DE10104008A1

DE10104008A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen

Info

Publication number: DE10104008A1
Application number: DE2001104008
Authority: DE
Inventors: Augustinus Bader
Original assignee: Bionethos Holding GmbH
Current assignee: Bionethos Holding GmbH
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2002-08-01

Abstract

Bei einem Verfahren zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen auf einer modellierbaren Trägerstruktur werden die Zellen zur Bildung einer Zellschicht in einen Zellkulturraum zwischen der Trägerstruktur oder einer auf der Trägerstruktur aufgebrachten Folie und einer zweiten Folie, insbesondere einer mikroporösen Folie, eingebracht. Sauerstoff und/oder Nährmedium werden in den Zellkulturraum eingeleitet. Der Zellkulturraum wird durch eine Gasmedium wechselnde Druckbelastung ausgesetzt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen nach der im Oberbegriff von Anspruch 1 näher definierten Art. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen.

In der älteren Anmeldung des Erfinders DE 199 35 643.2 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art beschrieben.

Es hat sich nun herausgestellt, daß die Bildung einer Zellschicht und das Zellwachstum deutlich verbessert wird, wenn man die Zellen einer Druckbelastung aus setzt. Hierzu ist es aus der Praxis bereits bekannt, einen Zellkulturraum durch mechanische Einrichtungen, wie z. B. einen Stempel, z. B. wie in der US 6,060,306, zu belasten. Neben dem hierfür erforderlichen kon struktiven Aufwand entspricht eine derartige Belastung aufgrund der dadurch erzielten Heterogenitäten nicht in-vivo-Verhältnissen. In der US 5,928,945 wird haupt sächlich über Scherstress mittels Kulturmedium eine mechanische Belastung von z. B. Knorpelzellen versucht. Dies ist jedoch unphysiologisch, da z. B. in Gelenkbe reichen keine derartigen Perfusionen auftreten. Zu sätzlich ist der Sauerstoffgehalt aufgrund der limi tierten Transportkapazität für Sauerstoff nicht bei allen Gewebearten in physiologische Bereiche einstell bar (McLimmans et al. 1968).

In der US 6,060,306 ist auch ein Apparat beschrieben, in dem ein Knorpelkonstrukt innerhalb einer Kultivie rungskammer durch Bewegungen der Außenwände wie in ei nem Blasebalg bewegt wird. Diese Bewegungsprozesse ha ben den Nachteil, daß die Bewegungsmuster einen hohe mechanische Belastung der Membranstrukturen bedingen, insbesondere dann, wenn diese aus Permeabilitätszwän gen für Sauerstoff besonders dünn sind, d. h. eine Dic ke im Mikrometerbereich haben. Dies führt dazu, daß die Membrane nach wenigen Tage reißen und die Produkte unsteril werden und dadurch für Implantationen nicht mehr geeignet sind. Weiterhin können die Membrane auf grund der Bewegungsmuster, die ständig konvex-konkave Verformungen hervorrufen, auch nur entsprechend punk tuell Druckverformungen erzeugen. Dadurch kommt es zu Oszillationen im Kulturmediumbereich und Druck-Hetero genitäten in den biologischen Geweben im Bioreaktor.

Der vorliegenden Aufgabe liegt daher die Aufgabe zu grunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen zu schaffen, wobei so weit wie möglich in-vivo-Verhältnisse simuliert werden können.

Insbesondere sollen in dem bioartifziellen Gewebe in nerhalb des Bioeaktors in allen Bereichen vollständig homogene Druckverhältnisse erzeugt werden können, ohne jegliche konvex-konkave Membranverformungen der Außen wände des Systems. Wenn diese Membrane zusätzlich Oxygenationsaufgaben übernehmen sollen, um unerwünschte Heterogenitäten der Transportdistanzen für die O₂ Dif fusion und damit Mangelzustände zu vermeiden, so müs sen sich diese in einer stabilen und möglichst kurzen Distanz zu den biologischen Konstrukten befinden, und idealerweise diesen immer direkt anliegen, d. h. sie müssen allen Bewegungen des biologischen Konstrukts in identischer Weise folgen, statt dies blasebalgartig zu induzieren.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das im kenn zeichnenden Teil von Anspruch 1 genannte Merkmal ge löst.

Eine Vorrichtung zur Lösung der gestellten Aufgabe ist aus Anspruch 3 ersichtlich.

