WO2019048524A1 - Verfahren zum herstellen einer dreidimensionalen biologischen struktur und diese struktur so erhaltend - Google Patents

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    • C12N2533/76—Agarose, agar-agar

Definitions

  • the present application relates to a method for the biodetermination of a three-dimensional biological structure containing living cells with at least two different materials for biodegradation.
  • This method is characterized in that one of the materials for printing by drop-on-demand is applied or introduced in at least one step.
  • this method is suitable for printing tissue structures, including those having utility structures.
  • Such structures are in particular cardiostructures, liver structures, kidney structures, alveolar structures, skin structures or neuronal structures.
  • a so-called biological three-dimensional structure is described.
  • the present application relates to the use of a three-dimensional structure according to the invention as a tissue model, in particular as a model for tissue genesis, for example suitable for testing therapy forms or for stratifying a therapy or for testing or identifying drug candidates.
  • tissues found in the human body are composed of a variety of cell types surrounded by matrices of different physical and chemical composition.
  • the liver, kidney or myocardium may be mentioned here.
  • matrices and cell types are not uniformly distributed, but exhibit a high degree of microstructural organization, that is, a highly organized microstructure.
  • the presence of a capillary network plays an essential role, this leads to the appropriate nutrients and the respiratory gases, or corresponding metabolic degradation products.
  • Bioprinting is a special tissue engineering process that uses the principle of generative manufacturing techniques - also known as rapid prototyping - to generate three-dimensional living tissue.
  • generative manufacturing techniques such as stereolithography, selective laser melting or fused-deposition modeling
  • cell-loaded printable materials for example hydrogels
  • this material is applied layer by layer according to a 3D model, whereby the hydrogels mimic the extracellular matrix of the natural tissue and thereby form a corresponding cell-friendly environment for 3D tissue engineering.
  • Droplet-based biodeduction can be performed using a variety of techniques, including laser-based, inkjet, and microvalve.
  • the methods differ in resolution or droplet size, the achievable cell viability and the suitability for the printing of planar microstructures as well as of freestanding 3D engravings.
  • drop pressure is one of these methods with the three basically mentioned techniques of laser-based printing, ink-jet printing or micro-valve printing.
  • Advantages of these printing techniques are the formation of individual drops, which may optionally have living cells, the size thereof may be up to 0.01 nl in volume, the current resolution is up to 45 ⁇ .
  • the individual drops can be applied simply and very precisely to predetermined positions. This makes it possible to apply very precise structures. This is especially true when using multiple print heads, which can be used with different print materials.
  • the present application relates to a method for biodegrading a three-dimensional biological structure containing living cells with at least two different materials for biodegradation, which according to their material properties at least two different subregions wherein at least a portion of said three-dimensional structure contains living cells, and wherein at least one of said materials for bioburden contains living cells, wherein in a first step, one of said materials is applied to a substrate; this material is optionally subjected to a first treatment, in particular a washing, and in a subsequent step a different material than used, applied or introduced in the first step, characterized in that at least one of the materials is applied or introduced by dropping pressure.
  • This process according to the invention can be carried out, for example, as an infiltration method or as a penetration method.
  • the present invention relates to biological three-dimensional structures obtainable by this process, which are in particular tissue structures and tissue models.
  • tissue models are suitable for use, for example, in tissue genesis or as an in vitro model for testing therapies or stratifying therapy, or testing or identifying drug candidates.
  • FIG. 1 schematically shows the infiltration methods and the penetration methods described herein.
  • FIG. 1a shows the infiltration process. Drops of a first printing material (Bionink A) are printed on a substrate. Subsequently, washing / rinsing takes place, for example, with PBS of the dropped material to then apply the second printing material (Bioink B) so as to fill up the interstices of the Bioink A.
  • a first printing material Bionink A
  • PBS PBS of the dropped material
  • the steps of dropping the Bioink A, washing and applying the Bioink B may optionally be repeated several times to obtain a multicellular tissue model.
  • FIG. 1b shows the penetration method.
  • the printing material Bioink B is applied to a substrate that has been washed with PBS, for example by spraying, drops, etc. Subsequently, the printing material is biodegraded. Ink A is printed as a drop, these drops penetrate into the film formed by the Bioink B. These steps can also be repeated several times to obtain multicellular tissue models.
  • FIG. 1 c shows the various multicellular tissue models.
  • a composite structure with Bioink A and surrounded Bioink B is shown.
  • a porous net from the Bionk B is shown.
  • the formerly existing Bioink A was dissolved out, for example by dissolving the corresponding printing material, for example by water, heating etc. and thus liquefaction.
  • a porous composite structure is shown on the right side.
  • the Bioink A was taken out to obtain a cavity.
  • the remaining cells can accordingly be present on the wall in this cavity.
  • vascular structures can be created.
  • the Bioink A is present in the remaining areas with encapsulated cells.
  • multicellular spheroids (MCS) can also be introduced into the cavities.
  • FIG. 2 a shows the results of the infiltration technique (left) and penetration technique (right).
  • 2a shows a capillary-like network represented by infiltration in FIG. 2a.
  • transmitted light images (BF") of microscopic scans of the control (cells in unstructured fibrin) and of a printed sample are shown shows the proportion of live ("live”, original green) and dead cells ("dead", original red)
  • a negative control is shown, in which a control sample is treated with ethanol
  • FIG. 3 shows an application according to the invention for generating three different tissue structures.
  • FIG. 3 a shows, by way of example, the generation of a cardiac muscle precursor structure. Cardiomyocytes were embedded in fibrin.
  • FIG. 3b shows the application of the described technique for the generation of kidney tissue, in particular the tubulointerstitium of the kidney. Tubular epithelial cells were embedded in drops of a leachable porogen (agarose-gelatin mixture).
  • the interstices of the printed drops were infiltrated with fibrin containing human mesenchymal stem cells (hMSCs) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). After dissolving out the porogen adhered epithelial cells at the edge of the resulting pores and formed there a homogeneous cell layer. After seven days of culture, the hMSCs and HUVECs in the surrounding fibrin formed their first capillary-like structures. The printed structures were stained and examined by fluorescence microscopy and two-photon microscopy. All cells were labeled with DAPI, the endothelial cells additionally with CD31, and the epithelial cells with LTL antibody stains.
  • FIG. 3c shows the application of the technique according to the invention for the generation of a liver tissue, in particular a liver flap tissue.
  • Hepatocytes were embedded in agarose droplets that were printed by the penetration method into a fibrin layer loaded with hMSCs and HUVECs, which build up a capillary-like network during their culture. Repeating several times, a six-layer structure was prepared. In the micrograph, the hepatocytes can be differentiated from the other cells due to their morphology. For better representation, they were colored virtually using an algorithm.
  • the amount of synthesized urea was on the hepatic lobe tissues thus prepared measured over 12 days (HEP +) and compared to another sample in which the hepatocytes were printed without a supporting capillary network (HEP). Patellates with a surrounding capillary network had a significantly higher urea synthesis than the control group and control (excluding cell culture medium).
  • FIG. 4 shows that the structures obtained from the printing technique can also be combined with multi-cellular spheroids (MCS) shown in FIG. 4a. These MCS can either be printed directly into the droplets, as shown in FIG. 4b, or they can be embedded in the resulting pores after the droplets have been dissolved out, see FIG. 4c.
  • MCS multi-cellular spheroids
  • Suitable spheroids may consist of stem cells, adult cells, primary cells, knock-out cells, wild-type cells, degenerate cells or tumor cells or combinations of such cells.
  • the inventors have succeeded in providing a method which, based on general method steps, permits the generation of different three-dimensional biological structures, in particular tissue structures which have an irregular structure, in particular have no uniformly distributed structures, but areas with supply structures and other specific areas.
  • the method of the invention is a platform method by which a variety of tissue analogs can be generated by printing corresponding irregular structures in their preform. It is possible to build the structural hierarchy of multiple tissue types using this drop-on-demand (DOD) based bioprinting method.
  • the inventive method differs from the prior art in that on the one hand the described method for forming the tissue model is not described above and secondly, the inventive method uses the basic principles of structural similarities, which generally show in different tissue structures.
  • the method according to the invention allows tissue anatomy to be represented in a more abstract form and generated by cultivation.
  • the individual tissue structure can be modeled.
  • the printing method is essentially the same for a wide variety of fabric structures, only the corresponding printing materials are different, that is, they have different cell types and / or MCS and optionally have different matrix materials.
  • the method according to the invention thus makes it possible to produce different tissue models in a simple and reproducible manner.
  • the process has a high degree of flexibility and represents a process which can be implemented industrially and can meet the requirements for admissibility for the medical sector.
  • a drop-based printing method in particular a drop-on-demand (DOD) bioprinting
  • DOD drop-on-demand
  • At least one first material also referred to as “one material” is used to form a first subregion and at least one second material, also referred to as “other material”, to form a second subregion of this three-dimensional structure.
  • One of these materials has living cells so that living cells are present in at least one of these subregions.
  • cell or “cells” includes also
  • MCS Multicellular Spheroids
  • MCS may consist of or include: stem cells, adult cells, primary cells, knock-out cells, wild-type cells, degenerate cells or tumor cells, or combinations thereof.
  • a material is applied to a substrate in a first step. This is followed by the application of another or other material. This application can be done in various ways. Preferred embodiments are shown in the figures.
  • the one material in the first step, is printed as a droplet on a substrate, these droplets having predetermined positions to each other and then, optionally after a washing step, an at least second material is applied or introduced, the by the Drops of the first material formed interstices fills.
  • This method also described as infiltration method or infiltration method, involves printing one or more layers of single drops of the first material on the substrate. These drops, which form corresponding regions, are thereby preferably formed in predetermined regions. Usually, these drops or the structures formed by these drops are spaced apart, so that corresponding gaps are formed. Possibly. the printed materials are cured, z. As by gelation or polymerization, so that the cells present if necessary remain alive.
  • the first material the one material
  • rinsing or washing with a rinsing liquid is carried out if necessary.
  • the second material the other material
  • this can also be done by printing, but alternatively, pipetting, spraying or other application techniques can be used.
  • This second material is infiltrated into the intermediate spaces and forms there at least a second portion.
  • This second material may also have cells and usually has a different material than the first printed material.
  • the three steps of drip printing, washing and infiltration can be repeated as often as desired to produce multi-layered constructs.
  • a rinsing washing
  • the gaps between the first material can be filled particularly well due to the capillary forces.
