträgerscheiben sowie durch die angeschlossenen Sondenhalter mit pH-Elektrode und O₂-Sonde gepumpt. Der Overlay-Raum wird durch die Ports C (9) und D (12) für die Zu- und Abführung für die Overlay-Atmosphäre mit einem Gasgemisch aus Luft, N₂ und CO₂ überströmt, wobei die in der Control Unit vorgewählten Werte für pH und pO₂, insbesondere pH-Wert auf 7,3 und der O₂-Gehalt im Kulturmedium auf 5% sich geregelt einstellen.
Nach 4 h Adhäsion wird das Kulturmedium aus dem Reaktor abgelassen. Es enthält in der Regel weniger als 1% der eingebrachten Zellen. Nun wird die zweite Hälfte der Stammzellsuspension wie vorstehend beschrieben in den Reaktor verbracht und durch Schwenken gleichmäßig verteilt. Der Reaktor wird jetzt so in den Magnetantrieb eingesetzt, dass die bisher horizontal nach oben zeigenden, besiedelten Flächen der Zellträger (2) nach unten zeigen und die Stammzellen der zweiten Zellsuspension auf den noch unbesiedelten Zellträger-Flächen adhärieren können. Ansonsten entsprechen die weiteren Bedingungen der zweiten Adhäsionsphase denen der ersten Besiedlungsphase.
Nach weiteren 4 h Adhäsionszeit wird die dynamische Expansion der adhärierten Stammzellen durch Starten der Bettrotation eingeleitet, wobei sich 0,5 bis 2 rpm bei mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark als geeignet erwiesen haben. Während der Expansionsphase werden Überströmung mit Overlay-Gasgemisch, pH-Wert und pO₂-Wert nicht verändert, das Kulturmedium wird weiterhin umgepumpt und frisches Medium wird ab jetzt ständig zugepumpt. Die Menge an frischem Medium wird so dosiert, dass der Glukosegehalt im ablaufenden Medium nicht unter 600 bis 500 mg/l sinkt. Der Verbrauch an Glukose und die Bildung von Laktat nehmen während der Expansionsphase exponentiell zu und verlangsamen sich erst dann, wenn die Zellträger beidseitig subkonfluent bis konfluent mit Stammzellen bewachsen sind. Das ist in der Regel nach 12–16 Tagen Kultivierungsdauer der Fall.
Für die Zellernte wird das Kulturmedium aus dem Reaktor abgelassen, das Reaktorgefäß wird zur Hälfte mit Alpha MEM gefüllt, das Kollagenase oder andere proteolytische Enzyme enthält. Das Drehbett rotiert dabei bei 37°C 30 bis 60 min lang mit 10 bis 15 rpm. Unter diesen Bedingungen lösen sich die mesenchymalen humanen Knochenmarkstammzellen vollständig von den Zellträgern. Die entstandene Zellsuspension wird abgelassen, schonend zentrifugiert, resupendiert in Medium und erneut zentrifugiert und kann dann direkt verwendet oder kryokonserviert werden.
Ausführungsbeispiel 2
Stammzellen aus der Innenwand von humanen Nabelschnurgefäßen werden nach einem bekannten Verfahren isoliert. Aus einer Nabelschnur kann eine Zellmenge geerntet werden, die für die direkte Ansiedlung im Drehbett-Bioreaktor ohne vorheriges Vermehren in Flaschenkultur und Passagieren ausreicht. Die Stammzellen werden in Amniopan (PAN Biotech) und 2 mg Gentamycin/ml suspendiert und über die Port (3, 4) in den Innenraum des Drehbettes, bestehend aus einem, mit einer Membran (17) aus einem Polyestergewebe mit einer Maschenweite von 10 μm dicht umschlossenen Paket von parallel, senkrecht auf der Welle (8) angeordneten runden scheibenförmigen Zellträger (5, 15) gemäß 4 mittels einer großvolumigen Spritze mit einer Kanüle mit 0,4 mm Innendurchmesser infundiert. Die Menge an Zellsuspension wird so gewählt, dass 500 Zellen pro cm² für die Hälfte der Besiedlungsfläche vorhanden sind und der Reaktorraum (1) zu 90% mit Zellsuspension gefüllt ist. Der Reaktor wird im GMP Breeder, angeschlossen an die Control Unit, mit einer auf 37°C geregelten Temperatur im Kulturmedium betrieben. Die erste Hälfte der in Suspension befindlichen Stammzellen wird zunächst durch vorsichtiges Schwenken des aus dem Antrieb