Durch ein Gasmedium bzw. durch die Bildung eines Gas raumes lassen sich in-vivo-Verhältnisse sehr gut simu lieren. So ist es z. B. möglich, die Zellschicht in dem Zellkulturraum sehr gezielt wechselnden und homogenen Druckbelastungen auszusetzen, welche beliebig häufig und beliebig schnell ohne großen Aufwand sehr gezielt gesteuert werden können. Sobald es über die externe Gasphase zu einer Druckeinwirkung auf die äußere Foli enschicht kommt, legt sich diese vollständig um das Implantat an. Dadurch können auch sehr komplexe 3-D Strukturen vollständig ummantelt werden. Die Diffusi onswege für O₂ werden dadurch gleichzeitig auf fast 0 reduziert. Bei 3-D Strukturen können die Folien/Mem branschichten idealerweise schon dem Implantat ent sprechende Formen besitzen, so daß im Druckbelastungs fall eine einfache Anmodellierung möglich ist.

Die Bildung eines Gasraumes kann auf verschiedene Wei se erfolgen. Hierzu kann z. B. ein druckfestes Gehäuse vorgesehen sein, das in vorteilhafter Weise gleichzei tig als Bioreaktor ausgebildet ist. In einem derarti gen Bioreaktor kann dann die Zellschicht in dem Zell kulturraum als selbständige Einheit behandelt werden. Hierzu kann die Einheit aus der mikroporösen Folie, dem Zellkulturraum und einer Schutzfolie gebildet sein, die auch die Trägerstruktur umgibt. In diesem Falle läßt sich dann die Einheit bei Bedarf aus dem Bioreaktor entnehmen - gegebenenfalls nach Entfernung von Anschlüssen für Sauerstoff und/oder Nährmedium - und z. B. einfrieren oder als Implantat transportieren.

Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausgestaltungen erge ben sich aus den nachfolgend anhand der Zeichnung prinzipmäßig beschriebenen Ausführungsbeispielen.

Es zeigt:

Fig. 1 eine Prinzipdarstellung einer ersten Ausfüh rungsform mit Gelenk-Knorpeln, die auf einer Trägerstrukturschicht, welches ein Kniegelenk darstellen soll, gezüchtet werden; und

Fig. 2 eine Prinzipdarstellung einer Vorrichtung, ähnlich der nach Fig. 1, mit einer Gegenstruk tur.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einer Vorrich tung zur Bildung von hyalinen Knorpeln als zu züchten den Zellen für eine Kniegelenk beschrieben. Selbstver ständlich ist diese Anwendungsart nur beispielsweise zu sehen. Im Rahmen der Erfindung sind noch zahlreiche andere Anwendungsfälle möglich.

Auf eine aus Trikalziumphosphat gebildete Trägerstruk tur 1 werden Knorpelzellen als Zellen 2 zur Bildung einer Zellschicht aufgelegt. Wie ersichtlich, ent spricht die Trägerstruktur 1 in ihrer Form einem Knie gelenk. Über die Zellen 2 wird eine mikroporöse Folie 3 gelegt, welche genügend elastisch sein muß, um das Zellwachstum nicht zu behindern. Als Material hierfür ist z. B. PTFE möglich. Die mikroporöse Folie 3 muß entweder die Trägerstruktur 1 dicht abschließen oder diese komplett umschließen. Bei der dargestellten Aus führungsform liegt sie seitlich an der Trägerstruktur 1 dicht an, während die Trägerstruktur 1 auf einer Platte 4 ruht. Die mikroporöse Folie 3 ist mit einem Zulaufanschluß 5 und einem Rücklaufanschluß 6 verse hen, über die Nährmedium im Durchlaufverfahren ein bringbar ist. Gleichzeitig kann hier auch Sauerstoff zugeführt werden, sofern Sauerstoff nicht aus der Um gebung der mikroporösen Folie 3 durch die Folie selbst eingebracht wird.

Wie ersichtlich, bildet die mikroporöse Folie 3 zusam men mit der Trägerstruktur 1 auf diese Weise einen Zellkulturraum 7 für die darin angeordneten Zellen 2.

Die mikroporöse Folie 3 und die Trägerstruktur 1 bil den - gegebenenfalls zusammen mit der Platte 4 - eine Einheit, welche in ein druckdichtes Gehäuse 8 einge setzt ist. Das druckdichte Gehäuse 8 bildet einen Bio reaktor. In das druckdichte Gehäuse 8 wird über einen Druckanschluß 9 eine Verbindung mit einem Druckmedium 10 geschaffen. In dem druckdichten Gehäuse 8 wird auf diese Weise ein Gasraum 11 geschaffen, der durch das Druckmedium 10 in gewünschter Weise unter wechselnde Druckbelastungen gesetzt wird. Diese wechselnden Druckbelastungen wirken sich über die mikroporöse Fo lie 3 auf die sich in dem Zellkulturraum 7 befindenden Zellen aus. Die mikroporöse Folie kann auch entfallen, so daß die Zellen direkt von der Schutzfolie ummodel liert werden. Wenn für eine separate Sauerstoff- oder Luftzufuhr für die Zellen 2 gesorgt wird, kann als Gasmedium auch jedes andere Gas verwendet werden.