  • suitable cell types eg endothelial cells and mesenchymal stem cells
  • This method of forming this structure may be followed by a further step, namely a step in which the first material is dissolved out of the formed three-dimensional structure. That is, in the case of a living cell hydrogel, for example, this hydrogel can be re-liquefied by appropriate heating and thus removed from this structure. It was found that the removal of this printing material, the cells possibly present in it adhere to the edges of the other part. With the aid of this method, it is particularly well possible, for example, to form further supply structures (for example vascular structures) which run orthogonally to the printed structure. By removing the material cavities can be created, on the inside of the outer boundary of these cells are reflected.
  • vascular structures for example vascular structures
  • This method is particularly suitable for the formation of vascular structures and epithelialized canals (eg tubules) in which cells forming vascular structures are introduced with the first material, such as endothelial cells, epithelial cells, mesenchymal stem cells, fibroblasts and / or smooth muscle cells including combinations thereof.
  • the first material such as endothelial cells, epithelial cells, mesenchymal stem cells, fibroblasts and / or smooth muscle cells including combinations thereof.
  • the penetration method the procedure is in principle reversed. That is, on a substrate which may have previously been treated with a rinsing solution, a material is applied. This application may be by printing, pipetting, spraying or other application techniques. This material can also have cells. This can then be followed, if necessary, a hardening of this material to then print by drip printing the other material as a single drop on this film of material.
  • the drop of the printing material can penetrate the surface of the formed film z. B. in the way that the drops are embedded in the layer formed by the material.
  • the drop so immersed in the other material and displaces this, it finds a penetration of the film with the Drop instead.
  • the drops are printed at the drop pressure in a predetermined pattern.
  • the application of the drops can be carried out layer by layer to form three-dimensional structures of the subregions.
  • These substructures are correspondingly embedded and are particularly suitable for ensuring supply structures or microstructures for supplying or removing nutrients, necessary metabolites including fluid, etc.
  • the method according to the invention it is accordingly possible to form microstructures and microorganizations of the tissues. Due to the general applicability, the method according to the invention permits the formation of a wide variety of tissue structures which differ after the use of the living cells, the printed material in which they are located and the manner of introduction, for example by means of the infiltration method or the penetration method.
  • the printing material is a gelatin-based material, in particular a gelatin agarose mix, polyethylene glycol (PEG) or a PEG derivative, or a poloxamer such as Pluronic, which material may comprise living cells and / or wherein this material is liquefiable and removable at a later date leaving the cells.
  • a gelatin-based material in particular a gelatin agarose mix, polyethylene glycol (PEG) or a PEG derivative, or a poloxamer such as Pluronic, which material may comprise living cells and / or wherein this material is liquefiable and removable at a later date leaving the cells.
  • the material that is applied by droplet pressure a stable or re-releasable hydrogel.
  • a stable hydrogel of this printing material include agarose, alginate, and other polysaccharides, as well as mixtures of these materials with protein-based gels (eg, collagen, fibrinogen, etc.), redissolving materials include, for example, gelatin or Pluronic Block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide.
  • Microgels, intramolecular Crosslinked macromolecules can also be used as re-dissolvable materials.
  • this printing material contains cells which then adhere to the edge of the cavities when they are dissolved out in order to form desired structures there, for example vascular structures or epithelialized tubules or other microstructures of the desired tissue.
  • detachable drops can form corresponding pores or cavities, so that then forms a corresponding structure, for example in the form of a network or the like, from the at least one other material with a defined pore size and spacing.
  • Corresponding pores may be used to allow the transport of nutrients or other fluids. In particular, the transport of these cells to inside or on the second material. Exemplary embodiments of such structures are described in the example.
  • the second or other material is preferably a hydrogel, in particular one based on fibrinogen or collagen, which may optionally have cells. After application either by generally known application methods, in particular by printing, this material forms fibrin structures and / or collagen structures which are particularly suitable for forming three-dimensional tissue structures, which can also be used, for example, in the implant area.
  • Suitable biocompatible materials are known in the art and are commercially available.
  • the printing materials furthermore include chemical, biological or physical crosslinkers, also called crosslinkers, which allow a corresponding hardening of the material and optionally diffuse into the other material in order to initiate the gelation thereof.
  • Suitable materials are, for example, thrombin, calcium chloride, glutaraldehyde, genipin or transglutaminase.
  • suitable materials contained in the printing materials may be chemical or biological or physical polymerization initiators or catalysts which optionally diffuse into the other material and cause it to gel or solidify.
  • Suitable polymerization initiators or catalysts are known to those skilled in the art, such as photoinitiators, photocatalysts, acids or alkalis for adjusting the pH required for gelation, etc.
  • the method is one for forming a three-dimensional biological structure, wherein said three-dimensional biological structure is a cardiostructure, a liver structure, a kidney structure, an alveolar structure, a skin structure, a cartilage structure, a bone structure optionally with bone marrow, a neuronal structure, or mixtures thereof is designed similarly.
  • said three-dimensional biological structure is a cardiostructure, a liver structure, a kidney structure, an alveolar structure, a skin structure, a cartilage structure, a bone structure optionally with bone marrow, a neuronal structure, or mixtures thereof is designed similarly.
  • These structures are particularly useful as tissue substitutes or as tissue analogs in clinical research.
  • these corresponding structures are also suitable as implants as substitutes for damaged tissue.
  • Other applications in the tissue are in particular bone including bone marrow and cartilage structures.
  • corresponding skin analogs can be displayed with formed epidermis, dermis and subcutis.
  • the multicellular spheroids can either be printed directly into the drops or embedded in the resulting pores after the drops have been dissolved out. This makes it possible to provide the constructs, namely tissue analogs and tissue substitutes, which have a capillary network and simulate complex structures.
  • the structure is a pancreatic analog or
  • MCS multi-cells
  • ⁇ -cells ⁇ -cells
  • ⁇ -cells ⁇ -cells
  • PP-cells ⁇ -cells
  • MCS with whole islets of Langerhans or parts thereof.
  • the method according to the invention is one in which, after application of the at least one further material, cultivation of this structure takes place in a suitable incubator.
  • the three-dimensional biological structure is an organ.
  • Organs include, a liver, a kidney, skin.
  • the living cells in the material are in particular those which are or comprise vascularizing cells, such as endothelial cells, epithelial cells, Schwann cells, nerve cells, mesenchymal stem cells, fibroblasts and / or smooth muscle cells.
  • vascularizing cells such as endothelial cells, epithelial cells, Schwann cells, nerve cells, mesenchymal stem cells, fibroblasts and / or smooth muscle cells.
  • the living cells in the printing material which forms the possibly remaining structure, such as the mesh or drops embedded in the mesh are cells, such as hepatocytes, keratinocytes, nerve cells, (tubus) epithelial cells and cardiomyocytes.
  • the cells MCS are as stated above.
  • Suitable materials for the printing materials include agarose, collagen, fibrin, alginate, chitosan, hyaluronic acid, elastin / fibronectin-based hydrogels, hyaloronic acid or synthetic hydrogels including polyethylene glycol, poly (n-isopropyl-acrylamide) and copolymers, polylactides , Polyurethanes or polyvinyl alcohols or mixtures thereof, poloxamers, such as. Pluronic, but also synthetically modified hydrogels including methacrylated gelatin (GelMA) or silicones.
  • GelMA methacrylated gelatin
  • the viscosity of the printing materials should be adjusted accordingly.
  • the materials are those that are dispensable.
  • gels can be printed by means of drop-on-demand printing up to about 5000 mPas, while other printing processes can also print viscosities of up to 960,000 mPas.
  • the viscosities of the at least two printing materials for the at least two printing subregions can be selected such that they are correspondingly far apart so that no or only slight mixing takes place.
  • the printing materials are selected such that they have little mixing due to different hydrophobic properties.
  • the first material can form a surface on which subsequent drops with a large contact angle z. B.> 20 ° can be applied.
  • the person skilled in the art is aware of suitable hydrophobizing agents and hydrophilic or hydrophobic materials which are used in the printing materials.
  • the hydrophobicity, especially that of the first printing material is important in that the droplets printed on the hydrophobic material spread less strongly. This allows a hydrophobic base layer or subsequently printed hydrophobic layers to place much more defined and spatially higher resolved single drops and drop structures.
  • the distances between individual drops and Drop structures can be set precisely by imprinting on a hydrophobic layer.
  • this biological three-dimensional structure is a tissue structure that can be used as a tissue substitute.
  • tissue substitutes find application in vitro as a tissue model, eg. B. as a model for tissue genesis or as a tissue model for testing therapy forms or to stratify a therapy or to test or identify drug candidates.
  • these structures can be used as tissue substitutes in vivo, i. H. when
  • Implant can be used.
  • tissue structures for in vitro or in vivo application may be organs or living tissue structures, such as a capillary network, a liver tissue structure, a heart tissue structure, a kidney tissue structure, an alveoli structure, a skin structure, a cartilage structure, a bone structure optionally with bone marrow, a neuronal Structure or hybrids thereof.
  • organs or living tissue structures such as a capillary network, a liver tissue structure, a heart tissue structure, a kidney tissue structure, an alveoli structure, a skin structure, a cartilage structure, a bone structure optionally with bone marrow, a neuronal Structure or hybrids thereof.
  • tissue structures or tissue substitutes may also have corresponding MCS or combinations of MCS with single cells to form the corresponding structures.
  • tissue structures The culturing conditions for the formation of these tissue structures are known to the person skilled in the art, and corresponding cultivation processes can be carried out in appropriate devices with suitable materials.
  • These structures according to the invention are characterized in that they exhibit a corresponding microstructure, in particular with regard to the arrangement of the various cell types and matrices.
  • tissue substitutes were prepared by the method according to the invention.
  • the following compositions were used:
  • 0.5 ml gelatin agarose solution consisting of equal parts mixed agarose (2%) and gelatin (10%) supplemented with 2% thrombin, in a Petri dish or a 12 ml -Wellplatte poured.
  • a pattern of spaced individual drops consisting of the above-described GA mixture is printed on the base layer.
  • the printing process is carried out at an air pressure of 0.5 bar, a valve opening time of 450 s, and a valve diameter of 300 ⁇ .
  • the printing process is repeated once.
  • the drop structures are washed with 500 ⁇ PBS.
  • each sample 30 ⁇ cell-loaded fibrinogen (3 x 10 6 HUVEC ⁇ / ml and 1 x 10 6 hMSCs ⁇ / ml) are pipetted on the printed sample, printed or sprayed. Printing and infiltration can be repeated as often as required to build up multi-layered structures.
  • the samples are then cultured at 37 ° C and 5% CO2 for a period of at least two weeks.
