DE102012100859B4

DE102012100859B4 - Verfahren zum Herstellen dreidimensionaler Strukturen und solche Strukturen

Info

Publication number: DE102012100859B4
Application number: DE102012100859.0A
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Jahnen-Dechent; Horst Fischer; Andreas Blaeser; Daniela Filipa Duarte Campos; Sabine NEUSS-STEIN; Michael Weber
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2015-12-17
Anticipated expiration: 2032-02-03
Also published as: DE102012100859A1; WO2013113883A1

Abstract

Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial mit den Schritten des Drucken oder Extrudieren des Strukturmaterials eingetaucht in eine Flüssigkeit, um eine dreidimensionale Struktur zu erhalten, wobei das Strukturmaterial ein Polymer ist, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte mit einer Dichte von mindestens 1,5 g/cm3 ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial umfassend den Schritt des Druckens oder Extrudierens des Strukturmaterials in einer Flüssigkeit zum Erhalt einer dreidimensionalen Struktur, wobei diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte gemäß Anspruch 1 ist. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung solche hergestellten dreidimensionalen Strukturen sowie entsprechende Druckeinrichtungen zum Ausbilden dieser dreidimensionalen Struktur, insbesondere zur erfindungsgemäßen Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Herstellung dreidimensionaler Strukturen, die zumindest teilweise lebende Zellen enthalten.
Stand der Technik
In den letzten Jahren hat die biotechnologische Herstellung von Biomaterialien zugenommen und insbesondere auf dem Gebiet des Tissue Engineerings wurden verschiedene Anwendungsbereiche diskutiert. Eines der Ziele des Tissue Engineering ist es, den Mangel an Spenderorganen durch die Implantation autologer Organe oder Gewebe zu beheben. Zur Generierung von entsprechenden Gewebesubstituten gibt es verschiedene Möglichkeiten. So werden in einem Ansatz dem Patienten Zellen entnommen und in vitro vermehrt. Nach Erhalt einer ausreichenden Zellzahl werden die Zellen dann mit Hilfe verschiedener Verfahren z. B. in einem Bioreaktor kultiviert. Je nach Anwendung werden die Zellen dort in oder auf ein formgebendes Stützgerüst, dem sogenannten Scaffold, verbracht. Dieses Gerüst oder Scaffold kann dabei biologischen Ursprungs oder synthetisch sein. Solche Scaffoldmaterialien können dabei sowohl degradierbare Materialien als auch Permanentmaterialien sein. In einigen Anwendungsbereichen sind biodegradierbare Materialien gewünscht, die im Laufe der Zeit durch die von den Zellen gebildete Struktur ersetzt oder remodelliert werden. Solche durch Tissue Engineering gewonnenen Gewebesubstitute schließen sowohl Haut als auch andere Weich- oder Hartgewebe ein. Diese beinhalten unter anderem Knochen- oder Knorpelgewebe aber auch verschiedene Formen von Gefäßen einschließlich Blutgefäßen aber auch Luftröhre oder Speiseröhre. Weitere durch Tissue Engineering gewonnene Strukturen beinhalten Herzklappen oder Venenklappen. Ziel des Tissue Engineerings ist die Bereitstellung von gesamten funktionsfähigen Geweben oder Organen. Das herzustellende Gewebesubstitut wird üblicherweise in Bioreaktoren bis zum Einsatz kultiviert. Je nach Anwendung kann das Gewebesubstitut mit entsprechend geeigneten Mitteln gelagert werden.
Wenn biodegradierbare Scaffolds eingesetzt werden, so werden hierzu bevorzugt biodegradierbare Strukturmaterialien genutzt, die als polymere Gele vorliegen, wie beispielsweise Kollagen-, Fibrin-, Alginat- oder Agarose-Gele. Bei Vermischung dieser polymeren Gele mit Zellen ist eine gleichmäßige Zellverteilung gewährleistet und die eingebrachten Zellen können sich entsprechend entwickeln und vermehren. Die Formgebung dieser dreidimensionalen Strukturen, den Scaffolds, die gegebenenfalls lebende Zellen enthalten, kann über verschiedene Verfahren erfolgen. Möglich sind hier Guss, Extrusion oder Drucken der dreidimensionalen Strukturen. Allerdings stellt die geringe Stabilität dieser Gele als Strukturmaterial Probleme bei der Herstellung entsprechender dreidimensionaler Strukturen dar. Bisherige Ergebnisse erlaubten allerdings lediglich die Herstellung von sehr kleinen dreidimensionalen Polymerkonstrukten.