Im Bedarfsfalle kann die aus der mikroporösen Folie 3 und der Trägerstruktur 1 gebildete Einheit auch noch von einer weiteren Schutzfolie 12 umgeben sein (siehe gestrichelte Darstellung). Die Schutzfolie 12 dient für einen Transport der Einheit aus dem Bioreaktor 8 und schließt die Einheit damit steril ab. Als Schutz folie 12 lassen sich verschieden Folien verwenden. Da durch, daß in dem Inneren des Gehäuses 8 ein Gasraum 11 gebildet wird, sollte die Schutzfolie 12 entspre chend modellierbar und gaspermeabel sein. Der Gasraum 11 kann dabei sowohl innerhalb der Schutzfolie 12 als auch außerhalb davon gebildet werden. Im letzten Falle ist deshalb in der Schutzfolie 12 ein Anschluß für ei ne Verbindung mit der Druckquelle 10 vorzusehen.

Anstelle von Trikalziumphosphat für die Trägerstruktur 1 können im Knochenersatzbereich auch Kollagene ver wendet werden, wobei z. B. auch ein Meniskus gezüchtet werden kann. Ebenso sind Bindegewebestrukturen, Poly mere, wie Polylaktide oder andere chemische Struktu ren, verwendbar.

Wesentlich ist, daß man Formen modellieren kann, die einem gewünschten Implantat entsprechen. Auf diese Weise kann man z. B. bei einem Defekt ein Implantat ei ner bestimmten Größe heraussuchen, wozu z. B. über com putertomographische Bilder eine entsprechende Analyse durchgeführt und dann in dem Bioreaktor 8 oder gegebe nenfalls vorher entsprechend eine gewünschte Trägerstruktur 1 geformt wird, auf der dann die dazugehöri gen Zellen gezüchtet werden.

Zusätzlich lassen sich im Bioreaktor 8 auch elektri sche Anschlüsse vorsehen, durch die man über entspre chende Verbindungsleitungen (nicht dargestellt) elek trische Impulse den Zellen 2 auflegen kann, womit noch bessere in-vivo-Simulationen erzielt werden können.

Die in der Fig. 2 dargestellte Ausführungsform ent spricht im wesentlichen der in der Fig. 1 besprochenen Form, weshalb für die gleichen Teile auch die gleichen Bezugszeichen beibehalten worden sind.

Unterschiedlich ist lediglich, daß über der mikroporö sen Folie 3 noch eine Meniskusstruktur 13 aufgebracht worden ist, über der wiederum eine Trägerstruktur 14 liegt. Auf diese Weise werden noch bessere in-vivo- Verhältnisse simuliert. Zur Bildung einer transporta blen Einheit kann das ganze dann ebenfalls von einer Schutzfolie 12 umgeben sein, durch welche Anschlüsse 5 und 6 zur Zu- und Abfuhr von Nährmedium und/oder Sau erstoff geführt sind. Der Gasraum 11 kann wiederum außerhalb der Schutzfolie 12 oder auch innerhalb über einen entsprechenden Druckanschluß gebildet werden.

Wie erwähnt, werden die Zellen zur Bildung einer Zell schicht in einem Zellkulturraum 7 zwischen zwei Folien oder zwischen einer Folie und der modellierbaren Trä gerstruktur 14 eingebracht. Ebenso kann die Träger struktur bilateral wie in einer Form mit zwei oder mehr Hälften angebracht sein. Die Form kann auch wäh rend dem Besiedlungsprozess ummodelliert, d. h. unter Annahme einer neuen Form angepasst werden.

Wesentlich ist, daß diese in sich mit Zellen/Matrix befüllbare Struktur in eine Kammer eingebracht werden kann, die mittels einer Gas- oder Flüssigkeitsphase einer Druckbelastung, die auch zyklischer Natur sein kann, ausgesetzt werden kann. Anstelle eines Gasmedi ums kann selbstverständlich auch ein flüssiges Medium verwendet werden.