  • the base layer is washed with 500 ⁇ PBS. Thereafter, each sample 30 ⁇ cell-loaded fibrinogen (3 x 10 6 HUVEC ⁇ / ml and 1 x 10 6 hMSCs ⁇ / ml) are pipetted on the base layer, printed or sprayed. Subsequently, a pattern of spaced individual drops of an agarose mixture consisting of equal parts mixed agarose (2%) and cell culture medium enriched with 2% thrombin, printed on the fibrin-coated base layer using a drop-on-demand bio-printer (eg from the Black Drop Biodrucker GmbH). Coating and printing can be repeated as often as required to build multi-layered structures. The samples are then cultured at 37 ° C and 5% CO2 for a period of at least two weeks.
  • a pattern of spaced individual droplets consisting of the above-described GA mixture is printed on the base layer.
  • the printing process is carried out at an air pressure of 0.5 bar, a valve opening time of 450 s, and a valve diameter of 300 ⁇ .
  • the printing process is repeated once.
  • the drop structures are washed with 500 ⁇ PBS.
  • each sample 30 ⁇ (10 ⁇ 6 cardiomyocytes 3 x) pipetted cell-loaded fibrinogen to the printed sample, printed or sprayed. Printing and infiltration can be repeated as often as required to build multi-layered structures.
  • the samples are then cultured at 37 ° C and 5% CO2 for a period of at least 5 days.
  • the base layer is washed with 500 ⁇ PBS. Thereafter, each sample 30 ⁇ (10 ⁇ 6 cardiomyocytes 3 x) pipetted cell-loaded fibrinogen to the base layer, printed or sprayed. Subsequently, a pattern of spaced individual drops of an agarose mixture consisting of equally mixed agarose (2%) and cell culture medium enriched with 2% thrombin, using a drop-on-demand bio-printer (eg., From the Black Drop Biodrucker GmbH ) printed on the fibrin-coated base coat. Coating and printing can be repeated as often as required to build multi-layered structures. The samples are then cultivated at 37 ° C and 5% CO2 for a period of at least 5 days. Preparation of kidney analog (infiltration)
  • a pattern of spaced single drop is consisting of the above-described GA Mix, provided with 3 x 10 ⁇ 6 HK-2 tubular epithelial cells per Millili- ter, printed on the base layer.
  • the printing process is carried out at an air pressure of 0.5 bar, a valve opening time of 450 s, and a valve diameter of 300 ⁇ . The printing process is repeated once. Subsequently, the drop structures are washed with 500 ⁇ PBS.
  • each sample 30 ⁇ cell-loaded fibrinogen (3 x 10 6 HUVEC ⁇ / ml and 1 x 10 6 hMSCs ⁇ / ml) are pipetted on the printed sample, printed or sprayed. Printing and infiltration can be repeated as often as required to build multi-layered structures.
  • the samples are then cultured at 37 ° C and 5% CO2 for a period of at least 1 week. Production of Liver Lobe Analog (Penetration)
  • the base layer is washed with 500 ⁇ PBS. Thereafter, each sample 30 ⁇ cell-loaded fibrinogen (3 x 10 6 HUVEC ⁇ / ml and 1 x 10 6 hMSCs ⁇ / ml) are pipetted on the base layer, printed or sprayed. Subsequently, a pattern of spaced individual drops of an agarose mixture consisting of equally mixed agarose (2%) and cell culture medium enriched with 2% thrombin, using a drop-on-demand bio-printer (eg., From the Black Drop Biodrucker GmbH ) printed on the fibrin-coated base coat.
  • a drop-on-demand bio-printer eg., From the Black Drop Biodrucker GmbH
  • the Aga used for printing rose hydrogel is loaded with hepatocytes (3 x 10 ⁇ 6 HUH7 hepatocytes). Coating and printing can be repeated as often as required to build multi-layered structures.
  • a sample containing no fibrin and hMSCs and HUVECs contained therein was similarly prepared. The samples are then cultured at 37 ° C and 5% CO2 for a period of at least 12 days. evaluation
  • tissue substitutes and tissue analogs are provided.
  • this universal method a variety of fabrics with complex structures can be provided which, as shown in the examples, very well reflect the original fabrics.
  • These tissues are accordingly suitable as substitutes, for example as implants, but also as analogues for in vitro processes, for example in the pharmaceutical sector. Due to its simplicity, the method according to the invention allows rapid production in a large number of tissues and allows the production of substantially identical tissue structures.

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zum Biodrucken einer dreidimensionalen biologischen Struktur enthaltend lebende Zellen mit mindestens zwei unterschiedlichen Materialien zum Biodrucken. Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass in mindestens einem Schritt eines der Materialien zum Drucken durch Drucken von Tropfen (drop-on-demand) Drucken aufgebracht oder eingebracht wird. Insbesondere eignet sich dieses Verfahren zum Drucken von Gewebestrukturen einschließlich solchen, die Versorgungsstrukturen aufweisen. Solche Strukturen sind insbesondere Kardiostrukturen, Leberstrukturen, Nierenstrukturen, Alveolenstrukturen, Hautstrukturen oder neuronale Strukturen. In einem weiteren Aspekt wird eine so erhältliche biologische dreidimensionale Struktur beschrieben. Schließlich betrifft die vorliegende Anmeldung die Verwendung einer dreidimensionalen erfindungsgemäßen Struktur als Gewebemodell, insbesondere als Modell zur Gewebegenese zum Beispiel geeignet zur Testung von Therapieformen oder zur Stratifizierung einer Therapie oder zum Testen oder Identifizieren von Wirkstoffkandidaten.

Description

Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen biologischen Struktur und diese Struktur so erhaltend
Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zum Biodrucken einer dreidimensi- onalen biologischen Struktur enthaltend lebende Zellen mit mindestens zwei unterschiedlichen Materialien zum Biodrucken. Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass in mindestens einem Schritt eines der Materialien zum Drucken durch Drucken von Tropfen (drop-on-demand) aufgebracht oder eingebracht wird. Insbesondere eignet sich dieses Verfahren zum Drucken von Gewebestrukturen einschließlich solchen, die Versorgungsstrukturen aufweisen. Solche Strukturen sind insbesondere Kardiostrukturen, Leberstrukturen, Nierenstrukturen, Alveolenstrukturen, Hautstrukturen oder neuronale Strukturen. In einem weiteren Aspekt wird eine so erhältliche biologische dreidimensionale Struktur beschrieben. Schließlich betrifft die vorliegende Anmeldung die Verwendung einer dreidimensionalen erfindungsgemäßen Struktur als Gewebemodell, insbesondere als Modell zur Gewebegenese zum Beispiel geeignet zur Testung von Therapieformen oder zur Stratifizierung einer Therapie oder zum Testen oder Identifizieren von Wirkstoffkandidaten.
Stand der Technik
Viele Gewebe die sich zum Beispiel im menschlichen Körper befinden, setzen sich zusammen aus einer Vielzahl von Zellarten, die von Matrizes mit unterschiedlicher physikalischer und chemischer Zusammensetzung umgeben sind. Beispielhaft seien hier die Leber, Niere oder das Myokardium genannt. In diesen Geweben sind Matrizes und Zellarten nicht gleichmäßig verteilt zu finden, sondern weisen einen ho- hen Grad einer mikrostrukturellen Organisation, das heißt eine hochorganisierte Mikrostruktur auf. Dabei spielt unter anderem das Vorliegen eines kapillaren Netzwerks eine wesentliche Rolle, dieses führt die entsprechenden Nährstoffe und die Atmungsgase zu, beziehungsweise entsprechende metabolische Abbauprodukte ab. Die seit einigen Jahren erforschte Technologie des Biodruckens (Bioprinting) besitzt das Potential, die komplexe Struktur der genannten Gewebe bis zu einem gewissen Grad nachzubilden, mit dem Ziel diese Gewebe als Implantate oder als /n-V7fro-Screening Plattform für pharmakologische Wirkstoffe und für Toxizitätsuntersuchungen einzu- setzen (Murphy S. V., Atala A. Nat. Biotechnol, 2014, 32(8), 773-785, Blaeser A., et al, Curr. Opin. Biomed. Eng. 2017, doi:10.1016/j.cobme.2017.04.003).
Bioprinting ist ein spezielles Tissue-Engineering-Verfahren, das sich dem Prinzip der generativen Fertigungsverfahren - auch als Rapid Prototyping bekannt - bedient, um dreidimensionale lebende Gewebe zu generieren. Typischerweise werden im Gegensatz zu industriell eingesetzten generativen Fertigungsverfahren, wie zum Beispiel der Stereolitographie, dem selektiven Laserschmelzen oder dem Fused-De- position-Modelling, beim Bioprinting mit Zellen beladene druckbare Materialien, zum Beispiel Hydrogele, als Baumaterial verwendet. Üblicherweise wird dieses Material hierbei gemäß eines 3D-Modells Schicht für Schicht aufgetragen, wobei die Hydro- gele die extrazelluläre Matrix des natürlichen Gewebes nachahmen und dabei eine entsprechende zellfreundliche Umgebung für das 3D Tissue Engineering ausbilden.
Heutige Ansätze zum Biodrucken verfolgen das Ziel die Anatomie und Form einer gewünschten Gewebeart möglichst naturgetreu nachzustellen. Die sich daraus ergebende Komplexität verlangt es, dass das jeweilige 3D-Modell, die eingesetzte Software, die verwendete Hardware, das Biomaterial und die Druckstrategie speziell auf das Zielgewebe abgestimmt werden müssen. Hieraus ergibt sich eine Vielzahl sehr spezielle Bioprinting-Ansätze, die das Drucken nur eines spezifischen Gewebetyps ermöglichen. Um entsprechend verschiedene Gewebearten auszubilden sind unterschiedliche Strategien und Modalitäten notwendig. In der Literatur wird zum Bei- spiel beschrieben, dass mit Photopatterning Lebermodelle generiert werden können, Mikroextrusionsverfahren werden verwendet um Nierenmodelle, Hautmodelle oder Knorpel und Knochenmodelle auszubilden. Eine koaxiale Mikroextrusion wurde in Verbindung mit einem Vernetzen durch UV-Lichtbestrahlung eingesetzt, um biogedruckte Thrombosemodelle oder vaskularisiertes Myokard zu bilden. Es gibt eine große Vielzahl von möglichen Herstellungsverfahren, Herstellungsstrategien, Biomaterialien und Drucksoftware, die nicht nur zeitintensiv sind, sondern auch ineffizient und unflexibel um standardmäßig eingesetzt werden zu können und um eine im Implantatbereich notwendige Zertifizierung dieser Herstellungsverfahren zu erreichen. Entsprechend ist eine kommerzielle Umsetzung schwierig.
Aus der Veröffentlichung von Stratesteffen H., et al, Biofabrication 9 (2017) 045002 ist die Druckfähigkeit durch Drop-On-Demand 3D Drucken für GelMA-Kol- lagen Mischungen und deren Förderung der Angiogenese beschrieben. Tan, Y.J. et al. beschreiben in Scientific Reports, 6:39140/DOM 0.1038/SREP39140 hybride Microscaffold-basierte 3D Biodruckverfahren von multizellulären Konstrukten mit hoher Kompressionsfestigkeit. Dort werden neue Kompositmaterialien zum Zweck des 3D Druckens beschrieben, ähnlich wie in Stratesteffen.