Landers R. et al., Journal of Materials Science, 37, 15, 3107–3116 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Stützgerüsten durch rapid prototyping.
Es besteht daher ein Bedarf Verfahren bereitzustellen, die die Herstellung von Gewebesubstituten bereitzustellen, die die oben genannten Probleme insbesondere bzgl. der Dimension der dreidimensionalen Strukturen überwindet. Insbesondere bei Einbringen von lebenden Zellen in die dreidimensionale Struktur (Scaffold) muss dieses Verfahren gewährleisten, dass die Zellen sich anschließend in die gewünschten Gewebesubstitute entwickeln können.
Fluorkohlenwasserstoffe sind nicht-wässrige (hydrophobe), biokompatible, stark oxygenierte Fluide mit hoher Schwimmdichte. Bereits seit den 50er Jahren werden Fluorkohlenwasserstoffe in Experimenten mit Flüssigkeitsatmung untersucht. Es zeigte sich, dass Suspensionskulturen in Perfluorkohlenwasserstoffen sehr gut überleben können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein im Anspruch 1 definiertes Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial ggf. enthaltend lebende Zellen umfassend den Schritt des Druckens oder Extrudierens des Strukturmaterials ggf. in Mischung mit lebenden Zellen eingetaucht in eine Flüssigkeit, um eine dreidimensionale Struktur ggf. enthaltend lebende Zelle zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte ist, bereit.
Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer dreidimensionalen Struktur, die zumindest teilweise lebende Zellen enthält und als Gewebesubstitut geeignet ist, wobei die Herstellung durch Drucken oder Extrudieren der Struktur eingetaucht in eine Flüssigkeit erfolgt (submerged), wobei die Flüssigkeit ein Fluorkohlenwasserstoff, insbesondere ein Perfluorkohlenwasserstoff ist. Diese Flüssigkeit, insbesondere das erfindungsgemäß verwendbare Fluorkohlenwasserstoff, ist dabei eine Flüssigkeit hoher Dichte mit einer Dichte von mindestens 1,5 g/cm³.
Durch Verwendung der Flüssigkeit hoher Dichte ist ein ortsselektives Einbringen des Strukturmaterials durch Drucken oder Extrudieren möglich.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf dreidimensionale Strukturen, insbesondere solche, die lebende Zellen enthalten, erhältlich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese dreidimensionalen Strukturen sind insbesondere artifizielle Weich- oder Hartgewebe.
Ein weiterer Aspekt stellt eine Druckeinrichtung zur insbesondere ortsspezifischen Ausbildung dieser dreidimensionalen Strukturen dar. Diese Einrichtung kann mit Hilfe von strukturgeometrischen Daten zur dreidimensionalen Struktur ortsselektiv das Strukturmaterial Drucken oder Extrudieren. Schließlich richtet sich die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt auf die Verwendung dieser dreidimensionalen Strukturen ggf. enthaltend lebende Zellen als artifizielles Gewebe, insbesondere als Weichgewebe oder Hartgewebe. Letztlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Flüssigkeit hoher Dichte mit einer Dichte von mindestens 1,5 g/cm³, insbesondere von Fluorkohlenwasserstoffen, wie Perfluorkohlenwasserstoffen, als Medium zum Drucken oder Extrudieren einer dreidimensionalen Struktur, die lebende Zellen enthält, bereit.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial ggf. enthaltend lebende Zellen umfassend den Schritt des Druckens oder Extrudierens des Strukturmaterials ggf. in Mischung mit lebenden Zellen eingetaucht in eine Flüssigkeit, um eine dreidimensionale Struktur ggf. enthaltend lebende Zelle zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte ist, wie in Anspruch 1 definiert.
Vorliegend wurde festgestellt, dass diese Flüssigkeit hoher Dichte derart unterstützend auf das gedruckte oder extrudierte Strukturmaterial einwirkt, dass die dreidimensionalen Strukturen unter Erhalt dieser Struktur einfach durch Extrudieren und Drucken hergestellt werden können. Insbesondere erlaubt diese Flüssigkeit ein ortsselektives Aufbauen der Struktur.