genommenen Reaktors gleichmäßig im Rektorraum verteilt. Der Reaktor wird sodann vertikal in die gesonderte an der Rückwand des GMP Breeders eingehängt. die Zellträgerscheiben sind dabei horizontal angeordnet. Das Drehbett wird 6 h lang nicht bewegt. Ebenso wird für den Zeitraum des Adhärierens kein frisches Kulturmedium zugefügt, um so ein statisches, stressfreies Adhärieren zu erreichen. Das Kulturmedium wird mit 10 bis 20 ml pro min über die Ports A (11) und B (10) für die Zu- und Abführung des Kulturmediums von unten nach oben durch das kleine Volumen außerhalb der mit einer Membran aus Polyestergewebe und einer Maschenweite von 10 μm sowie durch die angeschlossenen Sondenhalter mit pH-Elektrode und O₂-Sonde gepumpt. Der Overlay-Raum wird durch die Ports C (9) und D (12) für die Zu- und Abführung der Overlay-Armosphäre mit einem Gasgemisch aus Luft, N₂ und CO₂ überströmt, wobei die in der Control Unit vorgewählten Werte für pH und pO₂, insbesondere der pH-Wert auf 7,3 und einen O₂-Gehalt im Kulturmedium von 10% sich geregelt einstellen. Nach 6 h sind die Zellen vollständig adhäriert. Das Kulturmedium wird aus dem Reaktor abgelassen. Nun wird die zweite Hälfte der Stammzellen ebenfalls durch die Ports (3, 4) in die Hülle mit dem Drehbett aus runden scheibenförmigen Zellträger (5, 15) injiziert, wiederum als Suspension, die 90% des Reaktorvolumens füllt und 500 Zellen pro cm² für die zweite Hälfte der Zellträgerfläche enthält. Die Suspension wird durch Schwenken gleichmäßig zwischen den Scheiben verteilt. Der Reaktor wird jetzt um 180° gedreht in die gesonderte Vorrichtung an der Rückwand des GMP Breeders eingehängt, sodass die Stammzellen der zweiten Zellsuspension auf den noch unbesiedelten Zellträger-Flächen 6 h lang adhärieren können. Das Kulturmedium wird während dieser Zeit mit 10 bis 20 ml pro min über die Ports A (11) und B (10) wiederum von unten nach oben durch das kleine Volumen außerhalb der mit einer Membran aus Polyestergewebe und einer Maschenweite von 10 μm sowie durch die angeschlossenen Sondenhalter mit pH-Elektrode und O₂-Sonde gepumpt. Nach der zweiten Adhäsionsphase wird der Reaktor horizontal in den Magnetantrieb eingefügt und die dynamische Expansion der adhärierten Stammzellen durch Starten der Bettrotation, die 3 bis 6 rpm betragen kann, eingeleitet. Während der Expansionsphase wird die Überströmung mit Overlay-Gasgemisch, die jetzt horizontal erfolgt, gegenüber der Adhäsionsphasen nicht verändert. Ebenso werden pH-Wert und pO₂-Wert gleich gelassen. Das Kulturmedium wird weiterhin umgepumpt und frisches Medium wird ab jetzt ständig zugepumpt. Die Menge an zugeführtem frischem Medium wird fortlaufend so erhöht, dass der Glukosegehalt im ablaufenden Medium 300 bis 400 mg/l nicht unterschreitet. Der Verbrauch an Glukose und die Bildung von Laktat nehmen während der Expansionsphase exponentiell zu und verlangsamen sich erst dann, wenn die Zellträger beidseitig mit einer dicken 3D-Schicht von Stammzellen, eingebettet in selbstgenerierter extrazellulärer Matrix, überwachsen sind. Eine optimale Menge an Stammzellen ist normalerweise nach 20 bis 30 Tagen Kultivierungsdauer vorhanden. Für die Zellernte wird das Kulturmedium aus dem Reaktor abgelassen, das Reaktorgefäß wird zur Hälfte mit preisgünstigem DMEM gefüllt, das Kollagenase oder andere proteolytische Enzyme enthält. Das Drehbett wird bei 37°C 3 h bis 6 h lang mit 20 bis 30 rpm rotiert. Die Stammzellen aus den Innenwänden von Nabelschnurgefäßen werden unter diesen Bedingungen nahezu vollständig aus umgebenden Matrix herausgelöst. Die entstandene Zellsuspension wird abgelassen, schonend zentrifugiert, resupendiert in Medium und erneut zentrifugiert und kann dann direkt verwendet oder kryokonserviert werden.