Die Form der Folien ist reversiblen Druckbelastungs prozessen vollständig anpassungsfähig, da sie weitest gehend nicht einer eigenen Vorspannung unterliegt. Das heißt, wesentlich ist nicht die Elastizität der Foli en, sondern das positionskonforme Anliegen dieser Fo lien, welches durch eine sehr hohe Compliance oder Dehnbarkeit ermöglicht wird. Die Folien können somit anmodelliert werden bzw. werden durch Druckaufwendung maximal und homogen anmodelliert. Die Folien können auch profilierend verformt werden. Auch Innenprofilie rungen für den Zellkulturraum 7 sind möglich.

Diese Außenfolie 12 kann auf dem zu besiedelnden Trä gersubstrat 1 somit bereits initial, d. h. vor Beginn des Druckbelastungsprozesses, möglichst vollständig aufliegen, und kann damit die ansonsten durch eine re versible Druckbelastung ursächlich bedingten Ver schleißerscheinungen verhindern und direkt auch pro filgebend wirken. Diese Profilgebung kann auch noch dadurch unterstützt werden, indem der von außen appli zierte Druck über ein Druckprofil formend wirkt.

In den Behandlungsraum wird das zu besiedelnde Träger substrat 1, z. B. in einer in vivoartigen Form im Sinne eines Profils, Struktur auch als Hohlkörper (shell) eingebracht. Diese Strukturen können dann innerhalb und/oder außerhalb als auch transmural mit Substraten und Zellen besiedelt werden. Sie können auch mit Kul turmedium und Sauerstoff durchströmt werden.

Von Vorteil ist auch die Flexibilität der Vorrichtung und des Verfahrens, da die inneren Bioreaktorenbautei le entnehmbar sind und dadurch für Transport- und Kry prozesse zugänglich sind.

Claims

1. Vorrichtung Verfahren zum Züchten und/oder Behan deln von Zellen auf einer modellierbaren Träger struktur, wobei die Zellen zur Bildung einer Zell schicht in einen Zellkulturraum zwischen der Trä gerstruktur oder einer auf die Trägerstruktur auf gebrachten Folie und einer zweiten Folie, insbe sondere einer mikroporösen Folie eingebracht wer den, wobei Sauerstoff und/oder Nährmedium in den Zellkulturraum eingeleitet wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkulturraum (7) durch ein Gasmedium wech selnden Druckbelastungen ausgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß um den Zellkulturraum (7) und wenigstens teilweise um die Trägerstruktur (1) eine Schutzfolie (12) gelegt wird, wobei als Trägerstruktur (1) eine Form und Zusammensetzung verwendet wird, die einer in-vivo-Struktur weitgehend nachgebildet oder nachbildbar ist, und daß die beiden Folien (3, 12) mit der Trägerstruktur (1) als selbständige Ein heit in einen Bioreaktor eingebracht werden.

3. Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen auf einer Trägerstruktur, wobei die Zellen zur Bildung einer Zellschicht in einen Zellkultur raum zwischen der Trägerstruktur oder eines auf die Trägerstruktur aufgebrachten Folie und/oder einer mikroporösen Folie eingebracht sind, wobei Sauerstoff und/oder Nährmedium in den Zellkultur raum einleitbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkulturraum (7) in einem Gasraum (11) ange ordnet ist, der mit wenigstens einem Druckanschluß zur Verbindung mit einer Druckquelle (10) versehen ist oder der durch eine Druckquelle (10) unter wechselnden Druck setzbar ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Gasraum (11) durch ein den Zellkulturraum (7) und die Trägerstruktur (1) umgebendes druckdichtes Gehäuse (8) gebildet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das druckdichte Gehäuse (8) einen Bioreaktor bil det, in welchem der Zellkulturraum (7) vorzugswei se zwischen der mikroporösen Folie (3) und einer Schutzfolie (12), die auf und um die Trägerstruk tur (1) gelegt ist, gebildet ist, wobei die beiden Folien (3, 12) und die Trägerstruktur (1) als selb ständige Einheit in dem Bioreaktor angeordnet sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstruktur (1) in Form und Zusammensetzung wenigstens weitgehend einer in-vivo-Struktur nach gebildet ist oder modellierbar ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstruktur (1) aus Kalziummaterial, insbe sondere Kalziumphosphat, gebildet ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstruktur (1) aus Kollagen/extrazellu lärer Matrix gebildet ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstruktur (1) aus einem biodegradablen Polymer, wie z. B. Polylaktid, gebildet ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß über der mikroporösen Folie (3) oder der Träger struktur bzw. der ersten Außenfolie eine zweite Struktur (14) angeordnet ist, die in Form und gegebenenfalls in ihrer Zusammensetzung einer in vivo-Gegenstruktur zu der Trägerstruktur (1) nach gebildet ist.