Aus Marchioli, G. et al, DOI:10.1002/ADHM.201600058 ist ein Verfahren bekannt, das ein Hybridgerüst aus PCL gefüllt mit zellbeladenen Hydrogel beschreibt. Hierbei wird das PCL mit Extrusion bei 100°C extrudiert.
Eine Zusammenfassung von 3D Bioprintverfahren, insbesondere solcher zum Drucken von lebenden Zellen aufweisenden Hydrogelen zur Gewebegenerierung, wird in dem Artikel von Blaeser et al, 2017, siehe oben, diskutiert. Darin werden die verschiedenen Möglichkeiten des 3D Biodruckens beschrieben. Es wird zwischen Verfahren, die einen schichtweisen, einen linienweisen und einen tropfenweisen Aufbau erlauben, unterschieden.. Durch Anwendung verschiedener Techniken können unterschiedlichste Strukturen aufgebaut werden, die wie bereits oben ausgeführt, meist gewebespezifisch sind.
Das Biodrucken auf Tropfenbasis kann mit unterschiedlichen Techniken durchgeführt werden, hier können einerseits das laserbasierte Verfahren, das Tintenstrahl- drucken (Inkjet) und das Mikroventilverfahren genannt werden. Die Verfahren unter- scheiden sich in der Auflösung bzw. Tropfengröße, der erzielbaren Zellviabilität und der Eignung für das Drucken von planaren Mikrostrukturen sowie von freistehenden 3D-St.ru kturen.
Beim Bioprinting können wie ausgeführt verschiedene Techniken eingesetzt werden, der Druck mittels Tropfen (Tropfendruck) stellt eines dieser Verfahren dar mit den drei grundsätzlich oben genannten Techniken des laserbasierten Druckens, des Tintenstrahldruckens oder des Druckens mittels Mikroventilen. Vorteile dieser Drucktechniken sind die Ausbildung einzelner Tropfen, die gegebenenfalls lebende Zellen aufweisen können, wobei die Größe hiervon bis zu 0,01 nl im Volumen sein kann, die derzeitige Auflösung beträgt bis zu 45 μιτι.
Die einzelnen Tropfen können einfach und sehr genau an vorbestimmte Positio- nen aufgebracht werden. Dadurch ist es möglich sehr präzise Strukturen aufzubringen. Dies gilt insbesondere bei der Verwendung mehrerer Druckköpfe, womit verschiedene Druckmaterialien eingesetzt werden können.
Es gibt somit viele Verfahren zum Biodrucken und zum Herstellen von Gewebestrukturen, allerdings haben diese unterschiedliche Nachteile insbesondere die bisher nicht mögliche allgemeine Ausbildung von Gewebestrukturen verschiedener Art.
Entsprechend gilt es verbesserte Verfahren bereitzustellen, die auf Basis eines allgemeinen Prinzips mithilfe von Biodrucken dreidimensionale biologische Strukturen enthaltend lebende Zellen bereitstellen können, wobei in einfacher und kosten- günstiger Weise diese verschiedenen Gewebestrukturen erreichbar sind. Dabei werden mithilfe eines einfachen Weges strukturelle Hierarchien multipler Gewebearten unter Verwendung eines neuen Bioprintansatzes generiert.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß ist es möglich, mit einer einfachen Technik und einem einfachen Verfahren dreidimensionale biologische Strukturen zu generieren, die vielfältige Gewebearten in vitro generiert widerspiegeln.
Der wichtigste Unterschied zu zuvor genannten Bioprinting Strategien besteht darin, dass nicht Form und Anatomie der Zielgewebe, sondern deren biologische Funktion im Vordergrund stehen. Es wird nicht versucht die Anatomie eines einzelnen Gewebes eins-zu-eins nachzubilden, sondern den anatomisch gesehen, kleinsten gemeinsamen Nenner einer möglichst großen Zahl unterschiedlicher Gewebe zu identifizieren und mittels Bioprinting zu reproduzieren.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zum Biodrucken einer dreidimensionalen biologischen Struktur enthaltend lebende Zellen mit mindestens zwei unterschiedlichen Materialien zum Biodrucken, die entsprechend ihrer Materialeigenschaften mindestens zwei unterschiedliche Teilbereiche ausbilden, wobei mindestens ein Teilbereich dieser dreidimensionalen Struktur lebende Zellen enthält und wobei mindestens eines der Materialien zum Biodrucken lebende Zellen enthält, wobei in einem ersten Schritt eines dieser Materialien auf ein Substrat aufgebracht oder eingebracht wird; dieses Material gegebenenfalls einer ersten Behandlung, insbesondere einem Waschen unterzogen wird, und in einem sich anschließenden Schritt ein anderes Material als im ersten Schritt verwendet, aufgebracht oder eingebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Materialien durch Tropfendruck aufgebracht oder eingebracht wird.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann zum Beispiel als Infiltrationsmethode oder als Penetrationsmethode durchgeführt werden.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung mit diesem Verfahren erhältliche biologische dreidimensionale Strukturen, wobei es sich hier insbesondere um Gewebestrukturen und Gewebemodelle handelt.
Diese Gewebemodelle eignen sich zur Verwendung zum Beispiel der Gewebe- genese oder als in vitro Modell zur Testung von Therapieformen oder zur Stratifizie- rung der Therapie oder zum Testen oder Identifizieren von Wirkstoffkandidaten.
Beschreibung der Abbildungen
In der Figur 1 sind schematisch die hierin beschriebenen Infiltrationsverfahren und Penetrationsverfahren dargestellt.
Figur 1 a zeigt das Infiltrationsverfahren. Auf ein Substrat werden Tropfen eines ersten Druckmaterials (Bionink A) gedruckt. Anschließend findet ein Waschen/Spülen zum Beispiel mit PBS des aufgetropften Materials statt, um dann das zweite Druckmaterial (Bioink B) aufzubringen, um so die Zwischenräume des Bioinks A auf- zufüllen.
Die Schritte des Auftropfens des Bioinks A, Waschen und Aufbringen des Bioinks B können gegebenenfalls mehrfach wiederholt werden, um ein multizellulares Gewebemodell zu erhalten.
In der Figur 1 b ist das Penetrationsverfahren dargestellt. Hierzu wird auf ein Substrat, das mit PBS gewaschen wurde, das Druckmaterial Bioink B aufgebracht, zum Beispiel durch Sprühen, Tropfen etc. Anschließend wird das Druckmaterial Bio- ink A als Tropfen aufgedruckt, wobei diese Tropfen in den durch das Bioink B gebildeten Film eindringen. Diese Schritte können ebenfalls mehrfach wiederholt werden, um multizelluläre Gewebemodelle zu erhalten.
In der Figur 1 c sind die verschiedenen multizellulären Gewebemodelle darge- stellt. Auf der linken Seite ist eine Kompositstruktur mit Bioink A und umgebenen Bioink B dargestellt. In der Mitte ist ein poröses Netz aus dem Bionk B dargestellt. Die vormals vorhandene Bioink A wurde herausgelöst, zum Beispiel durch Lösen des entsprechenden Druckmaterials zum Beispiel durch Wasser, Erwärmung etc. und somit Verflüssigung.
Auf der rechten Seite ist eine poröse Kompositstruktur dargestellt. Dabei wurde im mittleren Bereich das Bioink A herausgenommen um eine Kavität zu erhalten. In dieser Kavität können entsprechend die verbliebenen Zellen an der Wand vorliegen. Dadurch können Gefäßstrukturen geschaffen werden. Das Bioink A ist in den übrigen Bereichen mit verkapselten Zellen vorhanden. Alternativ können in die Kavitäten auch Multizelluläre Spheroide (MCS) eingebracht werden.
Figur 2a zeigt die Ergebnisse der Infiltrationstechnik (links) und Penetrationstechnik (rechts). In Figure 2b ist ein kapillarartiges Netzwerk ausgebildet gemäß Figur 2a durch Infiltration dargestellt.. Im linken Teil von Figur 2b sind Durchlichtauf- nahmen („BF") mikroskopischer Scans der Kontrolle (Zellen in nicht strukturiertem Fibrin) und einer gedruckten Proben abgebildet. Eine Vitalfluoreszenzdoppelfärbung zeigt den Anteil lebender („Live", original grün) und toter Zellen („Dead", original rot). Im rechten Teil sind Teilbereiche der vorherigen Bilder in stärkerer Vergrößerung dargestellt. Zudem wird eine Negativkontrolle dargestellt, bei der eine Kontrollprobe mit Ethanol behandelt wurde, wodurch die Zellen abgetötet wurden und gezeigt werden kann, dass die Messmethode auch tote Zellen erfasst. In Figur 2c sind Ausschnitte der gedruckten Struktur dargestellt. Zu erkennen sind die entsprechend ausgebildeten dreidimensionalen Strukturen. Nach zweiwöchiger Kultur haben sich kapillarartige Netzwerke durch die Endothelzellen ausgebildet. Deutlich sind versorgungs- strukturartige Bereiche mit entsprechenden Kavitäten zu erkennen und andere Berei- che mit Zellstrukturen. Zur Darstellung des vaskulären Netzwerks wurde eine Immunfluoreszenzfärbung mit DAPI (Zellkern, original blau) und CD31 (endothelzellspezifi- scher Marker, original rot) durchgeführt und mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie (unten, rechts) und Fluoreszenzmikroskopie (unten, links) festgehalten. In Figur 3 ist eine erfindungsgemäße Anwendung zur Generierung von drei verschiedenen Gewebestrukturen dargestellt. Figur 3a zeigt beispielhaft die Generierung einer Herzmuskelvorläuferstruktur. Kardiomyozyten wurden hierbei in Fibrin eingebettet. Die nicht gedruckte Kontrolle wies bereits nach wenigen Tagen in Kultur er- hebliche Deformationen, hervorgerufen durch Kontraktion der Herzmuskelzellen, auf. Bei der gedruckten Struktur wurden mithilfe der Penetrationsmethode Agarosetropfen in die Fibrinschicht gedruckt, die die Struktur während des Zellwachstums mechanisch stabilisiert. Es ist gut zu erkennen, dass die Strukturen nach 5 und auch 7 Tagen nach der Herstellung nicht oder nur geringfügig deformiert wurden und sich die Zellen insbesondere entlang der gedruckten Strukturen ausgerichtet haben. In Figur 3b ist die Anwendung der beschriebenen Technik zur Generierung eines Nierengewebes, speziell dem Tubulointerstitium der Niere, dargestellt. Hierbei wurden Tu- bulusepithelzellen in Tropfen eines herauslösbaren Porogens (Agarose-Gelatine-Gemisch) eingebettet. Die Zwischenräume der gedruckten Tropfen wurden mit Fibrin, welches humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) und humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVECs) enthielt, infiltriert. Nach dem Herauslösen des Porogens adhärierten Epithelzellen am Rand der entstandenen Poren und bildeten dort eine homogene Zellschicht aus. Nach siebentägiger Kultivierung bildeten die im umliegenden Fibrin enthaltenen hMSCs und HUVECs erste kapillarähnliche Struktu- ren aus. Die gedruckten Strukturen wurden gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie und Zwei-Photonen-Mikroskopie untersucht. Alle Zellen wurde hierzu mit DAPI, die Endothelzellen zusätzlich mit CD31 , die Epithelzellen mit LTL Antikörperfärbungen markiert. Die mesenchymalen Stammzellen sind bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie durch Autofluoreszenz sichtbar. In Figur 3c ist die Anwendung der erfindungs- gemäßen Technik zur Generierung eines Lebergewebes, speziell eines Leberlappengewebes, dargestellt. Hepatozyten wurden hierfür in Agarosetropfen eingebettet, die mithilfe der Penetrationsmethode in eine mit hMSCs und HUVECs beladene Fibrinschicht gedruckt wurden, die während ihrer Kultivierung ein kapillarähnliches Netzwerk aufbauen. Durch mehrmaliges Wiederholen wurde eine sechs Schichten umfas- sende Struktur hergestellt. In der mikroskopischen Aufnahme können die Hepatozyten auf Grund ihrer Morphologie von den übrigen Zellen unterschieden werden. Zur besseren Darstellung wurden sie mit Hilfe eines Algorithmus virtuell eingefärbt. Die Menge an synthetisiertem Harnstoff wurde am so hergestellten Leberlappengeweben über 12 Tage gemessen (HEP+) und mit einer weiteren Probe verglichen, bei der die Hepatozyten ohne unterstützendes Kapillarnetzwerk gedruckt wurden (HEP). He- patozyten mit einem umgebenden Kapillarnetzwerk wiesen eine signifikant höhere Harnstoffsynthese auf, als die Vergleichsgruppe und die Kontrolle (ausschließlich Zellkulturmedium).