Zur Beurteilung der Patentfähigkeit in Betracht zu ziehende Druckschriften

US 493 90 87
US 397 65 47
JP 541 14 474
EP 0 820 337
EP 0 402 72
EP 0 904 353 in der Übersetzung DE 697 23264
EP 1 661 979
DE 696 28 291
DE 199 11 326
DE 89 04 976
DE 42 06 585
US 480 46 28
DE 20 2005 009 425
DE 195 46 652
DE 22 36 240
DE 39 32 633
DE 30 31 671
DE 42 00 446
DE 197 25 602
DE 35 41 738
DE 101 04 008
DE 100 46 175
DE 195 94 958
DE 34 09 501
DE 197 25 602
DE 199 15 610
DE 101 28 811
DE 102 22896
Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, Nr.: 12, S 1803–1807

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 4939087 [0003]
JP 54114474 [0004]
EP 0820337 [0005]
DE 69628291 [0005]
DE 19911326 [0006]
EP 1661979 [0007]
DE 8904976 [0008]
DE 4206585 [0009, 0022]
DE 2722921 [0011]
US 4804628 [0012]
DE 202005009425 [0013]
DE 19546542 [0014]
DE 2236240 [0015]
DE 3932633 [0018]
DE 3031671 [0019]
US 3976547 [0020]
DE 4200446 [0021]
EP 0402272 [0024]
DE 69022778 [0024]
DE 19725602 [0025]
DE 3541738 [0026]
DE 10104008 [0027]
DE 10046175 [0028]
DE 19504958 [0029]
DE 3409501 [0030]
DE 19915610 [0031]
DE 10128811 [0032]
DE 10222896 [0034]
EP 0904353 [0035]
DE 69723264 [0035]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, Nr.: 12, S 1803–1807 [0016]
Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, S. 1803–1807 [0053]

Claims

Verfahren zur dynamischen Züchtung und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von suspendierten primären Zellen oder Stammzellen humanen und tierischen Ursprungs in einem unter Bedingungen von GLP, GCP, GTP und GMP arbeitenden Drehbett-Bioreaktor mit als rotierbare Drehbetten ausgebildete Zellträger, wobei die in einem Kulturmedium suspendierten primären Zellen oder Stammzellen in einem Drehbett-Bioreaktors auf die als Drehbett ausgebildeten Zellträger adhäriert und anschließend mittels alternierender Bewegung der als Drehbett ausgebildete Zellträger durch das Kulturmedium und durch die Overlay-Atmosphäre dynamisch gezüchtet und expandiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Adhärieren der Stammzellen oder primären Zellen in einem geschlossenen System eines Drehbett-Bioreaktors statisch ohne Bewegung des aus Zellträger bestehenden Drehbettes und ohne Zuführung von frischen Kulturmedium über einen Zeitraum von 1 bis 12 h, vorzugsweise von 3 bis 6 h, jeweils nacheinander auf beiden Seiten der Zellträger, erfolgt, wobei das sich außerhalb des Drehbettes befindliche kleine Volumen an Kulturmedium umgepumpt, der nicht mit Kulturmedium gefüllte Kopfraum des Drehbett-Bioreaktors, vorzugsweise 5–10% des Volumens des Reaktorgefäßes mit einem Gasgemisch von CO₂ und Luft und/oder N₂ überströmt wird und der pH-Wert und pO₂-Wert in Abhängigkeit der zu vermehrenden Zellen, insbesondere die pO₂-Werte zwischen 1% und 100% eingestellt werden.
Verfahren zur dynamischen Züchtung und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von primären Zellen oder Stammzellen tierischen oder humanen Ursprungs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Adhäsion innerhalb einer die Zellträger des Drehbettes dicht umschließenden Hülle aus einem hochmolekularen semipermeablen, für die primären Zellen oder Stammzellen undurchlässigem Gewebe oder Membranen mit einer Poren- oder Maschenweite von 3 bis 15 μm, vorzugsweise 5 bis 10 μm, erfolgt.
Verfahren zur dynamischen Züchtung und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von primären Zellen oder Stammzellen tierischen oder humanen Ursprungs nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das hochmolekulare semipermeable Gewebe oder Membran aus polymeren Materialien wie Polyester, Polyamid, Polyäthylen oder ähnlichen Polymeren besteht.
Verfahren zur dynamischen Züchtung und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von primären Zellen oder Stammzellen tierischen oder humanen Ursprungs nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Adhärieren die primären Zellen oder Stammzellen mittels alternierender Bewegung des Drehbettes durch ein Kulturmedium und durch die Overlay-Atmosphäre dynamisch gezüchtet und expandiert, wobei das Bioreaktorgefäß mit 50 bis 90%, vorzugsweise mit 50 bis 60% mit Medium befüllt ist.