Unter dem Ausdruck „Strukturmaterial” wird vorliegend ein druck- oder extrudierbares Material verstanden, das eine dreidimensionale Struktur ausbilden kann. Insbesondere ist dieses Strukturmaterial eines, das eine beständige dreidimensionale Struktur ausbildet, insbesondere kann diese beständige dreidimensionale Struktur erhalten werden durch Abkühlen des zum Extrudieren oder Drucken erwärmten Strukturmaterials oder anderweitiges Aushärten dieser Strukturmaterials, z. B. durch Vernetzen etc, wie durch Induktion der Aushärtung durch Energiezufuhr.
Als Strukturmaterialien in Form von Polymer können sowohl thermosensitive synthetische Polymere als auch Hydrogele verwendet werden. Insbesondere sind die Hydrogele solche aus einem Material ausgewählt aus Agarose, Kollagen, Fibrin, Alginat, Chitosan, Hyaluronan oder synthetischen Hydrogelen einschließlich Polyethylenglycol, Poly-(N-Isopropylacrylamid) und Kopolymere, Polylaktide, Polyurethane oder Polyvinylalkohole oder Mischungen von sowohl natürlichen als auch synthetischen Polymeren, insbesondere Hydrogele, die stark hydratisiert sind und somit insbesondere im Zusammenspiel mit lebenden Zellen geeignet sind.
Unter dem Ausdruck „Flüssigkeit hoher Dichte” wird vorliegend ein Fluid, insbesondere eine Flüssigkeit, verstanden, das in einer Ausführungsform im Vergleich zu der Dichte des Strukturmaterials, das in die Flüssigkeit hoher Dichte gedruckt oder extrudiert wird, zum Zeitpunkt des Druckens oder Extrudierens eine Dichte von größer als 0,2 g/cm³, bevorzugt von größer als 0,3 g/cm³ aufweist, wobei die Flüssigkeit hoher Dichte eine Dichte von mindestens 1,5 g/cm³ aufweist.
Der Ausdruck „umfassen” oder „umfassend” und die Ausdrücke „enthaltend” oder „enthalten”, wie sie vorliegend verwendet werden, beinhalten die Ausführungsform von „bestehen” oder „bestehend aus” soweit nicht explizit anders ausgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet dreidimensionale Strukturen herzustellen, wobei diese Strukturen zumindest teilweise lebende Zellen enthalten können. Diese lebenden Zellen können dann im Rahmen des Tissue Engineering (im Deutschen auch als Gewebekonstruktion bzw. Gewebezüchtung bezeichnet) eingesetzt werden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können dabei die Nachteile bekannter Verfahren überwunden werden, nämlich die Herstellung von dreidimensionalen Strukturen guter mechanischer Stabilität und in Dimensionen, die aufgrund der geringen Stabilität der Gele, wie Hydrogele, die im Tissue Engineering-Bereich eingesetzt werden, bisher nicht erzielt werden konnten.
Bei der Flüssigkeit hoher Dichte handelt es sich um eine Flüssigkeit mit einer Dichte von mindestens 1,5 g/cm³, insbesondere bevorzugt einer Flüssigkeit mit einer Dichte von mindestens 1,7 g/cm³. Diese Flüssigkeiten sind bevorzugt hydrophobe Flüssigkeiten.
Besonders geeignete Flüssigkeiten hoher Dichte sind erfindungsgemäß Fluorkohlenwasserstoffe, insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe. Die erfindungsgemäß verwendbaren Flüssigkeiten, in die eingetaucht die dreidimensionalen Strukturen insbesondere ortsselektiv extrudiert bzw. gedruckt werden, sind dabei solche, die bevorzugt nicht wässrig, biokompatibel sowie gut oxygenierbar sind.
Insbesondere die Perfluorkohlenwasserstoffe erlauben ein Herstellen dreidimensionaler Strukturen, die zumindest teilweise lebende Zellen enthalten können.
Kohlenwasserstoffe und insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe sind bekannt als Flüssigkeiten, in denen Zellen überleben können. Sie sind z. B. als Flüssigkeiten beschrieben, die die Fähigkeit aufzeigen Atemgase, wie Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid zu lösen.
Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei den Perfluorkohlenwasserstoffen als Flüssigkeit hoher Dichte um Perfluorkohlenwasserstoffe ausgewählt aus der Gruppe von Perfluortributylamin (C₁₂F₂₇N), Perfluordecalin (C₁₀F₁₈), Perfluorhexamethylprisman (C₁₂F₁₈).