Figur 4: Die Figur 4 zeigt, dass die aus der Drucktechnik gewonnenen Strukturen auch mit Multizellulären Spheroiden (MCS) dargestellt in der Figur 4a kombiniert werden können. Diese MCS können entweder direkt in den Tropfen mitgedruckt werden, wie in der Figur 4b dargestellt oder sie können nach dem Herauslösen der Trop- fen in die entstandenen Poren eingebettet werden, siehe Figur 4c.
Entsprechend können komplexe Strukturen hergestellt werden, wie zum Beispiel solche mit MCS, die über ein Kapillarnetzwerk verbunden ist, beispielhaft hierzu die Figur 4d. Geeignete Spheroide können hierbei aus Stammzellen, adulten Zellen, Primärzellen, Knock-out Zellen, Wildtyp-Zellen, entarteten Zellen oder Tumorzellen oder Kombinationen von solchen Zellen bestehen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Den Erfindern ist es gelungen, ein Verfahren bereitzustellen, das aufbauend auf allgemeine Verfahrensschritte die Generierung unterschiedlicher dreidimensionaler biologischer Strukturen, insbesondere Gewebestrukturen erlaubt, die einen unregelmäßigen Aufbau aufweisen, insbesondere keine gleichmäßig verteilten Strukturen besitzen, sondern Bereiche mit Versorgungsstrukturen und andere spezifische Bereiche.
Das heißt, das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Plattformverfahren mit dem eine Vielzahl von Gewebeanaloga generiert werden können indem entsprechende unregelmäßige Strukturen in ihrer Vorform gedruckt werden. Es ist möglich mithilfe dieses auf drop-on-demand (DOD) basierten Bioprinting Verfahrens die strukturelle Hierarchie multipler Gewebearten aufzubauen. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich vom Stand der Technik dadurch, dass einerseits das beschriebene Verfahren zur Ausbildung des Gewebemodells nicht vorbeschrieben ist und zweitens das erfindungsgemäße Verfahren die Grundprinzipien struktureller Ähnlichkeiten nutzt, die sich allgemein in unterschiedlichen Gewebestrukturen aufzeigen. Im Gegensatz zu den Stand der Technik Verfahren, die spezifisch eine Gewebestruktur aufbauen, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Gewebeanatomie in abstrakterer Form darzustellen und durch Kultivierung zu generieren. So kann unter entsprechenden Bedingungen auf Basis dieser allgemeinen Strukturen unter Nut- zung der Gewebestruktur spezifischen Zellen und gegebenenfalls Kultivierungsbedingungen, die individuelle Gewebestruktur nachgebildet werden.
Durch dieses allgemeine Grundprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, komplett unterschiedliche Gewebestrukturen als Analoga mit hoher biofunktionaler Ähnlichkeit zu ihren natürlichen Counterparts bereitzustellen.
Das heißt, das Druckverfahren ist im Wesentlichen für die verschiedensten Gewebestrukturen gleich, nur die entsprechenden Druckmaterialien sind unterschiedlich, das heißt sie weisen unterschiedliche Zellarten und/oder MCS auf und weisen gegebenenfalls unterschiedliche Matrixmaterialien auf.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können somit einfach und reproduzier- bar unterschiedliche Gewebemodelle hergestellt werden. Das Verfahren weist eine hohe Flexibilität auf und stellt ein Verfahren dar, das industriell umsetzbar ist und für den medizinischen Bereich die Zulässigkeitsvoraussetzungen erfüllen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren, wobei mindestens eines der Materialien mit einem auf Tropfen basiertem Druckverfahren aufgebracht wird, insbesondere ein drop-on-demand (DOD) Bioprinting, ist dabei eines, bei dem separate Tropfen mit gegebenenfalls Zellen aufweisenden Matrixmaterialien, die im vorliegenden auch als Bioink oder Biotinte bezeichnet wird, gedruckt wird, um eine dreidimensionale biologische Struktur, insbesondere eine Gewebestrukturanaloga, bereitzustellen.
Im allgemeinsten Ansatz wird dabei mindestens ein erstes Material, auch als „ein Material" bezeichnet, verwendet um einen ersten Teilbereich auszubilden und mindestens ein zweites Material, auch als„anderes Material" bezeichnet, um einen zweiten Teilbereich dieser dreidimensionalen Struktur auszubilden. Eines dieser Materialien weist dabei lebende Zellen auf, so dass in mindestens einem dieser Teilbereiche lebende Zellen vorliegen.
Solange nicht anders ausgeführt umfasst der Begriff„Zelle" oder„Zellen" auch
Multizelluläre Spheroide (MCS). MCS können zum Beispiel bestehen oder umfassen: Stammzellen, adulten Zellen, Primärzellen, Knock-out Zellen, Wildtyp-Zellen, entarteten Zellen oder Tumorzellen oder Kombinationen hiervon. Dem allgemeinen Verfahren folgend wird dabei in einem ersten Schritt ein Material auf ein Substrat aufgebracht. Daran anschließend erfolgt das Aufbringen eines weiteren oder anderen Materials. Dieses Aufbringen kann dabei verschiedenartig erfolgen. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Figuren dargestellt.
In einer Ausführungsform wird dabei in dem ersten Schritt das eine Material als erstes Material als Tropfen auf ein Substrat aufgedruckt, wobei diese Tropfen vorbestimmte Positionen zueinander aufweisen und anschließend, gegebenenfalls nach einem Waschschritt, ein mindestens zweites Material aufgebracht oder eingebracht wird, das die durch die Tropfen des ersten Materials gebildeten Zwischenräume aus- füllt.
Dieses auch als Infiltrationsmethode oder Infiltrationsverfahren vorliegend beschriebene Verfahren beinhaltet, dass eine oder mehrere Schichten aus Einzeltropfen des ersten Materials auf dem Substrat gedruckt werden. Diese Tropfen, die entsprechende Bereiche ausbilden, werden dabei bevorzugt in vorbestimmten Berei- chen ausgebildet. Üblicherweise sind dabei diese Tropfen bzw. die durch diese Tropfen ausgebildeten Strukturen voneinander beabstandet, so dass entsprechende Zwischenräume gebildet werden. Ggf. werden die Druckmaterialien ausgehärtet, z. B. durch Gelierung oder Polymerisation, derart, dass die ggf. darin vorliegenden Zellen am Leben (vital) bleiben.
Nach Aufbau der Schichten mit dem Erstmaterial (dem einen Material) wird ggf. eine Spülung oder ein Waschen mit einer Spülflüssigkeit durchgeführt. Anschließend wird das zweite Material (das andere Material) aufgebracht, dieses kann ebenfalls durch ein Drucken erfolgen, alternativ können aber auch Pipettieren, Sprühen oder andere Auftragstechniken eingesetzt werden.
Dieses zweite Material wird in die Zwischenräume infiltriert und bildet dort mindestens einen zweiten Teilbereich aus. Dieses zweite Material kann dabei ebenfalls Zellen aufweisen und weist üblicherweise ein anderes Material als das erste Druckmaterial auf. Nach dem Aufbringen können die drei Schritte des Tropfdruckens, Waschens und Infiltrierens beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Kon- strukte herzustellen. Insbesondere wenn ein Spülvorgang (Waschen) zwischen dem Aufbringen des ersten Materials und des zweiten Materials erfolgt, können aufgrund der Kapillarkräfte die Zwischenräume zwischen dem ersten Material besonders gut ausgefüllt werden. Das beschriebene Verfahren erlaubt es, bei Einsatz geeigneter Zelltypen (z. B. Endothelzellen und mesenchymale Stammzellen) im zweiten Material, welches zwischen die Tropfen des ersten infiltriert wird, ein gerichtetes kapillarähnliches Netzwerk auszubilden. Dem Wachstum der kapillarähnlichen Strukturen kann durch die Positio- nierung der aus dem ersten Material bestehenden Tropfen eine gewünschte Richtung vorgegeben werden.