Vorrichtung zur Züchtung, und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von in Kulturmedien suspendierten primären Zellen oder Stammzellen, die aus einem Reaktorgefäß (1) mit wenigstens einem demontierbaren Verschlussdeckel (13), regelbaren Ports A (11) und B (10) für die Zu- und Abflüssen von Medien und Ports C (9) und D (12) für die Zu- und Abführung von Overlay-Atmosphäre und eine im Reaktorgefäß (1) axial angeordnete, über einen Magnetantrieb berührungslos angetrieben rotierenden Welle (8) besteht, wobei auf der Welle (8) ein oder mehrere aus Zellträger bestehende Drehbetten angeordnet sind, die mittels des berührungslosen Magnetantriebes alternierend durch ein Kulturmedium (16) und durch die sich im Kopfraum des Reaktorgefäßes (1) befindliche Overlay-Atmosphäre (14) bewegt werden, die rotierbare Welle (8) im Reaktorgefäß (1) auf der einen Seite lösbar und auf der anderen Seite des Reaktorgefäßes (1) in einem vom Reaktorgefäß (1) demontierbaren Deckel (13) gelagert ist, nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Drehbett aus einem Paket von übereinander, mit einem definiertem Abstand zueinander, parallel zur Welle (8) des Drehbettes angeordneten Zellträger (2) von rechteckigen Scheiben unterschiedlicher, jeweils dem Durchmesser des Reaktorgefäßes (1) angepassten Breite mit einer Dicke von 0,2 mm bis 2 mm, vorzugsweise von 0,5 bis 1 mm und aus runden Stirnscheiben (18, 19) mit entsprechend dimensionierte Rillen zur Fixierung der rechteckigen Scheiben besteht. wobei diese in einem definierten Abstand von 0,2 mm bis 4 mm, bevorzugt von 0,4 mm bis 0,8 mm, wobei gegeben falls der Abstand zwischen den Zellträger (2) durch entsprechende Noppen auf den Scheibenflächen präzise gewährleistet wird.
Vorrichtung zur Züchtung, und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von in Kulturmedien suspendierten primären Zellen oder Stammzellen nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass das Drehbettes aus Zellträger (5, 15) als Paket von runden Scheiben mit definierten Zwischenräumen, die auf der Welle (8) des Drehbettes senkrecht angeordnet sind, besteht, wobei die Zellträger-Scheiben eine Dicke von 0,2 mm bis 2 mm, vorzugsweise von 0,5 bis 1 mm haben und in einem definierten Abstand von 0,2 mm bis 4 mm, bevorzugt von 0,4 mm bis 0,8 mm auf der Welle (8) angeordnet, gegeben falls bei geringen Zwischenräumen mit entsprechende Noppen auf den Scheibenflächen versehen sind und die Außenscheiben des Pakets aus Zellträger (5, 15) je mit einem Port (3, 4)) mit elastischer Silikonmembran ausgerüstet ist.
Vorrichtung zur Züchtung, und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von in Kulturmedien suspendierten primären Zellen oder Stammzellen nach Anspruch 1 bis 4 und 6 dadurch gekennzeichnet, dass das Drehbett mit einer äußeren Hülle (17) versehen ist, die Hülle (17) die Zellträger (5, 15) im Drehbett dicht umschließt und aus hochmolekularen, semipermeablen, für die primären Zellen oder Stammzellen undurchlässigen Geweben oder Membranen mit einer Poren- oder Maschenweite von 3 bis 15 μm, vorzugsweise 5 bis 10 μ besteht.
Vorrichtung zur Züchtung, und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von in Kulturmedien suspendierten primären Zellen oder Stammzellen nach Anspruch 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Zellträger (2, 5, 15) aus glatten, gegeben falls auch aus Plasma behandelten, Zuschnitten aus Hochpolymeren, insbesondere aus Polystyrol, Polyester, Polyethylene, Polypropylene und anderen Polymeren, oder aus einer dichten Oxidkeramik mit geschliffener Oberfläche oder aus einem Siebgewebe mit einer Maschenweite von 01, bis 2 mm, vorzugsweise 0,4 bis 1 mm bestehen.
Vorrichtung zur Züchtung, und/oder Vermehrung und/oder Differenzierung von in Kulturmedien suspendierten primären Zellen oder Stammzellen nach Anspruch 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass das Drehbett aus Zellträger (2, 5, 15) nur aus Scheiben mit glatter Oberflächen oder aus abwechselnd angeordneten Scheiben aus glattem Material und aus Siebgewebe oder nur aus Siebgewebe-Scheiben besteht.