Perfluorkohlenwasserstoffe, wie Perfluordecalin oder Perfluorhexamethylprisman sind chemisch inert, so dass eine Umsetzung mit dem Strukturmaterial oder mit Zellkomponenten nicht auftritt. Perfluorkohlenwasserstoffe oder Perfluorkohlenwasserstoffemulsionen, die vorliegend unter dem Ausdruck Perfluorkohlenwasserstoffe fallen, sind als Sauerstoffträger bekannt. Sie werden z. B. als Blutersatz ( EP 0307087 B1 ) oder im Rahmen der Flüssigbeatmung beschrieben. Durch Tan, Q., et al., Tissue Engineering Part A, 2009; 15(9): 2471–2480 ist die Verwendung von Perfluorkohlenwasserstoffemulsionen zur Sauerstoffversorgung kultivierter Zellen und Gewebe bekannt. Überraschend wurde nun gefunden, dass solche Flüssigkeiten hoher Dichte, wie Fluorkohlenwasserstoffe und insbesondere Perfluorkohlenwasserstoffe, ideale Flüssigkeiten zur Herstellung dreidimensionaler Strukturen, die zumindest teilweise lebende Zellen enthalten, darstellen. D. h., bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Einrichtungen zum Extrudieren oder Drucken in die Flüssigkeit hoher Dichte eingetaucht und dann das Strukturmaterial ggf. enthaltend lebende Zellen dreidimensional extrudiert bzw. schichtweise gedruckt. Entsprechende Verfahren des Extrudierens und Druckens von Strukturen sind allgemein bekannt. Z. B. können Verfahren eingesetzt werden, wie sie aus dem „Rapid-Prototyping” bekannt sind. Diese Verfahren können ortsselektiv das Strukturmaterial extrudieren oder drucken. Üblicherweise erfolgt dieses aufgrund bereitgestellter strukturgeometrischer Daten. Diese Daten geben die detaillierte Geometrie dieser herzustellenden Struktur, wie des Gewebes, wieder.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren eines zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen. Diese Struktur enthaltend lebende Zellen wird dann in weiteren Schritten mittels bekannter Zellkulturverfahren kultiviert, um schließlich artifizielle dreidimensionale Strukturen als Gewebesubstitut bereit zu stellen. Strukturmaterial, das erfindungsgemäß eingesetzt wird ist dabei zumindest teilweise eine Mischung aus dem Strukturmaterial und lebenden Zellen, um dreidimensionale Strukturen, die zumindest abschnittsweise lebende Zellen enthalten, herzustellen. Bevorzugt handelt es sich bei den lebenden Zellen um eukaryotische Zellen, insbesondere Zellen humanen Ursprungs. Es ist insbesondere bevorzugt, dass es sich bei den Zellen um Primärzellen handelt, z. B. Zellen xenogenen, allogenen oder autologen Ursprungs. Diese Zellen werden entsprechend als Isolate bereitgestellt.
Die Zellen können dabei je nach herzustellender Struktur, z. B. je nach herzustellendem Hart- oder Weichgewebe, entsprechend gewebespezifische Zellen sein. Vorzugsweise liegen mehrere Arten dieser gewebespezifischen Zellen vor. Unter gewebespezifischen Zellen oder organspezifischen Zellen werden zunächst alle Zellen verstanden, die sich in dem Organ oder dem Gewebe befinden (einschließlich nicht auf das spezielle Gewebe oder Organ beschränkte Zellen). Diese Zellen schließen verschiedene Typen von Zellen einschließlich Muskelzellen, Epithelzellen, Nervenzellen, Bindegewebszellen aber auch Stammzellen ein. So können Zellen vom Typ Muskelzellen glatte Muskelzellen, quergestreifte Muskelzellen oder Herzmuskelzellen sein, Epithelzellen schließen ein Darmepithelzellen, Hautepithelzellen, Endothelzellen, Pneumozyten, Nervenzellen schließen ein Neuronen einschließlich motorische und sensorische Neuronen sowie Interneuronen, Gliazellen usw.; sowie Bindegewebszellen mit Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Myofibroblasten, Perizyten.
Die oben genannte Aufzählung ist nur beispielhaft und nicht abschließend zu verstehen. Je nach Gewebe oder Organ können auch entsprechend gewebe- und organspezifische Zellen eingebracht werden.