Diesem Verfahren zur Ausbildung dieser Struktur kann sich ein weiterer Schritt anschließen, nämlich ein Schritt, bei dem das erste Material aus der gebildeten dreidimensionalen Struktur wieder herausgelöst wird. D. h., im Falle eines Hydrogels mit lebenden Zellen kann dieses Hydrogel zum Beispiel durch entsprechendes Erwärmen wieder verflüssigt werden und somit aus dieser Struktur entfernt werden. Es zeigte sich dabei, dass bei dem Entfernen dieses Druckmaterials die möglicherweise darin vorliegenden Zellen an den Rändern des weiteren Teilbereichs adhärieren. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es besonders gut möglich, zum Beispiel weitere Versorgungsstrukturen ( z. B. Gefäßstrukturen), die orthogonal zur gedruckten Struktur verlaufen, auszubilden. Durch das Entfernen des Materials können Kavitäten geschaffen werden, an deren Innenseite der äußeren Begrenzung diese Zellen sich niederschlagen. Diese Methode eignet sich insbesondere zur Ausbildung von Gefäßstrukturen und epitheliali- sierten Kanälen (z. B. Tubuli), bei denen mit dem ersten Material Gefäßstrukturen aus- bildende Zellen eingebracht werden, wie Endothelzellen, Epithelzellen, mesenchymale Stammzellen, Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen einschließlich Kombinationen hiervon.
In einer weiteren Ausführungsform, der Penetrationsmethode, wird im Prinzip in umgekehrter Reihenfolge vorgegangen. D. h., auf einem Substrat, das ggf. vorher mit einer Spüllösung behandelt wurde, wird ein Material aufgetragen. Dieses Auftragen kann durch Drucken, Pipettieren, Sprühen oder anderen Auftragungstechniken erfolgen. Dieses Material kann ebenfalls Zellen aufweisen. Hieran anschließend kann sich ggf. ein Härten dieses Materials, um dann durch Tropfendrucken das weitere Material als Einzeltropfen auf diesen Materialfilm zu drucken.
Durch das Drucken kann der Tropfen des Druckmaterials die Oberfläche des ausgebildeten Films durchschlagen z. B. in der Art, dass die Tropfen in die durch das Material ausgebildete Schicht eingebettet werden. Der Tropfen taucht also in das andere Material ein und verdrängt dieses, es findet eine Penetration des Filmes mit den Tropfen statt.
Durch das Einbringen dieser Tropfen in die als Film ausgebildete Schicht ist es ebenfalls möglich, entsprechende Teilbereiche auszubilden. Das Einbringen der Tropfen kann dabei an vorbestimmten Positionen erfolgen, so dass die gewünschte Struk- tur ausgebildet wird. Auch hier kann ggf. wieder ein Entfernen eines dieser Materialien z. B. durch Erweichen des Druckmaterials erfolgen. Hierdurch lassen sich insbesondere Strukturen mit Kavitaten ausbilden, bei denen an den Rändern dieser Kavitaten entsprechend durch das Druckmaterial eingebrachte Zellen abgeschieden werden.
In einer Ausführungsform werden die Tropfen bei dem Tropfendruck in einem vorbestimmten Muster gedruckt. Dabei kann das Aufbringen der Tropfen Schicht für Schicht erfolgen, um dreidimensionale Strukturen der Teilbereiche auszubilden.
Diese Teilstrukturen, entweder als einen ersten Teilbereich oder als einen zweiten Teilbereich, sind entsprechend eingebettet und eignen sich insbesondere, um Versorgungsstrukturen oder Mikrostrukturen zum Zuführen oder Ableiten von Nährstoffen, notwendigen Metaboliten einschließlich Fluid etc. zu gewährleisten. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es entsprechend möglich Mikrostrukturen und Mikroor- ganisationen der Gewebe auszubilden. Dabei erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren durch die allgemeine Anwendbarkeit die Ausbildung verschiedenster Gewebestrukturen, die sich nach Einsatz der lebenden Zellen, dem Druckmaterial in wel- ehern sie sich befinden und der Art und Weise der Einbringung zum Beispiel mittels der Infiltrationsmethode oder der Penetrationsmethode unterscheiden.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Druckmaterial um ein Material auf Basis von Gelatine insbesondere ein Gelatine-Agarosemix, Polyethylenglykol (PEG) oder ein PEG-Derivat ist, oder ein Poloxamer, wie Pluronic, wobei dieses Ma- terial lebende Zellen aufweisen kann und/oder wobei dieses Material zu einem späteren Zeitpunkt verflüssigbar und entfernbar ist unter Zurücklassung der Zellen.
In einer Ausführungsform ist dabei das Material, das durch Tropfendruck aufgebracht wird, ein stabiles oder wieder lösbares Hydrogel. Beispiele für ein stabiles Hyd- rogel dieses Druckmaterials schließt Agarose, Alginat und andere Polysaccharide so- wie Mischungen dieser Materialien mit proteinbasierten Gelen (z. B. Kollagen, Fibrinogen, usw.) ein, wieder auflösbare Materialien sind zum Beispiel Gelatine oder Pluronic, ein Blockcopolymere aus Ethylenoxid und Propylenoxid.. Mikrogele, intramolekular vernetzte Makromoleküle, können ebenfalls als wiederauflösbare Materialien eingesetzt werden.
Mithilfe der lösbaren Hydrogele ist es möglich, entsprechende Kavitäten in der dreidimensionalen biologischen Struktur auszubilden. In einer Ausführungsform ent- hält dabei dieses Druckmaterial Zellen, die dann beim Herauslösen an dem Rand der Kavitäten adhärieren, um dort gewünschte Strukturen auszubilden, zum Beispiel Gefäßstrukturen oder epithelialisierte Tubuli oder andere Mikrostrukturen des gewünschten Gewebes.
Diese lösbaren Tropfen können entsprechende Poren oder Kavitäten formen, so dass sich dann eine entsprechende Struktur, zum Beispiel in Form eines Netzes oder Ähnliches, aus dem mindestens einem anderen Material mit definierter Porengröße und Abstand ausbildet.
Entsprechende Poren können verwendet werden, um den Transport der Nährstoffe oder anderer Fluide zu erlauben. Insbesondere den Transport dieser zu Zellen die sich innerhalb oder an dem zweiten Material befinden. Beispielhafte Ausbildungen solcher Strukturen werden im Beispiel beschrieben.
Das zweite oder andere Material ist dabei bevorzugt ein Hydrogel, insbesondere eines auf Basis von Fibrinogen oder Kollagen, das gegebenenfalls Zellen aufweisen kann. Dieses Material bildet nach Ausbringen entweder durch allgemein bekannte Auf- bringungsverfahren insbesondere durch Drucken Fibrinstrukturen und/oder Kollagenstrukturen aus, die insbesondere geeignet sind dreidimensionale Gewebestrukturen auszubilden, die zum Beispiel auch im Implantatbereich eingesetzt werden können.
Geeignete biokompatible Materialien sind dem Fachmann bekannt und sind kommerziell erhältlich.
Durch die individualisierte Aufbringung dieser mindestens zwei Druckmaterialien zur Ausbildung der mindestens zwei Teilbereiche ist es möglich individualisierte dreidimensionale Konstrukte auszubilden, die einfach in großer Stückzahl und reproduzierbar hergestellt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Druckmaterialien dabei wei- terhin chemische, biologische oder physikalische Vernetzer, auch Crosslinker genannt, die ein entsprechendes Härten des Materials erlauben und gegebenenfalls in das andere Material diffundieren, um die Gelierung dessen zu initiieren. Geeignete Materialien sind zum Beispiel Thrombin, Kalziumchlorid, Glutaralde- hyd, Genipin oder Transglutaminase.
Andere geeignete Materialien, die in den Druckmaterialien enthalten sind, können chemische oder biologische oder physikalische Polymerisationsinitiator oder Ka- talysatoren sein, die gegebenenfalls in das andere Material diffundieren und einen Kontakt mit diesem dessen Gelierung beziehungsweise Verfestigung bewirkt. Geeignete Polymerisationsinitiatoren oder Katalysatoren sind dem Fachmann bekannt, wie Fotoinitiatoren, Fotokatalysatoren, Säuren oder Laugen zur Einstellung des zur Gelierung erforderlichen pH-Wertes usw.
Dem Fachmann sind geeignete Strukturen bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren eines zur Ausbildung einer dreidimensionalen biologischen Struktur, wobei diese dreidimensionale biologische Struktur eine Kardiostruktur, eine Leberstruktur, eine Nierenstruktur, eine Alveolenstruktur, eine Hautstruktur, eine Knorpelstruktur, eine Knochenstruktur gegebenenfalls mit Knochenmark, eine neuronale Struktur oder Mischformen hiervon ähnlich ausgebildet ist. Diese Strukturen eignen sich insbesondere als Gewebesubstitute oder als Gewebeanaloga in der klinischen Forschung. Darüber hinaus eignen sich diese entsprechenden Strukturen auch als Implantate als Substitute für geschädigtes Gewebe. Weitere Anwendungen im Gewebe sind insbesondere auch Knochen einschließlich Knochenmark sowie Knorpelstrukturen. Ebenfalls können entsprechende Hautanaloga mit ausgebildeter Epidermis, Dermis und Subcutis dargestellt werden. Mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Vielzahl von entsprechenden Gewebe- und Organanaloga einfach in größerem Maßstab hergestellt werden.
Die Multizellulären Spheroide können dabei entweder direkt in den Tropfen mitgedruckt werden oder nach dem Herauslösen der Tropfen in die entstehenden Poren eingebettet werden. Hierdurch ist es möglich die Konstrukte, nämlich Gewebeanaloga und Gewebesubstitute bereitzustellen, die über ein Kapillarnetzwerk verfügen und komplexe Strukturen nachbilden.
In einer Ausführungsform ist die Struktur ein Bauchspeicheldrüsenanaloga oder
Bauchspeicheldrüsensubstitut. Dabei können mit Hilfe von Tropfen bzw. in die Poren MCS oder einzelne Zellen von unterschiedlichen in der Bauchspeicheldrüse vorkom- mende Zellen, wie α-Zellen, ß-Zellen, δ-Zellen, PP-Zellen, ε-Zellen oder MCS mit ganzen Langerhans-Inseln oder Teile davon, eingebracht werden.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um eines bei dem nach Aufbringen des mindestens weiteren Materials eine Kultivierung dieser Struktur in einem geeigneten Inkubator erfolgt.
Dem Fachmann sind die entsprechenden Kultivierungsbedingungen zur Kultivierung dieser gedruckten dreidimensionalen biologischen Strukturen bekannt. Sie sind entsprechend so ausgewählt, dass sich die Gewebestrukturen ausbilden.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der dreidimensionalen biologi- sehen Struktur dabei um ein Organ. Organe schließen dabei ein, eine Leber, eine Niere, Haut.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den lebenden Zellen in dem Material um insbesondere solche, die gefäßausbildende Zellen sind oder umfassen, wie Endothelzellen, Epithelzellen, Schwann-Zellen, Nervenzellen, mesen- chymale Stammzellen, Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen.