Weiterhin kann das Strukturmaterial bzw. die Mischung mit den lebenden Zellen und ggf. weiteren Zusatzstoffen weiterhin Hilfsstoffe zur Unterstützung des Kultivierungsprozesses enthalten. Solche Hilfsstoffe sind insbesondere Zelladhäsionsmoleküle, Differenzierungsfaktoren, immunologisch aktive Zytokine/Chemokine und/oder Antibiotika. Diese können ggf. mit dem Strukturmaterial konjugiert vorliegen. Als weitere Zusatzstoffe sind Ionen, Nährstoffe einschließlich Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und anderen notwendigen Nährstoffen, die die Proliferation und Differenzierung der Zellen fördern, möglich.
Je nach Anwendung kann es sich bei dem Strukturmaterial um ein permanentes Material oder um ein biodegradierbares Material handeln. Im Bereich des Tissue Engineerings kann insbesondere ein biodegradierbares Material vorteilhaft sein. Dieses biodegradierbare Material übernimmt vorübergehend die Funktion der extrazellulären Matrix, die im weiteren Verlauf von den Zellen selbst sezerniert wird. Anwendungsbereiche sind hier insbesondere Gefäße usw.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Ausbildung von Gewebesubstituten, insbesondere von artifiziellen Weichgewebe oder Hartgewebe. Weichgewebe oder Hartgewebe schließen ein Knochengewebe oder Knorpelgewebe aber auch Gefäße, wie Blutgefäße oder Luftröhre, Speiseröhre aber auch Herzklappen oder andere Klappen, Gewebeconduits zum Harnblasenersatz, Ligamente und Sehnenersatz sowie Organe.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der dreidimensionalen Struktur kann weitere Schritte umfassen. So kann nach Drucken oder Extrudieren der dreidimensionalen Struktur in der Flüssigkeit hoher Dichte, die Flüssigkeit hoher Dichte entfernt werden, um die dreidimensionale Struktur ggf. enthaltend lebende Zellen weiter zu kultivieren. Eine Kultivierung kann gemäß üblicher Verfahren, wie sie aus der Gewebezüchtung bekannt sind, erfolgen, um das Zielgewebe zu erhalten.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Druckverfahren. Dabei wird das Strukturmaterial ggf. enthaltend lebenden Zellen sequenziell ortsselektiv gedruckt. Das Drucken erfolgt in mehreren Schichten übereinander, um durch dieses mehrfache Drucken die Ausbildung der dreidimensionalen Struktur ggf. mit lebenden Zellen zu erlauben.
Durch dieses Drucken sind insbesondere komplexe dreidimensionale Strukturen herstellbar. Solche dreidimensionalen Strukturen umfassen Herzklappen aber auch andere Arten von Hart- und Weichgewebe sowie von Gefäßen, z. B. Gefäße mit abgehenden Gefäßteilen (Gefäßäste) usw. Gerade in komplexen dreidimensionalen Strukturen liegen Freiräume, wie Lumina und Kavitäten vor, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden können. Durch das ortsselektive Extrudieren oder Drucken des Strukturmaterials in der Flüssigkeit hoher Dichte lassen sich einfach entsprechende Lumina und Kavitäten ausbilden, so dass eine Schaffung komplexer dreidimensionaler Strukturen einfach möglich ist, ohne dass diese Strukturen aufgrund geringer Stabilität des Strukturmaterials sich während der Herstellung oder der späteren Kultivierung verformen.
Ein bekanntes Verfahren umfasst ein tintenstrahlbasiertes System, wie es in der Literatur beschrieben ist. Andere Verfahren sind solche auf pneumatischer Basis oder auf Extruder-Basis.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf dreidimensionale Strukturen enthaltend ggf. lebende Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Bei diesen dreidimensionalen Strukturen handelt es sich insbesondere um Gewebesubstitute, wie artifizielles Weichgewebe oder Hartgewebe, einschließlich Knochengewebe, Knorpelgewebe, Blutgefäße, Luftröhre, Speiseröhre, Herzklappe oder Organe. Diese so erhaltenen dreidimensionalen Strukturen ggf. enthaltend lebende Zellen können als artifizielles Gewebe eingesetzt und Patienten implantiert werden. Sie können als transientes oder permanentes Gewebe implantiert werden.
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbaren dreidimensionalen Strukturen können insbesondere komplexe Strukturen darstellen, die mit den bisher bekannten Verfahren aufgrund der Instabilität der hergestellten Strukturen nicht erreichbar waren oder nur durch Einsatz zusätzlicher Hilfsstrukturen.
Die strukturgeometrischen Daten, also die detaillierte Geometrie der nachzubildenden dreidimensionalen Struktur, insbesondere des Gewebes oder des Organs, erlauben die Steuerung der Extrudier- oder Druckeinrichtung, insbesondere des Druckkopfes oder der Extrudierdüse, um die Raumform der gewünschten dreidimensionalen Struktur ortsselektiv zu drucken. Diese strukturgeometrischen Daten werden mit Hilfe bekannter Verfahren auf Basis von Originalstrukturen, z. B. Gefäßen, Organen etc. generiert und dann entsprechend mit Hilfe der erfindungsgemäßen Einrichtung umgesetzt.
Es ist erfindungsgemäß möglich, bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren die dreidimensionalen Strukturen ohne Einsatz von Hilfsstrukturen herzustellen. D. h., es müssen keinerlei Stütz- oder Hilfsstrukturen genutzt werden, um insbesondere Strukturmaterialien, wie Hydrogele zu stützen. Diese Stützung erfolgt durch die Flüssigkeit hoher Dichte, in die das Stützmaterial extrudiert bzw. gedruckt wird. Überraschenderweise zeigte es sich, dass auch aufgrund der vorhandenen Dichteunterschiede das Stützmaterial bzw. die dreidimensionale Struktur nicht in ungewollter Art und Weise verformt wird.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf eine Einrichtung, wie eine Druckeinrichtung oder Extrusionseinrichtung, zum Ausbilden einer dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen. Diese Einrichtung umfasst Mittel zum Drucken oder Extrudieren, wobei diese Mittel derart ausgebildet sind, dass sie ein Drucken oder Extrudieren des Strukturmaterials enthaltend lebende Zellen ortsselektiv ermöglicht und ein Drucken oder Extrudieren in einer Flüssigkeit hoher Dichte erlaubt. Weiterhin weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte auf. Die Einrichtung zum Drucken oder Extrudieren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Extrudieren oder Drucken derart ausgebildet sind, dass sie ein in eine Flüssigkeit eingetauchtes Extrudieren oder Drucken ermöglichen. Die Einrichtung zum Drucken oder Extrudieren ist dabei derart ausgebildet, dass sie mit Hilfe von einer ggf. motorisierten X-, Y-, Z-Steuerung eine Positionierung dieser Mittel zum Drucken oder Extrudieren in eine in allen drei Dimensionen vorbestimmte Position erlaubt. Weiterhin ist dieses Mittel zum Drucken oder Extrudieren bevorzugt mit einer Einheit ausgestattet, die ein Erwärmen des zu druckenden oder extrudierenden Strukturmaterials ermöglicht. Entsprechende Steuerungselemente einschließlich Ventile erlauben eine präzise Mengenabgabe des zu extrudierenden oder druckenden Strukturmaterials.
Alternativ oder ergänzend kann die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte ebenfalls beweglich ausgebildet sein, d. h. ebenfalls in X-, Y- und Z-Richtung bewegbar ausgebildet sein. Sollte die Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme der Einrichtung für die Flüssigkeit hoher Dichte bewegbar ausgebildet sein, kann das Mittel zum Drucken und Extrudieren auch stationär ausgebildet sein.
Die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte ist geeignet zur Inkubation der dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen bei Temperaturen von mindestens 30°C. Insbesondere handelt es sich bei dieser Einrichtung um eine, die einen Bioreaktor selbst darstellt oder in einen Bioreaktor überführt werden kann oder, dass die in der Einrichtung gedruckte oder extrudierte Struktur in ein Nährmedium überführt werden kann. Hierdurch ist es einfach möglich, die durch Extrusion oder Druck hergestellte dreidimensionale Struktur mit enthaltenen lebenden Zellen zu kultivieren, um eine entsprechende dreidimensionale Struktur, die als Gewebesubstitut geeignet ist, bereitzustellen.
In einer Ausführungsform kann die Druckeinrichtung unter entsprechenden Kulturbedingungen gehalten werden.
Unter Bezugnahme auf die beigefügte 1 werden eine erfindungsgemäße Druckeinrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.
Die 1 stellt das Druckverfahren als ersten Schritt, die Inkubation bei 37°C, d. h. die Kultivierung der gedruckten dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen als zweiten Schritt sowie die erhaltene dreidimensionale Struktur im dritten Schritt dar.