In einer weiteren Ausführungsform sind die lebenden Zellen in dem Druckmaterial, das die ggf. verbleibende Struktur, wie das Netz oder in das Netz eingebettete Tropfen, ausbildet, Zellen, wie Hepatozyten, Keratinozyten, Nervenzellen, (Tubu- lus)Epithelzellen und Kardiomyozyten.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Zellen MCS wie oben ausgeführt.
Dabei können auch Mischungen von MCS und einzelnen Zellen eingesetzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, nämlich dem Drucken durch Tropfen, zeigte sich, dass die erhaltenen Strukturen eine besonders gute Formstabilität aufweisen und das Drucken stark verbessert ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem Strukturen gedruckt werden, die aus mindestens zwei Teilbereichen mit mindestens zwei Druckmaterialien bestehen, erlaubt die Verwendung dieser unterschiedlichen Druckmaterialien und jeder der dort enthaltenen Hydrogele, eine gegenseitige Stabilisierung dieser Bereiche, so z. B. bei Verwendung eines weniger stabilen Fibrins. Durch die Verwendung der ver- schiedenen Materialien ist es möglich, entsprechende organisierte kapillarähnliche Netzwerke auszubilden, wobei z. B. Endothelzellen, geeignet sind, diese mikroorganisierten kapillarähnlichen Netzwerke in den Teilbereichen des einen Druckmaterials auszubilden. Es können auch verschiedene Zellarten und Matrices in geeigneter Art und Weise entsprechend der Gewebemorphologie mit hoher Zellfunktionalität angeordnet werden.
Geeignete Materialien für die Druckmaterialien schließen ein Agarose, Kol- lagen, Fibrin, Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure, Elastin/Fibronectin-basierte Hydro- gele, Hyaloronsäure oder synthetische Hydrogele einschließlich Polyethylenglycol, Poly-(n-isopropyl-acrylamid) und Kopolymere, Polylactide, Polyurethane oder Polyvi- nylalkohole oder Mischungen hiervon, Poloxamere, wie z. B. Pluronic, aber auch synthetisch modifizierte Hydrogele einschließlich methacrylierter Gelatine (GelMA) oder Silikone.
Darüber hinaus sollte die Viskosität der Druckmaterialien entsprechend eingestellt werden. Es werden grundsätzlich keine besonderen Anforderungen an die eingesetzten Materialien gestellt, bevorzugt sind die Materialien aber solche, die dispensierbar sind. Z. B. können Gele mittels drop-on-demand-Druck bis ca. 5000 mPas ge- druckt werden, mit anderen Druckverfahren können auch Viskositäten von bis zu 960.000 mPas gedruckt werden.
In Abhängigkeit von dem Druckverfahren können die Viskositäten der mindestens zwei Druckmaterialien für die mindestens zwei Druckteilbereiche so ausgewählt werden, dass sie entsprechend weit auseinander liegen, so dass keine oder nur ge- ringe Vermischung erfolgt.
In einem weiteren Aspekt sind die Druckmaterialien derart ausgewählt, dass sie aufgrund unterschiedlicher hydrophober Eigenschaften eine geringe Vermischung aufweisen. Z. B. kann das erste Material nach der Gelierung oder Polymerisation eine Oberfläche ausbilden, auf der nachfolgende Tropfen mit einem großen Kontakt- winkel z. B. > 20° aufgebracht werden können. Dem Fachmann sind geeignete Hydrophobierungsmittel und hydrophile bzw. hydrophobe Materialien, die in den Druckmaterialien Einsatz finden, bekannt. Die Hydrophobizität, insbesondere die des ersten Druckmaterials, ist insofern von Bedeutung, als das Tropfen, die auf das hydrophobe Material gedruckt werden, sich weniger stark aufspreizen. Dadurch erlaubt es eine hydrophobe Grundschicht bzw. nachfolgend gedruckte hydrophobe Schichten, deutlich definiertere und räumlich höher aufgelöste Einzeltropfen und Tropfenstrukturen zu platzieren. Ferner können auch die Abstände zwischen Einzeltropfen und Tropfenstrukturen durch aufdrucken auf eine hydrophobe Schicht präzisier eingestellt werden.
Schließlich wird in einem weiteren Aspekt eine biologische dreidimensionale Struktur, erhältlich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, bereitgestellt. In einer Ausführungsform ist diese biologische dreidimensionale Struktur eine Gewebestruktur, die als Gewebesubstitut eingesetzt werden kann. Entsprechende Gewebesubsti- tute finden Anwendung in vitro als Gewebemodell, z. B. als Modell zur Gewebegenese oder als Gewebemodell zur Testung von Therapieformen oder zur Stratifizie- rung einer Therapie oder zum Testen oder Identifizieren von Wirkstoffkandidaten.
Darüber hinaus können diese Strukturen als Gewebesubstitute in vivo, d. h. als
Implantat verwendet werden.
Diese Gewebestrukturen für die in vitro oder in vivo Anwendung können dabei Organe sein bzw. Lebendgewebestrukturen, wie ein Kapillarnetzwerk, eine Lebergewebestruktur, eine Herzgewebestruktur, eine Nierengewebestruktur, eine Alveolen- struktur, eine Hautstruktur, eine Knorpelstruktur, eine Knochenstruktur gegebenenfalls mit Knochenmark, eine neuronale Struktur oder Mischformen hiervon.
Diese Gewebestrukturen oder Gewebesubstitute können in einem Aspekt auch entsprechend MCS oder Kombinationen von MCS mit Einzelzellen aufweisen, um die entsprechenden Strukturen auszubilden.
Die Kultivierungsbedingungen zur Ausbildung dieser Gewebestrukturen sind dem Fachmann bekannt, entsprechende Kultivierungsvorgänge können in entsprechenden Vorrichtungen mit geeigneten Materialien durchgeführt werden. Diese erfindungsgemäßen Strukturen zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine entsprechende Mikrostruktur aufzeigen, insbesondere in Bezug auf die Anordnung der verschiede- nen Zellarten und Matrices.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Figuren und in den Beispielen weiter erläutert.
Beispiele
Die Erfindung wird anhand der Bespiele und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.
Beispiel 1 Ausbildung von Geweben mit legenden Zellen und Organen
In einer ausführlichen Studie wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verschiedene Gewebesubstitute hergestellt. Dazu wurden die folgenden Zusammensetzungen verwendet:
Agarose (2 %), Gelatine (10 %), Fibrinogen (50 mg/ml), Thrombin (100 Units/ml), PBS, Zellkulturmedium.
Je nach der gewünschten Gewebestruktur wurden dabei die folgenden Zellen in das Druckmaterial eingebracht. Vorbereitung
Für alle Studien wird zur Herstellung einer Grundschicht 0,5 ml Gelatine-Agarose-Lösung (GA), bestehend aus zu gleichen Teilen gemischter Agarose (2 %) und Gelatine (10 %) angereichert mit 2 % Thrombin, in eine Petrischale oder eine 12-Well- platte gegossen.
Herstellung von Netzwerken mit kapillarähnlichen Strukturen (Infiltration)
Mit Hilfe eines Drop-on-Demand Biodruckers (z. B. von der Black Drop Biodrucker GmbH) wird ein Muster beabstandeter Einzeltropfen bestehend aus oben beschriebener GA-Mischung auf die Grundschicht gedruckt. Der Druckprozess erfolgt bei einem Luftdruck von 0,5 bar, einer Ventilöffnungszeit von 450 s, und einem Ventildurchmesser von 300 μιτι. Der Druckvorgang wird einmal wiederholt. Anschließend werden die Tropfenstrukturen mit 500 μΙ PBS gewaschen. Danach werden je Probe 30 μΙ zellbeladenes Fibrinogen (3 x 10Λ6 HUVECs / ml und 1 x 10Λ6 hMSCs / ml) auf die gedruckte Probe pipettiert, gedruckt oder gesprüht. Druckvorgang und Infiltration kön- nen beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Strukturen aufzubauen. Die Proben werden anschließend bei 37 °C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen kultiviert.
Herstellung von Netzwerken mit kapillarähnlichen Strukturen (Penetration)
Die Grundschicht wird mit 500 μΙ PBS gewaschen. Danach werden je Probe 30 μΙ zellbeladenes Fibrinogen (3 x 10Λ6 HUVECs / ml und 1 x 10Λ6 hMSCs / ml) auf die Grundschicht pipettiert, gedruckt oder gesprüht. Anschließend wird ein Muster beabstandeter Einzeltropfen einer Agarose-Mischung, bestehend aus zu gleichen Teilen vermischter Agarose (2%) und Zellkulturmedium angereichert mit 2 % Thrombin, mit Hilfe eines Drop-on-Demand Biodruckers (z. B. von der Black Drop Biodrucker GmbH) auf die Fibrin beschichtete Grundschicht gedruckt. Beschichtung und Druckvorgang können beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Strukturen aufzubauen. Die Proben werden anschließend bei 37 °C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen kultiviert.
Herstellung von Herzmuskelvorläufergewebe (Infiltration)
Mit Hilfe eines Drop-on-Demand Biodruckers (z. B. von der Black Drop Biodru- cker GmbH) wird ein Muster beabstandeter Einzeltropfen bestehend aus oben beschriebener GA-Mischung auf die Grundschicht gedruckt. Der Druckprozess erfolgt bei einem Luftdruck von 0,5 bar, einer Ventilöffnungszeit von 450 s, und einem Ventildurchmesser von 300 μιτι. Der Druckvorgang wird einmal wiederholt. Anschließend werden die Tropfenstrukturen mit 500 μΙ PBS gewaschen. Danach werden je Probe 30 μΙ zellbeladenes Fibrinogen (3 x 10Λ6 Kardiomyozyten) auf die gedruckte Probe pipettiert, gedruckt oder gesprüht. Druckvorgang und Infiltration können beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Strukturen aufzubauen. Die Proben werden anschließend bei 37 °C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen kultiviert.