Dargestellt ist eine übliche Zellkulturplatte als Beispiel einer Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte 1 enthaltend die Flüssigkeit hoher Dichte 2, z. B. einen Fluorkohlenstoff. Dabei kann die Platte in einer Aufnahmevorrichtung vorliegen, die eine Bewegung in die X-, Y- und Z-Richtung erlaubt (nicht dargestellt). Weiterhin dargestellt ist das Mittel zum Drucken oder Extrudieren des Strukturmaterials 3. Dieses Mittel ist ebenfalls in X-, Y- und Z-Richtung bewegbar. Der Extrusionskopf oder Druckkopf ist dabei so ausgebildet, dass kleinste Mengen an Strukturmaterial gedruckt bzw. extrudiert werden können. Dadurch können eine Vielzahl von Schichten übereinander gedruckt bzw. extrudiert werden. Wie dargestellt, ist das Mittel zum Drucken oder Extrudieren beheizbar 4, um das Strukturmaterial zu erwärmen und so in einem entsprechenden flüssigen Zustand zum Drucken bzw. Extrudieren zu halten. Nicht dargestellt sind die Steuereinrichtungen zum Steuern des Mittels zum Drucken oder Extrudieren bzw. zum Bewegen der Aufnahmeeinrichtung für die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte.
Mit Hilfe des Mittels zum Drucken bzw. Extrudieren wird schichtweise ortsselektiv gemäß den strukturgeometrischen Daten die dreidimensionale Struktur 5 extrudiert bzw. gedruckt. Ggf. können auch mehrere Extrusions- oder Druckmittel, d. h. mehrere -Köpfe oder -Düsen, verwendet werden, um z. B. Bereiche mit oder ohne Zellen zu drucken bzw. extrudieren oder um verschiedene Mischungen von Strukturmaterial und Zellen zu drucken bzw. extrudieren.
Über die entsprechende Steuerung des Mittels zum Drucken bzw. über die Steuerung der Positionierung und der Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte ist es möglich, die dreidimensionale Struktur zu drucken bzw. zu extrudieren. Das Drucken bzw. Extrudieren des jeweiligen fließbaren Strukturmaterials findet derart statt, dass der Druckkopf bzw. die Extrusionsdüse in die Flüssigkeit hoher Dichte eingetaucht ist und eine vorbestimmte Menge des Strukturmaterials an der vorgegebenen Position gedruckt bzw. extrudiert wird.
Mit dem Drucken in der Flüssigkeit, im Englischen auch als „submerged printing” oder „submerged extrusion” bezeichnet, ist es möglich dreidimensionale Strukturen einer gewünschten Größe bereitzustellen. Insbesondere ist es möglich, diese Strukturen derart bereitzustellen, dass keine Verformung der dreidimensionalen Struktur während des Druckens oder Extrudierens oder der späteren Kultivierung stattfindet. Dadurch ist die Größe der hergestellten dreidimensionalen Struktur nicht mehr derart begrenzt, wie es im Stand der Technik gegeben ist. Des Weiteren sind auch komplexe Strukturen möglich, die Kavitäten und Lumina einschließen oder komplexe Strukturen, wie Gefäßäste usw.
Nach dem Drucken bzw. Extrudieren wird die Aufnahmeeinrichtung mit der Flüssigkeit hoher Dichte und der hergestellten dreidimensionalen Struktur aus der Druckeinrichtung herausgenommen und in eine Einrichtung zum Kultivieren platziert. Vorher wird zumindest teilweise die Flüssigkeit hoher Dichte entfernt und durch entsprechendes Kulturmedium 6 ersetzt.