Herstellung von Herzmuskelvorläufergewebe (Penetration)
Die Grundschicht wird mit 500 μΙ PBS gewaschen. Danach werden je Probe 30 μΙ zellbeladenes Fibrinogen (3 x 10Λ6 Kardiomyozyten) auf die Grundschicht pipettiert, gedruckt oder gesprüht. Anschließend wird ein Muster beabstandeter Einzeltropfen einer Agarose-Mischung, bestehend aus zu gleichen Teilen vermischter Agarose (2%) und Zellkulturmedium angereichert mit 2 % Thrombin, mit Hilfe eines Drop-on-Demand Biodruckers (z. B. von der Black Drop Biodrucker GmbH) auf die Fibrin beschichtete Grundschicht gedruckt. Beschichtung und Druckvorgang können beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Strukturen aufzubauen. Die Proben werden an- schließend bei 37 °C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen kultiviert. Herstellung von Nierenanalog (Infiltration)
Mit Hilfe eines Drop-on-Demand Biodruckers (z. B. von der Black Drop Biodrucker GmbH) wird ein Muster beabstandeter Einzeltropfen bestehend aus oben beschriebener GA-Mischung, versehen mit 3 x 10Λ6 HK-2 Tubulusepithelzellen je Millili- ter, auf die Grundschicht gedruckt. Der Druckprozess erfolgt bei einem Luftdruck von 0,5 bar, einer Ventilöffnungszeit von 450 s, und einem Ventildurchmesser von 300 μιτι. Der Druckvorgang wird einmal wiederholt. Anschließend werden die Tropfenstrukturen mit 500 μΙ PBS gewaschen. Danach werden je Probe 30 μΙ zellbeladenes Fibrinogen (3 x 10Λ6 HUVECs / ml und 1 x 10Λ6 hMSCs / ml) auf die gedruckte Probe pipettiert, gedruckt oder gesprüht. Druckvorgang und Infiltration können beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Strukturen aufzubauen. Die Proben werden anschließend bei 37 °C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von mindestens 1 Woche kultiviert. Herstellung von Leberlappenanalog (Penetration)
Die Grundschicht wird mit 500 μΙ PBS gewaschen. Danach werden je Probe 30 μΙ zellbeladenes Fibrinogen (3 x 10Λ6 HUVECs / ml und 1 x 10Λ6 hMSCs / ml) auf die Grundschicht pipettiert, gedruckt oder gesprüht. Anschließend wird ein Muster beabstandeter Einzeltropfen einer Agarose-Mischung, bestehend aus zu gleichen Teilen vermischter Agarose (2%) und Zellkulturmedium angereichert mit 2 % Thrombin, mit Hilfe eines Drop-on-Demand Biodruckers (z. B. von der Black Drop Biodrucker GmbH) auf die Fibrin beschichtete Grundschicht gedruckt. Das zum Drucken eingesetzte Aga- rose-Hydrogel ist mit Hepatozyten beladen (3 x 10Λ6 HUH7 Hepatozyten). Beschich- tung und Druckvorgang können beliebig häufig wiederholt werden, um mehrschichtige Strukturen aufzubauen. Als Kontrolle wurde auf gleiche Weise eine Probe hergestellt, die kein Fibrin und keine darin enthaltenen hMSCs und HUVECs enthielt. Die Proben werden anschließend bei 37 °C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von mindestens 12 Tagen kultiviert. Auswertung
Zur Evaluierung der Überlebensrate der in den gedruckten Strukturen befindlichen Zellen wurden Vitalfluoreszenzdoppelfärbungen (FDA/PI) durchgeführt. Die Strukturen wurden mithilfe eines Lichtmikroskops mit Scanfunktion bei 5-facher und 10-facher Vergrößerung analysiert. Zur Darstellung der kapillarähnlichen Netzwerkfor- mation wurden die Proben mit Methanol fixiert und mit DAPI und einer für Endothel- zellen spezifischen Antikörperfärbung markiert (CD31 ). Die Tubulusepithelzellen wurden zusätzlich mit einer ihrerseits spezifischen Antikörperfärbung markiert (LTL). Die Proben wurden mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops mit Scanfunktion und mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie bei 5-facher, 10-facher und 20-facher Vergrößerung analysiert. Zur Bestimmung der Harnstoffsynthese der Leberlappenmodelle wurden an Tag 4, 8 und 12 der Kultivierung je 500 μΙ Überstand von den Proben genommen und einer photometrischen Messung unterzogen. Es wurde zwischen den Proben, mit He- patozyten und Fibrin sowie den darin enthaltenen hMSCs und HUVECs (HEP+), Proben mit ausschließlich Hepatozyten (HEP) und dem Zellkulturmedium (Control) unterschieden.
Erfindungsgemäß wird ein universelles Verfahren zur Biofabrikation von Gewe- besubstituten und Gewebeanaloga bereitgestellt. Mit diesem universellen Verfahren kann eine Vielzahl von Geweben mit komplexen Strukturen bereitgestellt werden, die, wie in den Beispielen dargestellt, die Originalgewebe sehr gut wiederspiegeln. Diese Gewebe sind entsprechend geeignet als Substitute zum Beispiel als Implantate aber auch als Analoga für in vitro Verfahren, zum Beispiel im pharmazeutischen Bereich. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt aufgrund seiner Einfachheit eine schnelle Herstellung in einer hohen Anzahl an Geweben und gewährt die Herstellung von im Wesentlichen identischen Gewebestrukturen.

Claims

Verfahren zum Biodrucken einer dreidimensionalen biologischen Struktur enthaltend lebende Zellen mit mindestens zwei unterschiedlichen Materialien zum Biodrucken, die entsprechend ihrer Materialeigenschaften mindestens zwei unterschiedliche Teilbereiche ausbilden, wobei mindestens ein Teilbereich dieser dreidimensionalen Struktur lebende Zellen enthält und wobei mindestens eines der Materialien zum Biodrucken lebende Zellen enthält, wobei in einem ersten Schritt eines dieser Materialien auf ein Substrat aufgebracht oder eingebracht wird; dieses Material gegebenenfalls einer ersten Behandlung, insbesondere einem Waschen unterzogen wird, und in einem sich anschließenden Schritt ein anderes Material als im ersten Schritt verwendet aufgebracht oder eingebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Materialien durch Tropfendruck aufgebracht oder eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in dem ersten Schritt das eine Material als erstes Material als Tropfen auf ein Substrat aufgedruckt wird, wobei diese Tropfen vorbestimmte Positionen zueinander aufweisen und anschließend, gegebenenfalls nach einem Waschschritt, ein mindestens zweites anderes Material aufgebracht oder eingebracht wird, das die durch die Tropfen des ersten Materials gebildeten Zwischenräume ausfüllt.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in dem anschließenden Schritt das andere Material als Tropfen in das eine Material gedruckt wird, derart, dass das andere Material gedruckt zumindest teilweise in das eine Material eintaucht oder dieses verdrängt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die gedruckten Tropfen des anderen Materials die Schicht des einen Materials durchschlägt, derart, dass die Tropfen in die durch das Material ausgebildete Schicht eingebettet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Tropfen bei dem Tropfendruck in einem vorbestimmten Muster gedruckt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das eine Material ein Material auf Basis von Gelatine ist, insbesondere ein Gelatine-Agarosemix, Polyethylenglykol (PEG) oder ein PEG-Derivat ist, oder ein Poloxamer, wobei dieses Material lebende Zellen aufweisen kann und wobei dieses Material gegebenenfalls zu einem späteren Zeitpunkt verflüssigbar und entfernbar ist unter Zurücklassung der Zellen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das andere Material ein Hydrogel ist, insbesondere auf Basis von Fibrin oder Collagen, das gegebenenfalls Zellen enthalten kann.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das eine Material mit einem chemischen oder biologischen oder physikalischen Vernetzer vermischt wird, der ggf. in das andere Material diffundiert und bei Kontakt mit dem anderen Material dessen Gelierung bewirkt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale Struktur eine Gewebestruktur ist mit einem Bereich, der einer Versorgungsstruktur entspricht und einem Bereich, der ein funktionales Gewebe ausbildet.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur, wobei diese dreidimensionale Struktur einer Kardio- struktur, einer Leberstruktur, einer Nierenstruktur, einer Alveolenstruktur, einer Hautstruktur, eine Knorpelstruktur, eine Knochenstruktur gegebenenfalls mit Knochenmark, einer neuronalen Struktur oder Mischformen hiervon ähnelt.
1 1 . Verfahren zur Herstellung einer dreidimensionalen Gewebestruktur nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem Aufbringen des mindestens zweiten anderen Materials eine Kultivierung hiervon in einem geeigneten Inkubator erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreidimensionale Struktur ein Organ ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die lebenden Zel- len in dem ersten Material insbesondere solche sind, die insbesondere gefäßausbildende Zellen sind oder umfassen, insbesondere wobei diese Endothelzel- len, mesenchymale Stammzellen, Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen sind 14. Biologische dreidimensionale Struktur erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
15. Biologische dreidimensionale Struktur nach Anspruch 14 wobei diese Struktur eine Lebergewebestruktur, eine Herzgewebestruktur, eine Nierengewebestruk- tur, eine Alveolenstruktur, eine Hautstruktur, eine Knochenstruktur gegebenenfalls mit Knochenmark, eine Knorpelstruktur, eine neuronale Struktur oder Mischformen hiervon ist.
16. Verwendung einer dreidimensionalen Struktur nach Anspruch 14 oder 15 als Gewebemodell, insbesondere als Modell zur Gewebegenese.
17. Verwendung einer dreidimensionalen Struktur nach Anspruch 14 oder 15 als Gewebemodell zur Testung von Therapieformen oder zur Stratifizierung einer Therapie oder zum Testen oder Identifizieren von Wirkstoffkandidaten.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016001442A1 (de) * 2014-07-04 2016-01-07 Rwth Aachen Gewebemodell und verfahren zur herstellung hiervon sowie dessen verwendung
WO2017011854A1 (en) * 2015-07-22 2017-01-26 Inventia Life Science Pty Ltd Process for printing 3d tissue culture models

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2880948T3 (es) * 2014-05-12 2021-11-26 Roosterbio Inc Células listas para imprimir y dispositivos integrados

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016001442A1 (de) * 2014-07-04 2016-01-07 Rwth Aachen Gewebemodell und verfahren zur herstellung hiervon sowie dessen verwendung
WO2017011854A1 (en) * 2015-07-22 2017-01-26 Inventia Life Science Pty Ltd Process for printing 3d tissue culture models

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLAESER A. ET AL., CURR. OPIN. BIOMED. ENG., 2017
LEE JIN WOO ET AL: "Development of a 3D cell printed construct considering angiogenesis for liver tissue engineering. Art 05007", BIOFABRICATION JUN 2012,, vol. 8, no. 1, 12 January 2016 (2016-01-12), pages 1 - 13, XP002767733, ISSN: 1758-5090, DOI: 10.1088/1758-5090/8/1/015007 *
MURPHY S. V.; ATALA A., NAT. BIOTECHNOL, vol. 32, no. 8, 2014, pages 773 - 785
STRATESTEFFEN H. ET AL., BIOFABRICATION, vol. 9, 2017, pages 045002
TAN, Y.J. ET AL., SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6
W SCHUURMAN ET AL: "Bioprinting of hybrid tissue constructs with tailorable mechanical properties", BIOFABRICATION, vol. 3, no. 2, 20 May 2011 (2011-05-20), UK, pages 021001, XP055218828, ISSN: 1758-5082, DOI: 10.1088/1758-5082/3/2/021001 *

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