Die dreidimensionale Struktur wird dann gemäß bekannter Verfahren kultiviert, um z. B. ein Gewebesubstitut 7, wie artifizielles Weichgewebe oder artifizielles Hartgewebe bereitzustellen.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens war es möglich, Körperstrukturen mit eingelagerten Zellen herzustellen, die anschließend kultiviert wurden. Eine Untersuchung dieser kultivierten Strukturen über einen Zeitraum von mindestens 24 Stunden zeigte, dass die Zellen überleben und sich auch in der Struktur entsprechend entwickelten und proliferierten. Hierzu wurde ein Agarose-Gel nach Autoklavieren auf ca. 37°C gebracht und mit Zellen einer Zelllinie, vorliegend MG-63 humane Osteosarkomzelllinie vermischt, um eine Konzentration von 200.000 Zellen/ml zu erhalten. Die verwendete Agarose-Hydrogel-Suspension hatte eine Endkonzentration von 3%. Mit Hilfe einer rechnergesteuerten Druckeinrichtung wurde das Zellen enthaltende Agarose-Hydrogel gedruckt. Dazu wurde der Druckkopf in Perfluortributylamin (C₁₂F₂₇N) getaucht und der Hohlkörper sequenziell Schicht für Schicht gedruckt, um einen über 3 cm langen Hohlkörper zu drucken. Nach Herstellung dieses über 3 cm langen Hohlkörpers wurde der Perfluorkohlenwasserstoff entfernt und durch Zellmedium (37°C) ersetzt. Nach 24stündiger Kultivierung konnte mittels Lebend-/Tot-Färbung der Zellen nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der gedruckten Zellen in der dreidimensionalen Struktur lebend waren und entsprechend verteilt in dem Hohlkörper vorlagen. Bei Überprüfung der dreidimensionalen Strukturen nach 2 oder 3 Wochen, konnten die guten Ergebnisse bestätigt werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen Struktur aus einem Strukturmaterial mit den Schritten des Drucken oder Extrudieren des Strukturmaterials eingetaucht in eine Flüssigkeit, um eine dreidimensionale Struktur zu erhalten, wobei das Strukturmaterial ein Polymer ist, dadurch gekennzeichnet, dass diese Flüssigkeit eine Flüssigkeit hoher Dichte mit einer Dichte von mindestens 1,5 g/cm³ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Strukturmaterial lebende Zellen enthält, zur Herstellung einer dreidimensionalen Struktur zumindest abschnittsweise enthaltend lebende Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Flüssigkeit hoher Dichte ein Fluorkohlenwasserstoffist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit hoher Dichte ein Perfluorkohlenwasserstoff ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit ein ausgewählt aus der Gruppe von Perfluorotributylamin (C₁₂F₂₇N), Perfluorodecalin (C₁₀F₁₈), oder ein Perfluorohexamethylprisman (C₁₂F₁₈) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Hydrogel ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Strukturmaterial weiterhin Zelladhäsionsmoleküle, Differenzierungsfaktoren, immunologisch aktive Zytokine/Chemokine und/oder Antibiotika, enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin den Schritt des Kultivierens der hergestellten dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen bei einer Temperatur von über 30°C aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ein sequenzielles Drucken von mehreren Schichten übereinander aufweist zum Ausbilden der dreidimensionalen Struktur.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturmaterial ein biodegradierbares Material ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin den Schritt das Entfernen der Flüssigkeit hoher Dichte weist zum Erhalt einer dreidimensionalen Struktur Knochengewebe, Knorpelgewebe, Blutgefäß, Luftröhre, Speiseröhre, Herzklappe oder Organ.
Verfahren nach Anspruch 11 zum Erhalt von Knochengewebe, Knorpelgewebe, Blutgefäß, Luftröhre, Speiseröhre, Herzklappe oder Organ.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen eukaryotische Zellen sind.
Dreidimensionale Struktur erhältlich mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Dreidimensionale Struktur gemäß Anspruch 14 in Form eines Gewebesubstituts, wie Knochengewebe, Knorpelgewebe, Blutgefäß, Luftröhre, Speiseröhre, Herzklappe oder Organ ist.
Verwendung einer Flüssigkeit hoher Dichte als Medium zum Drucken oder Extrudieren einer dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen, wobei diese Flüssigkeit hoher Dichte eine Dichte von mindestens 1,5 g/cm³ aufweist.
Druckeinrichtung zum Ausbilden einer dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen mit Mitteln zum Drucken oder Extrudieren gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei diese Mittel derart ausgebildet sind, dass diese ein Extrudieren oder Drucken des Strukturmaterials ggf. enthaltend Zellen ermöglicht, eine Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit hoher Dichte, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Extrudieren oder Drucken derart ausgebildet sind, dass sie ein in eine Flüssigkeit eingetauchtes Extrudieren oder Drucken ermöglichen, wobei die Einrichtung zur Aufnahme der Flüssigkeit geeignet ist zur Inkubation der dreidimensionalen Struktur enthaltend lebende Zellen bei Temperaturen von mindestens 30°C.
Verwendung einer dreidimensionalen Struktur ggf. enthaltend lebende Zellen nach einem der Ansprüche 14 oder 15 als artifizielles Gewebe, wie Knochengewebe, Knorpelgewebe, Blutgefäß, Luftröhre, Speiseröhre, Herzklappe oder Organ.